用于检测SARS-CoV-2冠状病毒S蛋白的纳米颗粒溶液、制备方法、试剂盒及应用
阅读说明：本技术 用于检测SARS-CoV-2冠状病毒S蛋白的纳米颗粒溶液、制备方法、试剂盒及应用 (Nanoparticle solution for detecting SARS-CoV-2 coronavirus S protein, preparation method, kit and application ) 是由 段醒妹 段永平 童荣生 于 2021-07-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了病毒抗体检测技术领域。尤其涉及一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗体的试剂盒,基于抗原-抗体免疫识别反应,纳米颗粒载体与光敏水凝胶的SARS-CoV-2冠状病毒Spike蛋白的快速检测试剂。本发明提供的用于新型冠状病毒S蛋白的检测试剂,借助现有S蛋白核酸序列,构建针对2019-nCoV的S蛋白纳米抗体识别复合物,可特异性的识别和鉴定新型冠状病毒特有的S蛋白。将光敏水凝胶技术与免疫识别纳米技术相结合,将病毒识别信号转化和呈现为可视的理化现象,从而实现快速的筛查和判断。(The invention discloses the technical field of virus antibody detection. In particular to a reagent kit for detecting a novel coronavirus SARS-CoV-2 antibody, which is a reagent for rapidly detecting SARS-CoV-2 coronavirus Spike protein based on antigen-antibody immune recognition reaction, nanoparticle carrier and photosensitive hydrogel. The detection reagent for the novel coronavirus S protein provided by the invention is used for constructing an S protein nano antibody recognition complex aiming at 2019-nCoV by virtue of the existing S protein nucleic acid sequence, and can specifically recognize and identify the specific S protein of the novel coronavirus. The photosensitive hydrogel technology is combined with the immune recognition nanotechnology, and virus recognition signals are converted and presented as visible physicochemical phenomena, so that rapid screening and judgment are realized.)
技术领域
本发明属于病毒抗体检测技术领域，尤其涉及一种用于检测新型冠状病毒 SARS-CoV-2的试剂，具体的为检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)Spike蛋白抗原的纳米颗粒，更具体的涉及一种基于抗原-抗体免疫识别反应、纳米颗粒载体及光敏催化反应的SARS-CoV-2冠状病毒Spike蛋白的快速检测试剂盒。
背景技术
SARS-CoV-2冠状病毒感染过程是由其表面的Spike蛋白(S蛋白)与宿主细胞表面的血管紧张素转换酶2(ACE2)的相互识别开启的，Spike蛋白是一类三聚体跨膜糖蛋白，在病毒表面形成特殊的花冠结构。冠状病毒进入易感细胞是一种复杂的过程，需要S蛋白的受体结合和蛋白水解过程协同作用以促进病毒-细胞融合。由于S蛋白暴露于病毒表面并介导病毒进入宿主细胞，因此它是感染后中和抗体的主要靶标，可作为SARS-CoV-2冠状病毒的抗原，是抗病毒药物、治疗性抗体、诊断方法等开发的关键靶标，发挥着无可替代的作用。然而，利用基于S蛋白免疫识别的检测技术还需进一步将该识别信号转化和呈现为可见的理化现象，从而实现快速筛查和判断。
世界各国的研究者们正在研究快速而准确的新型冠状病毒检测方法，基于 PCR技术(分子测试)的核酸检测试剂的发挥了重要作用，但该检测手段存在几个问题：
一是由于SARS-CoV-2冠状病毒为RNA病毒，检测需要依次完成样本处理、集中送检等复杂流程，总耗时超过1个小时，不能满足快速、高通量的检测需求，如果对于所有的求医人员都只采用核酸检测，对于一些医疗系统不够完善的地区，容易造成医疗拥挤，导致部分患者迟迟无法确诊，延误治疗或导致疫情扩大化；
二是核酸检测需要专业人员进行，且需要较高的实验室条件；
三是部分无症状感染者由于带毒量较低，或由于样品采集和处理的原因，会产生假阴性结果。因此，急需继续研发具有更高灵敏度、更短检测时间和更方便操作方法的检测技术。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中所存在的检测耗时较长，检测过程复杂以及检测灵敏度不高的技术缺陷，提供一种用于检测SARS-CoV-2冠状病毒S 蛋白的纳米颗粒溶液、试剂盒。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种用于检测SARS-CoV-2冠状病毒S蛋白的纳米颗粒溶液，所述纳米颗粒溶液包括纳米颗粒载体、所述纳米颗粒载体上负载有S蛋白克隆抗体和光敏催化剂。
本发明公开的一种纳米颗粒溶液，借助纳米颗粒这个载体，纳米颗粒表面可以提供偶联位点，将能特异性识别S蛋白克隆抗体和光敏催化剂共同偶联于纳米粒子上，即利用纳米颗粒作为介质，可将光敏水凝胶技术与免疫识别纳米技术完美结合。利用新型冠状病毒S蛋白与S蛋白克隆抗体的特异识别反应，使纳米颗粒牢固的附着在具有新型冠状病毒S蛋白的物质上，再利用光敏水凝胶能引发凝胶固化的特性，即可将病毒识别信号转化和呈现为可见的理化现象，因为光敏催化剂发生固化的过程快速，且固化反应前后溶液状态明显。从而实现快速筛查和判断。更加易于操作，极大的提高了检测效率，减少了病毒传播的风险。
作为本发明的优选技术方案，所述纳米颗粒载体由聚合物A和聚合物B交联而成，所述聚合物A为甲氧基聚乙二醇-聚己内酯聚合物(mPEG-PCL)，所述聚合物B为马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯聚合物(Mal-PEG-PCL)。
mPEG-PCL的结构式如下所示：
Mal-PEG-PCL的结构式如下所示：
甲氧基聚乙二醇-聚己内酯为两亲性共聚物，英文名称为monomethoxyl poly(ethylene glycol)-b-poly(ε-caprolactone)，简称mPEG-PCL，是一种二嵌段共聚物，一端是亲水链段甲氧基聚乙二醇，一端是亲油链段聚ε-己内酯，mPEG-PCL 具有生物可降解性、生物相容性和两亲性，且能够在水溶液中自组装为纳米颗粒，是理想的纳米药物载体骨架材料。
马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯聚合物同样为两亲性共聚物，英文名称是Maleimide-poly(ethylene glycol)-b-poly(ε-caprolactone)，简称Mal-PEG-PCL， Mal-PEG-PCL不仅具有生物可降解性、生物相容性和两亲性，且能够在水溶液中自组装为纳米颗粒，还能够通过马来酰亚胺基团与S蛋白抗体进行共价偶联，是理想的纳米药物功能化载体骨架材料。
聚合物A、聚合物B通过交联反应，使其形成纳米颗粒的同时提供马来酰亚胺基团(Mal-基团)，为S蛋白抗体和光敏催化剂提供在所述纳米颗粒负载的偶联位点。
作为本发明的优选技术方案，所述聚合物A(mPEG-PCL)的分子量范围为 4000Da～8000Da，为了确保制备得到的纳米粒骨架结构是均一的，防止因为分子量不同而带来的其他影响，所述聚合物A和所述聚合物B的分子量之间的比值为1:1。所述聚合物B(Mal-PEG-PCL)同样的分子量的范围为4000Da～ 8000Da。
作为本发明的优选技术方案，本申请提供了一种制备上述纳米颗粒溶液的方法，具体包括如下步骤：
S1、纳米颗粒载体的制备：按照重量比称取聚合物A和聚合物B，通过溶剂溶解，旋蒸成膜，再溶解于去离子水中，在50-70℃的水浴条件下震荡形成纳米颗粒载体溶液；2-8℃下冷藏备用；所述纳米颗粒载体溶液即为mPEG-PCL-Mal 阳离子聚合物纳米粒溶液；
S2、负载S蛋白克隆抗体：将S1中制备的所述纳米颗粒载体溶液与所述S 蛋白克隆抗体加入Hepes缓冲液中，2-8℃下反应24h以上，得到中间产物溶液备用；如前所述，在纳米颗粒载体的制备中，所述S蛋白克隆抗体的需求量只与纳米颗粒载体中聚合物B的含量有关且相对应；
S3、负载光敏催化剂：对所述光敏催化剂进行巯基修饰，将修饰后的光敏催化剂加入S2中制备的中间产物溶液中，3-8℃反应24h以上，反应结束后将反应液置于透析袋中进行透析，所述透析过程中的透析液为蒸馏水，透析结束后即得所述纳米颗粒溶液。
作为本发明的优选技术方案，所述聚合物A与所述聚合物B之间的质量比 1-2:9-10。更优选的，所述聚合物A与所述聚合物B之间的质量比1:9。
其中，所述S蛋白克隆抗体和所述光敏催化剂在进行和所述M-基团进行偶联时，先进行S蛋白克隆抗体的偶联反应，防止过量的所述光敏催化剂与所述纳米颗粒载体进行偶联反应时侵占偶联位点导致所述S蛋白克隆抗体偶联失败。影响最终的检测结果。纳米颗粒载体在进行负载所述S蛋白克隆抗体、所述光敏催化剂的过程中，聚合物B(Mal-PEG-PCL)上的Mal-基团分别与所述S蛋白克隆抗体、所述光敏催化剂按照摩尔比为1:1进行偶联；故所述S蛋白克隆抗体、所述光敏催化剂中其中一方的量过高均会对对方与Mal-基团的偶联产生影响。
作为本发明的优选技术方案，所述S蛋白克隆抗体与所述聚合物B的摩尔比为1：2-10；所述光敏催化剂与所述聚合物B的摩尔比为8-16：1。
作为本发明的优选技术方案，所述SARS-CoV-2冠状病毒的S蛋白的浓度至少为50μg/mL。申请人在研究过程中，使用到的SARS-CoV-2冠状病毒溶液中；S蛋白抗原的浓度远低于感染新型冠状病毒的患者咽部存在的S蛋白抗原的抗原含量，这表明，本申请的技术方案中，通过该浓度下的抗原与抗体的特异识别，能使得抗原-纳米颗粒载体两者牢固结合，保证了检测的准确性。
作为本发明的优选技术方案，所述光敏催化剂为Irgacure 2959。该光敏催化剂可在蓝光(波长405nm)作用下迅速吸收能量，产生自由基、阳离子等，从而引发光敏水凝胶固化。
作为本发明的优选技术方案，对所述光敏催化剂的修饰具体如下操作：
在氮气保护下，将所述Irgacure2959、巯基乙酸和对甲苯磺酸按比例溶于二氯甲烷溶液中，回流反应5-8h，反应结束后通过柱层析分离得到目标修饰产物： HS-Irgacure2959。
作为本发明的优选技术方案，本发明还公开了一种用于SARS-CoV-2冠状病毒S蛋白检测的试剂盒，包括上述的纳米颗粒溶液，还包括第二检测溶液和第三检测溶液；所述第二检测溶液为光敏水凝胶；所述第三检测溶液为清洗液。
负载有新型冠状病毒S蛋白的中转载体进入纳米颗粒溶液后，通过抗原-抗体识别反应，能够使所述纳米颗粒溶液中的纳米颗粒载体结合在所述中转载体上，使足量的所述光敏催化剂在所述第二检测溶液中与所述光敏水凝胶在蓝光波段产生交联固化反应；从而判断新型冠状病毒的存在与否。
其中，所述试剂盒中，规定所述第二检测溶液为1mL。本申请中，各材料的用量均基于用于引发光敏胶凝反应的所述光敏催化剂的最低用量，在该反应中，引起胶凝反应的光敏催化剂最低浓度0.25％(g/mL),即0.0025g/mL，当所述第二检测溶液的规格为1mL时，至少需要所述光敏催化剂Irgacure 2959的质量为2.5mg，对应的摩尔量为0.01mmoL。
进一步具体的，所述光敏催化剂与所述聚合物B的摩尔比为8-16：1。所述Irgacure2959的质量范围为5～8mg。进一步优选的，所述光敏催化剂与所述聚合物B的摩尔比为8-10：1，这个比例下，可确保充足的所述光敏催化剂负载于所述纳米颗粒载体，确保咽拭子蘸取蛋白抗体溶液时能有足够量的所述光敏催化剂与凝胶发生交联固化反应。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤1中，所述溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、四氯甲烷、乙醇、甲醇、乙醚、戊烷、乙酸乙酯或环己烷中的任意一种。
作为本发明的优选技术方案，所述第二检测溶液中，光敏水凝胶为甲基丙烯酰化明胶。甲基丙烯酰化明胶(GelMA)为双键改性明胶，其可通过紫外及可见光在光引发剂作用下交联固化成胶。GelMA光固化水凝胶兼具天然和合成生物材料的特征，其具有适于细胞生长和分化的三维结构，具有优异的生物相容性和细胞反应特性。Irgacure 2959为一种蓝光引发剂，在蓝光(波长405nm) 作用下，Irgacure 2959可迅速吸收能量，产生自由基、阳离子等，从而引发光敏水凝胶固化。
具体的，所述第二检测溶液通过如下方式制备得到：
作为本发明的优选技术方案，所述的GelMA水凝胶溶液的浓度范围为5-30 mg/mL，在此浓度范围内GelMA水凝胶溶液能在光催化剂的作用下在蓝光(波长405nm)照射下固化。
作为本发明的优选技术方案，所述清洗液为超纯水或生理盐水。2mL剂量封装。
一种应用上述试剂盒的方法，具体包括如下步骤：
步骤1、将采样后的咽拭子插入所述纳米颗粒溶液中搅动3-5秒取出；
步骤2、将咽拭子从所述纳米颗粒溶液中取出后，插入第三检测溶液中充分搅动洗涤；
步骤3、将咽拭子从所述第三检测溶液中取出，插入第二检测溶液中，搅动 3-5秒后取出；
步骤4、手持蓝光光源，在405nm的波长下持续照射第二检测溶液10秒后，倒置第二检测溶液使瓶口向下倾斜，通过观察第二检测溶液是否发生凝固判断所述咽拭子上是否携带新型冠状病毒。
本发明所述的SARS-CoV-2冠状病毒S蛋白检测试剂盒，在使用时，先进行采样：取干净的咽拭子，浸入浓度大于0.1mmoL的SARS-CoV-2冠状病毒S 蛋白溶液中一厘米左右，使其拭子头完全浸没于溶液中后搅动5秒。
将采样后的咽拭子插入纳米颗粒溶液中，使其拭子头完全浸没于溶液，并用咽拭子搅动纳米颗粒溶液3-5秒，保证拭子头与溶液充分接触；然后将咽拭子从纳米颗粒溶液中取出，插入第三检测溶液使其拭子头完全浸没于溶液，搅动3-5秒进行充分洗涤；再将咽拭子从第三检测溶液中取出，插入第二检测溶液使其拭子头完全浸没于溶液，搅动3-5秒使其与溶液充分混匀后取出；使用 405nm的蓝光光源，在第二检测溶液与水平面保持垂直的前提下使光源贴近管壁，呈45°角度持续照射第二检测溶液10秒；倒置第二检测溶液使其瓶口朝下，瓶身与水平面呈45°，管内溶液是否凝固与是否含SARS-CoV-2冠状病毒Spike 蛋白相关，即若含有SARS-CoV-2冠状病毒Spike蛋白，管内溶液会在照射后由液态转变为固态，溶液液面不会产生倾斜，判为阳性；反之仍为液态，溶液可以流动，液面发生倾斜，判为阴性。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明提出一种新的用于检测是否存在新型冠状病毒的方式，利用抗原-抗体免疫识别反应、纳米颗粒载体及光敏催化反应三种性质，并通过构建纳米颗粒载体，分别将S蛋白克隆抗体与光敏催化剂共同负载在纳米颗粒载体上，利用新型冠状病毒S蛋白与S蛋白克隆抗体的特异识别反应，和光敏催化剂能引发光敏水凝胶发生凝胶固化的特性，将病毒识别信号转化和呈现为可见的理化现象，因为光敏催化剂发生固化的过程快速，且固化反应前后溶液状态明显。从而实现快速筛查和判断。更加易于操作，极大的提高了检测效率，减少了病毒传播的风险。
本发明提出的一种用于SARS-CoV-2冠状病毒S蛋白检测的试剂盒，操作简单，反应前后变化明显，在危急情况下，普通人群可自行按使用步骤操作，以自我排查是否感染新型冠状病毒，及时的做好防护，及时的采取防护方式，避免病毒的大量传播。
附图说明
：图1为本发明实施例中在蓝光手电筒照射下，第二检测溶液在检测含 SARS-CoV-2冠状病毒S蛋白溶液后固化，在检测不含SARS-CoV-2冠状病毒S 蛋白的空白对照溶液后仍为液体的对照图；
具体实施方式
材料选择：
光敏催化剂(Irgacure 2959)：2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，分子量：224.25；购自MERCK公司；货号410896；
S蛋白克隆抗体：购自正能生物，Human anti-SARS-CoV-2Spike RBD antibody(hFC)，货号S209906；
S蛋白病毒：购自ORIGENE公司，CAT号：TP701142；
mPEG-PCL：购自西安瑞禧生物科技有限公司，分子量2000Da；
Mal-PEG-PCL：购自西安瑞禧生物科技有限公司，分子量2000Da；
Hepes缓冲液：购自广州赛国生物科技有限公司，分子量238.31，配置为浓度5moL/L缓冲液，主要成分羟乙基哌嗪乙硫磺酸；
甲基丙烯酰化明胶：购自Engineering For Life公司；
本发明通过S蛋白抗原-S蛋白克隆抗体的特异性识别方式，将负载了光敏催化剂的纳米颗粒通过咽拭子从纳米颗粒溶液中移出，然后在第三检测溶液中清洗掉干扰性结合，再把该咽拭子插入第二检测溶液中，因为咽拭子上粘有足够的光敏催化剂，所以和第二检测溶液混合后，通过蓝光(波长405nm)作用下迅速吸收能量，产生自由基、阳离子等，从而引发光敏水凝胶固化。实现新冠病毒抗原的检测。
在本发明提供了一种SARS-CoV-2冠状病毒S蛋白检测试剂盒，包括纳米颗粒溶液、第二检测溶液和第三检测溶液，所述纳米颗粒溶液为纳米颗粒载体溶液，所述纳米颗粒载体上负载有S蛋白克隆抗体和光敏催化剂；所述第二检测溶液为光敏水凝胶溶液；负载有新型冠状病毒S蛋白的中转载体进入纳米颗粒溶液后，能够通过抗原-抗体特异性识别反应，使所述纳米颗粒溶液中的纳米颗粒载体结合在所述中转载体上，使所述光敏催化剂进入到所述第二检测溶液中与所述光敏水凝胶在蓝光波段产生交联固化反应；引发所述交联固化反应的所述光敏催化剂的最低浓度为0.0025(g/mL)。
具体的，该检测试剂盒还包括第三检测溶液，所述中转载体蘸取所述纳米颗粒溶液后，通过所述第三检测溶液清洗掉干扰性结合，再进入第二检测溶液中反应。
进一步的，所述纳米载体颗粒由聚合物A和聚合物B交联而成，所述聚合物A为甲氧基聚乙二醇-聚己内酯聚合物，所述聚合物B为马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯聚合物。其中，聚合物A和聚合物B均为两亲性共聚物，具有生物可降解性、生物相容性和两亲性，且能够在水溶液中自组装为纳米颗粒，是理想的纳米药物载体骨架材料。在该载体上通过偶联反应连接其他物质以实现物质递送已有一定的文献支撑。本申请基于骨架材料上的偶联反应、抗原抗体的特异识别以及光敏催化剂与光敏水凝胶的交联固化三个方面的性能，研发出一种快速进行新冠病毒检测的试剂盒。结果迅速，极大的提高了检测效率，且该试剂盒操作方便，简单，更适用于普通人员自行检查，能极大的降低医护人员的工作量。
聚合物A、聚合物B通过交联反应，使其形成纳米颗粒的同时还可以提供马来酰亚胺基团(Mal-基团)，为S蛋白抗体和光敏催化剂提供在所述纳米颗粒上负载的偶联位点。
更进一步的，本发明中采用的纳米颗粒经前期的探索实验，确定出所述聚合物A与所述聚合物B之间的质量比为1-5:9，经进一步的筛选确定，当聚合物 A与所述聚合物B之间的质量比在1-2:9时，具有较好的聚合效果。
进一步的，S蛋白克隆抗体和光敏催化剂均通过聚合物B上的Mal-基团实现偶联，由于引发交联固化反应的光敏催化剂的最低浓度为0.25(g/mL)，根据光敏催化剂的分子量能够算出其摩尔质量为0.01mmol，规定检测试剂盒中，所述第二检测溶液中含有1mL的光敏水凝胶，则需要至少2.5mg的所述光敏催化剂，为保证纳米颗粒上负载足够的光敏催化剂，一般投料过程中，优选的，所述光敏催化剂的质量控制在2.5mg-10mg左右。
所述光敏催化剂与聚合物B的摩尔比为1-2:1的关系，聚合物B可适当过量，以确保其上有充足的Mal-基团来进行光敏催化剂的偶联；由于S蛋白抗体也是通过与所述纳米颗粒载体上的Mal-基团进行偶联，所以S蛋白抗体与所述纳米颗粒载体的摩尔比为1-1.5：1。
具体的，在制备纳米颗粒溶液制备过程中，先进行S蛋白抗体的负载，然后再进行光敏催化剂的负载。
进一步的，所述光敏催化剂为Irgacure 2959，化学名称为2-羟基-2-甲基 -1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮；所述光敏催化剂在进行负载前，需要先进行修饰，修饰的过程即在其上进行巯基的连接，通过巯基可实现与Mal-基团的偶联。具体的，所述第二检测溶液中的光敏水凝胶为甲基丙烯酰化明胶，经筛选后最佳的浓度范围为5-30％(g/mL)。
下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。
实施例1纳米颗粒溶液的制备
1、纳米颗粒载体的制备
将聚合物A(mPEG-PCL)(分子量为4000Da，PEG-PCL＝2000Da-2000Da) 10mg和聚合物B(Mal-PEG-PCL)90mg进行混合，聚合物B(分子量为4000Da， PEG-PCL＝2000Da-2000Da)；将混合物用二氯甲烷进行溶解，然后置于旋转蒸发仪上以60℃旋蒸45min后成膜。所成的膜取出后溶解于去离子水中，然后在60℃水浴条件下震荡5min，得到MP-Mal阳离子聚合物纳米颗粒溶液，置于4℃冰箱保存备用。
2、S蛋白抗体-MP-Mal纳米颗粒的制备
取制备好的MP-Mal纳米颗粒共100mg，与SARS-CoV-2冠状病毒S蛋白抗体100mg溶解于Hepes缓冲液中，混匀后于4℃环境下过夜反应。反应结束后所得溶液即为S蛋白抗体-MP-Mal纳米粒水溶液，置于4℃冰箱保存备用。
3、蛋白抗体-MP-Irgacure 2959纳米粒的制备
首先，在氮气保护下，将光引发剂Irgacure 2959 1.12g(5mmoL)、巯基乙酸0.24mL(3.4mmoL)、对甲苯磺酸0.16g(0.83mmoL)溶于50mL二氯甲烷溶液中，加热回流，反应5h后停止反应，直接旋干反应溶剂，最后柱层析分离得到目标修饰产物(2-巯基乙酸2-(4-(2-羟基-2-甲基丙酰基)苯氧基)乙酯)，简称HS-Irgacure 2959。
将上述制备好的S蛋白抗体-MP-Mal纳米颗粒水溶液，按照S蛋白抗体 -MP-Mal纳米颗粒100mg与上述修饰产物HS-Irgacure 2959 6mg溶解于Hepes 缓冲液中，混匀后于4℃环境下过夜反应。反应结束后将上述混合溶液放入 2000Da分子量大小的透析袋中，透析液为蒸馏水，于4℃环境下过夜透析。透析后所得溶液为S蛋白抗体-MP-Irgacure 2959纳米粒水溶液，即得纳米颗粒溶液，置于4℃冰箱保存备用。
在制备纳米颗粒溶液的过程中，为保证携带病毒的咽拭子能够充分的结合纳米颗粒，发明人进行了如下探索性实验：
本实施例1中，系列的实验过程中，咽拭子蘸取新冠病毒的浓度为50μg/mL。固定光敏水凝胶的体积为1mL，浓度为25％(w/v)，根据光敏凝胶催化反应发生的条件，制备出不同浓度的纳米颗粒溶液。并控制每次蘸取的纳米颗粒溶液的体积固定。如下表1所示：
表1为不同光敏催化剂含量下的数据统计表
上述表1中，每组实施例中的数据为10次重复试验的数据值。其中，对照组为采用刚拆封的咽拭子直接插入纳米颗粒溶液中进行的实验。
从表1可以看出，实施例1-1至实施例1-5中，通过增加光敏催化剂的含量，能够保证在携带病毒的情况下，咽拭子从所述纳米颗粒溶液中带出来纳米颗粒能够在清洗液清洗掉干扰性的结合后，还能保证在光敏水凝胶中进行固化的最低的摩尔比为实施例1-3中的8:1，当超过8:1时，实验结果一样，故选择纳米颗粒溶液中，所述光敏催化剂和所述聚合物B之间的摩尔比为8:1。所述的干扰性结合具体指除了通过抗原抗体反应结合在咽拭子上的纳米粒以外的其他附着在咽拭子上的物质
进一步的，由于S蛋白克隆抗体与所述聚合物B之间的理论摩尔比为1：1， S蛋白克隆抗体与所述光敏催化剂之间为相互竞争关系，为保证S蛋白克隆抗体能成功的与Mal-基团偶联，通常会过量投料，为防止过量的S蛋白克隆抗体占据光敏催化剂的Mal-基团导致光敏催化剂的没有充分的在纳米颗粒上偶联，对S蛋白克隆抗体的偶联过程中的比例进行探索，具体如表2所示：
表2为不同S蛋白抗体含量的检测实验数据表
当S蛋白抗体/聚合物B的加料比例太小，例如1：12时，由于S蛋白抗体太少，纳米粒无法连接上足够的S蛋白抗体，从而导致没有足够的纳米粒被带入第二检测溶液，无法引起胶凝反应；当S蛋白抗体/聚合物B的加料比例太大，例如1：1时，S蛋白抗体会侵占绝大部分纳米粒连接位点，导致光敏催化剂无法连接到纳米粒上，从而导致没有足够的光敏催化剂被带入第二检测溶液，无法引起胶凝反应。综上，S蛋白克隆抗体与聚合物B的摩尔比范围为1:2～10。
实施例2第二检测溶液的制备
1、GelMA水凝胶基质的制备
称取10g Gelatin于100mL PBS中，60℃搅拌至溶解，用滴液漏斗将8mL 的MA(甲基丙烯酸酐)缓慢滴入Gelatin溶液中，在50℃条件下反应3h。用 40℃预热后的PBS将明胶溶液稀释5倍，终止反应。用12-14kD的透析袋在40℃、 300rmp条件下搅拌透析一周后再冻干一周，使之呈白色泡沫状，4℃保存。
2、GelMA水凝胶溶液的制备
取上述步骤制备得到的白色泡沫状GelMA用PBS溶解至浓度为25％(w/v) 后以每瓶1ml剂量分装后在4℃条件下密封避光保存。
根据光敏催化剂与光敏水凝胶的交联固化反应，通过单一变量法进行了所述光敏水凝胶的最佳浓度的探索，固定光敏催化剂的浓度为0.25％(w/v)，准备如下表1的梯度浓度的光敏水凝胶，然后在蓝光(405nm)光源的照射下，观察凝胶的变化。
表3不同浓度下的光敏水凝胶凝固的情况记录表
项目
2-1
2-2
2-3
2-4
2-5
光敏水凝胶浓度
1％
2.5％
5％
25％
30％
光敏引发剂浓度
0.25％
0.25％
0.25％
0.25％
0.25％
是否凝固
否
是
是
是
凝胶难溶解
凝固时间
/
15s
3s
3s
/
从表3中的各项记录可以看出，综合凝固时间和凝固情况，当光敏水凝胶的浓度在5-25％时，交联固化的情况最佳。后续的实施例，选取实施例2-4的 25％的光敏水凝胶进行检测试验。
实施例3第三检测溶液的制备
取121℃高温下灭菌40分钟后的MiliQ水，以每瓶2mL剂量分装后密封保存。
试验例1
1.首先配制SARS-CoV-2冠状病毒S蛋白溶液，使用时，取出咽拭子，去除包装后将咽拭子浸入浓度大于0.1mmoL的SARS-CoV-2冠状病毒S蛋白溶液中一厘米左右，使其拭子头完全浸没于溶液中后搅动5秒。
2.取出实施例几中的纳米颗粒溶液，将采样后咽拭子插入纳米颗粒溶液中使其拭子头完全浸没于溶液，并用咽拭子搅动检测试剂A 3-5秒，保证拭子头与溶液充分接触；
3.取出第三检测溶液，将咽拭子从纳米颗粒溶液中取出，插入第三检测溶液使其拭子头完全浸没于溶液，搅动3-5秒进行充分洗涤；
4.取出第二检测溶液，将咽拭子从第三检测溶液中取出，插入第二检测溶液使其拭子头完全浸没于溶液，搅动3-5秒使其与溶液充分混匀后取出；
5.取出405nm的蓝光光源，在第二检测溶液与水平面保持垂直的前提下使光源贴近管壁，呈45°角度持续照射第二检测溶液10秒；
6.倒置第二检测溶液使其瓶口朝下，瓶身与水平面呈45°，管内溶液是否凝固与是否含SARS-CoV-2冠状病毒Spike蛋白相关，即若含有SARS-CoV-2冠状病毒Spike蛋白，管内溶液会在照射后由液态转变为固态，溶液液面不会产生倾斜，判为阳性；反之仍为液态，溶液可以流动，液面发生倾斜，判为阴性。
试验例2
试验例2与试验例1的过程一致，其区别在于，将刚拆封的咽拭子直接插入纳米颗粒溶液，不携带SARS-CoV-2冠状病毒S蛋白。
试验例3
试验例3与试验例1的过程一致，其区别在于，先将300-500微升浓度为 50μg/mL的SARS-CoV-2冠状病毒S蛋白溶液与体积1mL的纳米颗粒溶液混合，然后取刚拆封的咽拭子插入纳米颗粒溶液中使其拭子头完全浸没于溶液，并用咽拭子搅动检测试剂A3-5秒，保证拭子头与溶液充分接触。
试验例1显示：光敏水凝胶溶液在蓝光照射后由液态转变为固态，溶液液面未产生倾斜；
试验例2显示：光敏水凝胶溶液在蓝光照射后5-10秒内仍表现为液态，溶液液面会产生倾斜；
试验例3显示：光敏水凝胶溶液在蓝光照射后5-10秒内仍表现为液态，溶液液面会产生倾斜；
试验例3表明被S蛋白抗体污染的纳米颗粒溶液通过干净的咽拭子浸没，然后洗涤后与光敏水凝胶溶液不发生交联固化反应，这证明咽拭子上结合的纳米颗粒溶液不足以引发光敏水凝胶溶液的固化，这也能证明，S蛋白病毒在咽拭子上结合的牢固程度，能保证其与纳米颗粒溶液混合后，不会从咽拭子上脱离，从而保证足量的光敏催化剂进行交联固化反应。证明该S蛋白病毒来自于咽拭子上，而非由于纳米颗粒溶液被污染造成误判。这表明，本发明的技术方案能够快速的对患者检测是否携带新冠病毒做出判断，且该结果的准确度较高。
图1为有SARS-CoV-2冠状病毒S蛋白和没有SARS-CoV-2冠状病毒S蛋白的检测结果对照图。如图1所示，左1为没有SARS-CoV-2冠状病毒S蛋白的检测结果，其中凝胶为流体状态，左2为携带有SARS-CoV-2冠状病毒S蛋白的第二检测溶液，翻转瓶身，凝胶仍不会发生倾斜。始终为凝固状态。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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