阅读说明：本技术 用于预防腹（盆）腔术后组织粘连的二硫键交联透明质酸凝胶及其制备方法 (Disulfide bond cross-linked hyaluronic acid gel for preventing abdominal (pelvic) cavity postoperative tissue adhesion and preparation method thereof ) 是由 王云云 张红晨 王坤 胡慕兰 王昕宇 宋文俊 舒晓正 于 2019-09-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种用于预防腹(盆)腔术后组织粘连的二硫键交联透明质酸凝胶,二硫键交联透明质酸的含量在3～8mg/mL之间。本发明二硫键交联透明质酸凝胶用于腹(盆)腔术后组织粘连预防时具有独特的优势,不仅具有良好生物相容性,且具有良好的组织粘连预防效果。本发明还提供了用于预防腹(盆)腔术后组织粘连的二硫键交联透明质酸凝胶的制备方法。(The invention discloses a disulfide bond cross-linked hyaluronic acid gel for preventing tissue adhesion after abdominal (pelvic) cavity surgery, wherein the content of disulfide bond cross-linked hyaluronic acid is 3-8 mg/mL. The disulfide bond cross-linked hyaluronic acid gel has unique advantages when being used for preventing tissue adhesion after abdominal (pelvic) cavity operation, and not only has good biocompatibility, but also has good tissue adhesion prevention effect. The invention also provides a preparation method of the disulfide bond cross-linked hyaluronic acid gel for preventing the tissue adhesion after abdominal (pelvic) cavity operation.)

用于预防腹(盆)腔术后组织粘连的二硫键交联透明质酸凝胶 及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及用于预防腹(盆)腔术后组织粘连的二硫键交联透明质酸凝胶，还涉及所述用于预防腹(盆)腔术后组织粘连的二硫键交联透明质酸凝胶的制备方法。

背景技术

手术后组织粘连是自然愈合过程中发生的不可避免的病理生理现象，系由于体内疤痕组织形成的一种纤维素带，造成了正常情况下本不相连的组织或器官粘在一起，形成了异常的结构。通常腹(盆)腔手术后组织粘连情况最为严重，发生率可高达90％以上，术后并发症包括肠梗阻、继发性***症以及腹(盆)腔疼痛等(Sikirica等，BMC Surg.2011，11：13；ten Broek等，BMJ 2013，347：f5588)。

尽管外科手术过程中应该尽最大努力预防术后组织粘连的形成，但粘连作为自然愈合过程的一部分，即便再细致的手术技巧也不足以预防粘连的发生。此外，到目前为止，还没有任何一种已经上市的治疗方法或是“特效药”能够在粘连形成后缩减它。许多出现粘连相关并发症的患者需要再次手术进行探查，如果发现确实存在源自前次手术的粘连，则要行粘连松解术以去除粘连。虽然粘连松解术可作为某些患者的解决方案，但粘连的再形成现象仍然频繁发生。因此，预防性粘连防治策略及开发出安全有效的粘连预防产品成为了当前的重点(DeWilde等，Gynecol Surg.2007，4：243-253)。

粘连预防屏障材料(Adhesion Barrier)可将受损的组织在其修复过程中进行物理性隔离，因此理论上可有效减少粘连的形成。理想的粘连预防屏障材料应该具有良好的安全性，在体内可降解吸收，且可适用于开腹及腹腔镜的手术方式，能够有效地预防腹(盆)腔术后粘连的形成。当前市面上已有几种粘连预防屏障材料获准在腹(盆)腔术后使用，但它们在使用方法、功效及安全性方面存在差异，仍有很大的改进空间(Tulandi等，CurrOpin Obstet Gynecol.2005，17：395-398；DeWilde等，Gynecol Surg.2007，4：243-253；Arung等，World J Gastroenterol.2011，17：4545-4553；Practice Committee of theAmerican Society for Reproductive Medicine in collaboration with the Societyof Reproductive Surgeons，Fertil Steril.2013，99：1550-1555)。

透明质酸是一种由重复二糖单元(α-1，4-D-葡萄糖醛酸和β-1，3-N-乙酰-D-葡萄糖胺)组成的非磺化糖胺聚糖，在所有***中作为细胞外基质的主要成份存在，具有良好的生物相容性和独特的理化性质以及可促进创伤愈合的生物学功能。透明质酸曾经被认为是一种理想的粘连预防屏障材料，但由于其具有流动性且在体内会被透明质酸酶快速降解，因而无法有效地将受损的组织在其修复过程中进行物理性隔离，因此不具有显著的粘连预防效果(Wiseman，In：diZeraga GS，et al.，editors.Peritoneal Surgery.New York：Springer-Verlag；2000，pp 401-417)。

交联反应可有效降低透明质酸的流动性和延缓其在体内的降解吸收，交联的透明质酸有可能将受损的组织在其修复过程中进行有效的物理性隔离，因而在预防腹(盆)腔术后粘连方面具有良好的潜在前景。然而，不当的交联反应也可能损害透明质酸的生物相容性，例如三价铁离子交联的透明质酸钠凝胶引起了多起严重不良事故(Wiseman，AnnSurg.2006，244：630-632)。

本发明申请人在专利文件中(CN 102399295A)公开了一种二硫键交联的透明质酸凝胶，最大限度保持了透明质酸的初始结构、生理功能和生物相容性，同时有效延缓了透明质酸在体内的降解吸收和溶解流动性，但其预防腹(盆)腔术后粘连的应用尚未得到详细研究。

发明内容

本发明提供了一种用于预防腹(盆)腔术后组织粘连的二硫键交联透明质酸凝胶，具有良好的生物相容性及显著的腹(盆)腔术后组织粘连预防效果。

本发明通过以下技术方案实现：

一种用于预防腹(盆)腔术后组织粘连的二硫键交联透明质酸凝胶，其特征在于，该凝胶中二硫键交联透明质酸的含量在3～8mg/mL之间。

在本发明中，所述的二硫键交联透明质酸的含量表示为二硫键交联透明质酸凝胶单位体积中含有的二硫键交联透明质酸的重量(mg/mL)，优选在4～7mg/mL之间，特别优选在4.5～6mg/mL之间。

粘连预防屏障材料(adhesion barrier)通过将受损的组织在其修复过程中进行物理性隔离，以达到预防粘连的目的。如本领域技术人员所熟知，交联透明质酸凝胶的强度随着交联透明质酸含量的提高而增加，可提供更好的物理性隔离效果，因此应具有更好的粘连预防效果。对于本领域技术人员而言，为了进一步优化提高二硫键交联透明质酸凝胶的粘连预防效果，本领域技术人员能够预见的技术方案是提高二硫键交联透明质酸的含量。

在先的专利文件(CN 102399295A)公开了二硫键交联透明质酸凝胶(10mg/mL)具有比非交联透明质酸溶液更好的腹(盆)腔粘连预防效果；因此，可以预期的是更高含量的二硫键交联透明质酸凝胶可进一步增强腹(盆)腔粘连预防的效果(Yang等，BMCBiotechnology 2010，10：65；De Iaco等，Fertil Steril.1998，69：318-323)。

然而，与本领域技术人员所熟知的常识相反，本发明发现当二硫键交联透明质酸的含量较低时(3～8mg/mL)，二硫键交联透明质酸凝胶具有比高含量时(10mg/mL)更好的腹(盆)粘连预防效果。同时具有良好的生物相容性。

本发明所采取的技术方案是超出常识的，取得的有益效果是意想不到的。

本发明的再一个目的是提供所述的用于预防腹(盆)腔术后组织粘连的二硫键交联透明质酸凝胶的制备方法。所述制备方法的技术方案是透明质酸巯基化衍生物的水溶液经氧化过程即可得到本发明所述的二硫键交联透明质酸凝胶。

上述的氧化过程通常可在氧气的作用下进行，如空气中的氧气和/或水溶液中的溶解氧；在此过程中，不需添加交联剂，巯基被氧化形成二硫键交联，副产物为水，不需进一步纯化。在上述的制备过程中，可对透明质酸巯基化衍生物水溶液进行过滤除菌，然后在无菌条件下制备本发明所述的二硫键交联透明质酸凝胶；亦可采用终端灭菌等方式进行灭菌，终端灭菌方式可采用本领域技术人员所熟知的湿热灭菌等方式。

在本发明中，所述的透明质酸巯基化衍生物是指含有巯基的透明质酸衍生物，可通过透明质酸的巯基化改性制备，也包括各种透明质酸衍生物(如羧甲基透明质酸、乙酰化透明质酸等)进一步通过巯基化改性所制备的巯基化衍生物。透明质酸或其衍生物的侧链羧基、侧链羟基、以及还原性端基等通常是可进行巯基化改性的活性官能团，例如专利文献WO 2009/006780A1等在先文件所公开的多种透明质酸巯基化衍生物制备方法均可用于制备本发明所述的透明质酸巯基化衍生物；该等透明质酸巯基化衍生物较好保持了透明质酸的初始结构、生理功能和生物相容性，且可实现有效的二硫键交联，显著延缓体内的降解吸收和流动性。

在本发明中，各种巯基含量的透明质酸巯基化衍生物都可用于制备本发明所述的二硫键交联透明质酸；巯基含量表示为每克透明质酸巯基化衍生物中含有的巯基的微摩尔数(μmol/g)，优选的巯基含量为10～100μmol/g，特别优选的巯基含量为20～70μmol/g。

在本发明中，所述的透明质酸也包括其盐的形式(如钠盐、钾盐、锌盐、钙盐等)。

本发明的有益效果是：

本发明所述的用于预防腹(盆)腔术后组织粘连的二硫键交联透明质酸凝胶，采取了与本领域技术人员所熟知的常识相反的技术方案，不仅具有良好生物相容性，且取得了意想不到的腹(盆)腔术后组织粘连预防效果。本发明所述的制备方法具有不需要添加交联剂、制备工艺简单、不含杂质等许多优点。

附图说明

图1.二硫键交联透明质酸的含量对凝胶动力粘度的影响。

图2.二硫键交联透明质酸的含量对粘连涉及面积的影响。

图3.二硫键交联透明质酸的含量对粘连严重程度的影响。

图4.二硫键交联透明质酸的含量对粘连长度的影响。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

实施例1：二硫键交联透明质酸凝胶的制备

透明质酸巯基化衍生物以180KDa分子量的透明质酸钠为原料，采用Shu等所报道的方法制备(Shu等，Biomacromolecules 2002，3：1304-1311)，其巯基含量分别为24μmol/g、38μmol/g和57μmol/g。

将上述透明质酸巯基化衍生物溶解得到含量为3mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL和10mg/mL的水溶液，调节溶液pH值为7.4，除菌过滤后转移入无菌玻璃容器；室温密闭静置保存4周，溶液失去流动性并形成二硫键交联透明质酸凝胶。

实施例2：二硫键交联透明质酸凝胶的动力粘度性能评价

采用旋转粘度计，在剪切速率不小于0.25Hz的条件下(25±0.1℃)，按照中华人民共和国药典(2010年版)二部附录VIG第二法评价实施例1所制备的二硫键交联透明质酸凝胶的动力粘度。

肉眼观察可见二硫键交联透明质酸含量高的凝胶具有更好的强度，测试结果也表明含量高的凝胶具有更高的动力粘度。二硫键交联透明质酸的含量对凝胶动力粘度的影响参见图1。二硫键交联透明质酸含量为10mg/mL的凝胶具有最高的动力粘度(＞10,0000mPa.s)，超出了检测仪器测量上限，因此在图1中标识为大于10,0000mPa.s。

透明质酸巯基化衍生物的巯基含量亦对凝胶的动力粘度有一定的影响，高巯基含量透明质酸巯基化衍生物所制备的凝胶具有较高的动力粘度。

实施例3：二硫键交联透明质酸凝胶的细胞相容性评价

参照ISO10993.5-2009的标准评价实施例1制备的二硫键交联透明质酸凝胶的体外细胞毒性。

大鼠成纤维细胞(ATCC CCL1，NCTC Clone 929，Clone of Strain L)使用含抗生素(100u/mL青霉素，100μg/mL链霉素)和10％血清的RPMI 1640培养基培养于37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下。当细胞生长至趋近融合，使用膜蛋白酶消化，收集细胞并调整细胞浓度为5×10⁴/mL。

使用含10％血清的RPMI 1640培养基为浸提介质，每毫升浸提介质中加入0.2g二硫键交联透明质酸凝胶，37℃浸提24小时；然后用10％血清的RPMI 1640培养基稀释浸提原液，得到浸提原液含量分别为100％、50％、25％和12.5％的四种剂量的稀释浸提液。

将上述细胞悬液加入96孔板，每孔100μL(5×10³个细胞)，37℃，5％CO₂培养24小时；弃去培养基，分组加入稀释浸提液(100％、50％、25％和12.5％四种剂量)、阴性对照、空白对照和阳性对照，每组5孔，放入37℃，5％CO₂饱和水蒸汽培养箱内培养24小时。

培养结束后，取出细胞培养板，弃去其中培养基，加入100μL含血清10％的RPMI1640培养基，每孔加入MTT染色剂50μL(1mg/mL)，放入37℃，5％CO₂饱和水蒸汽培养箱内培养3小时；弃去培养板内培养基，每孔加入100μL异丙醇，震荡混匀，测定570nm波长吸收值。

根据各组吸收值与空白对照组吸收值的比值计算细胞相对增殖率，空白对照组的细胞相对增殖率计为100％。

阴性对照组的细胞相对增殖率与空白对照组相同，阳性对照组的细胞相对增殖率小于10％，结果符合预期。各二硫键交联透明质酸凝胶测试组的细胞相对增殖率均＞90％，没有细胞毒性，表明所测试的二硫键交联透明质酸凝胶具有良好的细胞相容性。

实施例4：二硫键交联透明质酸凝胶的体内组织相容性评价

参照ISO10993.6-2007的标准评价实施例1制备的9种二硫键交联透明质酸凝胶的体内组织相容性。这9种凝胶的二硫键交联透明质酸的含量分别为3mg/mL、6mg/mL和8mg/mL，分别采用巯基含量为24μmol/g、38μmol/g和57μmol/g的透明质酸巯基化衍生物制备。以市售非交联透明质酸凝胶产品为对照样品。

健康SD大鼠的皮肤经过常规消毒后，沿大鼠脊柱正中线两侧(距脊柱2cm处)皮下植入实施例1制备的二硫键交联透明质酸凝或对照样品(0.5mL)；于植入后3天、7天、10天和14天分别无痛处死动物，切取植入体及其周围组织进行肉眼观察；并将植入体及其周围组织置于10％***固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋后切片，然后经HE染色后进行组织病理学观察与评价。

肉眼观察凝胶与对照样品植入后3天时各动物创口出现轻度发红和水肿，但随着植入时间增加而逐渐消失。组织病理学观察表明各凝胶组的组织反应均不大于轻度，与对照样品相似。本测试结果表明所测试的二硫键交联透明质酸凝胶具有良好的组织相容性。

实施例5：二硫键交联透明质酸凝胶的制备

透明质酸巯基化衍生物以300KDa和1,500KDa分子量的透明质酸钠为原料，采用Wang等所报道的方法制备(Wang等，J Mater Chem.B，2015，3：7546-7553)，其巯基含量分别为103μmol/g和75μmol/g。

将上述透明质酸巯基化衍生物溶解得到含量为3mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL和10mg/mL的水溶液，调节溶液pH值为7.4，转移入玻璃容器后湿热灭菌；室温密闭静置保存4周，溶液失去流动性并形成二硫键交联透明质酸凝胶。

实施例6：二硫键交联透明质酸凝胶的细胞相容性评价

采用与实施例3相同的方法评价实施例5制备的二硫键交联透明质酸凝胶的体外细胞毒性。

各二硫键交联透明质酸凝胶测试组的细胞相对增殖率均＞90％，没有细胞毒性，表明所测试的二硫键交联透明质酸凝胶具有良好的细胞相容性。

实施例7：二硫键交联透明质酸凝胶的体内组织相容性评价

采用与实施例4相同的方法评价实施例5制备的4种二硫键交联透明质酸凝胶的体内组织相容性；其中2种凝胶采用巯基含量为75μmol/g的巯基化衍生物制备(1,500KDa)，另外2种凝胶采用巯基含量为103μmol/g的巯基化衍生物制备(300KDa)，含量分别为3mg/mL和4.5mg/mL。以市售非交联透明质酸凝胶产品为对照样品。

肉眼观察凝胶与对照样品植入后3天时各动物创口出现轻度发红和水肿，但随着植入时间增加而逐渐消失。组织病理学观察表明各凝胶组的组织反应均不大于轻度，与对照样品相似。本测试结果表明所测试的二硫键交联透明质酸凝胶具有良好的组织相容性。

实施例8：二硫键交联透明质酸凝胶预防腹(盆)腔粘连的效果评价

采用经典的白兔侧壁粘连模型(Sidewall Model)(John等，Fertil Steril.1997，68：37-42)评价实施例1所制备的二硫键交联透明质酸凝胶预防腹(盆)腔粘连的效果。所使用的二硫键交联透明质酸凝胶采用巯基含量为38μmol/g的透明质酸巯基化衍生物制备，含量分别为3mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL和10mg/mL。

健康雌性白兔肌注盐酸***(55mg/kg)和隆朋(5mg/kg)混合物进行麻醉，行中线剖腹手术。取出盲肠和小肠，施压使所有浆膜表面下出血，然后用无菌纱布轻轻摩擦受损的肠道，直到观察到点状出血。将盲肠和小肠放回到其正常解剖位置。切除腹壁右侧区面积为5×3cm²的腹膜及腹横肌。切除部位涂敷二硫键交联透明质酸凝胶(～4mL)或生理盐水对照品。手术切口采用可吸收缝合线缝分两层缝合关腹，小心操作保护其肠道不受伤害。

术后21天处死试验动物，开腹进行大体观察，同时检测评价侧壁损伤所涉及的粘连面积百分比及粘连的严重程度。粘连的严重程度按照四分法进行评分：0＝未发生粘连；1＝轻度粘连(易剥离的粘连)；2＝中度粘连(不可剥离，不撕扯器官)；3＝致密粘连(不可剥离，移动时撕扯器官)。

大体观察未发现任何慢性炎症及肉芽肿等症状，表明所测试的二硫键交联透明质酸凝胶具有良好的组织相容性。同时也未发现任何凝胶残余，表明所测试的二硫键交联透明质酸凝胶已被完全降解吸收。

评价结果参见图2(粘连面积百分比)和图3(粘连的严重程度)。所测试的二硫键交联透明质酸凝胶均具有粘连预防效果，含量为3mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL和8mg/mL的凝胶具有比含量为10mg/mL的凝胶更好的粘连预防效果(粘连面积更少且粘连严重程度更低)。

实施例9：二硫键交联透明质酸凝胶预防腹(盆)腔粘连的效果评价

采用经典的白兔子宫角模型(Uterine Horn Model)(John等，FertilSteril.1997，68：37-42)评价实施例1所制备的二硫键交联透明质酸凝胶预防腹(盆)腔粘连的效果。所使用的二硫键交联透明质酸凝胶采用巯基含量为57μmol/g的透明质酸巯基化衍生物制备，含量分别为3mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL和10mg/mL。

健康雌性白兔肌注3％戊巴比妥钠(3mg/kg)进行麻醉，沿腹白线打开腹腔，暴露双侧子宫和输卵管，定位子宫角。测量并记录子宫角的直径，只有子宫角直径在3mm以上的白兔可继续试验。使用10号手术刀片，至子宫角处开始，在输卵管方向1cm和子宫体方向4cm的范围内，反复刮擦约20次，至浆膜面出现肉眼可间点状出血为止。将刮伤的子宫和输卵管放回到其原来的自然解剖部位，在每侧损伤处涂敷2.5ml二硫键交联透明质酸凝胶或生理盐水对照品，在最后关腹前，用注射器将5mL二硫键交联透明质酸凝胶或生理盐水自腹壁切口的尾端处注入腹腔。

术后两周处死试验动物，打开腹腔，观察主要脏器的位置及外观，以及有无腹腔积液和残留试验样品等大体情况。暴露子宫和输卵管，确定子宫输卵管自身或与周围脏器的粘连，测定每处粘连的长度，两侧子宫输卵管粘连长度相加，作为该只动物的术后粘连长度。

大体观察未发现任何不良反应，表明所测试的二硫键交联透明质酸凝胶具有良好的组织相容性。同时也未发现任何凝胶残余，表明所测试的二硫键交联透明质酸凝胶已被完全降解吸收。

评价结果参见图4。所测试的二硫键交联透明质酸凝胶均具有粘连预防效果，含量为3mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL和8mg/mL的凝胶具有比含量为10mg/mL的凝胶更好的粘连预防效果(粘连长度更低)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。