阅读说明：本技术 一种武夷菌素防治水稻稻瘟病的方法及应用 (Method for preventing and treating rice blast by wuyiencin and application ) 是由 张克诚 葛蓓孛 施李鸣 刘炳花 韦秋合 杨淼泠 于 2019-10-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种武夷菌素防治水稻稻瘟病的方法及应用,包括：第一步,将武夷菌素发酵液兑水稀释制成武夷菌素药剂,所述武夷菌素药剂浓度为500-1000ppm；第二步,在水稻分蘖期、孕穗期以及齐穗期喷施所述武夷菌素药剂；本发明的有益效果是：使用链霉菌CK-15得到的武夷菌素对水稻稻瘟病的预防以及治疗有良好的抑菌效果,经过试验发现,在相同剂量的情况下,武夷菌素的效果优于常用于治疗水稻稻瘟病的稻瘟灵和春雷霉素,可用来替代当前作为水稻稻瘟病常规治疗药剂的稻瘟灵,可以大幅减少化学农药的使用,同时与现有技术中用于治疗水稻稻瘟病的生物农药以及化学农药可以进行配合使用。(The invention provides a method for preventing and treating rice blast by wuyiencin and application thereof, comprising the following steps: firstly, diluting Wuyiencin fermentation liquor with water to prepare Wuyiencin medicament, wherein the concentration of the Wuyiencin medicament is 500-1000 ppm; secondly, spraying the wuyiencin medicament in the tillering stage, the booting stage and the heading alignment stage of the rice; the invention has the beneficial effects that: experiments show that the Wuyiencin obtained by using the streptomyces CK-15 has good bacteriostatic effect on prevention and treatment of the rice blast, and the Wuyiencin has better effect than isoprothiolane and kasugamycin which are commonly used for treating the rice blast under the condition of the same dosage, can be used for replacing isoprothiolane which is currently used as a conventional treatment medicament for the rice blast, can greatly reduce the use of chemical pesticides, and can be matched with biological pesticides and chemical pesticides for treating the rice blast in the prior art for use.)

一种武夷菌素防治水稻稻瘟病的方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其属于微生物代谢产物领域，具体涉及一种武夷菌素防治水稻稻瘟病的方法及应用。

背景技术

水稻是全球半数人口的主食。国际水稻研究所2005年提出，到2020年水稻产量要在2005年基础上再增产1/3才能达到全球人口的需求量，因此，保证水稻连续增产是全球农业生产的重要任务。目前，水稻稻瘟病是水稻生产上威胁最大的病害之一，由真菌梨抱霉菌感染引起，与纹枯病、白叶枯病并称水稻三大病害。水稻稻瘟病又称为稻热病，是水稻生产中常发的重大病害之一。稻瘟病为真菌性病害，在全球水稻生产区均可发生，具有突发性、流行性、毁灭性等特点，可造成水稻严重减产，重者减产幅度可达40％-50％，甚至绝收。

稻瘟病菌(有性态Magnaporthe oryzae；无性态Pyriculariaoryzae)是引起稻瘟病的致病真菌。它存在遗传多样性，具有生理小种繁多，遗传宗谱与生理小种不是完全对应关系；致病变异大，多次连续传代后也对稻瘟病菌的致病性有影响；有特异的侵染过程。侵入过程包括：①稻瘟病菌的分生孢子萌发，孢子尖端吸附于寄主表面；②分生孢子两端立生芽管，芽管特异性分化形成附着胞；③产黒色素的附着胞在细胞内的一定膨压作用下，生长侵染栓，穿透植株外皮和细胞壁，以便致病菌入侵；④侵染栓在细胞内分生成侵染菌丝，侵染菌丝的穿透力极强，可以穿透寄主细胞壁；⑤稻瘟病菌在高度潮湿的环境中的潜育期在3-7d，被侵染的部位会生长新的分生孢子梗，分生孢子梗产生新的分生孢子，这些孢子将开始新一轮的侵染循环。由于稻瘟病菌的这些特点，导致稻瘟病难防难治，成为了农民生产和专家研究中的大难题。

水稻稻瘟病田间症状：水稻稻瘟病的病原为半知菌亚门真菌灰梨孢和稻梨孢，主要对水稻等寄主植物的地上部分产生危害，在整个水稻生育期均可发生，可以分为苗瘟、叶瘟、节瘟、穗颈瘟和谷粒瘟。

在现有技术中，对于水稻稻瘟病的治疗常常使用稻瘟灵等化学农药，而化学农药的大量使用会给土壤环境带来危害，同时会有一部分农药残留在水稻中，影响水稻的品质，同时容易带来抗药性。为了解决上述问题，生物农药成为了本领域专业人员的研究重点，现有技术中，灭稻瘟菌素、春雷霉素均对稻瘟病有治疗效果，但是治疗效果却没有显著提高，同时存在见效慢的缺点，而且单一生物农药的使用会带来抗药性的问题，因此扩大稻瘟病菌的杀菌杀虫谱也是亟待解决的问题。

发明内容

本发明克服了现有技术中的不足，本专利目的之一是提供了一种武夷菌素防治水稻稻瘟病的方法方法，通过利用武夷菌素抑制水稻稻瘟病病菌的发生及流行，以免水稻减产，同时避免在水稻上使用过多化学农药。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

武夷菌素用于水稻稻瘟病防治的应用。

本发明还提供了一种武夷菌素的制备方法，步骤如下：

第一步，活化链霉菌CK-15，菌株进行活化，将菌丝或孢子接种于MS培养基，置于28摄氏度的电热恒温培养箱中培养3-5d；

第二步，将活化成功的CK-15用划下部分菌块备用，在超净台中，用酒精灯火烧锥形瓶瓶口，将菌块迅速置于锥形瓶中并封口，在28℃，200r/min条件下摇床震荡培养72h，滤纸过滤发酵液得到武夷菌素。

进一步，在上述制备武夷菌素的第一步中，所述链霉菌CK-15的菌株活化采用平板划线法。

本发明还提供了一种武夷菌素治疗水稻稻瘟病的方法，步骤如下：

第一步，将武夷菌素发酵液兑水稀释制成武夷菌素药剂，所述武夷菌素药剂浓度为500-1000ppm；

第二步，在水稻分蘖期、孕穗期以及齐穗期喷施所述武夷菌素药剂。

进一步，所述第一步骤中，所述武夷菌素发酵液的浓度为1000-2000ppm。

进一步，在所述第二步骤的喷施过程中，所述水稻在分蘖期、孕穗期以及齐穗期每7-10天喷一次所述武夷菌素药剂。

进一步，所述武夷菌素药剂的喷施量为：每亩水稻稻田中喷施所述武夷菌素药剂10升。

本发明还提供了一种武夷菌素预防水稻稻瘟病的方法，步骤如下：

第一步，将武夷菌素发酵液兑水稀释制成武夷菌素药剂，武夷菌素药剂的浓度为50-100ppm；

第二步，在取水稻种子浸泡于所述武夷菌素药剂中，浸泡时间为24h；

第三步，将浸泡后的水稻种子种植。

本发明一种武夷菌素用于防治水稻稻瘟病，将武夷菌素应用于治疗水稻的稻瘟病，经过大量实验证明，武夷菌素对水稻稻瘟病有显著的治疗效果，为水稻稻瘟病的防治提供了一种新的途径；

利用武夷菌素防治水稻稻瘟病的有益效果为：使用链霉菌CK-15得到的武夷菌素对水稻稻瘟病的预防以及治疗有良好的抑菌效果，申请人经过试验发现，在相同剂量的情况下，武夷菌素的效果优于常用于治疗水稻稻瘟病的稻瘟灵和春雷霉素，这说明武夷菌素可用来替代当前作为水稻稻瘟病常规治疗药剂的稻瘟灵，可以大幅减少化学农药的使用，减轻农药对于土壤环境的危害，同时与现有技中用于治疗水稻稻瘟病的生物农药以及其他化学农药可以进行联合使用，防止病菌迅速产生抗药性，提升经济效益。而且武夷菌素对蔬果，粮食等作物的真菌病害有很好的防效，同时在农作物上喷施武夷菌素还具有一定的增产作用。

同时，在本发明中，武夷菌素对于水稻稻瘟病的预防以及治疗属于微生物制剂的应用，作为农药的替代品，不会对水稻带来副作用，提高了农产品的食用安全。

附图说明

图1是1000ppm武夷菌素标品液相色谱图；

图2是链霉菌CK-15发酵所得武夷菌素液相色谱图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。

实施例一

武夷菌素的制备

武夷菌素的制备首先活化链霉菌CK-15，菌株纯化采用平板划线法，用无菌牙签挑取CK-15的菌丝或孢子接种于MS培养基，在本实施例中采用CK-15的孢子作为接种材料，将接种后的MS培养基置于28摄氏度的电热恒温培养箱中培养3d。

其中上述的MS培养基的成分为：甘露醇20g，黄豆面20g，琼脂粉20g。

将活化成功的CK-15用无菌牙签划下1cm2大小的菌块备用，在超净台中，用酒精灯火烧锥形瓶瓶口，在锥形瓶内加入武夷菌素发酵培养基，将菌块迅速置于锥形瓶中并封口，在28℃，200r/min条件下摇床震荡培养72h，滤纸过滤发酵液得到武夷菌素。

武夷菌素发酵培养基的成分为：玉米粉20g/L，葡萄糖39g/L，黄豆面20g/L，氯化铵4g/L，碳酸钙2.65g/L，氯化铵0.4g/L。

武夷菌素效价评定

在制备完成后，对的到的武夷菌素进行测定其效价时，首先将1000ppm的武夷菌素作为标品，配制1000ppm武夷菌素作为标品。将发酵得到的武夷菌素通过0.22μm的微孔过滤器过滤1-1.5μl作为样品。将标品和样品进行高效液相色谱法进行分析根据样品的峰面积与标品的峰面积，得到武夷菌素的效价。液相色谱条件：ZORBAX SB-AQ(4.6mm*250mm，5μm)型色谱柱；1.4g/L三氯乙酸水溶液为流动相，流速为1m/s；柱温25℃；检测波长254nm。

通过高效液相色谱法对1000ppm武夷菌素标品和链霉菌CK-15发酵所得武夷菌素进行液相分析得到液相色谱图如图1、图2所示，其中1000ppm武夷菌素标品的峰面积为4618445，链霉菌CK-15发酵所得武夷菌素的峰面积为4618445。所以算得武夷菌素的效价为1077ppm。

CK-15对水稻稻瘟病菌的平板抑菌测定

首先对水稻稻瘟病菌RB22进行活化，从RB22培养基上取一小块菌饼置于米糠培养基中央，置于25摄氏度恒温培养室中，在光照下培养7d后可进行下一次活化，14d后可完成产孢。活化成功的RB22培养基长满白色菌丝和孢子。

上述米糠培养基成分为：燕麦3g，琼脂粉1.5g。

从活化好的RB22培养基上取一菌饼置于PDA培养基中央。在菌饼的一侧，用灭菌的牙签沾取CK-15，并在菌饼两侧各划一条直线。置于28℃恒温培养箱，倒置培养10d后观察结果。

上述PDA培养基的成分为：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，水1000mL。

从最后PDA培养基上的灭菌情况来看，在菌饼的两侧划线处形成明显的抑菌圈，所以可以得知CK-15中含有某种物质可以对水稻稻瘟病菌具有明显的抑制作用，因此我们能推测通过将链霉菌CK-15发酵得到的发酵液中同样含有抑制水稻稻瘟病菌的物质。

农用抗生素对水稻稻瘟病菌的平板抑菌测定

将武夷菌素、灭稻瘟菌素分别稀释至200ppm、400ppm、600ppm、800ppm、1000ppm。从活化成功的RB22培养基中加入无菌水，将菌丝和孢子洗下。将孢子悬浮液均匀涂布在培养基上，通过牛津杯法在培养基各中放置两枚牛津杯，分别加入200μl相同浓度的武夷菌素和春雷霉素。将平板置于28℃恒温培养箱中，培养5d后观察结果。结果如表1所示。

表1不同浓度农用抗生素对水稻稻瘟病菌形成抑菌圈

该表1为不同浓度农用抗生素对水稻稻瘟病菌形成抑菌圈的对比，由该表格可得知，灭稻瘟菌素S(纯品)对水稻稻瘟病菌的杀菌效果不佳，而武夷菌素的效果明显优于灭稻瘟素S，其中当武夷菌素的浓度为1000ppm时，杀菌效果为最佳。

由此可见，武夷菌素对于水稻稻瘟病有抑制杀菌效果，而且灭稻瘟菌素在使用浓度超过40mg/L时，易发生药害。对人的眼睛和皮肤有刺激性，不慎入眼会引起结膜炎，皮肤会出现疹子，所以使用武夷菌素来治疗稻瘟病可以有效避免对人体的损害。

多种药物对水稻稻瘟病菌的平板抑菌测定

配置1000ppm武夷菌素、春雷霉素和稻瘟灵。从已活化好的RB22培养基上取菌饼置于米糠培养基中央，在菌饼两侧分别置于一枚牛津杯，在牛津杯中分别加入1000ppm武夷菌素、春雷霉素、稻瘟灵和水各200μl。静置一段时间后，移至28摄氏度恒温培养箱中培养7d后观察结果。

根据上述实验，验证了当武夷菌素的浓度为1000ppm时，杀菌效果最佳，所以选取浓度为1000ppm的春雷霉素、稻瘟灵分别与水进行平板抑菌测定。最终，浓度为1000ppm的武夷菌素效果明显优于同浓度的春雷霉素和稻瘟灵，其中春雷霉素为防治水稻稻瘟病的农用抗生素，稻瘟灵为防治水稻稻瘟病的化学农药，所以该试验验证了在平板抑菌测定实验中，武夷菌素的效果明显优于同浓度的农用抗生素和化学农药。

多种药物对水稻稻瘟病菌的抑菌率测定

将武夷菌素用0.22μm的微孔过滤器过滤。配置1000ppm、500ppm的武夷菌素和春雷霉素，将配置好的抗生素分别加2ml到米糠培养基中，同时增加空白对照组，混匀静置，待其凝固。分别于培养基中央放置一枚菌饼。将培育基置于25℃恒温室，光照下培养7d后观察结果。

通过测量加入不同浓度农用抗生素的培养基菌落直径，并计算其抑菌率得到表2。

表2不同浓度农用抗生素抑菌效果

从该表2得知，武夷菌素的效果明显优于常用于治疗水稻稻瘟病的春雷霉素，其中，浓度为1000ppm的武夷菌素的抑菌率更是达到了62.5％。上述的平板抑菌实验证明了1000ppm的武夷菌素的杀菌效果最优，证明了武夷菌素应用到水稻稻瘟病的治疗的可行性。

实验室中多种药物对水稻稻瘟病的治疗

处理种子：将nipponbare水稻种子用水清洗，挑出损伤种子，挑选饱满种子240粒左右装入锥形瓶中，用去离子水清洗2次，用0.02％的NaClO溶液浸泡水稻种子一天后，用去离子水洗净后，浸泡两天。

处理土壤：将育苗基质用报纸分装后放入高温蒸汽灭菌锅中进行灭菌24h。

种植水稻：将灭菌土分装至直径为5cm的花盆中，每个花盆种7-9粒种子，一共12盆，放入托盘中，托盘中加2/3的水，每天浇水。

制作水稻稻瘟病菌孢子悬浮液：将RB22培养基置于25℃恒温培养室光照培养2周使其充分产孢，然后向培养基中加3-5ml的无菌水用涂布棒将培养基上的孢子洗下。

水稻稻瘟病接种：将4周龄的水稻移至温室，用一次性医用注射器分别对每个水稻材料接种稻瘟病混合菌株的孢子悬浮液，在距离水稻茎顶端约10cm处，将稻瘟病菌株孢子悬浮液注入稻茎中央部位，直到心叶冒出孢子悬浮液为止，每个材料注射3株，每株3个分蘖。4d后按照稻瘟病抗性调查分级标准统计数据

喷施药物：将接种成功的将3盆水稻划为一组，共分4组，并标记T1为对照组、T2为武夷菌素组、T3为稻瘟灵组、T4为春雷霉素组，分别对实验组两天喷施一次、每次喷施5ml，1000ppm的武夷菌素、稻瘟灵、春雷霉素，喷施三次按照稻瘟病抗性调查分级标准统计数据。

对发病的叶片进行统计，按照稻瘟病抗性调查分级标准进行数据统计统计情况如表3。

表3水稻接种后叶片发病等级统计

水稻接种成功，如上述步骤将植株分成四组，对四组水稻进行不同药物的喷施，隔天喷施一次，共喷施三次，根据叶片发病情况，按照稻瘟病抗性调查分级标准对每株水稻进行数据统计，实验组统计情况如表4。

表4施药三次后水稻发病等级统计

根据防治效果计算公式：防治效果(％)＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％，分别计算出武夷菌素、春雷霉素、稻瘟灵的防治效果：

武夷菌素：(58.41-17.89)/58.41*100％＝69.37％

春雷霉素：(54.44-23.57)/54.44*100％＝56.74％

稻瘟灵：(52.06-30.71)/52.06*100％＝41.01％

根据防治实验，可以得出武夷菌素对于水稻稻瘟病的防治效果强于春雷霉素以及稻瘟灵对水稻稻瘟病的治疗效果。

武夷菌素在水稻稻田中的应用

根据上述制备武夷菌素的方法制得武夷菌素，取2000ppm的武夷菌素发酵液兑水稀释制成1000ppm的武夷菌素药剂，将武夷菌素药剂置于4℃冰箱中冷藏。

上述示例中，武夷菌素发酵液的浓度不局限于2000ppm，在浓度范围为1000-2000ppm中选择；在兑水稀释后，武夷菌素药剂的浓度不局限于1000ppm，可以在500-1000ppm中任意选择。

等到水稻播种完成后，在水稻分别进入分蘖期、孕穗期以及齐穗期时，经过观察，发现水稻有稻瘟病的症状则开始对每亩水稻喷施武夷菌素药剂。在水稻的分蘖期、孕穗期以及齐穗期期间，每七天喷一次武夷菌素药剂，每亩稻田每次喷施10升武夷菌素药剂。

上述步骤中，对水稻进行喷施武夷菌素药剂时，在水稻的分蘖期、孕穗期以及齐穗期的喷施时间间隔为7-10天，可根据水稻稻瘟病的症状进行调整，当水稻稻瘟病症状减轻后可每10天喷一次武夷菌素药剂。

本发明一种武夷菌素用于防治水稻稻瘟病，将武夷菌素应用于治疗水稻的稻瘟病，经过大量实验证明，武夷菌素对水稻稻瘟病有显著的治疗效果，为水稻稻瘟病的防治提供了一种新的途径；

利用武夷菌素防治水稻稻瘟病的有益效果为：使用链霉菌CK-15得到的武夷菌素对水稻稻瘟病的预防以及治疗有良好的抑菌效果，申请人经过试验发现，在相同剂量的情况下，武夷菌素的效果优于常用于治疗水稻稻瘟病的稻瘟灵和春雷霉素，这说明武夷菌素可用来替代当前作为水稻稻瘟病常规治疗药剂的稻瘟灵，可以大幅减少化学农药的使用，减轻农药对于土壤环境的危害，同时与现有技术中用于治疗水稻稻瘟病的生物农药以及化学农药可以进行联合使用，防止病菌迅速产生抗药性。而且武夷菌素对蔬果，粮食等作物的真菌病害有很好的防效，同时在农作物上喷施武夷菌素还具有一定的增产作用。

同时，在本发明中，武夷菌素对于水稻稻瘟病的预防以及治疗属于微生物制剂的应用，作为农药的替代品，不会对水稻带来副作用，提高了农产品的食用安全。

实施例二

如实施例一所述制备武夷菌素后，种植水稻。

处理种子：将nipponbare水稻种子用水清洗，挑出损伤种子，挑选饱满种子240粒左右装入锥形瓶中，用去离子水清洗2次，用0.02％的NaClO溶液浸泡水稻种子一天后，用去离子水洗净后，浸泡两天。

处理土壤：将育苗基质用报纸分装后放入高温蒸汽灭菌锅中进行灭菌24h。

种植水稻：将灭菌土分装至直径为5cm的花盆中，每个花盆种7-9粒种子，一共12盆，放入托盘中，托盘中加2/3的水，每天浇水。

在水稻4周龄时，并标记T1为对照组、T2为武夷菌素组、T3为稻瘟灵组、T4为春雷霉素组，分别对实验组两天喷施一次、每次喷施5ml，1000ppm的武夷菌素、稻瘟灵、春雷霉素，喷施两次。

制作水稻稻瘟病菌孢子悬浮液：将RB22培养基置于25℃恒温培养室光照培养2周使其充分产孢，然后向培养基中加3-5ml的无菌水用涂布棒将培养基上的孢子洗下。

水稻接种水稻稻瘟病：将施过农药的水稻装进收纳箱中，将制备好的孢子悬浮液用无菌50ml的小喷壶均匀的喷在水稻叶片上，用保鲜膜将收纳箱箱口封好放进温度为26℃，湿度为80％的恒温光照培养箱中培养3-5d后，观察结果并根据稻瘟病抗性调查分级标准统计数据。

表5

根据表中的数据，武夷菌素对于水稻稻瘟病的预防效果强于春雷霉素以及稻瘟灵的预防效果。

武夷菌素用于水稻稻田中预防水稻稻瘟病

在水稻种植前，挑选需要种植的水稻种子，这些水稻种子为从无稻瘟病的稻田中留选的种子，将武夷菌素发酵液兑水制成武夷菌素药剂，武夷菌素发酵液的浓度为2000ppm，兑水稀释后，武夷菌素药剂的浓度为1000ppm，将待种植的水稻种子浸泡于1000ppm的武夷菌素药剂中，浸泡时间为24h，浸泡完成后洗净药液，将浸泡后的水稻种子催芽后，种植水稻。

经过试验证明，在水稻的各个生长时期，水稻稻瘟病的发病率远低于不进行武夷菌素处理的水稻。这说明，武夷菌素对于水稻稻瘟病的预防有显著的效果，而且武夷菌素对蔬果，粮食等作物的真菌病害有很好的防效，同时喷施武夷菌素还具有一定的增产作用，另外使用武夷菌素可以减少农药的使用，保护环境，有利于生态农业的发展。

以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。