单步atps增强型lfa诊断设计
阅读说明：本技术 单步atps增强型lfa诊断设计 (Single step ATPS enhanced LFA diagnostic design ) 是由 D·T·卡梅 B·M·吴 G·L·莫斯利 Y·T·赵 D·Y·佩雷拉 C·M·吴 韩玥 于 2018-05-30 设计创作，主要内容包括：在各种实施方式中,提供了单步基于纸的ATPS的诊断测定法,其利用ATPS组分的依次再溶解的概念来引起纸内所需的相分离行为。在一个说明性实施方式中,提供了一种芯,其用于在纸中的双水相提取系统中浓缩分析物,其中,所述芯包括被构造成接收样品的纸,其中所述纸包括第一区域和第二区域,所述第一区域包含双水相系统(ATPS)的第一组分,其中所述第一组分为干燥状态,所述第二区域包含双水相系统(ATPS)的第二组分,其中所述第二组分为干燥状态；并且将所述第一区域和第二区域布置成使得当所述吸液芯与流体样品接触时,所述ATPS的第一组分在第二组分之前水化。在某些实施方式中,第一组分和第二组分布置为使得它们基本上同时水化。(In various embodiments, a single-step paper-based ATPS diagnostic assay is provided that utilizes the concept of sequential resolubilization of ATPS components to induce the desired phase separation behavior within the paper. In one illustrative embodiment, a cartridge is provided for concentrating an analyte in an aqueous two-phase extraction system in paper, wherein the cartridge comprises paper configured to receive a sample, wherein the paper comprises a first region comprising a first component of an aqueous two-phase system (ATPS), wherein the first component is in a dry state, and a second region comprising a second component of the aqueous two-phase system (ATPS), wherein the second component is in a dry state; and arranging the first and second regions such that when the wick is contacted with a fluid sample, the first component of the ATPS hydrates before the second component. In certain embodiments, the first component and the second component are disposed such that they are hydrated substantially simultaneously.)
相关申请的交叉引用
技术领域
本申请要求2017年5月31日提交的USSN62/513,347的权益和优先权，将其整体上通过援引并入本文以用于所有目的。
政府支持的声明
本发明是在美国国家科学基金会政府支持下完成的，授权号1549003。政府拥有本发明的某些权利。
背景技术
传染病如衣原体和HIV大大地影响了发达国家和发展中国家。衣原体感染是由沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)细菌引起的性传播感染(STI)，如果不进行治疗，可能导致妇女的***性疾病和引起生殖系统永久损坏(Hafner(2015)Contraception,92:108-115)。自1993年以来，衣原体的患病率在美国一直稳步上升，在2014年的报告的新的衣原体感染已超过140万例(Centers for Disease Control and Prevention(2014)Sexually Transmitted Disease Surveillance 2014:1-176)。虽然衣原体相对直接地治疗，没有显示出对主要药物治疗选择产生抗性的迹象(Krupp&Madhivanan(2015)Indian JSex Transm Dis 36：3-8)，但它仍是美国最常见的STI之一(Centers for DiseaseControl and Prevention(2014)Sexually Transmitted Disease Surveillance 2014:1-176)。另一方面，HIV是由人类免疫缺陷病毒引起的，该病毒攻击人体的免疫系统，特别是CD4细胞。仅在2015年，全世界大约有210万新的HIV病例，在美国大约有39,513人被诊断出患有HIV(CDC(2015)HIV Surveill.Rep.27:1-82)。解决衣原体感染和艾滋病毒发病率日益增加的一种方法是通过对危险人群进行低成本的现场(POC)筛查，这个理论模型(Huang etal.(2013)Sex Transm.Infect.89:108-114.doi:10.1136/sextrans-2011-050355；Miller(1998)Sex.Transm.Infect.25:201-211)和孤立的试验研究(Mahilum-Tapay et al.(2007)BMJ,335:1190-1194；Low et al.(2006)Lancet,368:2001-2016)已显示出令人鼓舞的结果。
不幸的是，当前基于金标准实验室的诊断方法(例如ELISA测试、核酸扩增测试(NAAT)或细胞培养方法)都不适用于POC筛查。这是由于设备成本高，需要训练有素的人员以及需要较长的时间得到结果。相反，基于纸的诊断是更合适的技术，具有效进行大规模筛查所需的两个组件：同一就诊时的现场诊断和治疗，以及未经培训或受过最少培训的人员的管理。最常用的纸诊断方法是侧流测定技术(LFA)，这是一种用视觉阐释的基于抗体的诊断方法，因其在妊娠试验中的广泛应用而得到认可(Wong&Tse(2009)Lateral FlowImmunoassay,1st ed.Springer,New York)。不幸的是，衣原体LFA检测目前还不够灵敏，无法有效地诊断(Land et al.(2009)Hum.Reprod.Update,16:189-204),这是大多数传基于纸的传染病诊断所遇到的局限(Gubala et al.(2012)Anal.Chem.84:487-515)。尽管HIVLFA检测在消费者市场上比衣原体LFA检测更成熟，但仍有提高其灵敏度的余地，以进一步降低假阴性和病毒潜在传播的风险。
近年来，为提高基于纸的测定的灵敏度而做出了巨大的努力。一些关键的创新包括Yager实验室使用二维纸网络的工作(Fu et al.(2010)Sensors Actuators,BChem.149:325-328；Fu et al.(2010)Lab Chip,10:918-920.；Osborn et al.(2010)LabChip,10:2659-2565；Fu et al.(2011)Microfluid Nanofluidics,10:29-35；Kauffman etal.(2010)Lab Chip,10:2614-2617；Fridley et al.(2012)Lab Chip,12:4321；Fu et al.(2012)Anal.Chem.84:4574-4579；Lutz et al.(2013)Lab Chip,13:2840-2847)和Whitesides实验室的基于纸的微流体分析设备(Mosadegh et al.(2015)Biomaterials,52:262–271；Thuo et al.(2014)Chem.Mater.26:4230-4237；Lan et al.(2014)Anal.Chem.86:9548-9553；Badu-Tawiah et al.(2014)Lab Chip,15:655-659)。以前，我们的实验室开发了一种无需设备的方法，以用于在把靶标分析物施加到LFA测试之前对其进行热力学预浓缩。简而言之，这是通过利用双水相系统(ATPS)来完成的，其分为两个不同的液相，其中靶标分析物彻底地分配在两相之一，有效地浓缩了靶标。在第一种方法中，我们的三步诊断过程涉及(i)将大量靶标溶液与ATPS组分混合，(ii)等待宏观相分离，以及(iii)提取浓缩的靶标相并将其施加到LFA测试上。使用这种方法，我们证明了对大病毒(Jue et al.(2014)Biotechnol.Bioeng.111:2499-2507；Mashayekhi et al.(2010)Anal.Bioanal.Chem.398:2955-2961)和小蛋白靶标(Mashayekhi et al.(2012)Anal.Bioanal.Chem.404:2057-2066；Chiu et al.(2014)Ann.Biomed.Eng.42(11):2322–2332)的检出限都有所改善。最近，我们发现当ATPS流动通过纸时，相分离过程得到了加速，通过省略掉等待和提取步骤，将总诊断时间从数小时减少到数分钟。利用这种现象，我们的实验室证明了同时浓缩和检测纸中蛋白质生物标志物的能力(Chiu et al.(2014)LabChip,14:3021-3028；Pereira et al.(2015)Anal.Chim.Acta.882:83-89)。该诊断过程仍然需要在将溶液施加到LFA测试条之前进行ATPS组分混合步骤，这可能适合于本来就需要混合到预定缓冲液中的应用(例如，基于拭子的诊断)。
发明内容
在各种实施方式中，本文描述了单步ATPS纸基诊断测定法，其基于依次再溶解ATPS组分的新概念，以在纸内产生所需的相分离行为。
本文设想的各种实施方式可以包括但不必限于以下实施方式中的一个或多个：
实施方式1：一种用于在纸的双水相提取系统中浓缩分析物的芯，所述芯包含：
配置为接收样品的纸，其中所述纸包括：
第一区域，其含有双水相系统(ATPS)的第一组分，其中所述第一组分为干燥状态；和
第二区域，其含有双水相系统(ATPS)的第二组分，其中所述第二组分为干燥状态；
其中所述第一区域和所述第二区域布置成使得当所述芯与流体样品接触时，所述ATPS的所述第一组分在所述第二组分之前水化；或其中所述纸包括：
既包含双水相系统(ATPS)的第一组分又包含双水相系统的第二组分的区域，其中所述第一组分和所述第二组分为干燥状态，使得当所述芯与流体样品接触时，所述ATPS的所述第一组分和所述ATPS的所述第二组分基本上同时水化。
实施方式2：根据实施方式1所述的芯，其中，所述纸包含：
第一区域，其含有双水相系统(ATPS)的第一组分，其中所述第一组分为干燥状态；和
第二区域，其含有双水相系统(ATPS)的第二组分，其中所述第二组分为干燥状态；和
其中所述第一区域和所述第二区域布置成使得当所述芯与流体样品接触时，所述ATPS的所述第一组分在所述第二组分之前水化。
实施方式3：根据实施方式1-2中任一项所述的芯，其中所述芯配置为使得所述ATPS的第一组分在水化时流入所述ATPS的所述第二组分中，从而使所述第二组分水化以提供混合相，当ATPS移动通过所述芯时，该混合相分离成包含所述第一组分的第一相和包括所述第二组分的第二相。
实施方式4：根据实施方式1-3中任一项所述的芯，其中所述第一组分和所述第二组分是聚合物/盐ATPS的组分，其中所述第一组分包含盐并且所述第二组分包含聚合物。
实施方式5：根据实施方式4所述的芯，其中所述盐包含一种或多种选自由下述组成的组中的盐：磷酸钾、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵、柠檬酸钠、氯化镁、柠檬酸镁、磷酸镁、氯化钠、柠檬酸钾和碳酸钾。
实施方式6：根据实施方式5所述的芯，其中，所述盐包含磷酸钾。
实施方式7：根据实施方式4-6中任一项所述的芯，其中所述盐的范围为约0.1％w/w至约40％w/w，或约1％w/w至最多约30％w/w，或从约5％w/w至最多约25％w/w，或从约10％w/w至最多约20％w/w。
实施方式8：根据实施方式7所述的芯，其中所述盐以约15％(w/w)存在。
实施方式9：根据实施方式4-8中任一项所述的芯，其中所述聚合物包含选自由下述组成的组中的聚合物：聚乙二醇(PEG)、乙烯/丙烯共聚物(例如UCONTM 50-HB)、丙二醇(PPG)、甲氧基聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮。
实施方式10：根据实施方式9所述的芯，其中，所述聚合物包括聚乙二醇(PEG)。
实施方式11：根据实施方式10所述的芯，其中所述PEG的分子量为约1,000至约100,000，或约4,000至约50,000，或约5,000至最多约40,000，或至多约30,000，或至多约20,000。
实施方式12：根据实施方式11所述的芯，其中，所述聚合物包括聚乙二醇(PEG)8000MW。
实施方式13：根据实施方式4-12中任一项所述的芯，其中所述聚合物包含约1％w/w至约30％w/w，或约5％w/w至最多约25％w/w，或约10％w/w至最多约25％w/w，或约10％w/w至最多约20％w/w的聚合物。
实施方式14：根据实施方式13所述的芯，其中所述聚合物占约10％(w/w)。
实施方式15：根据实施方式1-14中任一项所述的芯，其中所述纸包含选自由下述组成的组中的材料：纤维素、玻璃纤维、硝酸纤维素、聚偏二氟乙烯、尼龙、电荷改性尼龙、聚醚砜、聚四氟乙烯(PTFE)及其组合。
实施方式16：根据实施方式15所述的芯，其中，所述纸包含玻璃纤维。
实施方式17：根据实施方式1-16中任一项所述的芯，其中，所述芯包含多层所述纸。
实施方式18：根据实施方式17所述的芯，其中所述芯包含至少3层，或至少4层，或至少5层，或至少6层，或至少7层，或至少8层，或至少9层、或至少10层，或至少15层或至少20层所述纸。
实施方式19：根据实施方式17所述的芯，其中，所述芯包含约5层的所述纸。
实施方式20：根据实施方式1-19中任一项所述的芯，其中在所述第一区域和所述第二区域之间设置有无ATPS组分的区域。
实施方式21：根据实施方式1-19中任一项所述的芯，其中，所述第一区域邻近于所述第二区域设置。
实施方式22：根据实施方式1-21中任一项所述的芯，其中所述芯包括样品施加区。
实施方式23：根据实施方式22所述的芯，其中，所述样品施加区域包括样品垫。
实施方式24：根据实施方式1-23中任一项所述的芯，其中当LFA与所述芯流体连通时，所述芯在所述第二区域下游和侧流测定器(LFA)上游的区域中逐渐变细。
实施方式25：根据实施方式1-24中任一项所述的芯，其中所述芯被配置为联接至侧流测定器(LFA)，并提供从所述芯到所述LFA的流体连通。
实施方式26：根据实施方式25所述的芯，其中，所述芯被配置为联接至LFA，使得芯的平面垂直于所述LFA的平面。
实施方式27：根据实施方式25所述的芯，其中，所述芯被配置为联接至LFA，使得芯的平面平行于所述LFA的平面。
实施方式28：根据实施方式25所述的芯，其中，所述芯联接至侧流免疫测定技术。
实施方式29：根据实施方式28所述的芯，其中，所述芯联接至LFA，使得所述芯的平面平行于所述LFA的平面。
实施方式30：根据实施方式28所述的芯，其中，所述芯连接至LFA，使得所述芯的平面垂直于所述LFA的平面。
实施方式31：根据实施方式28-30中任一项所述的芯，其中所述侧流测定器包括：
LFA纸，该LFA纸包括：
缀合区，所述缀合区含有包含指示剂部分的缀合物，所述指示剂部分连接至与待检测的分析物结合的结合部分；或所述缀合区被配置为接收与待检测的分析物复合的纳米缀合物；
吸收区；和
检测区，所述检测区包含捕获分析物/纳米缀合物复合物的部分。
实施方式32：根据实施方式31所述的芯，其中，所述检测区包括检测线。
实施方式33：根据实施方式31-32中任一项所述的芯，其中所述LFA包括对照区，所述对照区包含捕获分析物/纳米缀合物复合物的部分和不存在所述分析物的所述纳米缀合物。
实施方式34：根据实施方式31-33中的任一项所述的芯，其中，所述对照区包括对照线。
实施方式35：根据实施方式31-34中任一项所述的芯，其中所述缀合区包括缀合垫。
实施方式36：根据实施方式31-35中任一项所述的芯，其中，所述吸收区包括吸收垫。
实施方式37：根据实施方式31-36中任一项所述的芯，其中所述LFA纸的材料与包括所述芯的纸是相同的。
实施方式38：根据实施方式31-37中任一项所述的芯，其中所述LFA纸的材料与包括所述芯的纸是不同的。
实施方式39：根据实施方式31-38中任一项所述的芯，其中所述LFA纸选自由下述组成的组的材料：纤维素、玻璃纤维、硝酸纤维素、聚偏二氟乙烯、尼龙、电荷改性尼龙、聚醚砜、聚四氟乙烯(PTFE)、聚酯及其组合。
实施方式40：根据实施方式39所述的芯，其中所述LFA纸包含硝酸纤维素。
实施方式41：根据实施方式39所述的芯，其中所述LFA纸包含玻璃纤维。
实施方式42：根据实施方式22-23或31-41中任一项所述的芯，其中所述芯的样品施加区或所述LFA的缀合区包含纳米缀合物，所述纳米缀合物包含与分析物结合部分连接的指示剂部分，该分析物结合部分与待检测的分析物结合。
实施方式43：根据实施方式42所述的芯，其中所述分析物结合部分选自由下述组成的组：抗体、凝集素、蛋白质、糖蛋白、核酸、单体核酸、聚合核酸、适体、适体酶、小分子、聚合物、凝集素、碳水化合物、多糖、糖和脂质。
实施方式44：根据实施方式43所述的芯，其中所述分析物结合部分包含与所述分析物结合的抗体。
实施方式45：根据实施方式42-44中任一项所述的芯，其中所述指示剂包含选自由下述组成的组中的部分：比色指示剂，荧光指示剂和可被包含比色指示剂或荧光指示剂的构建体结合的部分。
实施方式46：根据实施方式42-45中任一项所述的芯，其中，所述指示剂包含选自由下述组成的组中的材料：合成聚合物、金属、矿物、玻璃、石英、陶瓷、生物聚合物、塑料及其组合。
实施方式47：根据实施方式42-46中任一项所述的芯，其中所述指示剂包括比色指示剂。
实施方式48：根据实施方式47所述的芯，其中所述指示剂包含金纳米颗粒
实施方式49：一种用于检测分析物的系统，所述系统包括：
容器，其包含干燥的纳米缀合物，所述纳米缀合物包含示剂部分，所述指示剂部分连接至与所述分析物结合的分析物结合部分；和
包含第一纸的设备，该第一纸含有双水相系统的组分，其中所述第一纸与侧流测定器(LFA)流体连通，并且其中所述第一纸包含：
第一区域，其含有双水相系统(ATPS)的第一组分，其中所述第一组分为干燥状态；和
第二区域，其含有双水相系统(ATPS)的第二组分，其中所述第二组分为干燥状态；其中：
所述第一区域和所述第二区域布置成使得当所述芯与流体样品接触时，所述ATPS的所述第一组分在所述第二组分之前水化；或
所述第一区域和所述第二区域是相同区域，并且所述第一组分和第二组分各自分布在基本上相同的区域上。
实施方式50：根据实施方式49所述的系统，其中，所述第一区域和所述第二区域是相同区域，并且所述第一组分和第二组分各自分布在基本上相同的区域上。
实施方式51：根据实施案49-50中任一项所述的系统，其中所述第一组分和所述第二组分是聚合物/盐ATPS的组分，其中所述第一组分包含盐并且所述第二组分包含聚合物。
实施方式52：实施方式51所述的系统，其中所述盐包含一种或多种选自由下述组成的组中的盐：磷酸钾、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵、柠檬酸钠、氯化镁、柠檬酸镁、磷酸镁、氯化钠的盐、柠檬酸钾和碳酸钾。
实施方式53：实施方式52所述的系统，其中所述盐包含磷酸钾。
实施方式54：根据实施方式51-53中任一项所述的系统，其中所述聚合物包含选自由下述组成的组中的聚合物：聚乙二醇(PEG)、乙烯/丙烯共聚物(例如UCONTM50-HB)、丙二醇(PPG)的聚合物、甲氧基聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮。
实施方式55：实施方式54所述的系统，其中所述聚合物包含乙烯/丙烯共聚物(例如，UCONTM 50-HB)。
实施方式56：根据实施方式49-55中任一项所述的系统，其中所述第一纸包含由下述组成的组中的材料：纤维素、玻璃纤维、硝酸纤维素、聚偏二氟乙烯、尼龙、电荷改性尼龙、聚醚砜、聚四氟乙烯(PTFE)、聚酯及其组合。
实施方式57：根据实施方式56所述的系统，其中所述第一纸包含玻璃纤维。
实施方式58：根据实施方式49-57中任一项所述的系统，其中所述第一纸包含单层的所述纸。
实施方式59：根据实施方式49-57中任一项所述的系统，其中所述第一纸包含多个层的所述纸。
实施方式60：根据实施方式59所述的系统，其中，所述第一纸包括至少3层，或至少4层，或至少5层，或至少6层，或至少7层，或至少8层，或至少9层，或至少10层，或至少15层，或至少20层所述纸。
实施方式61：根据实施方式49-60中任一项所述的系统，其中在所述第一纸和所述侧流测定器之间设置有间隔物，其中所述间隔物在所述第一纸和所述侧流测定器之间提供流体连通。
实施方式62：实施方式61所述的系统，其中所述间隔物经处理以减少分析物和/或纳米缀合物和/或纳米缀合物/分析物复合物的非特异性结合。
实施方式63：实施方式62所述的系统，其中所述间隔物经BSA处理。
实施方式64：根据实施方式62-63中任一项所述的系统，其中所述间隔物包含选自由下述组成的组中的材料：纤维素、玻璃纤维、硝酸纤维素、聚偏二氟乙烯、尼龙、电荷改性尼龙、聚醚砜的材料、聚四氟乙烯(PTFE)、聚酯及其组合。
实施方式65：根据实施方式64所述的系统，其中所述间隔物纸包含玻璃纤维。
实施方式66：根据实施方式49-60中任一项所述的系统，其中所述纸邻近于侧流测定器设置。
实施方式67：根据实施方式49-66中任一项所述的系统，其中，所述侧流测定器包括：
LFA纸，该LFA纸包括：
吸收区；和
检测区，所述检测区包含捕获分析物/纳米缀合物复合物的部分。
实施方式68：根据实施方式67所述的系统，其中，所述检测区包括检测线。
实施方式69：根据实施方式67-68中任一项所述的系统，其中所述LFA包括对照区，所述对照区包含捕获分析物/纳米缀合物复合物的部分，和不存在所述分析物的所述纳米缀合物。
实施方式70：根据实施方式69所述的系统，其中所述对照区包括对照线。
实施方式71：根据实施方式67-70中任一项所述的系统，其中所述吸收区包括吸收垫。
实施方式72：根据实施方式67-71中任一项所述的系统，其中所述LFA纸的材料与所述第一纸是相同的。
实施方式73：根据实施方式67-71中任一项所述的系统，其中所述LFA纸的材料与所述第一纸是不同的。
实施方式74：根据实施方式67-73中任一项所述的系统，其中所述LFA纸的材料包含选自由下述组成的组中的材料：纤维素、玻璃纤维、硝酸纤维素、聚偏二氟乙烯、尼龙、电荷改性尼龙、聚醚砜、聚四氟乙烯(PTFE)、聚酯及其组合。
实施方式75：实施方式74所述的系统，其中所述LFA纸包含硝酸纤维素。
实施方式76：根据实施方式49-75中任一项所述的系统，其中分析物结合部分选自由下述组成的组：抗体、凝集素、蛋白质、糖蛋白、核酸、单体核酸、聚合核酸、适体、适体酶、小分子、聚合物、凝集素、碳水化合物、多糖、糖和脂质。
实施方式77：实施方式76所述的系统，其中所述分析物结合部分包含与所述分析物结合的抗体。
实施方式78：根据实施方式76-77中任一项所述的系统，其中所述指示剂包含选自由下述组成的组中的部分：比色指示剂，荧光指示剂和能够被包含比色指示剂或荧光指示剂的构建体结合的部分。
实施方式79：根据实施方式76-78中任一项所述的系统，其中，所述指示剂包含选自由下述组成的组中的材料：合成聚合物、金属、矿物、玻璃、石英、陶瓷、生物聚合物、塑料及其组合。
实施方式80：根据实施方式76-79中任一项所述的系统，其中所述指示剂包含比色指示剂。
实施方式81：实施方式80所述的系统，其中所述指示剂包含金纳米颗粒。
实施方式82：一种检测和/或定量样品中的分析物的方法，所述方法包括：
提供包含所述样品的水溶液或悬浮液；和
将所述溶液施加至实施方式1-48中任一项所述的芯，其中随着所述溶液移动通过所述芯，所述溶液依次使所述第一组分和所述第二组分水化，并且使所述分析物分配到所述ATPS的相中；
将所述ATPS递送至所述侧流测定器中；和
如果存在所述分析物，则在所述侧流测定器中检测出和/或定量所述分析物。
实施方式83：实施方式82所述的方法，其中所述递送包括使根据实施方式1-30中任一项所述的芯与所述侧流测定器的样品接收区接触。
实施方式84：根据实施方式82所述的方法，其中，所述芯与所述芯流体连通，并且所述ATPS流入所述LFA。
实施方式85：根据实施方式84所述的方法，其中，所述芯是实施方式28-48中任一项的芯。
实施方式86：一种检测和/或定量样品中的分析物的方法，所述方法包括：
提供实施方式49-81中任一项的系统；
将所述样品引入到含有干燥的纳米缀合物的容器中，以水化所述纳米缀合物并使所述纳米缀合物与所述样品接触，其中当在所述样品中存在所述分析物时，所述纳米缀合物形成纳米缀合物/分析物复合物；
接触所述设备的包含双水相系统的所述组分的区域，并使所述组分水化，其中所述水化的组分流过所述侧流测定器；和
如果存在所述分析物，则在所述侧流测定器检测出和/或定量所述分析物。
实施方式87：根据实施方式82-86中任一项所述的方法，其中在施加到所述设备之前所述样品未经处理。
实施方式88：根据实施方式82-86中任一项所述的方法，其中在施加到所述设备之前稀释所述样品。
实施方式89：实施方式88所述的方法，其中所述样品用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释。
实施方式90：根据实施方式82-89中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
实施方式91：根据实施方式82-89中任一项所述的方法，其中所述受试者是非人哺乳动物。
实施方式92：根据实施方式82-91中任一项所述的方法，其中所述样品选自由下述组成的组：生物样品(例如，口腔液或组织样品、鼻液、尿液、血液或血液级分、脑脊髓液、淋巴、组织活检、***样品等)、食物样品和环境样品。
实施方式93：根据实施方式82-92中任一项所述的方法，其中所述分析物包含细菌、真菌、原生动物、病毒或其组分。
实施方式94：根据实施方式82-92中任一项所述的方法，其中所述分析物包括感染的标志物。
实施方式95：实施方式94所述的方法，其中所述标志物包含针对感染性病原体的抗体(例如抗HIV抗体)。
实施方式96：一种试剂盒，其包含：
容纳实施方式1-48中任一项所述的芯的容器；和/或
容纳实施方式49-82中任一项所述的系统的容器和/或设备的容器。
定义
术语“多肽”，“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。
本文中的术语“核酸”或“寡核苷酸”或语法等同物是指至少两个共价连接在一起的核苷酸。本发明的核酸优选地是单链或双链的，并且通常将含有磷酸二酯键，尽管在某些情况下，如下所述，包括具有类似主链的核酸类似物，包括例如磷酰胺(Beaucage et al.(1993)Tetrahedron 49(10):1925)和其中的参考；Letsinger(1970)J.Org.Chem.35:3800；Sprinzl et al.(1977)Eur.J.Biochem.81:579；Letsinger et al.(1986)Nucl.AcidsRes.14:3487；Sawai et al.(1984)Chem.Lett.805,Letsinger et al.(1988)J.Am.Chem.Soc.110:4470；和Pauwels et al.(1986)Chemica Scripta 26:1419),硫代磷酸酯(Mag et al.(1991)Nucleic Acids Res.19:1437；和美国专利号5,644,048),二硫代磷酸酯(Briu et al.(1989)J.Am.Chem.Soc.111:2321),O-甲基亚磷酰胺键(见Eckstein,Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,Oxford University Press),和肽核酸主链和连接(见Egholm(1992)J.Am.Chem.Soc.114:1895；Meier et al.(1992)Chem.Int.Ed.Engl.31:1008；Nielsen(1993)Nature,365:566；Carlsson et al.(1996)Nature 380:207)。其他类似核酸包括具有正骨架(Denpcy et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6097；非离子主链(美国专利号5,386,023,5,637,684,5,602,240,5,216,141和4,469,863；Angew.(1991)Chem.Intl.Ed.English 30:423；Letsinger et al.(1988)J.Am.Chem.Soc.110:4470；Letsinger et al.(1994)Nucleoside&Nucleotide13:1597；Chapters 2and 3,ASC Symposium Series 580,"Carbohydrate Modifications in Antisense Research",Ed.Y.S.Sanghui和P.Dan Cook；Mesmaeker et al.(1994),Bioorganic&Medicinal Chem.Lett.4:395；Jeffs et al.(1994)J.Biomolecular NMR 34:17；Tetrahedron Lett.37:743(1996))和非核糖主链的核酸，包括美国专利号5,235,033和5,034,506中所述的那些以及ASC研讨会系列580第6和7章Carbohydrate Modifications in Antisense Research,Ed.Y.S.Sanghui and P.DanCook.包含一种或多种碳环糖的核酸也包括在核酸定义内(见Jenkins et al.(1995),Chem.Soc.Rev.pp169-176)。在Rawls,C&E News 1997年6月2日第35页中描述了几种核酸类似物。可以进行核糖-磷酸主链的这些修饰，以促进添加另外的部分，例如标记，或增加此类分子在生理环境中的稳定性和半衰期。另外，本发明的核酸也可以是三链的。
如本文所用，“抗体”是指由基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的一种或多种多肽组成的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，其进而定义了免疫球蛋白类别，分别为IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。
已知典型的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N末端定义了约100至110或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别是指这些轻链和重链。
抗体以完整的免疫球蛋白形式存在，或以各种肽酶消化产生的许多特征明确的片段形式存在。因此，例如，胃蛋白酶消化铰链区中二硫键下方的抗体以产生F(ab)'2，F(ab)'2是Fab的二聚体，其本身是通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。F(ab)'2可以在温和的条件下还原以破坏铰链区中的二硫键，从而将(Fab')2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体本质上是具有部分铰链区的Fab(见Fundamental Immunology,W.E.Paul,ed.,Raven Press,N.Y.(1993),for a more detailed description of other antibody fragments)。尽管就完整抗体的消化而言定义了各种抗体片段，但是本领域技术人员将理解，可以通过化学或利用重组DNA方法从头合成此类Fab'片段。因此，如本文所用，术语抗体还包括通过修饰完整抗体或使用重组DNA方法从头合成的抗体片段。优选的抗体包括单链抗体(作为单条多肽链存在的抗体)，更优选单链Fv抗体(sFv或scFv)，其中可变重链和可变轻链(直接或通过肽接头)连接在一起而形成连续的多肽。单链Fv抗体是共价连接的VH-VL异二聚体，其可以由包含直接连接或通过肽编码接头连接的VH-和VL-编码序列的核酸表达(Huston,et al.(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883)。尽管VH和VL作为一条多肽链相互连接，但VH和VL结构域非共价结合。首先要在丝状噬菌体表面表达的功能性抗体分子是单链Fv's(scFv)，但是，其他表达策略也很成功。例如，如果链中的一条(重链或轻链)与g3衣壳蛋白融合，并且互补链以可溶性分子的形式输出到周质，则Fab分子可在噬菌体上展示。两条链可以在相同或不同的复制子上编码；重要的一点是，每个Fab分子中的两条抗体链都在翻译后组装，并且二聚体通过一条链与例如g3p的连接而引入到噬菌体颗粒中(见,例如,美国专利号5,733,743)。scFv抗体和许多其他结构将天然聚集但化学分离的轻和重多肽链从抗体V区转换为折叠成三维结构的分子，该三维结构与本领域技术人员已知的抗原结合位点的结构基本相似(见,例如,美国专利号5,091,513,5,132,405和4,956,778)。特别优选的抗体应包括所有已在噬菌体上展示的抗体(例如，scFv、Fv、Fab和二硫键连接的Fv(Reiter et al.(1995)Protein Eng.8:1323-1331)。
适体是由核酸形成的抗体类似物。适体酶是一种酶类似物，由核酸形成。特别地，仅在第二种特定分析物的存在下，适体才可以起到改变构型以捕获特定分子的作用。适体甚至可能不需要在某些检测中检测到第一个标记的结合，例如nano-CHEM-FET，在该检测中可以直接检测到重组。
术语“结合部分”或“结合对”的成员是指特异性结合其他分子、细胞，微生物等以形成结合复合物的分子，复合物例如抗体-抗原，凝集素-碳水化合物，核酸-核酸、生物素-亲和素等。此类结合部分包括但不限于单体或聚合核酸、适体、适体酶、蛋白质、多糖、糖、凝集素等(参见例如,Haugland,"Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals"(Sixth Edition))，以及任何能够形成如上所述的结合对的分子。
短语“特异性结合”表示该分子优先结合感兴趣的靶标或与该靶标(分析物)的亲和力大于与其他分子的亲和力。例如，抗体将选择性结合其所针对的抗原。在严格条件下，DNA分子将结合基本互补的序列，而不结合无关序列。特异性结合可以指确定在异质分子群(例如，蛋白质和其他生物制剂)中靶标的存在的结合反应。因此，在指定的条件下(例如在抗体的情况下为免疫测定条件或在核酸的情况下为严格杂交条件)，特异性配体或抗体与其特定的“靶标”分子结合，并且不大量结合样品中存在的其他分子。
术语有机小分子是指分子大小可与药物中通常使用的有机分子相比的分子。该术语不包括生物大分子(例如蛋白质，核酸等)。优选的有机小分子的尺寸范围为至多约5000Da，更优选至多2000Da，最优选至多约1000Da。
术语“分析物”是指待检测的任何部分。分析物包括但不限于特定的生物分子(蛋白质、抗体、核酸)、细菌或其组分、病毒或其组分(例如衣壳蛋白)、真菌或其组分、原生动物或其组分、药物、毒素、食品病原体，等等。
本文所用的术语“纸”并不限于由木浆或其他纤维状植物物质制成的薄片，尽管在某些实施方式中，可以设想在本文所述的设备中使用此类纸。纸更通常是指通常为片状的多孔材料，但不限于此，其允许流体流过。
附图说明
图1显示了典型的侧流免疫测定测试条(上图)和夹心形式的侧流免疫测定(下图)的示意图。
图2说明了PEG/盐ATPS组分的再水化顺序。当PEG和磷酸钾在单独的区域中再水化以及它们作为混合物再水化时，在ARROW设计的单张纸内相分离的随时间可视化。显示了发生相分离的下游区域的特写图像，因此，第一张图像位于t＝6秒而不是t＝0。通过使BSA-DGNP和亮蓝染料的悬浮液流动来实现富PEG相、贫PEG相和宏观混合域区域的可视化和鉴定。
图3说明了UCON/盐ATPS组分的再水化顺序。当UCONTM-50-HB-5100和磷酸钾在单独的区域中再水化以及它们作为混合物再水化时，单个玻璃纤维条内相分离的随时间可视化。将图像裁切为包含玻璃纤维条的相同区域，以观察相对流速。通过使BSA-GNP和亮蓝染料的悬浮液流动来实现富UCON相、贫UCON相和宏观混合域区域的可视化和鉴定。
图4(a-b图)显示了相分离的动力学过程。图a)拍摄了在流体流动过程中，具有单独的两相组分的ARROW的随时间图像。液体由BSA-DGNP和亮蓝染料的悬浮液组成，其允许观察相分离。图b)拍摄了在通过BSA-GNP和亮蓝染料的悬浮液再水化的过程中的混合UCON/盐设计的随时间图像。
图5A和5B示出了ARROW和LFA整合诊断设计布局的一个实施方式。图5A示出了ARROW和LFA整合诊断(注意，在某些实施方式中，玻璃纤维可以用其他材料代替)。图5B是ARROW和LFA整合诊断设计布局，并且包括在玻璃纤维上的脱水PEG、空白玻璃纤维和在玻璃纤维上的脱水磷酸钾的ARROW和SEM图像。在所示的实施方式中，玻璃纤维纸的顶部和底部尖端也是空白玻璃纤维。
图6示出了TUBE和LFA整合设计的一个实施方式，其包括含有干燥的GNP缀合物的样品管和含有在玻璃纤维垫中脱水的UCON/盐ATPS的测试条。还显示了UCON/盐垫、BSA处理的间隔物和硝酸纤维素膜的SEM图像。
图7说明通过引入ARROW，可改善沙眼衣原体LFA的检出限。呈现了在有和没有ARROW的情况下，在不同的沙眼衣原体浓度下LFA结果的比较。测试线位于LFA条的底部，对照线位于LFA测试条的顶部。对于0ng/μL沙眼衣原体，阴性对照的结果显示在最左侧面图中。
图8说明了通过引入TUBE对人IgM LFA的检出限的改善。比较了在有和没有TUBE的情况下，在不同的人IgM浓度下LFA结果的比较。测试线位于LFA条的底部，对照线位于LFA测试条的顶部。阴性对照结果显示在最左侧的图中。
图9的a-b图显示了ARROW/LFA系统和仅LFA系统(图a)，TUBE/LFA系统和仅LFA系统(图b)的定量LFA测试线强度的图。
具体实施方式
众多诊断应用可受益于直接添加样品而无需与其他溶液和缓冲液额外混合。在各种实施方式中，本文描述的是基于ATPS组分依次再溶解以引起纸内所需的相分离行为的新概念的单步ATPS纸基诊断测定。作为原理的证据，该概念理在两种不同的诊断应用中使用了两种不同的聚合物/盐ATPS来证明：一种用于检测沙眼衣原体以用于衣原体诊断，另一种用于在潜在的HIV抗体诊断应用中检测人免疫球蛋白M(IgM)。
衣原体诊断利用ATPS再水化和再溶解优化的芯(称为ARROW)，在所示的实施方式中，其采用聚乙二醇和磷酸钾(PEG/盐)ATPS。在该设计中，其一个实施方式在图5A和5B中进行了说明，将样品溶液添加到设备中，该溶液在流动过程中直接使ATPS成分再溶解，导致相分离和随后纸中沙眼衣原体的浓缩。
IgM诊断设计利用了下述系统，该系统包括装有干燥纳米探针缀合物的容器(例如试管)和含有干燥的UCONTM-50-HB-5100和磷酸钾(UCON/盐)ATPS组分的纸条设计。在此基于管和UCON的生物标志物提取设备(称为TUBE)中，干燥组分被设计为以特定顺序重新溶解，其中靶标首先被缀合物捕获，然后在纸中浓缩。
请注意，这两种设计的执行都比仅对组分进行脱水然后使其再水化更为困难，因为再水化化的组分需要产生适当的相分离条件。因此，对该过程进行了优化，以使其与LFA正确整合，并证明了其在不影响测试结果准确性的情况下将LFA对传染病生物标志物的检出限提高了10倍。据我们所知，这首次展示了将ATPS组分脱水到纸上以提供按顺序溶解方案，该方案仅允许添加样品以实现靶标的相分离和浓缩。
在某些实施方式中，可以提供本文所述的方法和设备以用于临床应用的分析物收集、提取、浓缩和检测。在某些实施方式中，所述方法和设备允许快速检测和/或定量生物样品(例如，口腔液或组织样品、尿液、血液或血液级分、脑脊髓液、淋巴、组织活检、***样品等)、食物样品、环境样品中的细菌、真菌、原生动物、病毒或其他分析物，等等。
在某些实施方式中，本文提供的测定和设备是准确、灵敏、便携式、一次性的，并且非常适合现场使用，用于现场环境测试，现场食品测试等，而只需最少的培训或设备。
ARROW形式的测定
脱水ATPS诊断设备(例如，脱水PEG/盐ATPS诊断设备)的一个说明性但非限制性实施方式显示在图5A和5B中。如图所示，在各种实施方式中，该设备包括两个主要组件：ATPS再水化和再溶解优化的芯(ARROW)和标准侧流测定技术(LFA)。在所示的实施方式中，ARROW由层叠在一起的几张纸片(例如玻璃纤维片)组成。然而，将认识到，在某些实施方式中，可以使用单张纸，或者在某些实施方式中，芯包括至少2层，或至少3层，或至少4层，或至少5层，或至少6层，或至少7层或至少8层或至少9层或至少10层或至少15层或至少20层的纸。
由于ATPS的功能是浓缩目标病原体，因此期望ARROW能够吸收大量样品溶液。在所示的实施方式中，在每张纸(例如，玻璃纤维)片的上游部分15％(w/w)盐(例如，磷酸钾)是脱水的，下游部分10％(w/w)的聚合物(例如，PEG 8000)是脱水的。但是，将意识到这些量是可以如下所述地变化。
在某些实施方式中，在脱水的聚合物(例如，PEG)和片材的尖端之间留有空白空间，以允许收集含有浓缩的分析物(例如，病原体)的贫聚合物相。在某些实施方式中，每个片材的下游尖端可以逐渐变细(例如形成一个点)，这促进了液体适当过渡到LFA(例如进入LFA的缀合垫)。
在所示的实施方式中，诊断的LFA部分由包含比色指示剂的缀合垫组成，该缀合垫与印刷有一次抗体和二次抗体的硝酸纤维素膜连接(例如，以提供指示剂线和对照线)，然后是吸水垫。然而，将意识到在LFA中不必提供比色指示剂。因此，在某些实施方式中，比色指示剂可以设置在芯(ARROW)的区域中。还将意识到所述指示剂不必是比色指示剂，并且在各种实施方式中，所述指示剂可以简单地包括，尤其是，纳米缀合物，其包含与结合至待检测分析物的分析物结合部分连接的指示剂部分，例如，如下所述。
在某些实施方式中，ARROW配置为提供与LFA的流体连通。因此，例如，LFA部分通过将缀合垫的小的上游部分垂直地装配到已经在ARROW中切割的狭缝中而与ARROW接合。
在所示的实施方式中，将ARROW设计为浓缩能够自行分配到单相的生物标志物。由于沙眼衣原体的整体细菌相对较大(0.8至1μm)，因此无需干预即可将其彻底分配到贫PEG相。
应当注意的是，尽管图5A和5B示出了与LFA整合的芯，但是在某些实施方式中，芯可以与单独的LFA组合或与其他测定系统组合而与LFA分开使用，或者只需作为分析物试剂浓缩器。
尽管上述ARROW系统在分开的区域中提供ATPS组分以允许按顺序再水化，但是在某些实施方式中，期望的是第一组分和第二组分基本上同时再水化，如在下文所述的TUBE形式测定的各种实施方式中。因此，在某些实施方式中，芯包括在基本上相同的区域中以干燥状态提供的ATPS的第一组分和第二组分，使得当与流体样品接触时，两种组分基本上在同一时间再水化。
鉴于上述情况，本领域技术人员可以使用包括不同的纸、不同的ATPS组分、不同的纳米缀合物(它们配置为检测不同的分析物)等的众多ARROW变型。
TUBE形式的测定
许多传染性疾病生物标志物靶标，例如通常在HIV快速检测中检测到的HIV抗体，规模较小，并且不能彻底地分配为单相。因此，可以利用另一种策略来浓缩这些生物标志物。先前，我们的小组证明了通常用于LFA中的金纳米颗粒缀合物可以直接添加到ATPS中，其中它们在聚合物/盐ATPS中彻底地分配到贫聚合物相。这种分配可用于执行分析物不彻底地分配为单相的ATPS。
通过这种形式，将包含与结合至指示剂(例如金纳米颗粒)的分析物结合的结合部分的纳米缀合物添加至样品溶液，并使其在相分离发生之前与溶液中存在的靶标分析物结合。在开始相分离之后，大的纳米缀合物/靶标复合物分配至单相，例如UCON/盐ATPS中的贫UCON相，从而将靶标浓缩为单相。
提取所分配复合物并将其施加至LFA可以提高结合靶标的检出限。在这项研究中，我们集中于将这种机制整合到脱水形式中，以使用人IgM抗体(970kDa，或直径约37nm)作为模型生物标志物靶标来浓缩较小的靶标。
图6所示的“TUBE”设计中显示该方法的一个实施方式。如图所示，“TUBE”系统包括两个主要组件：1)样品管；2)包含连接到标准LFA的ATPS(例如，UCON/盐)垫的测试条。在这种设计中，期望的是纳米复合物在ATPS浓缩步骤之前进入整个样品溶液并与靶标结合。同样重要的是，结合靶标后，纳米缀合物同时进入脱水的ATPS区域，以使之前浓缩到所得贫聚合物相中(例如，贫UCON相)中的纳米缀合物(例如金纳米颗粒(GNPs))最大化。一种达到这些设计标准的方法是将纳米复合物干燥，并将其以粉末形式储存在样品管(例如，微量离心管)中。在这种情况下，向管中首先添加液体样品，其导致纳米缀合物再溶解并与样品中存在的任何分析物(例如人IgM)结合。接下来，将测试纸加入样品管中，然后将纳米缀合物(例如GNPs)共同吸到测试条中，其首先与ATPS区域(例如，UCON/盐垫)接触。当发生这种情况时，脱水的ATPS组分(例如，UCON/盐混合物)会被芯吸溶液再水化，导致ATPS的形成和分离(例如，分成富UCON相和贫UCON相)。与分析物结合的纳米缀合物(例如，GNP)在新形成的贫聚合物相(例如，贫UCON相)的流体前沿处浓缩，而新形成且粘度更高的富聚合物相(例如，富UCON相)的区域滞后。可选地包含一种或多种试剂(例如，BSA)以减少或防止非特异性结合的间隔物垫可以确保贫聚合物(例如，贫UCON)相均匀过渡到LFA检测区，并防止或减少纳米缀合物的非特异性结合。
图6中所示的特定TUBE形式是说明性的而非限制性的。鉴于上述多种变型的TUBE形式，本领域技术人员可以使用包括配置为检测不同的分析物的不同的纸、不同的ATPS组分、不同的纳米缀合物、等的TUBE形式。
ATPS和ATPS组分
在各种实施方式中，本文描述的设备配置为引入双水相系统(ATPS)的组分，其中ATPS的组分(第一组分和第二组分)在芯中以干燥状态或作为LFA设备的组分。在某些实施方式中，ATPS组分布置成使得它们在与样品接触时依次再水化。提供足够量的ATPS组分，以使当被含有测定样品材料的靶标分析物的流体样品(例如，含水样品)再水化时，这些组分形成混合相溶液，其分配和浓缩靶标分析物和/或分析物/纳米缀合物复合物。
在一些实施方式中，ATPS组分在再水化时包含两种水溶液，第一相溶液和第二相溶液，其有效地混合以形成混合相溶液，然后随着溶液运动通过所述纸而进行分配。在一些实施方式中，混合相溶液是均匀的溶液，而在某些其他实施方式中，水化的第一相溶液和第二相溶液是不混溶的。在一些实施方式中，第一相溶液和第二相溶液是不混溶的，但是水化的第一相溶液的区域与水化的第二相溶液的区域混合。在一些实施方式中，混溶度由温度的变化和/或不同组分例如盐的浓度的变化驱动。在一些实施方式中，第一/第二相可以包含诸如胶束、盐和/或聚合物等组分。在一些实施方式中，相对于第二相，与ATPS接触的靶标分析物(例如，生物分子、细菌(或其片段)、真菌(或其片段)或病毒等)优先分布、分配和/或浓缩至再水化的第一相中，反之亦然，这基于其物理和化学特性(例如大小，形状，疏水性和电荷)。在一些实施方式中，靶标分析物(例如细菌、真菌、病毒等)主要(或彻底)分配到ATPS的再水化的第一或第二相溶液中，并因此浓缩在ATPS中。在一些实施方式中，通过调节再水化的第一相溶液和再水化的第二相溶液之间的体积比来浓缩靶标分析物。在一些实施方式中，通过减少分析物所分配至的相的体积来浓缩靶标分析物。通过说明的方式，在一些实施方式中，靶标分析物在再水化的第一相溶液中浓缩10倍，例如，通过使用再水化的第一相溶液与再水化的第二相溶液的体积比为1：9，因为分析物彻底分配至其中的相的体积为总体积的1/10。
在一些实施方式中，通过使用其他比例获得其他浓度。因此，在一些实施方式中，再水化的第一相溶液与再水化的第二相溶液的比率包括约1：1，约1：2，约1：3，约1：4，约1：5，约1：6，约1：7，约1：8，约1：9或约1:10的比率。在一些实施方式中，再水化的第一相溶液与再水化的第二相溶液的比率包括约1:20，约1:30，约1:40，约1:50，约1:60，约1:70，约1:80，约1:90或约1：100的比率。在一些实施方式中，再水化的第一相溶液与再水化的第二相溶液的比率包括约1：200，约1：300，约1：400，约1：500，约1：600，约1：700，约1：800，约1：900或约1：1000。
在一些实施方式中，再水化的第二相溶液与再水化的第一相溶液的比率包括约1：1，约1：2，约1：3，约1：4，约1：5，约1：6，约1：7，约1：8，约1：9或约1:10。在一些实施方式中，再水化的第二相溶液与再水化的第一相溶液的比率包括约1:20，约1:30，约1:40，约1:50，约1:60，约1:70，约1:80，约1:90或约1：100。在一些实施方式中，再水化的第二相溶液与再水化的第一相溶液的比率包括约1：200，约1：300，约1：400，约1：500，约1：600，约1：700，约1：800，约1：900或约1：1000。
在一些实施方式中，分析物在再水化的第一相溶液和再水化的第二相溶液之间基本上均匀地分配，从而防止了分析物的浓缩。在此类系统中，靶标分析物的浓缩可通过引入捕获靶标分析物的其他组分(例如探针(例如，与和待测分析物结合的结合部分连接的指示剂部分))来实现，其中探针主要分配到一个相中，从而增强靶标分析物的分配行为以实现浓缩。
在一些实施方式中，再水化的第一/第二相溶液包含胶束溶液。在一些实施方式中，胶束溶液包含非离子表面活性剂。在一些实施方式中，胶束溶液包含洗涤剂。在一些实施方式中，胶束溶液包含Triton-X。在一些实施方式中，作为非限制性实例，胶束溶液包含类似于Triton-X的聚合物，例如Igepal CA-630和Nonidet P-40等。在一些实施方式中，胶束溶液基本上由Triton-X组成。
在一些实施方式中，再水化的胶束溶液的粘度(在室温(～25℃)下为约0.01厘泊至约5000厘泊，约0.01厘泊至约4500厘泊，约0.01厘泊至约4000厘泊，约0.01厘泊至约3500厘泊，约0.01厘泊至约3000厘泊，约0.01厘泊至约2500厘泊，约0.01厘泊至约2000厘泊，约0.01厘泊至约1500厘泊，约0.01厘泊至约1000厘泊或约0.01厘泊至约500厘泊。在一些实施方式中，胶束溶液在室温下的粘度为约0.01厘泊至约450厘泊，约0.01厘泊至约400厘泊，约0.01厘泊至约350厘泊，约0.01厘泊至约300厘泊，约0.01厘泊至约250厘泊，约0.01厘泊至约200厘泊，约0.01厘泊至约150厘泊或约0.01厘泊至约100厘泊。
在一些实施方式中，再水化的第一/第二相溶液包含聚合物(例如，聚合物溶液)。在某些实施方式中，该聚合物包括一种或多种选自由下述组成的组中的聚合物：聚乙二醇(PEG)、乙烯/丙烯共聚物(例如、UCONTM聚合物)、丙二醇(PPG)、甲氧基聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮等。在某些实施方式中，该聚合物是聚乙二醇(PEG)。在各种实施方式中，PEG可具有1000至100,000的分子量。在某些实施方式中，PEG包括PEG-4600、PEG-8000或PEG-20,000。在某些实施方式中，该聚合物是聚丙二醇(PPG)。在各种实施方式中，PPG可具有100至10,000的分子量。在某些实施方式中，PPG包括PPG 425。在某些实施方式中，聚合物是右旋糖酐。在各种实施方式中，右旋糖酐可以具有在1000和1,000,000之间的分子量。在某些实施方式中，右旋糖酐包括右旋糖酐6000、右旋糖酐9000、右旋糖酐35,000或右旋糖酐200,000。在某些实施方式中，聚合物包括乙烯/丙烯共聚物(例如，UCONTM聚合物)。说明性但非限制性的乙烯/丙烯共聚物包括但不限于UCONTM 50-HB-5100、UCONTM 50-HB-3520、UCONTM 50-HB-2000、UCONTM 50-HB-660、UCONTM 50-HB-400、UCONTM 50-HB-260、UCONTM 50-HB-170、UCONTM50-HB-100、UCONTM 60-H-5300、UCONTM 60-H2300、UCONTM 60-H-1600、UCONTM 60-H-1100、UCONTM 60-H-760、UCONTM 60-H-340、UCONTM 75-H-9500、UCONTM 75-H-1400、UCONTM 75-H-450等。
在一些实施方式中，再水化的聚合物溶液包含为约0.01％w/w聚合物，或约0.05％w/w聚合物，或约0.1％w/w聚合物，或约0.15％w/w聚合物，或约0.2％w/w聚合物，或约0.25％w/w聚合物，或约0.3％w/w聚合物，或约0.35％w/w聚合物，或约0.4％w/w聚合物，或约0.45％w/w聚合物，或约0.5％w/w聚合物，或约0.55％w/w聚合物，或约0.6％w/w聚合物，或约0.65％w/w聚合物，或约0.7％w/w聚合物，或0.75％w/w聚合物，或约0.8％w/w聚合物，或约0.85％w/w聚合物，或约0.9％w/w聚合物，或约0.95％w/w聚合物，或约1％w/w聚合物。在一些实施方式中，聚合物溶液包含约1％w/w的聚合物，或约2％w/w的聚合物，或约3％w/w的聚合物，或约4％w/w的聚合物，或约5％w/w聚合物，或约6％w/w聚合物，或约7％w/w聚合物，或约8％w/w聚合物，或约9％w/w聚合物，或约10％w/w聚合物，或约11％w/w聚合物，或约12％w/w聚合物，或约13％w/w聚合物，或约14％w/w聚合物，或约15％w/w聚合物，或约16％w/w聚合物，或约17％w/w聚合物，或约18％w/w聚合物，或约19％w/w聚合物，或约20％w/w聚合物，或约21％w/w聚合物，或约22％w/w聚合物，或约23％w/w聚合物，或约24％w/w聚合物，或约25％w/w聚合物，或约26％w/w聚合物，或约27％w/w聚合物，或约28％w/w聚合物，或约29％w/w聚合物，或约30％w/w聚合物，或约31％w/w聚合物，或约32％w/w聚合物，或约33％w/w聚合物，或约34％w/w聚合物，或约35％w/w聚合物，或约36％w/w聚合物，或约37％w/w聚合物，或约38％w/w聚合物，或约39％w/w聚合物，或约40％w/w聚合物，或约41％w/w聚合物，或约42％w/w聚合物，或约43％w/w聚合物，或约44％w/w聚合物，或约45％w/w聚合物，或约46％w/w聚合物，或约47％w/w聚合物，或约48％w/w聚合物，或约49％w/w聚合物，或约50％w/w聚合物。在一些实施方式中，聚合物溶液包含约10％w/w聚合物，或约20％w/w聚合物，或约30％w/w聚合物，或约40％w/w聚合物，或约50％w/w聚合物，或约60％w/w聚合物，或约70％w/w聚合物，或约80％w/w聚合物，或约90％w/w聚合物。在一些实施方式中，聚合物溶液包括约10％w/w聚合物至约80％w/w聚合物的聚合物溶液。在一些实施方式中，再水化的聚合物溶液包括下述聚合物溶液，其为约1％w/w至约30％w/，或约5％w/w至约25％w/w，或约10％w/w至约25％w/w，或约10％w/w高达约20％w/w的聚合物。
在一些实施方式中，再水化的第一和/或第二相溶液包含盐，从而形成盐溶液。在一些实施方式中，靶标分析物(例如细菌、真菌、病毒等)和/或探针-分析物复合物分配到盐溶液中。在某些实施方式中，盐溶液包含低离液盐(kosmotropic salt)。在一些实施方式中，盐溶液包含高离液盐(chaotropic salt)。在一些实施方式中，该盐包含镁盐、锂盐、钠盐、钾盐、铯盐、锌盐和铝盐中的一种或多种。在一些实施方式中，该盐包括溴化物盐、碘化物盐、氟化物盐、碳酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、羧酸盐、硼酸盐或磷酸盐。在一些实施方式中，该盐是磷酸钾。在一些实施方式中，该盐是硫酸铵。
在一些实施方式中，再水化盐溶液包括盐溶液，该盐溶液包含约0.01％w/w盐，或约0.05％w/w盐，约0.1％w/w盐，或约0.15％w/w盐，或约0.2％w/w盐，或约0.25％w/w盐，或约0.3％w/w盐，或约0.35％w/w盐，或约0.4％w/w盐，或约0.45％w/w盐，或约0.5％w/w盐，或约0.55％w/w盐，或约0.6％w/w盐，或约0.65％w/w盐，或约0.7％w/w盐，或约0.75％w/w盐，或约0.8％w/w盐，或约0.85％w/w盐，或约0.9％w/w盐，或约0.95％w/w盐，或约1％w/w盐。在一些实施方式中，再水化的盐溶液包含盐溶液，其为约1％w/w盐，或约2％w/w盐，或约3％w/w盐，或约4％w/w盐，或约5％w/w盐，或约6％w/w盐，或约7％w/w盐，或约8％w/w盐，或约9％w/w盐，或约10％w/w盐，或约11％w/w盐，或约12％w/w盐，或约13％w/w盐，或约14％w/w盐，或约15％w/w盐，或约16％w/w盐，或约17％w/w盐，或约18％w/w盐，或约19％/w盐，或约20％w/w盐，或约21％w/w盐，或约22％w/w盐，或约23％w/w盐，或约24％w/w盐，或约25％w/w盐，或约26％w/w盐，或约27％w/w盐，或约28％w/w盐，或约29％w/w盐，或约30％w/w盐，或约31％w/w盐，或约32％w/w盐，或约33％w/w盐，或约34％w/w盐，或约35％w/w盐，或约36％w/w盐，或约37％w/w盐，或约38％w/w盐，或约39％w/w盐，或约40％w/w盐，或41％w/w盐，或约42％w/w盐，或约43％w/w盐，或约44％w/w盐，或约45％w/w盐，或约46％w/w盐，或约47％w/w盐，或约48％w/w盐，或约49％w/w盐，或约50％w/w。在一些实施方式中，再水化盐溶液包含范围为约0.1％w/w至约40％w/w，或约1％w/w至约30％w/w，或约5％w/w至约25％w/w，或从约10％w/w至约20％w/w的盐溶液。在一些实施方式中，再水化盐溶液包含为约0.1％w/w至约10％w/w的盐溶液。在一些实施方式中，盐溶液为约1％w/w至约10％w/w。
在一些实施方式中，再水化的第一/第二相溶液包含与水不混溶的溶剂。在一些实施方式中，溶剂包括非极性有机溶剂。在一些实施方式中，溶剂包括油。在一些实施方式中，溶剂包括戊烷、环戊烷、苯、1，4-二恶烷、***、二氯甲烷、氯仿、甲苯或己烷。
在一些实施方式中，再水化的第一相溶液包含胶束溶液，而再水化的第二相溶液包含聚合物。在一些实施方式中，再水化的第二相溶液包含胶束溶液，而再水化的第一相溶液包含聚合物。在一些实施方式中，再水化的第一相溶液包含胶束溶液，而再水化的第二相溶液包含盐。在一些实施方式中，再水化的第二相溶液包含胶束溶液，而再水化的第一相溶液包含盐。在一些实施方式中，胶束溶液是Triton-X溶液。在一些实施方式中，再水化的第一相溶液包含第一聚合物，而再水化的第二相溶液包含第二聚合物。在一些实施方式中，再水化的第一/第二聚合物包含聚乙二醇和/或右旋糖酐。在一些实施方式中，再水化的第一相溶液包含盐，而再水化的第二相溶液包含盐。在一些实施方式中，再水化的第二相溶液包含聚合物，并且再水化的第一相溶液包含盐。在一些实施方式中，第一相溶液包含聚乙二醇，第二相溶液包含磷酸钾。在一些实施方式中，第二相溶液包含聚乙二醇，并且第一相溶液包含磷酸钾。在一些实施方式中，第一相溶液包含盐，第二相溶液包含盐。在一些实施方式中，第一相溶液包含低离液盐，第二相溶液包含高离液盐。在一些实施方式中，第二相溶液包含低离液盐，并且第一相溶液包含高离液盐。
在一些实施方式中，再水化的第一相溶液包含表1的组分1，并且再水化的第二相溶液包含表1的组分2。在一些实施方式中，再水化的第二相溶液包含表1的组分1并再水化的第二相溶液包含表1的组分2。
在一些实施方式中，在干燥之前，将表1的组分悬浮或溶解在缓冲液中。在一些实施方式中，在干燥之前，将表1的组分悬浮/溶解在与样品所来源的生物系统相容的缓冲液中。在一些实施方式中，在干燥之前，将表1的组分悬浮/溶解在盐溶液中。在一些实施方式中，在干燥之前，将表1的组分悬浮/溶解在PBS中。在一些实施方式中，将表1的组分在干燥之前悬浮/溶解在水中。在一些实施方式中，将表1的组分在干燥之前悬浮/溶解在生物流体中。
表1.显示说明性双水相聚合物/盐提取/浓缩系统。
应当指出，UCONTM 50-HB聚合物包括通过使用碱催化剂在约100℃至约150℃的温度下使等重量的环氧乙烷和环氧丙烷与丁醇反应而制备的乙烯/丙烯共聚物。所得的UCONTM50-HB是具有以下一般结构的无规共聚物：
上述ATPS系统和组分是说明性的而非限制性的。使用本文提供的教导，本领域技术人员可以利用许多其他ATPS系统和组分。
侧流测定
在某些实施方式中，本文所述的芯配置为与侧流测定器(LFA)联合工作，并且本文所述的系统配置为提供用于检测一种或多种靶标分析物的侧流测定器。LFA通常包括多孔基质(例如纸)，例如如上所述，其中设置有样品和测定组分。多孔基质构造成并具有足以允许当组分处于液相时测定试剂流过多孔基质的孔隙率。这种多孔LFA设备称为纸或纸流体设备，并且这些术语可互换使用。
侧流测定器(LFA)基于多孔基质(例如纸)的使用，例如多孔纸、微结构聚合物、烧结聚合物等。选择多孔基质特别是因为其例如通过毛细作用将流体输送通过基质的能力。典型的LFA包括可以用作海绵并保持施加的样品流体的样品接收区(例如，样品垫)。施加/接收的流体通过LFA移动到缀合区(例如，缀合垫)，在某些实施方式中，该区域包含纳米缀合物(例如，与和待检测靶标分析物结合的部分(例如，抗体)连接的指示剂)。当流体移动到缀合区时，纳米缀合物与样品中的分析物结合(如果存在的话)，形成纳米缀合物/分析物复合物。应当注意，在本文所述的某些实施方式中，可以使样品与测试条外部的纳米缀合物接触(参见例如本文所述的TUBE形式)，在这种情况下，LFA不需要引入到缀合区。
纳米缀合物在流过包含LFA的多孔基质时与分析物结合。LFA通常包括检测区，该检测区包含与分析物/纳米缀合物复合物结合并由此固定分析物/纳米缀合物复合物的固定部分(捕获部分)。通常，固定部分布置成形成线或条。当分析物/纳米缀合物复合物在检测区中的一条线上累积时，产生可检测信号(例如，视觉发色信号)，表明分析物的存在。在某些实施方式中，LFA还包括对照区，该对照区含有结合纳米缀合物和纳米缀合物分析物复合物的捕获部分，以提供指示试剂已经通过检测区的阳性信号。
在某些实施方式中，在通过这些反应区之后，流体进入最终的多孔材料，例如吸收区，其仅充当废物容器。在各种实施方式中，LFA可以配置为作为竞争性或夹心测定法操作。图1示意性地说明了LFA。
因此，在各种实施方式中，侧流测定器包括多孔基质(例如，纸)，设置在纸上或纸中的样品接收区，以及设置在纸上或纸中的检测区，其中检测区至少包括第一测试线，以及可选地第二测试线，并且在某些实施方式中可选地第三测试线。在说明性但非限制性的实施方式中，测试线可以由当存在分析物时捕获分析物(例如，分析物/指示剂复合物)的固定结合部分(例如抗体)的行来定义。在某些实施方式中，侧流测定器另外包括缀合区，该缀合区含有与结合靶标分析物的部分连接的指示剂。侧流测定器设备可以另外包括对照线和/或吸收垫(例如，槽)。
样品接收区
在某些实施方式中，本文所述的LFA设备包括用于施加/接收生物样品的样品接收区。在某些实施方式中，样品接收区包括设置在纸基体上或纸基体中的样品垫。在某些实施方式中，样品垫可以充当过滤器，该过滤器可以从收集的流体中去除碎屑、污染物和粘液。它还可以存储干燥的试剂，并且在再水化时，这些试剂可以(i)调整溶液以达到最佳检测条件(pH、离子强度等)；(ii)分解所收集试样中可能影响检测的粘液、糖蛋白和其他粘性物质。
样品垫的说明性材料包括但不限于纤维素、硝酸纤维素、玻璃纤维、棉、织造纸(woven paper纸)或无纺纸等。样品垫上的试剂可包括但不限于表面活性剂，例如TritonX-100、Tween 20或十二烷基硫酸钠等；聚合物，例如聚乙二醇、泊洛沙姆、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等；缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、硼酸钠、TRICINE等；蛋白质，例如白蛋白等；酶，例如蛋白酶等；盐，例如氯化钠、磷酸钠、胆酸钠、磷酸钾等。在各种实施方式中，可以通过以下方式将这些试剂施加到样品垫上：(i)将纸材料浸渍在试剂溶液中，或(ii)经由毛细管作用芯吸所述膜。经处理的样品垫可通过以下方法进行干燥：(i)空气干燥(在室温下放置)；(ii)烘烤(使用烘箱或加热设备在高温下放置)；(iii)真空；或(iv)冻干。
缀合区
在某些实施方式中，本文所述的LFA设备可包括用于将样品与纳米缀合物(例如，与和靶标分析物结合的部分连接的指示剂)混合的缀合区。在某些实施方式中，缀合区包括缀合垫。在某些实施方式中，当存在缀合区时，其可以含有用结合靶标分析物的结合部分修饰的脱水指示剂(例如，比色指示剂、荧光指示剂、放射性指示剂、磁性指示剂等)。在某些实施方式中，结合部分是对靶标分析物具有高亲和力的特异性结合部分。当样品溶液到达缀合垫时，指示剂(例如比色指示剂)被再水化。然后，指示剂上的结合部分可以与分析物结合，并且所得的复合物可以流至检测区。在某些实施方式中，指示剂可以包括比色指示剂，其可以包括金属颗粒例如金、银颗粒；聚合物颗粒，例如乳胶珠；和包封可见或荧光染料的聚苯乙烯颗粒。用于缀合区(例如，缀合垫)的说明性材料材料包括但不限于纤维素、硝酸纤维素、玻璃纤维、棉、织造纸或无纺纸等。在某些实施方式中，可以将比色指示剂可施加到如上所述的垫上并在其上脱水。
检测区
在某些实施方式中，LFA包括检测区(例如反应垫)，其可以包含固定试剂，所述固定试剂捕获分析物/纳米缀合物复合物(例如用于测试信号)，或者捕获不具有分析物的纳米缀合物和分析物纳米缀合物复合物。分析物纳米缀合物复合物和/或不具有分析物的纳米缀合物的捕获，可以产生可检测的信号(例如视觉信号)，以指示在特定测试线处靶标分析物的存在或不存在或量，和/或以提供对照线处的对照信号。用于检测区的说明性材料包括但不限于纤维素、硝酸纤维素、玻璃纤维、棉、织造纸或无纺纸等。
在侧流测试条的某些实施方式中，检测区中的试剂以垂直于流动方向的线的形式固定，以确保所有样品均可与固定的试剂相互作用。可以优化试剂的浓度以控制信号强度，从而控制测定的灵敏度。例如，可以通过固定具有不同浓度的同一试剂的多条线来设计半定量测定。因此，每条线仅在达到靶标生物分子的特定浓度时才会产生信号。然后可以通过对例如如上所述可见的线的数目计数来解释靶标生物分子的浓度。
吸水垫/槽
在某些实施方式中，侧流设备包括设置在检测区下游的吸收垫，并且当存在所述对照线时，吸收垫设置在对照线的下游。在某些实施方式中，槽在存在时可包括吸收垫，该吸收垫收集过多的流体并防止可能影响测试性能的回流。槽的说明性材料包括但不限于纤维素、硝酸纤维素、玻璃纤维、棉、织造纸和非无纺纸等。
包含LFA和/或芯的纸。
在各种实施方式中，本文所述的LFA和/或芯(ARROW)包括一种或多种纸，其提供了多孔基质，ATPS和/或样品溶液可流过该多孔基质。当ATPS或其组分处于流体相时所述多孔基质被构造成具有足以允许ATPS或其组分流过多孔基质的孔隙率。这种多孔LFA在本文中被称为纸或纸流体设备，并且这些术语可互换使用。
本文所用的术语“纸”并不限于由木浆或其他纤维状植物物质制成的片材，尽管在某些实施方式中，可以设想在本文所述的设备中使用此类纸。纸更通常是指通常为片状的多孔材料，但不限于此，其允许流体流过。
在一些实施方式中，多孔基质足够多孔，以允许ATPS的混合相溶液、第一相溶液和/或第二相溶液和/或靶标分析物流过LFA。在一些实施方式中，多孔基质足够长和/或足够深，以使混合相溶液、第一相溶液和/或第二相溶液和/或靶标分析物垂直和/或水平地流动通过LFA或斑点测定设备。在一些实施方式中，第一相溶液以第一速率流动通过多孔基质，第二相溶液以第二速率流动通过多孔基质，其中第一速率和第二速率不同。在LFA或斑点测定的一些实施方式中，多孔基质尤其包括诸如烧结玻璃陶瓷、矿物、纤维素、玻璃纤维、硝酸纤维素、聚偏二氟乙烯、尼龙、电荷改性尼龙、聚醚砜、其组合，等等。
夹心测定
在一些实施方式中，LFA配置为提供或运行夹心测定(参见图1)。在一些实施方式中，例如当分析物是纳米缀合物/分析物复合物的组分时，夹心测定法包含结合靶标分析物的捕获部分(例如抗体)。在一些实施方式中，该设备包含纳米缀合物(例如，与和感兴趣的分析物结合的结合部分(例如，抗体)连接的指示剂)。在一些实施方式中，指示剂提供可检测的性质(比色、荧光、放射性等)。在一些实施方式中，例如在本文所述的TUBE系统中，在将指示剂施加到设备上之前将其添加到样品中，并结合靶标分析物以形成探针-分析物复合物。在一些实施方式中，在将样品添加至LFA设备并结合靶标分析物以形成探针-分析物复合物之后，指示剂可以与在LFA设备的缀合区中的样品结合(例如，在本文所述的ARROW方法的某些实施方式中)。
纳米缀合物/分析物复合物流动通过LFA或通过流通设备流向吸收垫。在一些实施方式中，指示剂-分析物复合物的靶标分析物与捕获部分结合。在一些实施方式中，捕获部分固定在测试线或测试区上，并且纳米缀合物/分析物复合物被固定在测试线上或测试区域中。在一些实施方式中，纳米缀合物包含比色部分(例如，金纳米颗粒)，并且随着纳米缀合物/分析物复合物在测试线处或在测试区中累积，测试线或测试区将显示强烈的颜色(例如，可检测的信号)，表明阳性结果。在一些实施方式中，样品中不存在靶标分析物，并且纳米缀合物/分析物复合物的纳米缀合物不与捕获部分相互作用，并且在测试区中不存在测试线或信号表明在该测试线处的阴性结果。在一些实施方式中，LFA在对照线上(或在对照区中)包含纳米缀合物捕获部分，其与包含纳米缀合物的指示剂和/或结合部分直接相互作用，因此，无论在样品中是否存在靶标分析物，纳米缀合物与纳米缀合物捕获部分结合并在对照线上或在对照区中累积。在一些实施方式中，纳米缀合物捕获部分是结合所述结合部分的二次抗体，其中结合部分是结合该靶标分析物的一次抗体。在一些实施方式中，纳米缀合物变得固定并在对照线上或对照区中被检测，表明有效测试。在一些实施方式中，阳性结果(例如，样品中存在靶标分析物)由如上所述的在测试线处的可检测信号指示。在一些实施方式中，在没有如上所述的测试线信号的情况下，在对照线处或在对照区中的可检测信号指示阴性结果。
纳米缀合物(探针)。
在某些实施方式中，本文描述的系统和/或设备和/或本文描述的方法利用纳米缀合物(探针)，其中所述纳米缀合物包含与结合靶标分析物的分析物结合部分连接的指示剂部分，以形成纳米缀合物/分析物复合物。
包含纳米缀合物的指示剂部分。
在一些实施方式中，包含纳米缀合物的指示剂部分包含合成聚合物、金属、矿物、玻璃、石英、陶瓷、生物聚合物、塑料和/或其组合中的一种或多种。在一些实施方式中，纳米缀合物包含聚合物，所述聚合物包含聚乙烯、聚丙烯、尼龙
在一些实施方式中，指示剂部分包含可检测标记。可检测标记包括通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电、光学或化学方式可检测的任何成分。说明性的有用的可检测标记包括但不限于荧光纳米颗粒(例如，量子点(Qdots))、金属纳米颗粒(包括但不限于金纳米颗粒、银纳米颗粒、铂纳米颗粒)，荧光染料(例如荧光素、德克萨斯红、若丹明，绿色荧光蛋白等,例如参见Molecular Probes,Eugene,Oregon,USA)、放射性标记(例如3H、125I、35S、14C、32P、99Tc、203Pb、67Ga、68Ga、72As、111In、113mIn、97Ru、62Cu、64lCu、52Fe、52mMn、51Cr、186Re、188Re、77As、90Y、67Cu、169Er、121Sn、127Te、142Pr、143Pr、198Au、199Au、161Tb、109Pd、165Dy、149Pm、151Pm、153Sm、157Gd、159Gd、166Ho、172Tm、169Yb、175Yb、177Lu、105Rh、111Ag等)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和在ELISA中常用的其他酶等)、各种比色标记、磁性或顺磁性标记(例如磁性和/或顺磁性纳米颗粒)、自旋标记、不透射线的标记等。
替代地或另外地，指示剂部分是可以与包含可检测标记的另一颗粒结合的指示剂部分。在一些实施方式中，探针在检测区(例如，测试线、对照线、测试区、对照区)提供可检测信号。在一些实施方式中，指示剂部分提供可检测的性质，其包括比色标记/性质、荧光标记/性质、酶标记/性质、生色标记/性质和/或放射性标记/性质中的一种或多种。在一些实施方式中，探针是金纳米颗粒，并且可检测性质是颜色。在一些实施方式中，颜色是橙色、红色或紫色。
在一些实施方式中，纳米缀合物还包含涂层。在一些实施方式中，涂层包含聚乙二醇或聚丙二醇。在一些实施方式中，涂层包括聚丙烯。在一些实施方式中，涂层包含聚丙二醇。在一些实施方式中，涂层包含葡聚糖。在一些实施方式中，涂层包含亲水性蛋白质。在一些实施方式中，涂层包含血清白蛋白。在一些实施方式中，涂层对第一相溶液或第二相溶液具有亲和力。
包含纳米缀合物的结合部分。
在一些实施方式中，包含纳米缀合物的结合部分包含结合靶标分析物(例如，细菌、真菌、病毒、凝集素、糖、蛋白质、DNA等)的分子。在一些实施方式中，结合部分是特异性结合靶标分析物的分子。在一些实施方式中，“特异性结合”是指该分子优先结合至靶标分析物或以比其他分子更大的亲和力与靶标分析物结合。作为非限制性实例，抗体将选择性地或特异性地结合针对产生抗体的抗原。同样，作为非限制性实例，在严格条件下，DNA分子将结合基本互补的序列而不结合无关序列。在一些实施方式中，“特异性结合”可以指结合反应，其确定靶标分析物在分子(例如蛋白质和其他生物制剂)的异质群体中的存在。在一些实施方式中，结合部分结合其特定的靶标分析物，并且不大量结合样品中存在的其他分子。
在一些实施方式中，结合部分包含抗体、凝集素、蛋白质、糖蛋白、核酸、单体核酸、聚合核酸、适体、适体酶、小分子、聚合物、凝集素、碳水化合物、多糖、糖、脂质或其任何组合。在一些实施方式中，结合部分是能够与靶标分析物形成结合对的分子。
在一些实施方式中，结合部分是抗体或抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab‘、Fab‘-SH、F(ab')2、Fv、Fv’、Fd、Fd’、scFv、hsFv片段、卵形抗体、双链抗体和如上所述其他片段。
在某些实施方式中，结合部分包含适体。在一些实施方式中，适体包含由核酸形成的抗体类似物。在一些实施方式中，适体不需要结合在某些测定中将被检测的标记物，例如nano-CHEM-FET，其中可直接检测重构。在一些实施方式中，结合部分包含适体酶。在一些实施方式中，适体酶包含由核酸形成的酶类似物。在一些实施方式中，仅在第二种特异性分析物的存在下，适酶才起作用以改变构型从而捕获特异性分子。
用于促进纳米缀合物/分析物复合物的分配的纳米缀合物。
在一些实施方式中，仅靶标分析物优先分配到第一相溶液或第二相溶液或第一相溶液和第二相溶液的界面中。在一些实施方式中，靶标分析物单独彻底地分配到第一相溶液或第二相溶液或第一相溶液和第二相溶液的界面中。
但是，在一些实施方式中，仅靶标分析物不优先分配到第一相溶液或第二相溶液或第一相溶液和第二相溶液的界面中。因此，在某些实施方式中，纳米缀合物选择成使得纳米缀合物/分析物复合物优先或彻底地分配到第一相溶液或第二相溶液中或第一相溶液和第二相溶液的界面中，从而引起(纳米缀合物/分析物复合物的)靶标分析物优先或彻底地分配到第一相溶液或第二相溶液中或在第一相溶液和第二相溶液的界面处。
在一些实施方式中，当关于靶标分析物(或纳米缀合物/分析物复合物)分配到ATPS的第一/第二相溶液中时，短语“优先分配”表示与ATPS的另一相溶液相比，更多量的靶标分析物配置在优先的相溶液中。
在一些实施方式中，当相对于靶标标分析物(或纳米缀合物/分析物复合物)分配到ATPS的第一/第二相溶液中时，短语“彻底分配”表示与ATPS的另一相溶液相比，约90％或更多的靶标分析物配置在优先的相溶液中。
在一些实施方式中，更大量的靶标分析物分配到第一相溶液中。在一些实施方式中，大于约50％，或大于约55％，或大于约60％，或大于约65％，或大于约70％，或大于约75％，或大于约80％，或大于约85％，或大于约90％，或大于约95％，或大于约98％，或大于约99％的靶标分析物分配到第一相溶液中。在一些实施方式中，大于约99％，或大于约99.1％，或大于约99.2％，或大于约99.3％，或大于约99.4％，或大于约99.5％，或大于约99.6％，或大于约99.7％，或大于约99.8％，或大于约99.9％的靶标分析物分配到第一相溶液中。
在一些实施方式中，更大量的分析物分配到第二相溶液中。在一些实施方式中，大于约50％，或大于约55％，或大于约60％，或大于约65％，或大于约70％，或大于约75％，或大于约80％，或大于约85％，或大于约90％，或大于约95％，或大于约98％，或大于约99％的靶标分析物分配到第二相溶液中。在一些实施方式中，大于约99％，或大于约99.1％，或大于约99.2％，或大于约99.3％，或大于约99.4％，或大于约99.5％，或大于约99.6％，或大于约99.7％，或大于约99.8％，或大于约99.9％的靶标分析物分配到第二相溶液中。
在一些实施方式中，更大量的分析物分配到第一相溶液和第二相溶液的界面中。在一些实施方式中，大于约50％，或大于约55％，或大于约60％，或大于约65％，或大于约70％，或大于约75％，或大于约80％，或大于约85％，或大于约90％，或大于约95％，或大于约98％，或大于约99％的靶标分析物分配到界面中。在一些实施方式中，大于约99％，或大于约99.1％，或大于约99.2％，或大于约99.3％，或大于约99.4％，或大于约99.5％，或大于约99.6％，或大于约99.7％，或大于约99.8％，或大于约99.9％的靶标分析物分配到所述界面中。
在一些实施方式中，该设备包括或被配置为利用和/或在该设备上进行的测定利用一种纳米缀合物(针对单一分析物的探针)。在一些实施方式中，该设备包括或被配置为利用和/或在该设备上进行的测定利用至少两种不同的纳米缀合物(各自针对不同的分析物)，或至少3种不同的纳米缀合物或至少4种不同的纳米缀合物，或至少5种不同的纳米缀合物，或至少7种不同的纳米缀合物，或至少10种不同的纳米缀合物，或至少15种不同的纳米缀合物，或至少20种不同的纳米缀合物。
样品采集
在各种实施方式中，使用本文所述的设备和方法测定的样品包括生物样品。示例性的生物样品包括但不限于生物流体，例如血液或血液级分、尿液、淋巴液、鼻腔或口腔液等。
在生物样品包含组织的情况下，在某些实施方式中，可以将组织裂解、匀浆化和/或研磨，并且可选地将其悬浮在样品溶液中。当生物样品包含生物流体时，可以直接对流体进行测定或在测定之前将其悬浮在样品溶液中。在某些实施方式中，样品溶液可以起到保存或稳定生物样品或其组分的作用，和/或可以起到提取或浓缩生物样品或其组分的作用。在某些实施方式中，样品溶液可以包含缓冲液，其可选地含有防腐剂和/或酶(蛋白酶、核酸酶等)和/或表面活性剂和/或ATPS组分。
在某些实施方式中，特别是在现场护理的实施方式中，可以立即或在适当的时间间隔后将样品施加至本文所述的测定设备或系统。在某些实施方式中，可以将样品递送至运行测定的远程测试设施。
采集生物样品的方法和设备是本领域技术人员众所周知的。
试剂盒
在某些实施方式中，提供了用于检测靶标分析物的试剂盒。在某些实施方式中，试剂盒包括含有如本文所述的ATPS水化和再溶解优化的芯(ARROW)的容器。在某些实施方式中，可以在容器中仅提供ARROW。在某些实施方式中，试剂盒可另外包含装有侧流测定器(LFA)的容器。在某些实施方式中，包含LFA的容器是与包含ARROW的容器是不同的容器。在某些实施方式中，单个容器包含ARROW和LFA。在某些实施方式中，ARROW和LFA作为结合单元一起组装在单个容器中。
在某些实施方式中，试剂盒包括包含如本文所述的干燥的纳米缀合物的容器和包含如本文所述的包含ATPS组分的条和LFA条的容器。
在某些实施方式中，试剂盒包含用于使用试剂盒定量一种或多种靶标分析物的说明书(指导材料)。
尽管指导材料通常包括书面或印刷材料，但不限于此。本发明考虑了能够存储这种说明书并将其传达给最终用户的任何介质。此类介质包括但不限于电子存储介质(例如磁盘、磁带、盒带、芯片)，光学介质(例如CD ROM)等。此类媒体可能包括提供此类指导材料的互联网站点的地址。
应当理解，本文描述的实例和实施方式仅出于说明目的，并且对本领域技术人员暗示了根据其的各种修改或改变造成，并且其将被包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的通过引用整体上并入本文。
实施例
提供以下实施例以举例说明，但不限制要求保护的发明。
实施例1
通过在基于纸的诊断内的双水相系统组分的依次水化，改进了用于细菌和抗体生物标志物的侧流免疫测定技术
我们的实验室开发了一种使用双水相系统(ATPS)来热力学浓缩目标分子的方法，以提高侧流免疫测定技术(LFA)的灵敏度，而无需样品制备步骤。具体而言，我们为PEG/磷酸钾和UCONTM-50-HB-5100/磷酸钾系统开发了纸内ATPS组分依次再溶解的新概念，并将其应用于我们的诊断设计，其只需要添加样品即可。我们从视觉上证明了成功的ATPS相分离，并进一步确定了脱水聚合物和盐再溶解顺序的重要性。最后，我们证明了我们的新颖设计将针对沙眼衣原体细菌和针对人免疫球蛋白M(IgM)抗体的LFA检出限提高了10倍，并在不到15分钟内提供了结果。我们技术的这一重大进步使LFA可以由未经培训或受过最少培训的人员操作，从而大大扩展了其作为POC测试的适用性。
材料和方法
修饰有金纳米颗粒的抗IgM抗体的制备(抗IgM GNP)
柠檬酸盐封端的金纳米颗粒根据Frens及其同事略加修改而合成(Frens(1972)Kolloid-Zeitschrift und Zeitschrift für Polym.250:736-741)。简而言之，将100μL的1％w/v氯化金(III)水化物溶液溶解在10mL的超纯无菌水中(Rockland ImmunochemicalsInc.,Gilbertsville,PA)。将溶液搅拌并加热至沸腾，然后加入90μL的2％(w/v)柠檬酸三钠溶液。在10分钟的过程中，使反应混合物的颜色变为红橙色。为了形成官能化的金纳米探针(GNP)，将60μL的100mM硼酸钠缓冲液(pH 9)添加到1mL柠檬酸盐封端的金纳米颗粒悬浮液中，然后加入16μg抗人IgM抗体(IgM-Ab)。将反应混合物在振荡器上放置30分钟，以促进抗体和GNP之间的配位键的形成。然后将100μL的10％w/v胎牛血清白蛋白(BSA)添加到悬浮液中，然后在振荡器上放置10分钟。通过离心除去游离抗体，并将沉淀重悬于100μL 100mM硼酸钠缓冲液(pH9.0)中。除非另有说明，否则所有材料、化学品和试剂均购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。
修饰有包被葡聚糖的金纳米颗粒的抗沙眼衣原体抗体的制备(抗CT DGNP)
根据Min和同事的方法合成了包被葡聚糖的金纳米颗粒(DGNPs)，并做了些微修改(Jang et al.(2013)Biomaterials,34:3503-3510)。由于我们的小组先前已证明这些DGNP在高盐条件下提供增强的稳定性，因此特意将它们与PEG/盐ATPS一起使用，而PEG/盐ATPS需要的盐浓度高于UCON/盐系统。简而言之，把得自明串珠菌属(Leuconostoc spp.)的葡聚糖750mg(Mw 15,000-25,000)溶解在10mL的超纯无菌水(Rockland ImmunochemicalsInc.,Gilbertsville,PA)中。将溶液搅拌并加热至沸腾，然后加入135μL的1％w/v氯化金(III)水化物溶液。反应混合物的颜色变为***，搅拌并煮沸约20分钟。为了形成官能化的DGNP悬浮液，将35μL的100mM硼酸钠缓冲液(pH 9)添加至1mL的DGNP悬浮液中，然后添加16μg的抗沙眼衣原体抗体(CT-Ab)。将反应混合物在振荡器上放置20分钟，以促进抗体和DGNP之间形成配位键。然后将100μL的10％w/v BSA添加到悬浮液中，然后在振荡器上放置10分钟。通过离心除去游离抗体，并将沉淀重悬于100μL 100mM硼酸钠缓冲液(pH 9.0)中。
用于检测沙眼衣原体和IgM的LFA测试的准备
这项研究中的所有LFA测试都采用了夹心测定形式。以此形式，存在足够量的靶标生物标志物会产生红色测试线，而生物标志物的缺乏或不足会导致没有可见的测试线。对照线的存在指示流动的完成和测试的有效性。在针对沙眼衣原体的LFA测试中，首先将2mg/mL抗沙眼衣原体抗体和25％w/v蔗糖的溶液印在硝酸纤维素膜上以形成测试线。与抗CTDGNP上的一次抗体结合的二次抗IgG抗体印刷在CT-Ab测试线的下游以形成对照线。然后将膜放置在真空密封的干燥室中过夜以固定抗体。
在针对人IgM的LFA测试中，首先将1.5mg/mL抗人IgM抗体和25％w/v蔗糖的溶液印刷在硝酸纤维素膜上以形成测试线。印刷与抗IgM GNP上的一次抗体结合的0.2mg/mL蛋白A溶液以形成对照线。将该膜也放置在真空密封的干燥室中过夜。
ARROW和TUBE设计的准备
为了使纸中的ATPS和LFA组分脱水，将玻璃纤维纸切成合适的几何形状，然后放在培养皿中。将ATPS组分的溶液调至合适的浓度，然后移液到纸段上。为了制备ARROW，使用的ATPS组分是聚乙二醇(PEG)8000和溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)中的磷酸钾盐。为了准备TUBE设计，使用的ATPS组分是UCONTM-50-HB-5100和溶解在PBS中的磷酸钾盐。为了使组分脱水，使用Labconco FreeZone 4.5冻干机(Fisher Scientific，Hampton，NH)将纸段在非常低的压力下放置2小时。
扫描电子显微镜(SEM)
将纸段切割并使用上述脱水方法进行处理。纸样品包括用15％(w/w)磷酸钾，10％(w/w)PEG，30％(w/w)UCONTM-50-HB-5100和3％(w/w)磷酸钾的混合物或无其他成分(例如，空白玻璃纤维)进行脱水。将纸段分别放置在覆盖有干燥碳带的支架上，并使用South BayTechnology离子束溅射/蚀刻系统(South Bay Technology,San Clemente,CA)对其溅射以金属覆层。使用纳米机械电子成像中心的ZEISS Supra 40VP SEM(ZEISS，Irvine，CA)和UCLA的CNSI，在10kV下以约500倍的放大倍率对样品成像。
确定PEG和磷酸钾再水化顺序的重要性
为了使纸上ATPS的相分离可视化，缀合BSA的DGNP(BSA-DGNP)(由于表面等离振子共振而呈***/浅紫色(Daniel&Astruc(2004)Chem.Rev.104:293-346；Peter et al.(2007)J.Phys.Chem.111:14664-14669))和亮蓝FCF染料(The Kroger Co.,Cincinnati,OH)都添加到在PBS中制备的ATPS的溶液中。我们确认，在试管中完成该系统的相分离后，BSA-DGNP彻底分配至贫PEG相，而Brilliant Blue染料则分配至富PEG相(Chiu et al.(2014)Lab Chip,14:3021-3028)。这使我们能够直接在纸上使用悬浮液来鉴定贫PEG相(颜色为***/浅紫色)、富PEG相(浅蓝色)和混合域区域(颜色为深蓝色/深紫色)。
为了更好地观察相分离行为，仅用单片ARROW进行实验，而没有锥形尖端。在一种情况下，磷酸钾在PEG的上游脱水，而在另一种情况下，PEG在磷酸钾的上游脱水。在第三种情况下，将PEG与磷酸钾混合，然后一起脱水。脱水组分的浓度为15％(w/w)的磷酸钾和10％(w/w)的PEG 8000。用佳能EOS 1000D照相机(Canon U.S.A.,Inc.,Lake Success,NY)拍摄图像。
确定UCONTM-50-HB-5100和磷酸钾的再水化顺序
为了首先确定比色指示剂在UCONTM-50-HB-5100/磷酸钾ATPS中的分配，将红色BSA偶联的GNPs(BSA-GNPs)和亮蓝FCF染料都添加到了ATPS PBS溶液中。在管中进行相分离后，BSA-GNPs彻底地分配到底部的贫UCON相，而亮蓝染料则分配到顶部的富UCON相。因此，对于脱水的ATPS的相分离，用红色的BSA-GNPs识别出贫UCON相。类似地，分别用浅蓝色和深紫色识别富含UCON的相和混合域区域。
使用UCON/盐系统在单张纸上测试了三种不同的条件。在一种情况下，UCONTM-50-HB-5100在磷酸钾的下游脱水，在第二种情况下，UCONTM-50-HB-5100在磷酸钾的上游脱水，在最后一种情况下，UCONTM-50-HB-5100与磷酸钾混合，然后一起脱水。脱水组分的浓度为30％(w/w)UCONTM-50-HB-5100和3％(w/w)磷酸钾。使用摄像机在不同时间点拍摄图像。
观察相分离动力学
为了使脱水ATPS系统的相分离可视化，我们仅使用我们的诊断物中的ARROW组分，其在脱水的10％(w/w)PEG 8000的上游具有脱水的15％(w/w)的磷酸钾。此设置不包含LFA膜或缀合垫。使含有BSA-DGNP和亮蓝染料的悬浮液沿着条流动，直到流体到达纸的末端为止。为了使脱水的UCON/盐ATPS的相分离可视化，将混合状态的UCON/盐垫用30％(w/w)和3％(w/w)的磷酸钾脱水到玻璃纤维纸条上。此设置不包括LFA膜或具有脱水GNP的试管。使含有BSA-GNP和亮蓝染料的PBS溶液沿着条向上流动。使用摄像机在不同时间点捕获图像。
使用整合的LFA和ARROW检测沙眼衣原体
对于仅LFA系统和整合的LFA和ARROW系统，执行LFA测试以检测0.5至500ng/μL之间的不同沙眼衣原体浓度，以使它们以对数刻度均匀分布。样品悬浮液包含在PBS中稀释的沙眼衣原体(EastCoast Bio,North Berwick,ME)。对于对照和脱水ATPS条件，每个测试的样品溶液体积分别为70和600μL。对照使用较小的样品体积，因为其没有ARROW组分，因此不需要太多的样品量即可进行测试。对照LFA条由样品垫(用1％BSA处理)、包含抗CT DGNP的缀合垫、硝酸纤维素膜和吸收剂垫组成。整合设计将初始样品垫替换为ARROW组件。我们没有在对照组中包括空白纸芯来模拟ARROW组分，因为与没有芯的情况相比，沙眼衣原体可以在空白的芯中丢失，所以其更是更严格的比较。在使用佳能EOS 1000D相机拍摄图像之前，使测试进行15分钟。
使用整合的LFA和TUBE检测人IgM
LFA测试是在人IgM(EastCoast Bio,North Berwick,ME)的PBS溶液中进行的，其中人IgM的浓度范围为0.01到10ng/μL。在此，用于对照情况和脱水ATPS条件的样品体积分别为25μL和150μL。对照LFA条由样品垫(用1％BSA处理)、包含抗IgM GNP的缀合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫组成。在TUBE设计中，省去了样品垫和缀合垫，取而代之的是用脱水的UCON/盐条和经过1％BSA水溶液处理的间隔物垫。将与对照情况相同量的GNP与BSA混合至BSA总浓度为1％(w/v)，然后将其施加至微量离心管。然后使用Labconco FreeZone 4.5冻干机(Fisher Scientific,Hampton,NH)将试管置于非常低的压力下1小时，剩下为干粉形式GNP。
为了使用TUBE设计进行测试，将IgM样品添加到样品管中以使GNP再水化并使其与靶标结合。然后，将具有脱水UCON/盐垫的测试条浸入试管中，然后将样品芯吸至吸收垫。在使用佳能EOS 1000D相机拍摄图像之前，使测试进行12分钟。
定量图像分析
使用先前由我们的实验室开发和描述的自定义MATLAB脚本分析图像(Jue et al.(2014)Biotechnol.Bioeng.111:2499-2507)。简而言之，在此程序中，LFA图像仅在膜边缘内部被裁剪，然后进行分析。该程序获取具有可见对照线和测试线的阳性测试的数个校准图像，并使用这些图像来确定从对照线到测试线的长度。然后，通过确定测试线上的平均像素强度并减去膜背景的平均像素强度来分析实验图像。最后，它返回作为所测试的最大信号强度(由所测试的最高浓度产生)的相对测试线信号。使用GraphPad Prism绘制像素强度。
结果与讨论
PEG和磷酸钾再水化顺序的重要性
我们新颖的ARROW设计引入了在流体流动过程中依次进行ATPS组分再溶解后未探索的相分离概念，这与传统的ATPS研究方法不同，后者研究的是在停滞溶液中以ATPS组分初始均匀分布检查相分离。因此，我们研究了PEG和磷酸钾水化顺序对纸内相分离行为的影响。为此，我们使用了由BSA-DGNP和亮蓝染料组成的悬浮液，其允许我们在悬浮液流动经过纸时观察到相分离过程，这是我们实验室先前使用的技术(Chiu et al.(2014)Lab Chip,14:3021-3028)。简而言之，BSA-DGNP分配到由***/浅紫色表示的贫PEG相中，而蓝色染料则分配到由浅蓝色表示的富PEG相中。宏观混合域的区域包含BSA-DGNP和蓝色染料，由深蓝色/深紫色表示。在玻璃纤维纸制备过程中，我们更改了脱水ATPS组分的位置，以使一种条件使脱水磷酸钾位于脱水PEG的上游(称为“盐→PEG”)，一种条件使脱水PEG位于脱水磷酸钾的上游(表示为“PEG→盐”)，第三个条件是PEG和磷酸钾的混合物在整个条上脱水。
从这些结果(图2)，我们注意到几个有趣的发现。首先，“混合”条件下没有导致可见的相分离，因为由于富PEG和贫PEG的区域的混合，整个条呈紫色。此外，与“PEG→盐”条件相比，领先的贫PEG液在“盐→PEG”条件下的***显著更暗，这表明“盐→PEG”条件在领先流体中包含更多的BSA-DGNP流体，因此在浓缩大物质时更有效。此外，与“PEG→盐”条件下的富PEG相相比，“盐→PEG”条件下的富PEG相随时间的推移显示更显著的体积增长。这表明，在“盐→PEG”条件下，新形成的贫PEG相能够脱离混合区域，并更有效地穿过尾随的富PEG相并收集到领先的贫PEG相中。这导致富PEG相随着混合域变小而变大。这种现象的一个可能原因是在富PEG相中形成与领先的贫PEG相连接的贫PEG相通道。对多孔介质内的多相流体流动的研究发现，当置换更多粘性流体时，较少粘性流体会形成优先的通道(Wooding&Morel-Seytoux(1976)Annu.Rev.Fluid Mech.8:233-274)。
我们假设，切换ATPS组分的位置(使PEG在磷酸钾之前再溶解)减少或防止形成贫PEG通道。当考虑在使先导流体从脱水PEG区过渡到脱水磷酸钾区的位置流过“PEG→盐”条件的样品溶液时，该流体包含高浓度的再溶解PEG，并且不含磷酸钾。随着流体流入脱水的磷酸钾区域，磷酸钾的浓度增加并且发生相分离。如果从传统的PEG和磷酸钾相图(Hatti-kaul(2000)Aqueous Two-Phase Systems Methods and Protocols,1st ed.HumanaPress)的角度研究这种情况，则该领先流体中的初始相分离将在高PEG和低磷酸钾浓度的区域处发生。如杠杆法所述(Hatti-kaul(2000)Aqueous Two-Phase Systems Methods andProtocols,1st ed.Humana Press；Morse(1997)J.Geol.105:471-482)，这种初始的相分离将导致较大的富PEG集相体积和较小的贫PEG相体积。我们假设较大的初始富PEG相阻止贫PEG相通道的形成和连接到领先的贫PEG相。这将阻止随后形成的贫PEG相通过和收集到前导流体中。我们对“PEG→盐”条件的观察结果支持了这一假设，特别是：(i)在领先的贫PEG相中BSA-DGNP的浓度较低，由较浅的***颜色表示并且(ii)存在宏观混合域区域，位于富PEG相后面，由深紫色表示。根据这些观察，我们决定在引入有LFA的最终设计中使用“盐→PEG”条件。
UCONTM-50-HB-5100和磷酸钾再水化顺序的重要性
在TUBE设计中，我们使用与前面所述相同的比色指示剂，研究了UCONTM-50-HB-5100和磷酸钾再水化在纸上的相分离行为的顺序。测试了三种不同的组合(图3)：一种是脱水磷酸钾位于脱水的UCONTM-50-HB-5100的上游(“盐→UCON”)，另一种是脱水的UCONTM-50-HB-5100位于脱水磷酸钾(“UCON→盐”)的上游，以及一种是两种成分混合在一起并均匀地沿整个玻璃纤维条(“混合”)施用。我们观察到“UCON→盐”条件几乎没有引起明显的分离，这可以通过BSA-GNP的混合域和蓝色染料沿条的混合所引起的紫色来看出。这与以下假设相符：大量的高浓度富UCON相阻止了贫UCON相通道的形成，在这种情况下，完全阻止了独特的贫UCON相的领先前锋的形成。另一方面，在“盐→UCON”条件下观察到相分离，其中在15秒内可见包含GNP的领先前锋。在“混合”条件下，我们注意到在10秒内发生了相分离，这表明将UCON和磷酸钾的混合物再水化未阻碍贫UCON相域的收集和贫UCON相的形成。尽管``混合”条件产生的领先前锋体积近似等于“盐→UCON”的情况，但它也产生了较低的流速，这已显示在改善LFA检出限方面具有其他优势(Choi et al.(2016)Anal.Chem.88:6254-6264)。因此，在稍后引入LFA的设计中使用了“混合”条件。
相分离的动力学
一旦优化了两个ATPS的再水化条件，我们就更详细地观察这两个系统中的相分离时间。重要的是证明我们的脱水方法允许使样品溶液在流动通过诊断过程中快速再水化。如图4的a图所示，我们使用ARROW设备观察到成功的相分离，其中在悬浮液流入脱水PEG区域后不久便发生了相分离。我们还注意到，贫PEG区域被收集到在富PEG区域前面的领先流体中，这模拟我们之前的工作中发现的重要现象(Chiu et al.(2014)Lab Chip,14:3021-3028)，考虑到贫PEG区会包含浓缩的沙眼衣原体，并且在流过缀合垫时需要处于领先流体中，因此这是必要的。流动通过ARROW的过程仅花费了大约30s。
有趣的是，我们观察到领先流体中的贫PEG区域随着流体流过脱水PEG区域而扩大，这在从时间点13到23s的过渡中最为明显。在此期间，我们还观察到富PEG区域扩大，但在脱水PEG区域的开始位置仍保持了其初始位置。这两个观察结果共同表明，脱水的PEG和磷酸钾的量足以在领先流体中进行初始相分离后继续进行相分离，并且新形成的贫PEG区域流动通过富PEG区域，以在领先的贫PEG区域进行收集。
在10秒内，在混合的UCON-盐设计(图4，b图)中也发现了相分离。在此，含有BSA-GNP的贫UCON区域收集到领先流体前锋，将GNP从较大的初始溶液中浓缩到很小的体积，这在整个流动研究过程中保持一致。相分离后(10s至30s)，通过条的流速显著下降，这很可能归因于形成粘稠的富UCON滞后相。
将LFA与脱水ATPS整合
然后，我们使用PEG/盐ATPS和UCON/盐ATPS的脱水组分来产生两种不同的测定设计。我们的脱水PEG/盐ATPS诊断设备(图5)由两个主要组件组成：ARROW和标准LFA。ARROW由层叠在一起的几层玻璃纤维片材组成。考虑到ATPS的功能是浓缩目标病原体，因此ARROW必须能够芯吸大量样品溶液。在每个玻璃纤维板的上游部分使15％(w/w)的磷酸钾脱水，而在每个玻璃纤维板的下游部分使10％(w/w)的PEG 8000脱水。重要的是在脱水PEG和片材尖端之间留出空白，以收集含有浓缩病原体的贫PEG相。每个片材的下游尖端逐渐变细以形成一个点，这有利于液体适当过渡到缀合垫中。
诊断的LFA部分由连接至硝酸纤维素膜(具有一次抗体和二次抗体)、然后是吸收垫的包含比色指示剂的缀合垫组成。LFA部分通过将缀合垫的小上游部分垂直装配到已在ARROW中切割的狭缝中而与ARROW相连。
将ARROW设计为浓缩能够自行分配到单相的生物标志物。由于沙眼衣原体的完整细菌相对较大(0.8至1μm)，因此无需干预即可将其彻底分配到贫PEG相。但是，许多传染性疾病生物标志物靶标，例如通常在HIV快速检测中检测的HIV抗体，其规模较小，并且不能彻底地分配到一个相。因此，必须利用另一种策略来浓缩这些生物标志物。此前，我们的小组证明了通常用于LFA中的金纳米颗粒缀合物可以直接添加到ATPS中，它们在聚合物/盐ATPS中会彻底分配至贫聚合物相(Mashayekhi et al.(2012)Anal.Bioanal.Chem.404:2057-2066；Chiu et al.(2014)Ann.Biomed.Eng.42(11):2322–2332)。以此形式，将GNP添加到UCON/盐样品溶液中，并在相分离发生之前使其与溶液中存在的靶标结合。相分离开始后，大的GNP-靶标复合物分配到贫UCON相，从而将靶标集中到贫UCON相。GNP的提取和应用LFA提高这些蛋白质靶标的检出限。在该研究中，我们集中于将这种机制引入脱水形式中，以使用人IgM抗体(970kDa，或直径约37nm)作为生物标志物靶标的模型来浓缩较小的靶标。
TUBE设计(图6)由两个主要组件组成：样品管和测试条，测试条由连接到标准LFA的UCON/盐垫组成。在这种设计中，至关重要的是在ATPS浓缩步骤之前，GNP进入整个样品溶液并与靶标结合。同样重要的是，结合靶标后，GNP同时进入脱水的ATPS区域，以使浓缩到所得的贫UCON相的领先前锋中的GNP最大化。达到这些设计标准的一种方法是干燥缀合物，并将其以粉末形式储存在样品微量离心管中。在这种情况下，首先将液体样品添加到试管中，其中将GNP溶解并立即与存在的任何人IgM结合。接下来，将测试条添加到样品管中，GNP共同吸起测试条，首先与UCON/盐垫接触。当发生这种情况时，脱水的UCON/盐混合物会被芯吸溶液再水化，引起富UCON相和贫UCON相的形成和分离。GNP浓缩在新形成的贫UCON流体前沿中，而新形成且更粘稠的富UCON相滞后。间隔垫包含BSA，以确保贫UCON相均匀过渡到基于硝酸纤维素的检测区，并防止GNP的非特异性结合。
玻璃纤维纸的空白玻璃纤维区域的SEM图像(图5)显示了基于多孔纤维的基质结构。脱水的PEG、磷酸钾和混合的UCONTM-50-HB-5100/磷酸钾区显示出相似的多孔结构，并增加了类似网的连接，我们认为其包含了大部分各自的ATPS组分(图5和图6)。这些图像表明，脱水过程不会使对正确芯吸样品流体至关重要的玻璃纤维纸的多孔结构显著变形。硝酸纤维素纸的SEM图像(图6)显示了典型的孔结构和大小，其容纳样品流体的运输。
使用整合的LFA和脱水的ATPS提高了沙眼衣原体和人IgM的检出限
然后，我们证明了我们的ARROW设计有效地浓缩沙眼衣原体样品悬浮液，导致改善的LFA的检出限。为此，我们在使用和不使用ARROW组件，在LFA测试条上运行了不同初始浓度的沙眼衣原体样品悬浮液。我们从LFA图的结果(图7)可以看出，仅LFA系统在约15.8ng/μL沙眼衣原体开始显示假阴性结果，而整合LFA和ARROW系统在1.58ng/μL沙眼衣原体附近显示假阴性结果。这从视觉上证明了检出限提高了10倍。
最后，我们证明了我们可以使用TUBE诊断来将人IgM有效地浓缩在PBS样品中，并改善LFA的检出限(图8)。在这种情况下，LFA对照的检出限被确定为0.31ng/μL。另一方面，整合的TUBE和LFA系统能够在0.031ng/μL准确检出的人IgM，从视觉上证明与LFA对照相比，检出限提高了10倍。
我们还使用由我们实验室开发和描述的定制MATLAB程序(图9)(Jue et al.(2014)Biotechnol.Bioeng.111:2499-2507)对LFA图像上测试线的像素对比度进行了量化。这使我们能够定量评估检出限的提高。对于任何指定浓度的沙眼衣原体，与仅LFA系统相比，整合的ARROW和LFA系统的相对测试线强度显著增加。例如，在50ng/μL沙眼衣原体时，仅LFA条件的相对强度为30.3％±10.8％，而整合的ARROW和LFA的相对强度为76.8％±11.1％。在所有IgM浓度下使用整合的TUBE和LFA对IgM测试进行图像分析时，也可以看到类似的结果。例如，在1.0ng/μL IgM下，仅LFA条件的相对像素强度为36.1％±6.6％，而整合的TUBE和LFA的像素对比度强度为66.1％±10.0％。在这两种情况下，当整合了脱水的ATPS成分时，图像分析都能够在较低的浓度下检测到比背景强度明显更高的测试线。
结论
在当前的研究中，我们提出了两个新的基于纸的诊断设计，这些设计能够通过ATPS组分的脱水来实现热力学目标浓度。使用这些基于纸设备，仅需添加样品，而无需其他样品制备步骤。我们在ARROW设计中使用了脱水的PEG/磷酸钾盐ATPS来浓缩和检测沙眼衣原体，在TUBE设计中使用了脱水的UCONTM-50-HB-5100/磷酸钾ATPS来浓缩和检测人IgM。具体而言，我们证明了ARROW和TUBE设计将其各自的生物标志物靶标的LFA检出限提高了10倍，同时仍在不到15分钟的时间内提供了结果。
具有更高灵敏度的LFA诊断(仍保持其低成本，快速的结果时间和易用性)，将显著增加其作为传染病POC筛查测试的适用性。我们已经证明，脱水的ATPS技术可以应用于适合通过通过LFA进行检测的各种不同目标。由于灵敏度差，大多数基于LFA的传染病诊断方法尚未开发出或未使用。考虑到脱水的ATPS可以提高LFA灵敏度，而无需向用户添加任何其他步骤，因此我们的新技术有可能创建许多可行的传染病LFA测试，供医生使用和作为非处方测试使用。
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