一种超低浓度单组分聚肽水凝胶及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种超低浓度单组分聚肽水凝胶及其制备方法与应用 (Ultralow-concentration single-component polypeptide hydrogel and preparation method and application thereof ) 是由 柏谦 董常明 于 2021-08-06 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物医用材料领域,尤其是涉及一种超低浓度单组分聚肽水凝胶及其制备方法与应用。本发明以羧基化聚肽为高分子骨架,经一步修饰制得邻苯二酚功能化聚肽,再经氧化和冷冻物理处理,得到一种化学键-氢键共交联单组分聚肽水凝胶；超低浓度单组分聚肽水凝胶不仅具有超低的临界成胶浓度和耐热、耐盐、耐尿素稳定性,而且具有组织界面清除性；超低浓度单组分聚肽水凝胶具有优异的生物相容性和生物降解性,能够快速高效地止血并促进伤口愈合。本发明所述的单组分聚肽水凝胶,制备方法简单、成本低、使用方便,在伤口止血剂、密封胶、以及创伤辅料方面具有重要的临床应用潜能。(The invention relates to the field of biomedical materials, in particular to an ultra-low concentration single-component polypeptide hydrogel and a preparation method and application thereof. The invention takes carboxylated polypeptide as a polymer framework, prepares catechol functionalized polypeptide through one-step modification, and obtains a chemical bond-hydrogen bond co-crosslinking single-component polypeptide hydrogel through oxidation and freezing physical treatment; the ultra-low concentration single-component polypeptide hydrogel not only has ultra-low critical gelling concentration and stability of heat resistance, salt resistance and urea resistance, but also has tissue interface clearance; the ultralow-concentration single-component polypeptide hydrogel has excellent biocompatibility and biodegradability, and can quickly and efficiently stop bleeding and promote wound healing. The single-component polypeptide hydrogel disclosed by the invention is simple in preparation method, low in cost and convenient to use, and has important clinical application potential in the aspects of wound hemostats, sealants and wound auxiliary materials.)
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域，尤其是涉及一种超低浓度单组分聚肽水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
在世界范围内，创伤是所有年龄段的第三大死亡原因，因此人们对止血和促伤口愈合敷料有众多研究，且市场需求仍在快速增长。聚肽和蛋白质水凝胶在伤口止血剂、密封胶、及其创伤辅料方面已有大量研究，但是仅有少量产品进入临床应用。这主要由于它们多为多组分材料、在较高的成胶浓度下使用(5-20wt％)、制备复杂、不易从组织界面清除而造成二次损伤、以及蛋白材料的免疫原性和生物安全性等。例如中国发明专利(CN 107596429B)“徐虹、王瑞等，一种血液蛋白响应型γ-聚谷氨酸水凝胶止血材料及其制备方法和应用”，但是该化学交联聚肽水凝胶缺乏可注射性、自修复性、以及组织界面清除性，并且成胶浓度高、制备工艺复杂、需要双组分混合，从而限制了临床使用。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一种超低浓度单组分聚肽水凝胶及其制备方法与应用。该水凝胶内部无小分子残留，具有自修复性，可注射性，适宜粘附性，组织界面清除性，生物相容性和生物可降解性，不仅解决现有水凝胶的制备工艺复杂、成胶浓度高、双(多)组分应用难、缺乏组织界面清除性而造成临床二次损伤；并且显著克服目前伤口止血剂、密封胶、以及创伤辅料应用时存在的止血时间长、止血率低、及伤口愈合效果差等问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的第一个目的是提供一种邻苯二酚功能化聚肽，其结构式如下(1)或(2)或(3)：
其中：
R为其中x为0、1或2；
n、m均为正整数，n、m相同或不相同。
在本发明的一个实施方式中，所述邻苯二酚功能化聚肽以γ-聚谷氨酸、α-聚谷氨酸或α-聚天冬氨酸等羧基化聚肽作为骨架高分子，其分子量介于10kDa-2000kDa。
本发明的第二个目的是提供一种超低浓度单组分聚肽水凝胶，以所述邻苯二酚功能化聚肽为核心成分，所述邻苯二酚功能化聚肽浓度为0.1％-1％，优选为≥0.4％。
在本发明的一个实施方式中，所述超低浓度单组分聚肽水凝胶中共混有氧化石墨烯，此时为一种杂化聚肽水凝胶。
本发明的第三个目的是提供一种超低浓度单组分聚肽水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)以含羧基聚肽为高分子骨架，经邻苯二酚修饰后制得邻苯二酚功能化聚肽；
(2)将步骤(1)得到的邻苯二酚功能化聚肽在在碱性溶液中氧化，然后使用去离子水透析除去碱性物质；
(3)将步骤(2)所得溶液冷冻处理，在室温解冻得到超低浓度单组分聚肽水凝胶或步骤(2)所得溶液经冷冻处理后再冷冻干燥得到固体，然后在磷酸盐缓冲液溶解后得到该聚肽水凝胶，成胶时间20-120s。
在本发明的一个实施方式中，所述邻苯二酚为多巴胺或3,4-二羟基苯甲胺等，接枝率在10％-50％。
在本发明的一个实施方式中，所述碱性溶液通过碳酸钠、碳酸氢钠或氢氧化钠配置得到，pH为8-10；优选浓度为0.05M的碳酸氢钠溶液，pH为8.3。
在本发明的一个实施方式中，所述邻苯二酚功能化聚肽浓度在0.1％-1％，优选为≥0.4％。
在本发明的一个实施方式中，所述邻苯二酚功能化聚肽溶液在碱性条件下通过透析或搅拌氧化时间为12-36h，优选为24h，温度为25℃。。
在本发明的一个实施方式中，所述邻苯二酚功能化聚肽溶液优选为在0.05M碳酸氢钠水溶液中透析或搅拌24h，透析或搅拌温度为25℃。
在本发明的一个实施方式中，所述冷冻温度为-50-0℃，优选为-18℃，所述冷冻时间为≥9h，优选为24h。
本发明的第四个目的是提供一种超低浓度单组分聚肽水凝胶的应用。
在本发明的一个实施方式中，所述超低浓度单组分聚肽水凝胶在制备伤口止血剂、密封胶或创伤辅料上的应用。
本发明的第五个目的是提供一种杂化聚肽水凝胶，在所述超低浓度单组分聚肽水凝胶中共混有氧化石墨烯。
本发明的第六个目的是提供一种所述杂化聚肽水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)以羧基化聚肽为高分子骨架，经邻苯二酚修饰后制得邻苯二酚功能化聚肽；
(2)将步骤(1)得到的邻苯二酚功能化聚肽在碱性溶液中氧化，然后使用去离子水透析或搅拌，得到邻苯二酚功能化聚肽溶液；
(3)将步骤(2)所得溶液经冷冻处理后再冷冻干燥得到固体，然后在磷酸盐缓冲液溶解后加入氧化石墨烯溶液，以得到共混有氧化石墨烯的杂化聚肽水凝胶。
本发明的第七个目的是提供所述杂化聚肽水凝胶的应用，所述杂化聚肽水凝胶在制备伤口止血剂、密封胶或创伤辅料上的应用。
在本发明的一个实施方式中，超低浓度单组分聚肽水凝胶可共混0.1-1wt％的氧化石墨烯(GO)，优选0.5wt％GO制备杂化聚肽胶；在大鼠肝脏止血模型中，聚肽胶的止血时间约1min，杂化胶缩短至10s左右；止血率从90％左右进一步提高至98％左右。
在本发明的一个实施方式中，超低浓度单组分聚肽水凝胶用于大鼠全层皮肤缺损愈合，伤口可在3天愈合率43％左右，7天愈合率82％左右，14天完全愈合达100％。
本发明以羧基化聚肽为高分子骨架，经一步修饰制得邻苯二酚功能化聚肽，再经氧化和冷冻物理处理，得到一种化学键-氢键共交联单组分聚肽水凝胶；超低浓度单组分聚肽水凝胶不仅具有超低的临界成胶浓度和耐热、耐盐、耐尿素稳定性，而且具有组织界面清除性；超低浓度单组分聚肽水凝胶具有优异的生物相容性和生物降解性，能够快速高效地止血并促进伤口愈合。本发明所述的单组分聚肽水凝胶，制备方法简单、成本低、使用方便，在伤口止血剂、密封胶、以及创伤辅料方面具有重要的临床应用潜能。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明提供了一种制备超低浓度单组分聚肽水凝胶的方法，以羧基化聚肽为骨架高分子，经一步修饰得邻苯二酚功能化聚肽，再经过氧化和冷冻两步物理处理，制得一种化学键-氢键共交联的单组分聚肽水凝胶。
(2)本发明提供的制备超低浓度单组份聚肽水凝胶的方法，流变学测定的最低成胶浓度0.1wt％左右，制备简单，大大降低了成本。
(3)本发明所得的超低浓度单组分聚肽水凝胶具有可注射性、自修复性、适宜的粘附性、以及组织界面清除性；并且具有优异的生物相容性和血液相容性(溶血率0.5％左右)和生物降解性。
(4)本发明所得的水凝胶可以单独用于止血，也可以共混GO或其他物质，优选共混0.5wt％的GO；商品化氰基丙烯酸酯4011TM对大鼠肝脏缺损的止血时间110s，相对失血率18％，1wt％的单组分聚肽水凝胶止血时间和相对失血量可达1min和10％左右，共混0.5wt％GO杂化聚肽水凝胶的止血时间大大降低至12s，其止血率进一步提高至98.4％。因此本发明所得水凝胶在止血剂和密封胶上有很高的实际应用价值。
(5)本发明所得的聚肽水凝胶用于大鼠全层皮肤缺损愈合，伤口3天愈合率达43％左右，7天愈合率82％左右，14天愈合率100％，并有较多毛囊生成；然而，商品化TegadermTM处理后伤口3天愈合率26％左右，7天愈合率59％左右，14天愈合率98％左右，并且14天基本无毛囊生成。因此，本发明所得单组分聚肽水凝胶在创伤敷料上有很高的实际应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中邻苯二酚功能化聚肽核磁氢谱示意图。
图2为本发明实施例1中水凝胶(Gel1 1)和实施例2中水凝胶(Gel1 1GO0.5)的可注射性、自愈合性和组织界面清除性效果示意图，比例尺：1cm。
图3为实施例1中水凝胶和实施例2中水凝胶的溶血率。
图4为实施例1中水凝胶和实施例2中水凝胶的体内降解效果图，箭头指向水凝胶。
图5为本发明实施例1中水凝胶和实施例2中水凝胶的肝脏止血时间。
图6为本发明实施例1中水凝胶和实施例2中水凝胶的肝脏止血率。
图7为本发明实施例1水凝胶和实施例2中水凝胶促进伤口愈合的效果图。
具体实施方式
本发明提供一种邻苯二酚功能化聚肽，其结构式如下(1)或(2)或(3)：
其中：
R为其中x为0、1或2；
n、m均为正整数，n、m相同或不相同。
在本发明的一个实施方式中，所述邻苯二酚功能化聚肽以γ-聚谷氨酸、α-聚谷氨酸或α-聚天冬氨酸等羧基化聚肽作为骨架高分子，其分子量介于10kDa-2000kDa。
本发明还提供一种超低浓度单组分聚肽水凝胶，以所述邻苯二酚功能化聚肽为核心成分，所述邻苯二酚功能化聚肽浓度为0.1％-1％，优选为≥0.4％。
在本发明的一个实施方式中，所述超低浓度单组分聚肽水凝胶中共混有氧化石墨烯，此时为杂化聚肽水凝胶。
本发明还提供一种超低浓度单组分聚肽水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)以羧基化聚肽为高分子骨架，经邻苯二酚修饰后制得邻苯二酚功能化聚肽；
(2)将步骤(1)得到的邻苯二酚功能化聚肽在在碱性溶液中氧化，然后使用去离子水透析或搅拌；
(3)将步骤(2)所得溶液冷冻处理，在室温解冻得到超低浓度单组分聚肽水凝胶或步骤(2)所得溶液经冷冻处理后再冷冻干燥得到固体，然后在磷酸盐缓冲液溶解后得到该聚肽水凝胶，成胶时间20-120s。
在本发明的一个实施方式中，所述邻苯二酚为多巴胺或3,4-二羟基苯甲胺等，接枝率在10％-50％。
在本发明的一个实施方式中，所述碱性溶液通过碳酸钠、碳酸氢钠或氢氧化钠配置得到，浓度为0.05M，pH为8-10。
在本发明的一个实施方式中，所述邻苯二酚功能化聚肽浓度在0.1％-1％，优选为≥0.4％。
在本发明的一个实施方式中，所述氧化时间为12-36h，优选为24h。
在本发明的一个实施方式中，所述邻苯二酚功能化聚肽溶液优选为在0.05M碳酸氢钠水溶液中透析或搅拌24h，透析或搅拌温度为25℃。
在本发明的一个实施方式中，所述冷冻温度为-50-0℃，优选为-18℃，所述冷冻时间为≥9h，优选为24h。
本发明还提供一种超低浓度单组分聚肽水凝胶的应用。
在本发明的一个实施方式中，所述超低浓度单组分聚肽水凝胶在制备伤口止血剂、密封胶或创伤辅料上的应用；所述超低浓度单组分聚肽水凝胶中共混有氧化石墨烯。
在本发明的一个实施方式中，超低浓度单组分聚肽水凝胶可共混0.1-1wt％的氧化石墨烯(GO)，优选0.5wt％GO制备杂化聚肽胶；在大鼠肝脏止血模型中，聚肽胶的止血时间约1min，杂化胶缩短至10s左右；止血率从90％左右进一步提高至98％左右。
在本发明的一个实施方式中，超低浓度单组分聚肽水凝胶用于大鼠全层皮肤缺损愈合，伤口可在3天愈合率43％左右，7天愈合率82％左右，14天完全愈合达100％。
本发明以羧基化聚肽为高分子骨架，经一步修饰制得邻苯二酚功能化聚肽，再经氧化和冷冻物理处理，得到一种化学键-氢键共交联单组分聚肽水凝胶；超低浓度单组分聚肽水凝胶不仅具有超低的临界成胶浓度和耐热、耐盐、耐尿素稳定性，而且具有组织界面清除性；超低浓度单组分聚肽水凝胶具有优异的生物相容性和生物降解性，能够快速高效地止血并促进伤口愈合。本发明所述的单组分聚肽水凝胶，制备方法简单、成本低、使用方便，在伤口止血剂、密封胶、以及创伤辅料方面具有重要的临床应用潜能。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
实施例1
本实施例提供一种超低浓度单组分聚肽水凝胶的制备方法。
(1)取聚合度为300的α-聚谷氨酸(分子量38.7kDa)129mg(1mmol)溶于DMSO(二甲基亚砜)中，在低温下加入46mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(0.24mmol)和27.6mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(0.24mmol)活化过夜，氮气氛围下加入多巴胺盐酸盐38mg(0.2mmol)和少量三乙胺(TEA)作为缚酸剂，并在25℃下反应48h后反应液直接在pH＝7.4的PBS中透析1d，再使用去离子水透析1d，再使用去离子水透析1d，使用紫外检测水中无多巴胺(DA)后，收集得到的无色透明溶液，冻干得到白色固体，即邻苯二酚功能化α-聚谷氨酸，接枝率20％，产率99％。
本实施例所得邻苯二酚功能化α-聚谷氨酸核磁氢谱示意图如图1所示。
(2)取100mg邻苯二酚功能化α-聚谷氨酸溶于20ml的0.05M NaHCO3中，温度为25℃，并放入0.05M NaHCO3溶液中透析24h，然后置入去离子水中透析6h除去NaHCO3。
(3)将(2)中所得溶液放入-18℃冰箱冻存24h，冷冻干燥后，取10mg样品，加入1ml的PBS缓冲液(10mM，pH为7.4)得到1％的水凝胶(Gel1 1)。
实施例2
本实施例提供一种杂化聚肽水凝胶的制备方法。
(1)取聚合度为300的α-聚谷氨酸129mg(1mmol)溶于DMSO中，在低温下加入46mgEDC(0.24mmol)和27.6mg NHS(0.24mmol)活化过夜，氮气氛围下加入多巴胺盐酸盐38mg(0.2mmol)和少量TEA作为缚酸剂，并在25℃下反应48h后反应液直接使用去离子水透析，使用紫外检测水中无DA后，收集所得溶液。
本实施例所得邻苯二酚功能化α-聚谷氨酸核磁氢谱示意图如图1所示。
(2)将(1)所得溶液在0.05M NaHCO3溶液中透析24h，温度为25℃，然后置入去离子水中透析6h除去NaHCO3。
(3)将(2)中所得溶液在-18℃冰箱冻存24h，然后冷冻干燥，取10mg所得样品，加入0.5ml的PBS缓冲液(10mM，pH为7.4)和0.5ml的1％氧化石墨烯(GO)溶液得到杂化聚肽水凝胶(Gel1 1GO0.5)。
实施例1中水凝胶(Gel1 1)和实施例2中水凝胶(Gel1 1GO0.5)的可注射性、自愈合性和组织界面清除性效果如图2所示。
可注射性来自于水凝胶剪切变稀现象，当应变大于81％时，水凝胶呈现液体的状态，自愈合性来自于水凝胶内部疏水相互作用和氢键相互作用，水凝胶含有多巴基团使其拥有了组织粘附性，而聚肽主链带有羧酸根，呈负电状态，使其不易黏附与组织表面，因此水凝胶具有组织界面清除性。
实施例3
本实施例提供一种超低浓度单组分聚肽水凝胶的制备方法。
(1)取聚合度为1000的α-聚谷氨酸(分子量129kDa)129mg(1mmol)溶于DMSO中，在低温下加入46mg EDC(0.24mmol)和27.6mg NHS(0.24mmol)活化过夜，氮气氛围下加入多巴胺盐酸盐38mg(0.2mmol)和少量TEA作为缚酸剂，并在25℃下反应48h后反应液直接在pH＝7.4的PBS中透析1d，再使用去离子水透析1d，使用紫外检测水中无DA后，收集得到的无色透明溶液，冻干该溶液得到白色固体，即邻苯二酚功能化α-聚谷氨酸，接枝率20％，产率99％。
本实施例所得邻苯二酚功能化α-聚谷氨酸核磁氢谱示意图如图1所示。
(2)取100mg邻苯二酚功能化α-聚谷氨酸溶于20ml的0.05M NaHCO3中，搅拌24h，转速300-500r/min，温度为25℃，然后将其置入去离子水中透析6h除去NaHCO3。
(3)将(2)中所得溶液在-18℃冰箱冻存24h，然后冷冻干燥，取10mg所得样品，加入1ml的PBS缓冲液(10mM，pH为7.4)得到1％的超低浓度单组分聚肽水凝胶。
实施例4
本实施例提供一种超低浓度聚肽水凝胶的制备方法。
(1)取聚合度为1000的α-聚谷氨酸129mg(1mmol)溶于DMSO中，在低温下加入92mgEDC(0.48mmol)和55mg NHS(0.48mmol)活化过夜，氮气氛围下加入多巴胺盐酸盐76mg(0.4mmol)和少量TEA作为缚酸剂，并在25℃下反应48h后反应液直接在pH＝7.4的PBS中透析1d，再使用去离子水透析1d，再使用去离子水透析1d，使用紫外检测水中无DA后，收集得到的无色透明溶液，冻干得到白色固体，即邻苯二酚功能化α-聚谷氨酸，接枝率40％，产率99％。
本实施例所得邻苯二酚功能化α-聚谷氨酸核磁氢谱示意图如图1所示。
(2)取100mg邻苯二酚功能化α-聚谷氨酸溶于20ml的0.05M NaHCO3中，温度为25℃，并放入0.05M NaHCO3溶液中透析24h，然后置入去离子水中透析6h除去NaHCO3。
(3)将(2)中所得溶液放入-18℃冰箱冻存24h，冷冻干燥后，取10mg样品，加入1ml的PBS缓冲液(10mM，pH为7.4)得到1％的水凝胶。
实施例5
本实施例提供一种超低浓度单组分聚肽水凝胶的制备方法。
(1)取聚合度为500的α-聚谷氨酸(分子量64.5kDa)129mg(1mmol)溶于DMSO中，在低温下加入46mg EDC(0.24mmol)和27.6mg NHS(0.24mmol)活化过夜，氮气氛围下加入多巴胺盐酸盐38mg(0.2mmol)和少量TEA作为缚酸剂，并在25℃下反应48h后反应液直接在pH＝7.4的PBS中透析1d，再使用去离子水透析1d，再使用去离子水透析1d，使用紫外检测水中无DA后，收集得到的无色透明溶液，冻干得到白色固体，即邻苯二酚功能化α-聚谷氨酸，接枝率20％，产率99％。
本实施例所得邻苯二酚功能化α-聚谷氨酸核磁氢谱示意图如图1所示。
(2)取100mg邻苯二酚功能化α-聚谷氨酸溶于20ml的0.05M NaHCO3中，温度为25℃，并放入0.05M NaHCO3溶液中透析24h，然后置入去离子水中透析6h除去NaHCO3。
(3)将(2)中所得溶液放入-18℃冰箱冻存20h，室温解冻后得到0.5％的水凝胶。
实施例6
本实施例提供一种超低浓度单组分聚肽水凝胶的制备方法。
(1)取分子量为300kDa的γ-聚谷氨酸129mg(1mmol)溶于12ml去离子水中，搅拌2h，在低温下加入230mg EDC(1.2mmol)和138mg NHS(1.2mmol)活化30min，氮气氛围下加入1ml含有多巴胺盐酸盐76mg(0.4mmol)的水溶液和少量TEA作为缚酸剂，并在25℃下反应18h，反应结束后，反应液直接在去离子水中透析2d，冻干得到白色固体，即邻苯二酚功能化γ-聚谷氨酸，接枝率13％。
本实施例所得邻苯二酚功能化γ-聚谷氨酸核磁氢谱示意图如图1所示。
(2)取100mg邻苯二酚功能化γ-聚谷氨酸溶于20ml的0.05M NaHCO3中，温度为25℃，并放入0.05M NaHCO3溶液中透析24h，然后置入去离子水中透析6h除去NaHCO3。
(3)将(2)中所得溶液放入-18℃冰箱冻存24h，冷冻干燥后，取10mg样品，加入1ml的PBS缓冲液(10mM，pH为7.4)得到1％的水凝胶。
实施例7
本实施例提供一种超低浓度单组分聚肽水凝胶的制备方法。
(1)取聚合度300的α-聚天冬氨酸(分子量34.5kDa)115mg(1mmol)溶于12ml去离子水中，搅拌2h，在低温下加入230mg EDC(1.2mmol)和138mg NHS(1.2mmol)活化30min，氮气氛围下加入1ml含有多巴胺盐酸盐76mg(0.4mmol)的水溶液和少量TEA作为缚酸剂，并在25℃下反应18h，反应结束后，反应液直接在去离子水中透析2d，冻干得到白色固体，即邻苯二酚功能化α-聚天冬氨酸，接枝率12％。
本实施例所得邻苯二酚功能化α-聚天冬氨酸核磁氢谱示意图如图1所示。
(2)取100mg邻苯二酚功能化α-聚天冬氨酸溶于20ml的0.05M NaHCO3中，温度为25℃，并放入0.05M NaHCO3溶液中透析24h，然后置入去离子水中透析6h除去NaHCO3。
(3)将(2)中所得溶液放入-18℃冰箱冻存24h，冷冻干燥后，取40mg样品，加入1ml的PBS缓冲液(10mM，pH为7.4)得到4％的水凝胶。
实施例8
本实施例提供一种溶血率测定实验。
将100μL实施例1及实施例2制备得到的超低浓度聚肽水凝胶浸没到500μL含有枸橼酸钠抗凝剂的兔子血液中，37℃摇床中振荡3h，PBS和1％Triton X–100分别作为阴性和阳性对照组。将血液离心10min(4000rpm)，然后吸取200μL上清液加入到5mL去离子水中，使用UV–Vis光谱仪测试540nm处的吸光值。根据公式计算得到溶血率：溶血率(％)＝(A样品–A阴性)/(A阳性–A阴性)×100％，A表示540nm处的吸光值。每组实验重复5次，结果如图3所示。
实施例9
本实施例提供一种水凝胶体内移植实验。
将300μL实施例1及实施例2制备得到的超低浓度聚肽水凝胶样品植入大鼠皮下，然后使用手术缝合线将手术部位缝合，在7d和14d时再次将对应大鼠麻醉，将种植部位和附近皮肤及肌肉组织取出，放入4％水合氯醛中固定，取材结束后将大鼠暴露在100％的二氧化碳中安乐死。组织标本使用石蜡包埋切片，使用苏木精伊红染色(H&E)，并用倒置显微镜观察和拍照。
结果如图4所示，可以看出，实施例1中水凝胶和实施例2中水凝胶的体内降解效果很好。
实施例10
本实施例提供一种体内肝脏止血实验。
SD大鼠用戊巴比妥钠麻醉(1.5％，100mg/mL)，然后切开腹部将肝脏暴露出来。在肝叶上创建一个直径为5mm的伤口，然后将实施例1及实施例2制备得到的超低浓度聚肽水凝胶注射到出血位置，将肝叶放置到已经称重的滤纸上面，记录止血时间(图5)和2min内流失血液的质量，并计算止血率(图6)。未经处理的伤口作为阴性对照组。止血率(％)＝1-(M样品/M对照)×100％，M样品和M对照分别表示样品组和阴性对照组的失血质量，每组样品重复四次。
结果如图5和图6所示，可以看出，实施例1中水凝胶的止血时间与止血率都优于4011TM，实施例2中水凝胶的止血效果更佳，止血时间在10s左右，止血率达98％。
实施例11
本实施例提供一种伤口愈合实验。
利用SD大鼠皮肤全层缺损模型评估超低浓度单组分聚肽水凝胶对伤口愈合的影响。首先将SD大鼠进行全身麻醉，在背部切割一个直径1cm的圆形伤口，然后将实施例1及实施例2制备得到的超低浓度单组分聚肽水凝胶填充到伤口位置。制备超低浓度单组分聚肽水凝胶的溶液均用无菌过滤器(0.22μm)过滤后使用。每隔一定时间对伤口进行观察拍照，通过image J测量伤口的面积。伤口愈合率(％)＝(S0–St)/S0×100％，S0：伤口的初始面积；St：第t天伤口的面积，如图7所示，所有的实验重复5次。术后7天和14天，将皮肤组织取材后用4％的多聚甲醛固定，并用石蜡包埋，然后将组织切片用H&E染色后用光学显微镜观察。
结果如图5和图6所示，可以看出，实施例1中和实施例2中水凝胶促进伤口愈合效果优于商品化TegadermTM，在14d愈合率达到100％，其中实施例1中水凝胶在7d便使伤口愈合了80％，14d时已有毛发生成，接近于正常皮肤。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。