一种基于单颗粒成像的外泌体亚型分析方法
阅读说明：本技术 一种基于单颗粒成像的外泌体亚型分析方法 (Exosome subtype analysis method based on single particle imaging ) 是由 余辉 翟春荟 杨玉婷 于 2021-06-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种基于单颗粒成像的外泌体亚型分析方法,该方法通过对外泌体单颗粒的动态成像和数字化分析,同时获取粒径及表面分子标志物信息,通过数据分析算法进行亚型的分类。首先,在金属芯片表面修饰识别分子,通过流体装置将该待测外泌体样品加入金属芯片表面的反应腔,通过高灵敏的显微成像系统及数据分析软件实现外泌体与分子相互作用过程的动态检测,构建外泌体粒径与分子标志物间的定量模型,实现亚型的聚类分析,解决了外泌体亚型分析中亚型样品分离困难的关键问题。(The invention relates to a single-particle imaging-based exosome subtype analysis method, which is used for dynamically imaging and digitally analyzing exosome single particles, simultaneously acquiring particle size and surface molecular marker information and classifying subtypes through a data analysis algorithm. Firstly, modifying recognition molecules on the surface of a metal chip, adding the exosome sample to be detected into a reaction cavity on the surface of the metal chip through a fluid device, realizing dynamic detection of an interaction process of exosomes and molecules through a high-sensitivity microscopic imaging system and data analysis software, constructing a quantitative model between an exosome particle size and a molecular marker, realizing subtype cluster analysis, and solving the key problem of difficult subtype sample separation in exosome subtype analysis.)
技术领域
本发明属于体外诊断技术领域，涉及一种基于表面等离子体共振成像的免分离的外泌体亚型分析方法。
背景技术
液体活检(Liquid biopsy)技术通过检测血液中的循环生物标志物等，用于实现对癌症患者的早期筛查、指导治疗方案、治疗监测和复发监控，是目前最具前景的癌症诊断和治疗工具之一。外泌体是由细胞分泌的直径在30-150纳米之间的微小膜泡，在绝大多数人体液，广泛存在于尿液、血液、乳汁、唾液等各种人体液。外泌体含有其宿主细胞中特异的蛋白、脂质和核酸，能作为信号分子传递给其他细胞从而改变其他细胞的功能，在多种生理病理过程中起着重要的作用，如免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等。不同细胞分泌的外泌体具有不同的组成成分和功能，因此可作为液体活检的生物标志物。相比其他循环生物标志物，外泌体具有易于富集，稳定性强且不易降解的特点，受到越来越多关注。
由于肿瘤类型不同，肿瘤突变差异，细胞来源以及胞外环境的差异等，血液中的外泌体在尺寸分布，数量以及内容物组成等方面存在严重的个体差异。利用非对称流体技术手段，可按照粒径进一步将30-150nm的外泌体群体分为小于50nm，60-80nm以及90-120nm三个亚群。质谱分析可知，每个亚群有自己的特征标志物。这表明外泌体的尺寸与内容物之间存在特定的关系。由于癌症类型的不同，癌细胞分泌的外泌体携带癌症特异性标志物与粒径之间也有关联。目前基于外泌体群体分析的液体活检技术，例如热泳富集技术结合适配体荧光多参数检测，对于6种常见癌症的诊断只有较低的准确率。因此，发展与粒径和表面标志物相关的外泌体亚型分析方法对于癌症的准确诊断有着极为重要的意义。
目前能够实现外泌体分析的技术包括：通过电镜来分析外泌体的大小和形态，采用动态光散射(DLS)估算平均粒径，并通过Westernblot和ELISA等方法对蛋白分子标志物进行检测。整个分析过程不仅样品处理复杂、耗时长、消耗样品量多，同时缺乏外泌体个体间的差异信息，无法同时得到粒径与分子标志物信息。厦门大学颜晓梅教授课题组在NanoFCM技术方面做出了杰出的成果，实现了对40nm外泌体的高灵敏测量，但缺乏足够的分子信息，需要通过对外泌体样品进行荧光免疫标记来实现特异性检测，因此受到荧光通道数目、荧光分析发光效率、样品前处理、半定量检测等限制，在外泌体亚型分析方面有很大的局限性。而传统的SPR技术由于缺乏单颗粒成像分析能力，无法同时获得外泌体的粒径和分子标志物信息，更无法分析外泌体的亚型。通过非对称流体技术或者尺寸排阻色谱技术将外泌体群体按照粒径大小分群的方式受到严苛的技术手段限制，在临床极不适用。因此，急需发展一种与尺寸和表面标志物相关的，免分离的外泌体亚型分析技术。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的需按照粒径大小将外泌体进一步分离的难点，提供一种免分离的，单外泌体尺度上的外泌体亚型分析方法，具有高灵敏性，高特异性，操作简单的特点。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种基于单颗粒成像的外泌体亚型分析方法，该方法包括以下步骤：
1)将PDMS通道与金片键合，得到芯片，形成稳定的样品流通池；
2)通过Au-S键自组装法，将多种核酸适配体结合到步骤1)所得芯片表面，并利用MCH和BSA阻断芯片表面剩余的活性位点，得到基于核酸适配体捕获的外泌体传感器芯片，构成微流控进样体系；
3)将待检测外泌体样品加入步骤2)所得微流控进样体系，采用表面等离子体共振成像平台无标记实时监测并记录外泌体与适配体特异性相互作用；
4)基于图像分析的单颗粒计数及粒径统计进行分析。
步骤1)中，PDMS通道通过以下方法获得：采用CAD绘制通道图案，将该图案印制在菲林板模具上，利用光刻技术，在菲林板模具的硅片表面形成图形化的微流控通道，清洗，依次进行高温处理和硅烷化处理，使硅片表面亲水；将PDMS液体倒入模具内，高温固化后，即可得到PDMS通道。
进一步地，所述的PDMS通道尺寸：长×宽×高为10mm×1mm×30μm，每一个PDMS芯片含有三条通道；
所述的高温处理的温度为120-150℃，时间为1-3小时；
所述的硅烷化处理为：将硅片放置于一片滤纸上，取5微升硅烷化试剂(3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTS))，在通风厨中，滴加于滤纸上，用培养皿扣上滤纸和硅片，使硅烷化试剂挥发，5-10min后，硅烷化过程完成。
所述的PDMS液体为市售产品，如可选用道康宁184聚二甲基硅氧烷PDMS，其由PartA与Part B按质量比10：1混合而成，其中Part A为聚二甲基硅氧烷预聚物，Part B为带乙烯基侧链的预聚物及交联剂。
所述的高温固化的固化温度为85℃，固化时间为2-3小时。
进一步地，步骤1)中，PDMS通道与金片键合的方法包括以下步骤：
1-1)将Au芯片充分清洗，并用氮气吹干，置于洁净的培养皿中待用；
1-2)将PDMS通道与Au芯片同时照射氧Plasma，将二者结合，高温固化后即可得到含芯片的样品流通池。
更进一步地，步骤1-2)中照射氧Plasma的时间为50秒；PDMS与Au芯片键合的温度为120℃。
进一步地，步骤2)具体为：
2-1)将核酸适配体，MCH及TCEP进行混合，配置成修饰液，加入所述样品流通池内，避光过夜修饰；
2-2)用BSA溶液替换适配体修饰液，并静置，使BSA占据Au芯片表面未修饰的结合位点，之后用PBS清洗，即得到所述的Aptamer/MCH/BSA修饰的外泌体捕获传感芯片。
更进一步地，步骤2-1)中，核酸适配体根据检测疾病的类型选择，其中一端为巯基；核酸适配体，MCH与TCEP的摩尔比为1：1：5；所述避光过夜修饰的温度为20℃；微流控进样体系包括微量注射泵，微流控管道，其中微流控管道含有PDMS通道，PDMS通道与金片键合，金片上修饰有特征核酸适配体。
步骤2-2)中，BSA溶液的质量体积浓度为1％w/v，修饰完毕后，用PBS冲洗三次。
进一步地，步骤3)所述的表面等离子体共振成像平台，采用的物镜是油镜，物镜的数值孔径范围为1.39～1.79；
采用的激光光源为p偏振光，光源波长范围为550～780nm；
采用CMOS相机的像素大小范围在30～200nm。
进一步地，步骤4)具体分析方法为：
4-1)基于Python平台，利用图像差分算法，识别单帧图片上的外泌体图像；
4-2)利用追踪算法，按照时间序列，追踪单个外泌体贴附解离过程，记录其在贴附过程中的最大亮度，作为粒径的特征数值；
4-3)将外泌体群体按照粒径大小分为三个亚群，分别统计每个亚群中的数量占比。
进一步地，步骤4-3)中，用30，50，100，160nm的二氧化硅纳米颗粒作为标准品，绘制标准曲线，对外泌体的粒径进行测定。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明利用iPM平台，可实现30-150nm的外泌体的全粒径分析，并且实时监测外泌体与表面适配体的特异性相互作用，检测的灵敏度可以达到5×107个外泌体/mL，与NTA能力接近。
(2)本发明利用核酸适配体作为识别元件，通过Au-S键自组装膜法直接结合到Au芯片表面，具有步骤简单、易于实现、不需要再对基底进行其他复杂修饰处理等优点，在检测过程中能够实现对目标外泌体的特异性结合，有效提高了传感器的特异性。
(3)本发明基于图像分析的单颗粒计数及粒径统计软件系统，可简单快速处理数据，同时获取粒径与表面标志物信息，避免了外泌体亚型分析中需要分离的技术难点，可望用于血液液体活检技术中外泌体亚型的分析，准确判定癌症类型。
附图说明
图1为基于表面等离子体共振的外泌体亚型分析系统示意图；
图2为iPM平台检测30-150nm的二氧化硅纳米颗粒绘制的粒径与亮度标准工作曲线；
图3为iPM平台对乳腺癌细胞系MCF-7来源的外泌体浓度测试；
图4a为利用iPM平台对肿瘤来源的细胞系中粒径与表面标志物的亚型分析：MCF-7细胞系粒径分布；
图4b为利用iPM平台对肿瘤来源的细胞系中粒径与表面标志物的亚型分析：四种肿瘤来源的外泌体的亚群比例分析；
图5为本发明核酸适配体传感器与BSA修饰芯片进行外泌体捕获数量比较图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
本发明采用核酸适配体修饰的SPR芯片对癌症细胞系培养液提取的外泌体群体进行检测的方法，具体为：采用微流控进样体系，向修饰有特征核酸适配体的PDMS通道注入10uL待测外泌体样品，流速为2uL/min选择适当的观测区域，利用SPRM平台实时记录外泌体与适配体的相互作用图像，大概2-5min后，图像采集完毕，根据30nm，50nm，70nm，100nm与160nm的二氧化硅绘制的标准粒径曲线，将外泌体群体分为三个亚群，实现亚群的聚类分析。如图1所示。
后续用自动软件分析系统(即Python平台，该平台为本领域的常用系统)对图像进行分析，先利用图像差分方法去除背景噪音，得到单帧外泌体图像信号，随后利用时间序列对外泌体与表面修饰的适配体的特异性结合作用进行分析，同时提取外泌体的亮度与数量信息。
对该核酸适配体SPR传感器进行特异性测定，方法为：将癌细胞培养液来源的外泌体样本溶液分别通入核酸适配体通道和仅有BSA修饰的通道中，采用上述同样方法，在相同条件下进行图像采集和数据处理，分析两种修饰条件下，样本中特异性吸附在芯片的外泌体数量，考察核酸适配体SPR传感器的特异性性能。
干涉等离子体成像(interferometric plasmonic microscopy,iPM)技术，实现了外泌体单颗粒动态免标记成像，其检测限达到30纳米，完全覆盖外泌体的粒径范围；通过对iPM芯片表面进行分子修饰，可同时实现外泌体表面分子标记物的定量检测。与传统的基于棱镜的SPR/SPRi技术不同，iPM技术采用高放大倍数和大数值孔径的物镜作为光路耦合元件，配合高性能相机进行高分辨率外泌体图像的采集，并量化获取图像特征，建立其与外泌体粒径、浓度等信息的定量关系。其关键技术原理是基于iPM的干涉成像理论模型进行实验条件的优化，使其信噪比达到散粒噪声极限，并通过数值重建和时空域滤波算法，将成像灵敏度提高到30nm单颗粒检测水平；同时iPM结合了传统SPR生物传感技术的优点，即通过表面修饰可实现分子标志物的高通量分析，在此平台上同时实现了物理和分子信息的多参数检测。
核酸适配体(aptamer)又称“人工抗体”，是一类通过指数富集配体系统进化技术(SELEX)在体外筛选得到的单链DNA或RNA片段，长度一般为20-100个核苷酸，能与相应配体专一而紧密地结合，从而实现对目标分子的特异性检测。将适配体作为识别单元，具有尺寸小、亲和性好、易于人工合成和修饰、稳定性强、在基底上固定操作简单、用于检测小分子时检测限低等优点。因此，本发明将干涉等离子体成像技术与具有特异性识别功能的核酸适配体结合，构建特异性捕获肿瘤来源的外泌体的传感器芯片，以获得良好的检测灵敏度和特异性。
具体而言，本发明利用Au-S键在iPM芯片表面自组装修饰肿瘤分子特异性核酸适配体，利用MCH和BSA阻断剩余结合位点，得到最终的传感器芯片。其中采用核算适配体作为捕获原件，提高了传感器的选择性和特异性，采用iPM平台采集数据，不仅能够得到单个外泌体的粒径信息，加上iPM的超灵敏特性，可观测粒径在30nm的外泌体颗粒，而且能够利用SPR的特性，观测外泌体膜表面抗原与核酸适配体的特异性相互作用信息。检测方法快速简便，可实现外泌体群体的免标记单分子检测。
本发明利用Python软件实现数据的全自动分析。利用差分的背景去除方法，可有效去除背景噪音，使得信号更有效地体现。基于Gan神经网络对外泌体图像进行识别，准确率可达90％以上。软件系统可识别30nm的标准二氧化硅颗粒，实现高灵敏的颗粒识别，提高数据分析效率。
本发明实现针对现有外泌体亚群分析过程中需事先将亚群分离的难点，将iPM检测平台与具有特异性识别功能的核酸适配体相结合，构建用于检测单个外泌体的SPR传感器。由于存在表面近场效应，有效避免了检测过程中本体溶液的干扰，iPM平台极大地提高了检测的灵敏度，实现了30-150nm的外泌体全粒径检测；加之，该平台具有SPR的性能，可实现单个外泌体与特异性适配体动态作用的监测，实现特异性检测。结合高效的图像处理软件，能够对收集的数据进行快速分析。该方法芯片制作工艺简单，可操作性强，重现性好，能够同时实现粒径与表面标志物的检测，对外泌体亚群进行分析，得到更精准的癌症识别方法。
实施例1：
用于检测外泌体的核酸适配体iPM传感器的制备方法如下：
(1)芯片的加工处理。2.0cm×2.0cm的BK-7玻片，经去离子水冲洗，除去表面大颗粒灰尘后，再用无水乙醇清洗，洗去表面部分有机污渍，重复以上步骤三次，用氮气将表面的水渍和乙醇溶剂吹干，清洗至表面没有肉眼可见的残留污渍即可。最后用氢焰灼烧表面，提高平整度，进一步去除表面有机物残留。用磁控溅射FHR仪器先在表面镀一层3nm的金属铬，提高与金膜的附着力。随后再在铬表面镀一层47nm的金层，芯片的初步加工即可完成。将芯片置于洁净的收纳盒中保存。
(2)芯片预处理。从玻璃盒中取出一片待修饰的芯片，依次用去离子水和无水乙醇清洗表面，重复三次，直至表面无肉眼可见的污渍。用洁净的氮气将表面吹干后，再用氢焰来回清扫表面，进一步去除表面的有机物。注意火焰与金膜不能长时间接触，否则会毁坏芯片。
(3)微流体进样系统的构建。PDMS通道的加工过程为：先用CAD画出通道的图案，尺寸为10mm×1mm×30μm(长×宽×高)，每一个PDMS芯片含有三条通道，制作菲林板模具，利用光刻技术，在硅片表面图形化出微流控通道的模板，后经清洗，高温处理及硅烷化处理，将硅片表面变得亲水；将按10：1(Part A：Part B)配置的PDMS液体倒模，高温固化2-3小时后，即可得到PDMS通道。将制作好的PDMS通道与Au芯片同时照射氧Plasma 50秒，将二者结合，高温固化后即可得到加样系统；
(4)核酸适配体修饰液的配置。核酸适配体的选择与待测肿瘤分子标志物相对应。核酸适配体一端带有巯基，用于与金膜表面自组装单分子层。取核酸适配体母液(500μM)1μL，MCH母液(500μM)1μL，TCEP母液(500μM)5μL，并加入93μL 1×PBS溶液中，充分振荡混匀，在室温中停留30min后，即可用于芯片表面修饰。
(5)特异性核酸适配体传感器的构建。取上述核酸适配体修饰液20μL于微量注射器中，用微量注射泵缓慢通入PDMS通道中，置于室温避光过夜修饰。孵育12h，制得特异性核酸适配体传感界面。修饰完毕后，将修饰液排出，用PBS清洗三次，再用20μL 1％BSA溶液将剩余的结合位点阻断，避免外泌体在金膜上的非特异性吸附，最后用1×PBS(pH＝7.4)进行清洗，制得核酸适配体传感器。
实施例2：
采用实施例1制备的特异性核酸适配体传感器进行二氧化硅标准品的检测。
使用基于商业全内反射显微镜(Olympus IX-81)改建的SPRM作为检测仪器，选用放大倍数60倍，数值孔径N.A＝1.49的油镜，光源为超宽带光源SLED，光源控制电流的强度在150mA，观察视野为512×512pixels(full field of view:51.2×51.2μm2)。采用micromanager控制CCD相机(Photometrics)记录SPRM的成像信号。Cell lens软件用以控制光路的入射角度。
配置适当浓度的二氧化硅纳米颗粒标准品，粒径分别为30nm，50nm，70nm，100nm以及160nm。将标准品分别通入含有实施例1所得核酸适配体传感器的微流控通道中，以100FPS采样速率进行数据采集，获得二氧化硅标准品的粒径与亮度标准曲线，用于外泌体样品粒径的标定。由于iPM平台高灵敏的检测特性，能够检测到30nm二氧化硅的信号。结果如图2所示，随着粒径增加，检测到的特征亮度也随之增加，二者呈指数关系。
实施例3：
采用实施例1制备的特异性核酸适配体传感器进行外泌体样品的检测。
采用差速离心方法将细胞培养液中全粒径的外泌体样品提取出来，外泌体沉淀用50μL 1×PBS(pH＝7.4)溶解，保存于4℃冰箱待用。样品测试前，需用NTA测定其浓度，将样品浓度调整至109个外泌体/mL，超声震荡混匀后即可用于检测。先在微流控通道中注满1×PBS(pH＝7.4)溶液，调整好入射角的角度，略微大于SPR共振角即可。左右移动观察视野，寻找一个表面干净的视野用于外泌体测定。
首先测试该方法的线性浓度范围。分别将浓度为107，5×107，108，109个外泌体/mL样品通入测试通道，统计外泌体的数量，绘制先行曲线，如图3所示。
取10μL待测外泌体样本，用微量注射泵注入PDMS管道，根据实验情况，采用1-5μL/min的流速通过待测区域。同时以100FPS的采样速率进行采样，以乳腺癌细胞系MCF-7为例，表面分别修饰CD63，HER2，EpCAM，PTK7，PSMA以及PD-L1等肿瘤特异性适配体，对MCF-7细胞系来源的外泌体进行特异性检测。记录外泌体在特异性核酸适配体表面的结合情况，利用软件处理系统获取单颗粒外泌体的特征亮度以及特异性结合的情况。如图4a所示，可以得出MCF-7特异性结合外泌体在各种表面的粒径分布情况。如图4b所示，可得出不同粒径范围的MCF-7特异性结合外泌体的亚群信息。
实施例4：
采用实施例1制备的核酸适配体传感器进行外泌体样品特异性检测：
在芯片修饰过程中，将特异性适配体替换为BSA，进行芯片修饰，作为阴性对照。采用与实施例3中相同的步骤进行样品制备，数据采集，数据分析过程。获取在BSA表面结合的数量与在特异性修饰HER2适配体表面做对比，以说明特异性适配体芯片对外泌体的特异性捕获。如图5所示，可以看出在本发明核酸适配体传感器进行外泌体样品特异性检测捕获数量更高。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
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