一种γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺及制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺及制备方法和应用 (Gamma-polyglutamic acid-graft-indole structure primary amine and preparation method and application thereof ) 是由 袁晓燕 牛情婧 张启发 任丽霞 赵蕴慧 于 2019-10-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺及制备方法和应用。将γ-PGA溶于去离子水中,加入1-羟基苯并三唑,冰浴活化,然后加入溶有吲哚结构伯胺的二甲基亚砜溶液,室温下进行反应。将所得反应液透析、冻干后得到产物γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺。用pH值为6.0、6.6、7.0和7.4的磷酸盐缓冲液配制γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺的溶液,将细胞在含有海藻糖的γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺的磷酸盐缓冲溶液中37℃下孵化3h,在液氮中冻存细胞。γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺与海藻糖共同作用,能促进海藻糖的胞内负载,可以使细胞冻存后的存活率达到80％～90％,可运用于细胞冻存领域。(The invention discloses gamma-polyglutamic acid-graft-indole structure primary amine and a preparation method and application thereof. Dissolving gamma-PGA in deionized water, adding 1-hydroxybenzotriazole, activating in ice bath, adding dimethyl sulfoxide solution dissolved with indole structure primary amine, and reacting at room temperature. And dialyzing and freeze-drying the obtained reaction solution to obtain the product gamma-polyglutamic acid-graft-indole structure primary amine. Preparing a solution of gamma-polyglutamic acid-graft-indole structure primary amine by using a phosphate buffer solution with pH values of 6.0, 6.6, 7.0 and 7.4, incubating cells in the phosphate buffer solution of the gamma-polyglutamic acid-graft-indole structure primary amine containing trehalose at 37 ℃ for 3h, and freezing and storing the cells in liquid nitrogen. The gamma-polyglutamic acid-graft-indole structure primary amine and the trehalose act together, so that the intracellular load of the trehalose can be promoted, the survival rate of the frozen cells can reach 80-90%, and the method can be applied to the field of cell freezing.)
技术领域
本发明涉及一种γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺及制备方法和应用，属于生物材料领域。
背景技术
冷冻保护剂是用于保护细胞和生物组织免受冰晶形成引起冻伤的化学物质。目前细胞的冷冻保存通常使用二甲基亚砜或甘油为冷冻保护剂，但由于二甲基亚砜和甘油会影响细胞的活性和功能，细胞复苏后，需要繁琐的洗涤过程才能使用。海藻糖是一种天然二糖，具有良好的生物相容性和稳定性，是一种良好的冷冻保护剂，能够保护细胞和生物体抵抗冷冻或脱水损伤。细胞内负载海藻糖的主要方法包括利用聚合物和多肽、纳米粒子与细胞膜作用负载及制备海藻糖脂质体等化学方法(S.Stewart,X.He.Intracellulardelivery of trehalose for cell banking.Langmuir,2019,35(23):7414-7422)海藻糖内源性基因表达或海藻糖转运基因TRET1表达等基因工程方法，以及热、电致等渗透方法。正负电解质稳定的磷灰石纳米粒子可以提高海藻糖的渗透性，从而促进海藻糖载入红细胞(M.Stefanic,K.Ward,H.Tawfik,R.Seemann,V.Baulin,Y.Guo,J.B.Fleury,C.Drouet.Apatite nanoparticles strongly improve red blood cellcryopreservation by mediating trehalose delivery via enhanced membranepermeation.Biomaterials,2017,140:138-149)。Motta等人利用海藻糖脂质体将海藻糖导入脐血干细胞，提高了干细胞的冷冻存活能力(J.P.Motta,F.H.Paraguassú-Braga,L.F.Bouzas,L.C.Porto.Evaluation of intracellular and extracellular trehaloseas a cryoprotectant of stem cells obtained from umbilical cordblood.Cryobiology,2014,68(3):343-348)。大分子冷冻保护剂，如抗冻肽、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、白蛋白及羟乙基淀粉等，能吸附于冰晶表面，降低冰晶形成速率，阻止冰晶生长。为提高冷冻保护剂的作用，通常需要在细胞冷冻保存时添加两种类型及以上的保护剂。
多肽结构中的芳香族残基，对于细胞膜具有一定的扰动作用，从而使得细胞膜产生可逆的微孔。此外，两亲性聚合物对于细胞膜具有扰动作用，被广泛用作细胞内药物传递的载体。Slater课题组通过两亲性pH响应性聚合物对细胞膜的作用，促进海藻糖的胞内负载，从而提高骨肉瘤细胞的冷冻存活率(S.A.Mercado,N.K.H.Slater.Increasedcryosurvival of osteosarcoma cells using an amphipathic pH-responsive polymerfor trehalose uptake.Cryobiology,2016,73(2):175-180)。
本发明以γ-聚谷氨酸和吲哚结构伯胺为原料，以1-羟基苯并***为催化剂，制备了γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺，方法操作简便、反应条件温和。通过用吲哚结构伯胺接枝γ-聚谷氨酸，得到的两亲性聚合物对细胞膜具有扰动作用，有利于海藻糖载入细胞内，使细胞的冷冻存活率达到80％～90％。以γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚伯胺作为冷冻保护剂的方法未见报道。
本发明制备了一种γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺，可以与海藻糖共同作用提高细胞的冷冻存活率。使用色胺、4-氨基甲基吲哚和吲哚-3-甲胺等吲哚结构伯胺对γ-聚谷氨酸进行疏水改性，得到的γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺与细胞膜具有相互作用，可以用于海藻糖等非膜渗透性保护剂的胞内负载从而运用于细胞冻存和药物载体等领域。
本发明的技术方案如下：
一种γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺的结构式如下：
其中，InR-为含吲哚结构基团，例如：
式中，n表示聚合物的重复单元数，x/n表示γ-聚谷氨酸的接枝率，取值范围为0.10≤x/n≤0.60。
制备γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺反应方程式：
其中，HOBt为1-羟基苯并***。
本发明的γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺的制备方法包括如下步骤：
(1)将γ-聚谷氨酸溶于去离子水中，加入1-羟基苯并***，冰浴活化。
(2)加入溶有吲哚结构伯胺的二甲基亚砜溶液，室温下进行反应。
(3)将所得反应液透析、冻干后得到产物γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺。
所述步骤(1)中γ-聚谷氨酸分子量1～100万，1-羟基苯并***/γ-聚谷氨酸结构单元摩尔比为1～3:1，其中每毫升去离子水加入0.02g的γ-聚谷氨酸。
所述步骤(2)中二甲基亚砜体积与步骤(1)中去离子水体积相等，吲哚结构伯胺/γ-聚谷氨酸结构单元摩尔比为0.1～0.6:1，冰浴时间为10～120min，室温反应时间为2～48h。
所述步骤(3)是将室温反应所得的反应液在去离子水中透析3天以上，之后冻干1天，得到γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺。
本发明的γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺能促进海藻糖载入细胞，用于细胞冷冻保护，应用方法如下：
用磷酸盐缓冲液配制γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺和海藻糖的混合溶液，加入细胞悬浮液，摇匀并在37℃水浴摇床中孵化，随后在液氮中冻存细胞。
所述磷酸盐缓冲液的pH值为6.0、6.4、7.0和7.4，γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺的浓度为1mg/mL，海藻糖浓度为0.2～0.4M，所用细胞包括造血干细胞、血管平滑肌细胞、红细胞，每毫升加入细胞的量为80μL。
本发明公开一种γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺及制备方法和应用，将γ-聚谷氨酸在1-羟基苯并***的作用下，与吲哚结构的伯胺反应，反应液在去离子水中透析3天，并冻干1天，得到γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺。用pH值为6.0～7.4的磷酸盐缓冲液配制浓度为1mg/mL的γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺溶液，将细胞在含有0.2～0.4M海藻糖的γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺的磷酸盐缓冲溶液中，于37℃孵化3h。γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺与海藻糖共同作用，能促进海藻糖的胞内负载，可以使细胞冻存后的存活率达到80％～90％。γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺冷冻保护剂与二甲基亚砜和甘油共同使用，可以减少二甲基亚砜和甘油的用量以减少对细胞的损伤。
具体实施方法
下面通过实施案例对本发明的技术方案作进一步的描述，以下实施案例是对本发明的进一步说明，并不限制本发明的适用范围。
(1)γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺的制备
将1-羟基苯并***/γ-聚谷氨酸结构单元摩尔比以1～3:1溶于去离子水，每毫升去离子水加入0.02g的γ-聚谷氨酸。加入等体积的溶有吲哚结构伯胺的二甲基亚砜，吲哚结构伯胺/γ-聚谷氨酸结构单元摩尔量为0.1～0.6:1，先在冰浴中搅拌10～120min，之后在室温反应2～48h。在去离子水中透析3天随后冻干1天，得到γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺。
(2)γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚结构伯胺用于细胞冻存
用pH值为6.0、6.6、7.0或7.4的磷酸盐缓冲液配制1mL聚合物海藻糖混合溶液，其中聚合物的浓度为1mg/mL，海藻糖浓度为0.2～0.4M。加入80μL细胞悬浮液，摇匀在37℃水浴摇床中孵化3h，随后在液氮中冻存2h以上。冻存取出后，立刻在37℃水浴中解冻细胞，计算冷冻存活率。其中阴性对照组为各样品相应pH值的海藻糖的磷酸盐缓冲溶液，阳性对照组加入去离子水使细胞全部溶血。
实施例1：γ-聚谷氨酸-接枝-色胺的制备及应用
将0.4g的γ-聚谷氨酸(10万分子量)加入100mL圆底烧瓶中，加入20mL去离子水在磁力搅拌器上搅拌至溶解。加入0.38g的1-羟基苯并***，冰浴活化20min。将0.047g色胺溶于20mL的二甲基亚砜中，加入圆底烧瓶中，室温反应2h。反应结束后将反应液移入透析袋中，在盛有去离子水的烧杯中透析3天，在冻干机中冻干1天，得到接枝率为10％的γ-聚谷氨酸-接枝-色胺，结构式如下：
用pH值为6.0的磷酸盐缓冲溶液配制浓度为1mg/mL的接枝率为10％的γ-聚谷氨酸-接枝-色胺溶液，将红细胞在含0.2M海藻糖的改性γ-聚谷氨酸的磷酸盐缓冲溶液中孵化3h，进行冷冻保存。以接枝率为10％的γ-聚谷氨酸-接枝-色胺为冷冻保护剂时红细胞冷冻存活率为83％。
实施例2：γ-聚谷氨酸-接枝-色胺的制备及应用
将1.0g的γ-聚谷氨酸(1万分子量)加入250mL圆底烧瓶中，加入50mL去离子水在磁力搅拌器上搅拌至溶解。加入1.925g的1-羟基苯并***，冰浴活化10min。将0.2425g色胺溶于50mL的二甲基亚砜中，加入圆底烧瓶中，室温反应24h。反应结束后将反应液移入透析袋中，在去离子水的烧杯中透析3天，在冻干机中冻干1天，得到接枝率为20％的γ-聚谷氨酸-接枝-色胺，其结构式如下：
用pH值为7.0的磷酸盐缓冲液配制浓度为1mg/mL的接枝率为20％的γ-聚谷氨酸-接枝-色胺溶液，将造血干细胞在含0.2M海藻糖的改性γ-聚谷氨酸的磷酸盐缓冲溶液中孵化3h，进行冷冻保存。以接枝率为20％的γ-聚谷氨酸-接枝-色胺为冷冻保护剂时造血干细胞冷冻存活率为85％。
实施例3：γ-聚谷氨酸-接枝-色胺的制备及应用
将0.4g的γ-聚谷氨酸(1万分子量)加入100mL圆底烧瓶中，加入20mL去离子水在磁力搅拌器上搅拌至溶解。加入1.15g的1-羟基苯并***，冰浴活化10min。将0.097g色胺溶于20mL的二甲基亚砜中，加入圆底烧瓶中，室温反应24h。反应结束后将反应液移入透析袋中，在去离子水的烧杯中透析3天，在冻干机中冻干1天，得到接枝率为20％的γ-聚谷氨酸-接枝-色胺，其结构式如下：
用pH值为7.0的磷酸盐缓冲液配制浓度为1mg/mL的接枝率为20％的γ-聚谷氨酸-接枝-色胺溶液，将红细胞在含0.4M海藻糖的改性γ-聚谷氨酸的磷酸盐缓冲溶液中孵化3h，进行冷冻保存。以接枝率为20％的γ-聚谷氨酸-接枝-色胺为冷冻保护剂时红细胞冷冻存活率为90％。
实施例4：γ-聚谷氨酸-接枝-色胺的制备及应用
将0.2g的γ-聚谷氨酸(100万分子量)加入50mL圆底烧瓶中，加入10mL去离子水在磁力搅拌器上搅拌至溶解。加入0.38g的1-羟基苯并***，冰浴活化120min。将0.14g色胺溶于10mL的二甲基亚砜中，加入圆底烧瓶中，室温反应12h。反应结束后将反应液移入透析袋中，在去离子水的烧杯中透析3天，在冻干机中冻干1天，得到接枝率为60％的γ-聚谷氨酸-接枝-色胺，结构式如下：
用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液配制浓度为1mg/mL的接枝率为60％的γ-聚谷氨酸-接枝-色胺溶液，将造血干细胞在含0.3M海藻糖的改性γ-聚谷氨酸的磷酸盐缓冲溶液中孵化3h，进行冷冻保存。以接枝率为60％的γ-聚谷氨酸-接枝-色胺为冷冻保护剂时造血干细胞冷冻存活率为83％。
实施例5：γ-聚谷氨酸-接枝-4-氨基甲基吲哚的制备及应用
将0.2g的γ-聚谷氨酸(10万分子量)加入50mL圆底烧瓶中，加入10mL去离子水在磁力搅拌器上搅拌至溶解。加入0.19g的1-羟基苯并***，冰浴活化20min。将0.021g的4-氨基甲基吲哚溶于10mL的二甲基亚砜中，加入圆底烧瓶中，室温反应2h。反应结束后将反应液移入透析袋中，在去离子水的烧杯中透析3天，在冻干机中冻干1天，得到接枝率为10％的γ-聚谷氨酸-接枝-4-氨基甲基吲哚，结构式如下：
用pH值为6.0的磷酸盐缓冲溶液配制浓度为1mg/mL的接枝率为10％的γ-聚谷氨酸-接枝-4-氨基甲基吲哚溶液，将红细胞在含0.2M海藻糖的改性γ-聚谷氨酸的磷酸盐缓冲溶液中孵化3h，进行冷冻保存。以接枝率为10％的γ-聚谷氨酸-接枝-4-氨基甲基吲哚/海藻糖为冷冻保护剂时红细胞冷冻存活率为80％。
实施例6：γ-聚谷氨酸-接枝-4-氨基甲基吲哚的制备及应用
将0.4g的γ-聚谷氨酸(1万分子量)加入100mL圆底烧瓶中，加入20mL去离子水在磁力搅拌器上搅拌至溶解。加入0.76g的1-羟基苯并***，冰浴活化20min。将0.043g的4-氨基甲基吲哚溶于20mL的二甲基亚砜中，加入圆底烧瓶中，室温反应2h。反应结束后将反应液移入透析袋中，在去离子水的烧杯中透析3天，在冻干机中冻干1天，得到接枝率为10％的γ-聚谷氨酸-接枝-4-氨基甲基吲哚，结构式如下：
用pH值为6.0的磷酸盐缓冲溶液配制浓度为1mg/mL的接枝率为10％的γ-聚谷氨酸-接枝-4-氨基甲基吲哚溶液，将造血干细胞在含0.4M海藻糖的改性γ-聚谷氨酸的磷酸盐缓冲溶液中孵化3h，进行冷冻保存。以接枝率为10％的γ-聚谷氨酸-接枝-4-氨基甲基吲哚/海藻糖为冷冻保护剂时造血干细胞冷冻存活率为80％。
实施例7：γ-聚谷氨酸-接枝-4-氨基甲基吲哚的制备及应用
将1.0g的γ-聚谷氨酸(100万分子量)加入250mL圆底烧瓶中，加入50mL去离子水在磁力搅拌器上搅拌至溶解。加入1.9g的1-羟基苯并***，冰浴活化20min。将0.65g的4-氨基甲基吲哚溶于50mL的二甲基亚砜中，加入圆底烧瓶中，室温反应12h。反应结束后将反应液移入透析袋中，在去离子水的烧杯中透析3天，在冻干机中冻干1天，得到接枝率为60％的γ-聚谷氨酸-接枝-4-氨基甲基吲哚，结构式如下：
其中，x/n＝0.6。
用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液配制浓度为1mg/mL的接枝率为60％的γ-聚谷氨酸-接枝-4-氨基甲基吲哚溶液，将红细胞在含0.3M海藻糖的改性γ-聚谷氨酸的磷酸盐缓冲溶液中孵化3h，进行冷冻保存。以接枝率为60％的γ-聚谷氨酸-接枝-4-氨基甲基吲哚为冷冻保护剂时红细胞冷冻存活率为83％。
实施例8：γ-聚谷氨酸-接枝-4-氨基甲基吲哚的制备及应用
将0.4g的γ-聚谷氨酸(100万分子量)加入100mL圆底烧瓶中，加入20mL去离子水在磁力搅拌器上搅拌至溶解。加入0.76g的1-羟基苯并***，冰浴活化20min。将0.26g的4-氨基甲基吲哚溶于20mL的二甲基亚砜中，加入圆底烧瓶中，室温反应12h。反应结束后将反应液移入透析袋中，在去离子水的烧杯中透析3天，在冻干机中冻干1天，得到接枝率为60％的γ-聚谷氨酸-接枝-4-氨基甲基吲哚，结构式如下：
其中，x/n＝0.6。
用pH值为6.6的磷酸盐缓冲溶液配制浓度为1mg/mL的接枝率为60％的γ-聚谷氨酸-接枝-4-氨基甲基吲哚溶液，将血管平滑肌细胞在含0.3M海藻糖的改性γ-聚谷氨酸的磷酸盐缓冲溶液中孵化3h，进行冷冻保存。以接枝率为60％的γ-聚谷氨酸接枝4-氨基甲基吲哚为冷冻保护剂时血管平滑肌细胞冷冻存活率为84％。
实施例9：γ-聚谷氨酸-接枝-4-氨基甲基吲哚的制备及应用
将0.4g的γ-聚谷氨酸(1万分子量)加入100mL圆底烧瓶中，加入20mL去离子水在磁力搅拌器上搅拌至溶解。加入1.15g的1-羟基苯并***，冰浴活化10min。将0.087g的4-氨基甲基吲哚溶于20mL的二甲基亚砜中，加入圆底烧瓶中，室温反应24h。反应结束后将反应液移入透析袋中，在去离子水的烧杯中透析3天，在冻干机中冻干1天，得到接枝率为19％的γ-聚谷氨酸-接枝-4-氨基甲基吲哚，其结构式如下：
用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液配制浓度为1mg/mL的接枝率为19％的γ-聚谷氨酸-接4-氨基甲基吲哚溶液，将红细胞在含0.4M海藻糖的改性γ-聚谷氨酸的磷酸盐缓冲溶液中孵化3h，进行冷冻保存。以接枝率为19％的γ-聚谷氨酸-接枝-4-氨基甲基吲哚/为冷冻保护剂时红细胞冷冻存活率为86％。
实施例10：γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚-3-甲胺的制备及应用
将0.4g的γ-聚谷氨酸(100万分子量)加入100mL圆底烧瓶中，加入20mL去离子水在磁力搅拌器上搅拌至溶解。加入0.76g的1-羟基苯并***，冰浴活化120min。将0.260g的吲哚-3-甲胺溶于20mL的二甲基亚砜中，加入圆底烧瓶中，室温反应24h。反应结束后将反应液移入透析袋中，在去离子水的烧杯中透析3天，在冻干机中冻干1天，得到接枝率为55％的γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚-3-甲胺，结构式如下：
用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液配制浓度为1mg/mL的接枝率为55％的γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚-3-甲胺溶液，将造血干细胞在含0.3M海藻糖的改性γ-聚谷氨酸的磷酸盐缓冲溶液中孵化3h，进行造血干细胞冷冻保存。以接枝率为55％的γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚-3-甲胺-为冷冻保护剂时造血干细胞冷冻存活率为83％。
实施例11：γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚-3-甲胺的制备及应用
将0.2g的γ-聚谷氨酸(10万分子量)加入50mL圆底烧瓶中，加入10mL去离子水在磁力搅拌器上搅拌至溶解。加入0.38g的1-羟基苯并***，冰浴活化10min。将0.043g的吲哚-3-甲胺溶于10mL的二甲基亚砜中，加入圆底烧瓶中，室温反应2h。反应结束后将反应液移入透析袋中，在去离子水的烧杯中透析3天，在冻干机中冻干1天，得到接枝率为19％的γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚-3-甲胺，结构式如下：
其中，x/n＝0.19。
用pH值为7.0的磷酸盐缓冲液配制浓度为1mg/mL的接枝率为19％的γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚-3-甲胺溶液，将红细胞在含0.4M海藻糖的改性γ-聚谷氨酸的磷酸盐缓冲溶液中孵化3h，进行冷冻保存。以接枝率为19％的γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚-3-甲胺为冷冻保护剂时红细胞冷冻存活率为88％。
实施例12：γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚-3-甲胺的制备及应用
将1.0g的γ-聚谷氨酸(1万分子量)加入250mL圆底烧瓶中，加入50mL去离子水在磁力搅拌器上搅拌至溶解。加入2.875g的1-羟基苯并***，冰浴活化20min。将0.1075g的吲哚-3-甲胺溶于50mL的二甲基亚砜中，加入圆底烧瓶中，室温反应12h。反应结束后将反应液移入透析袋中，在去离子水的烧杯中透析3天，在冻干机中冻干1天，得到接枝率为10％的γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚-3-甲胺，结构式如下：
用pH值为6.0的磷酸盐缓冲液配制浓度为1mg/mL的接枝率为10％的γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚-3-甲胺溶液，将红细胞在含0.2M海藻糖的改性γ-聚谷氨酸的磷酸盐缓冲溶液中孵化3h，进行冷冻保存。以接枝率为10％的γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚-3-甲胺-为冷冻保护剂时红细胞冷冻存活率为83％。
实施例13：γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚-3-甲胺的制备及应用
将0.4g的γ-聚谷氨酸(10万分子量)加入100mL圆底烧瓶中，加入20mL去离子水在磁力搅拌器上搅拌至溶解。加入1.15g的1-羟基苯并***，冰浴活化10min。将0.175g的吲哚-3-甲胺溶于20mL的二甲基亚砜中，加入圆底烧瓶中，室温反应24h。反应结束后将反应液移入透析袋中，在去离子水的烧杯中透析3天，在冻干机中冻干1天，得到接枝率为38％的γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚-3-甲胺，其结构式如下：
用pH值为7.0的磷酸盐缓冲液配制浓度为1mg/mL的接枝率为38％的γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚-3-甲胺溶液，将血管平滑肌细胞在含0.4M海藻糖的改性γ-聚谷氨酸的磷酸盐缓冲溶液中孵化3h，进行冷冻保存。以接枝率为38％的γ-聚谷氨酸-接枝-吲哚-3-甲胺-为冷冻保护剂时,血管平滑肌细胞冷冻存活率为85％。