光交联重组胶原蛋白水凝胶、制备方法及其在3d生物打印中的应用
阅读说明：本技术 光交联重组胶原蛋白水凝胶、制备方法及其在3d生物打印中的应用 (Photo-crosslinking recombinant collagen hydrogel, preparation method and application thereof in 3D bioprinting ) 是由 杨树林 金明杰 王子勋 邓爱鹏 朱帅 于 2019-10-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种光交联重组胶原蛋白水凝胶、制备方法及其在3D生物打印中的应用。通过将甲基丙烯酸酐加入到重组胶原蛋白的磷酸盐溶液中,充分搅拌反应得到甲基丙基酸酐改性重组胶原蛋白,再将改性重组胶原蛋白溶解于培养基中,加入光引发剂,混合均匀后光反应交联固化制得光交联重组胶原蛋白水凝胶。本发明的重组胶原蛋白水凝胶前驱液置于模具中或作为3D打印墨水,经光反应交联固化制得组织工程支架或3D打印成品,还可在水凝胶前驱液中加入细胞,制备负载细胞的组织工程支架或3D打印成品。本发明的水凝胶理化性能良好、生物相容性好,且质量稳定,成形性良好,可以制备为任意大小和形状,适于大规模工业化生产。(The invention discloses a photo-crosslinking recombinant collagen hydrogel, a preparation method and application thereof in 3D bioprinting. Methacrylic anhydride is added into phosphate solution of the recombinant collagen, the methyl propyl anhydride modified recombinant collagen is obtained through full stirring reaction, the modified recombinant collagen is dissolved in a culture medium, a photoinitiator is added, and the photo-crosslinking recombinant collagen hydrogel is prepared through photo-reaction crosslinking and solidification after uniform mixing. The recombinant collagen hydrogel precursor liquid is placed in a mould or used as 3D printing ink, and is subjected to photoreaction, crosslinking and curing to prepare a tissue engineering scaffold or a 3D printing finished product, and cells can be added into the hydrogel precursor liquid to prepare a cell-loaded tissue engineering scaffold or a 3D printing finished product. The hydrogel has good physical and chemical properties, good biocompatibility, stable quality and good formability, can be prepared into any size and shape, and is suitable for large-scale industrial production.)
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，涉及一种光交联重组胶原蛋白水凝胶、制备方法及其在3D生物打印中的应用。
背景技术
胶原蛋白是动物体内含量最丰富的一类结构蛋白质。胶原蛋白具有很强的生物活性及生物功能，能参与细胞的迁移、分化和增殖，使***具有机械强度，同时胶原蛋白还能促进细胞生长，具有良好的生物相容性与可生物降解的特性。基于这些特性，胶原蛋白在烧创伤修复、眼角膜疾病治疗、创面止血、药物传递与缓释、矫形、保健、美容等医疗卫生领域有广泛应有。常见的胶原蛋白是从牛骨、牛皮、鱼鳞、鱼皮、猪皮等动物组织中分离提取而来，存在动物病毒隐患、应用于人体时会产生异体或异种的排异反应且分子量不确定、分布范围广等缺点和不足。本发明人的前期研究成果很好的克服了这些缺陷：利用基因重组技术生产的人源胶原蛋白取代天然胶原。该重组胶原是以III型胶原为模板，体外构建六串联序列并连入pPIC9K形成类人胶原蛋白基因六串联体表达载体pPIC9KG6。将该表达载体导入毕赤酵母后进行高密度发酵，并通过分离纯化，得到高纯度RHC(中国专利ZL200610098297.5)。
3D生物打印是3D打印的一个重要分支，最大的特点是可以精准分配载细胞生物材料，用于构建复杂的三维活体组织或器官。3D生物打印可以弥合人工组织构建与天然机体组织之间相容性不足的缺陷，通过集成生物材料学、细胞生物学、组织工程学、物理学、医学等多领域的技术优势以达到对目标组织或器官的精细化再现从而解决日益严重的人源器官短缺的问题，并且可服务于高通量毒理学检测、药物开发等领域。
水凝胶是一类不溶于水但有很强亲水性的柔软高分子材料，其分子具有独特的三维立体网络状构型，亲水基与水分子相结合，将水分子锁牢于三维立体网络内部，而疏水基遇水则产生膨胀，使其可以在水溶液中大量吸收水溶液并保持一定的形状。水凝胶作为一类高水量、生物相容性好的仿生生物功能材料，长期以来一直被应用做组织工程支架材料的开发。将含有胶原蛋白的水凝胶作为3D生物打印墨水可在模拟细胞体内生长环境、建立体外细胞培养模型或者促进创伤修复、填充、再生等方面具有重要应用价值。
现有的3D生物打印墨水很大一类是使用明胶作为主要原料，但因其分子内共价键和氢键断裂，造成明胶没有棒状三螺旋空间结构，只剩下类三螺旋结构，依赖分子内氢键维持，使其丧失了生物活性。同时，明胶不溶于水，但加热可使其溶解，是一类热可容的蛋白质混合物，这些使得明胶基材料黏度高，加工条件复杂，耗能较高，不利产业化推广(汲聪玲.白鲢鱼皮明胶理化特性研究及其性能改进[D].2016.合肥工业大学硕士学位论文；林述荣,陈贝,王勤,et al.胶原特性及其制备方法研究进展[J].渔业研究,2018,40(05):73-81，等)。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种光交联重组胶原蛋白水凝胶的制备方法，具体步骤如下：
步骤1，将甲基丙烯酸酐加入到重组胶原蛋白的磷酸盐溶液(PBS)中，充分搅拌反应，离心取上清液，加水稀释上清液，透析，透析结束后冷冻干燥，得到甲基丙基酸酐改性重组胶原蛋白；
步骤2，甲基丙基酸酐改性重组胶原蛋白溶解于培养基中，加入光引发剂水溶液，混合均匀得到水凝胶前驱液，光反应交联固化得到重组胶原蛋白水凝胶。
本发明的目的之二在于提供上述制备方法制得的重组胶原蛋白水凝胶。
本发明的目的之三在于提供上述光交联重组胶原蛋白水凝胶在制备组织工程支架中的应用。
具体地，上述光交联重组胶原蛋白水凝胶在制备组织工程支架中的应用，具体应用方法为：
步骤1，将甲基丙烯酸酐加入到重组胶原蛋白的磷酸盐溶液(PBS)中，充分搅拌反应，离心取上清液，加水稀释上清液，透析，透析结束后冷冻干燥，得到甲基丙基酸酐改性重组胶原蛋白；
步骤2，甲基丙基酸酐改性重组胶原蛋白溶解于培养基中，加入光引发剂水溶液，混合均匀得到水凝胶前驱液；
步骤3，将步骤2得到的水凝胶前驱液置于模具中，光反应交联固化制得具有特定形状的组织工程支架。
本发明的目的之四在于提供上述光交联重组胶原蛋白水凝胶在3D生物打印中的应用。
具体地，上述光交联重组胶原蛋白水凝胶在3D生物打印中的应用，具体应用方法为：
步骤1，将甲基丙烯酸酐加入到重组胶原蛋白的磷酸盐溶液(PBS)中，充分搅拌反应，离心取上清液，加水稀释上清液，透析，透析结束后冷冻干燥，得到甲基丙基酸酐改性重组胶原蛋白；
步骤2，甲基丙基酸酐改性重组胶原蛋白溶解于培养基中，加入光引发剂水溶液，混合均匀得到水凝胶前驱液；
步骤3，将步骤2得到的水凝胶前驱液作为3D生物打印墨水，通过3D生物打印光反应交联固化后得到3D生物打印成品。
本发明所述的重组胶原蛋白的类型可为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ与G-X-Y重复序列型或其他小分子量胶原。重组胶原蛋白可来自微生物表达系统(大肠杆菌、链球菌、汉森酵母、酿酒酵母、毕赤酵母等)、哺乳动物表达系统(转基因鼠、人胚肾上皮细胞等)、昆虫表达系统(昆虫细胞、转基因蚕等)和植物表达系统(转基因烟草、大麦种子、玉米等)。所述的重组胶原蛋白的分子量为2～500Kd。所述的重组胶原蛋白类型选自重组人源胶原蛋白、重组类人源胶原蛋白或其它类型重组胶原蛋白。
在本发明的
具体实施方式
中，所述的重组胶原蛋白为重组人源胶原蛋白。在具体实施方式中，本发明的重组人源胶原蛋白为中国专利ZL 200610098297.5所公开的方法获得的重组人源胶原蛋白，更优选的是，通过中国专利ZL 201110327865.5提供的高密度发酵和纯化方法，利用通过不同重复数同向串联基因重组质粒所构建的巴氏毕赤酵母基因工程菌(菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNO.5021)而生产的重组人源胶原蛋白。人源胶原蛋白比起动物(尤其是非哺乳动物)胶原蛋白而言，对人体的使用安全性更为可靠。
作为优选，步骤1中，所述的重组胶原蛋白的磷酸盐溶液中，重组胶原蛋白的含量为5～20％(W/V)，更优选为10～20％(W/V)。
作为优选，步骤1中，所述的甲基丙烯酸酐的添加量为3～12％(V甲基丙烯酸酐/V重组胶原蛋白的磷酸盐溶液)，更优选为6～9％(V甲基丙烯酸酐/V重组胶原蛋白的磷酸盐溶液)。
作为优选，步骤1中，加水稀释上清液时的稀释倍数为3～5倍。
作为优选，步骤1中，透析前溶液的pH值为6～8，更优选为6.5～7.5。
本发明中，步骤2中，所述的培养基为适用于相应目标细胞的完全培养基，可以为本领域常规使用的细胞或组织培养基，例如DMEM完全培养基等。
本发明中，步骤2中所使用的光引发剂为紫外光引发剂或可见光引发剂。光引发剂为紫外光引发剂2959时，溶液中光引发剂2959的含量为0.01～1％，优选为0.5～1％；光引发剂为蓝光引发剂LAP时，溶液中光引发剂LAP的含量为0.01～2％，优选为0.1～0.5％。
作为优选，步骤2中，将甲基丙基酸酐改性重组胶原蛋白溶解于培养基中，其中甲基丙基酸酐改性重组胶原蛋白的含量为2～30％(W/V)；作为3D生物打印墨水使用时，更优选为5～15％(W/V)，浓度过低时不利于3D生物打印过程中的成型控制。
作为优选，步骤2中，光引发剂水溶液与含有甲基丙烯酸酐改性重组胶原蛋白的培养基的体积比为1:5～20，更优选为1:10～15。
作为优选，步骤2中，培养基中还添加海藻酸钠、透明质酸、黄原胶或明胶等，以增加水凝胶墨水打印后的机械强度或拓宽应用范围。更优选地，所述的海藻酸钠、透明质酸、黄原胶、明胶等的含量为0～30％(W/V)。
本发明的步骤3中，所述的光反应交联固化采用的光的特定照射波长范围为200～800nm。光引发剂为紫外光引发剂2959时，特定照射波长范围为365～405nm，最优选为365nm；光引发剂为蓝光引发剂LAP时，特定照射波长范围为400～450nm，最优选为405nm。对水凝胶用特定波长的光源进行照射，作为优选，照射时长为5～300秒。
作为优选，步骤2中，所述的培养基中还加入细胞，制成负载细胞的水凝胶前驱体，直接经特定波长光源照射交联固化后制成负载细胞的组织工程支架；或以负载细胞的水凝胶前驱体作为3D生物打印墨水，经特定波长光源照射交联固化制成负载细胞的3D生物打印成品。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明的重组胶原蛋白具有良好的生物活性，同时重组人源胶原具有很好的水溶性，利于3D生物打印墨水的制作。另外重组胶原蛋白水溶液黏度低，利于通过滤膜，已达到无菌效果。同时本发明的光交联重组胶原蛋白水凝胶在交联过程中采用特定波长光源照射，无需额外引入其它化学交联剂，因此本发明光交联重组胶原蛋白水凝胶无毒性，生物相容性好。本发明的光交联重组胶原蛋白水凝胶理化性能良好，不含杂质，成型性良好，可以制备为任意大小和形状。光交联重组胶原蛋白水凝胶的应用领域广泛，可以应用在3D生物打印、细胞培养与组织工程支架等领域，用于皮肤修复、眼角膜修复、各类骨组织修复、血管构建、医疗美容、修复填充料、药物载体、药物释放载体、毒理学测试模型、化妆品测试模型、动物模型替代品等。
附图说明
图1：a为405nm波长蓝光照射固化后的光交联胶原蛋白水凝胶实物；b为光交联胶原蛋白水凝胶作为3D生物打印墨水经3D生物打印后365nm波长紫外光照射固化后的光交联水凝胶实物。
图2：a为在照射固化后的光交联胶原蛋白水凝胶表面培养的小鼠胚胎成纤维细胞(NIH 3T3)24小时图；b为在照射固化后的光交联胶原蛋白水凝胶表面培养的小鼠胚胎成纤维细胞(NIH 3T3)72小时图。证明小鼠胚胎成纤维细胞能适应光交联胶原蛋白水凝胶的环境，正常增殖且细胞形态良好。
图3：照射固化后的载有小鼠胚胎成纤维细胞(NIH 3T3)的光交联胶原蛋白水凝胶培养24小时与72小时的吖啶橙/溴乙锭染色图，证明小鼠胚胎成纤维细胞能适应光交联胶原蛋白水凝胶的环境，正常增殖且无细胞毒性；a为使用NIH 3T3培养24小时吖啶橙/溴乙锭染色图；b为使用NIH 3T3培养72小时吖啶橙/溴乙锭染色图。
图4：为人脐静脉内皮细胞(HUVEC)小鼠胚胎成纤维细胞(NIH 3T3)分别在光交联固化后重组胶原蛋白水凝胶浸提液培养与相应培养基培养72小时的相对增殖情况统计图，表明本发明的光交联重组胶原蛋白水凝胶合格，无细胞毒性；a为使用HUVEC进行细胞毒性测试72小时结果；b为使用NIH 3T3进行细胞毒性测试72小时结果。
具体实施方式
为了便于理解，下面将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描述。需要特别说明的是，具体实施例仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然，本领域及相关领域的普通技术人员均可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变或丰富应用领域，这些修正和改变或在其他领域的应用也纳入本发明的范围。
下述实施例中，所用的试剂、原料都是现有产品，如胶原蛋白是根据本发明人中国专利ZL 201110327865.5所制备的重组人源胶原蛋白，甲基丙烯酸酐、AO、EB购自Aladdin，小鼠胚胎成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞购自中科院上海细胞库，PBS缓冲液、DMEM培养基、F12培养基、青链霉素混合液购自Hyclone，胎牛血清购自四季青生物科技有限公司，光引发剂2959购自巴斯夫，蓝光引发剂LAP购自江阴司特易生物技术公司，MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自碧云天生物公司。实施例中采用的重组人源胶原蛋白为中国专利ZL200610098297.5所公开的方法获得的重组人源胶原蛋白，通过中国专利ZL201110327865.5提供的高密度发酵和纯化方法，利用通过不同重复数同向串联基因重组质粒所构建的巴氏毕赤酵母基因工程菌(菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.5021)而生产的重组人源胶原蛋白。
下述实施例中，水凝胶的制备过程均在超净台中进行操作，确保无菌条件，同时所需原料也应确保无菌，可采用高压蒸汽灭菌、紫外照射或Γ射线照射等物理或化学手段进行灭菌、杀菌处理。
实施例1光交联重组胶原蛋白水凝胶的制备
将1g重组人源胶原蛋白加入10ml磷酸缓冲液中，搅拌30分钟使其完全溶解，配置成10％(W/V)胶原蛋白磷酸盐溶液。将0.6ml甲基丙烯酸酐在2分钟内加入至胶原蛋白磷酸盐溶液，在50℃条件下搅拌反应60分钟。将反应后的溶液加入10ml离心管中，4000g条件下离心3分钟。之后取上清液加去离子水稀释2倍，调节pH值为7，然后把稀释后的溶液加入到36MM透析袋(MW:14000)中，室温下去离子水条件下透析7天，每8小时更换去离子水。透析结束后将溶液在-80℃下冷冻，再置于真空冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂有限公司，型号：LGJ-10D，参照其厂商说明条件进行冷冻干燥)中冷冻干燥，形成冻干产物。
将蓝光引发剂LAP溶于去离子水中，配置为0.5％(W/V)的光引发剂溶液，溶解条件：避光、50℃水浴。
将100mg冻干产物溶于1mlDMEM完全培养基(含青链霉素与胎牛血清)，溶解条件：37℃水浴。将1ml含甲基丙烯酸酐改性胶原蛋白的完全培养基与0.1ml蓝光引发剂LAP水溶液混合均匀，离心除气泡，获得水凝胶前驱液。
将水凝胶前驱液加入到48格孔板中用405nm的蓝光光源进行照射，通过光反应相互交联固化，得到重组胶原蛋白水凝胶。
实施例2光交联重组胶原蛋白水凝胶的制备
将1g重组人源胶原蛋白加入10ml磷酸缓冲液中，搅拌30分钟使其完全溶解，配置成10％(W/V)胶原蛋白磷酸盐溶液。将0.6ml甲基丙烯酸酐在2分钟内加入至胶原蛋白磷酸盐溶液，在50℃条件下搅拌反应60分钟。将反应后的溶液加入10ml离心管中，4000g条件下离心3分钟。之后取上清液加去离子水稀释2倍，调节pH值为7，然后把稀释后的溶液加入到36MM透析袋(MW:14000)中，室温下去离子水条件下透析7天，每8小时更换去离子水。透析结束后将溶液在-80℃下冷冻，再置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，形成冻干产物。
将光引发剂2959溶于去离子水中，配置为1％(W/V)的光引发剂溶液，溶解条件：避光、50℃水浴。
将100mg冻干产物溶于1mlDMEM完全培养基(含青链霉素与胎牛血清)，溶解条件：37℃水浴。将1ml含甲基丙烯酸酐改性胶原蛋白的完全培养基与0.1ml光引发剂2959水溶液混合均匀，离心除气泡，获得水凝胶前驱液。
将水凝胶前驱液加入到48格孔板中用365nm的紫外光光源进行照射，通过光反应相互交联固化。
实施例3载细胞光交联重组胶原蛋白水凝胶的制备
将1g重组人源胶原蛋白加入10ml磷酸缓冲液中，搅拌30分钟使其完全溶解，配置成10％(W/V)胶原蛋白磷酸盐溶液；将0.6ml甲基丙烯酸酐在2分钟内加入至胶原蛋白磷酸盐溶液，在50℃条件下搅拌反应60分钟；将反应后的溶液加入10ml离心管中，4000g条件下离心3分钟；之后取上清液加去离子水稀释2倍调节pH值为7，然后把稀释后的溶液加入到36MM透析袋(MW:14000)中,室温下去离子水条件下透析7天，每8小时更换去离子水；透析结束后将溶液在-80℃下冷冻，再置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，形成冻干产物。
将蓝光引发剂LAP溶于去离子水中，配置为0.5％(W/V)的光引发剂溶液，溶解条件：避光、50℃水浴。
将100mg冻干产物溶于1mlDMEM完全培养基(含青链霉素与胎牛血清)，溶解条件：37℃水浴；将1ml含甲基丙烯酸酐改性胶原蛋白的完全培养基与0.1ml蓝光引发剂LAP水溶液混合均匀，离心除气泡，获得水凝胶前驱液。
小鼠胚胎成纤维细胞的培养基，培养基中含有以下组分：每100ml完全培养基含有15ml胎牛血清、1ml青链霉素混合液(100×)、84mlDMEM。
用上述培养基将小鼠胚胎成纤维细胞重悬。
取500ul小鼠胚胎成纤维细胞重悬液与水凝胶前驱液混匀，将载有小鼠胚胎成纤维细胞的水凝胶前驱液加入到48格孔板中用405nm的紫外光光源进行照射，通过光反应相互交联固化。
实施例4载细胞光交联重组胶原蛋白水凝胶的制备
将1g重组人源胶原蛋白加入10ml磷酸缓冲液中，搅拌30分钟使其完全溶解，配置成10％(W/V)胶原蛋白磷酸盐溶液。将0.6ml甲基丙烯酸酐在2分钟内加入至胶原蛋白磷酸盐溶液，在50℃条件下搅拌反应60分钟。将反应后的溶液加入10ml离心管中，4000g条件下离心3分钟。之后取上清液加去离子水稀释2倍调节pH值为7，然后把稀释后的溶液加入到36MM透析袋(MW:14000)中，室温下去离子水条件下透析7天，每8小时更换去离子水。透析结束后将溶液在-80℃下冷冻，再置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，形成冻干产物。
将蓝光引发剂LAP溶于去离子水中，配置为0.5％(W/V)的光引发剂溶液，溶解条件：避光、50℃水浴。
将100mg冻干产物溶于1mlF12完全培养基(含青链霉素与胎牛血清)，溶解条件：37℃水浴；将1ml含甲基丙烯酸酐改性胶原蛋白的完全培养基与0.1ml蓝光引发剂LAP水溶液混合均匀，离心除气泡，获得水凝胶前驱液。
人脐静脉内皮细胞的培养基，培养基中含有以下组分：每100ml完全培养基含有15ml胎牛血清、1ml青链霉素混合液(100×)、84mlF12。
用上述培养基将人脐静脉内皮细胞重悬。
取500ul人脐静脉内皮细胞重悬液与水凝胶前驱液混匀，将载有人脐静脉内皮细胞的水凝胶加入到48格孔板中用405nm的紫外光光源进行照射，通过光反应相互交联固化。
实施例5光交联重组胶原蛋白水凝胶作为3D生物打印墨水进行3D生物打印
将1g重组人源胶原蛋白加入10ml磷酸缓冲液中，搅拌30分钟使其完全溶解，配置成10％(W/V)胶原蛋白磷酸盐溶液。将0.6ml甲基丙烯酸酐在2分钟内加入至胶原蛋白磷酸盐溶液，在50℃条件下搅拌反应60分钟。将反应后的溶液加入10ml离心管中，4000g条件下离心3分钟。之后取上清液加去离子水稀释2倍调节pH值为7，然后把稀释后的溶液加入到36MM透析袋(MW:14000)中，室温下去离子水条件下透析7天，每8小时更换去离子水。透析结束后将溶液在-80℃下冷冻，再置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，形成冻干产物。
将蓝光引发剂LAP溶于去离子水中，配置为0.5％(W/V)的光引发剂溶液，溶解条件：避光、50℃水浴。
将100mg冻干产物溶于1mlDMEM完全培养基(含青链霉素与胎牛血清)，溶解条件：37℃水浴。将1ml含甲基丙烯酸酐改性胶原蛋白的完全培养基与0.1ml蓝光引发剂LAP水溶液混合均匀，离心除气泡，获得水凝胶墨水。
将水凝胶墨水加入到3D生物打印机(瑞典CELLINK BIO-X，参照其厂商说明条件进行打印操作)注射器中进行打印操作(压力为70kpa，打印头移动速度10mm/s，紫外光源移动速度1mm/s，选用打印针头规格为27G)，每打印完一层后，对所打印出的产品用405nm的蓝光光源进行照射，通过光反应相互交联固化。
实施例6载细胞光交联重组胶原蛋白水凝胶作为3D生物打印墨水进行3D生物打印
将1g重组人源胶原蛋白加入10ml磷酸缓冲液中，搅拌30分钟使其完全溶解，配置成10％(W/V)胶原蛋白磷酸盐溶液，将0.6ml甲基丙烯酸酐在2分钟内加入至胶原蛋白磷酸盐溶液，在50℃条件下搅拌反应60分钟，将反应后的溶液加入10ml离心管中，4000g条件下离心3分钟，之后取上清液加去离子水稀释2倍调节pH值为7，然后把稀释后的溶液加入到36MM透析袋(MW:14000)中，室温下去离子水条件下透析7天，每8小时更换去离子水，透析结束后将溶液在-80摄氏度下冷冻，再置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，形成冻干产物。
将蓝光引发剂LAP溶于去离子水中，配置为0.5％(W/V)的光引发剂溶液，溶解条件：避光、50℃水浴。
将100mg冻干产物溶于1mlDMEM完全培养基(含青链霉素与胎牛血清)，溶解条件：37℃水浴。将1ml含甲基丙烯酸酐改性胶原蛋白的完全培养基与0.1ml蓝光引发剂LAP水溶液混合均匀，离心除气泡，获得水凝胶前驱液。
小鼠胚胎成纤维细胞的培养基，培养基中含有以下组分：每100ml完全培养基含有15ml胎牛血清、1ml青链霉素混合液(100×)、84mlDMEM。
用上述培养基将小鼠胚胎成纤维细胞重悬。
取500ul小鼠胚胎成纤维细胞重悬液与水凝胶前驱液混匀，将载有小鼠胚胎成纤维细胞的水凝胶墨水加入到3D生物打印机注射器中进行打印操作(压力为50kpa，打印头移动速度10mm/s，紫外光源移动速度2mm/s，选用打印针头规格为27G)，每打印完一层后，对所打印出的产品用405nm的蓝光光源进行照射，通过光反应相互交联固化。
实施例7小鼠胚胎成纤维细胞在光交联重组胶原蛋白水凝胶组织工程支架上的培养
小鼠胚胎成纤维细胞的培养基，培养基中含有以下组分：每100ml完全培养基含有15ml胎牛血清、1ml青链霉素混合液(100×)、84mlDMEM。
用上述培养基将小鼠胚胎成纤维细胞重悬。
光交联重组胶原蛋白水凝胶的制备同实施例1，不同的是使用的培养基为上述小鼠胚胎成纤维细胞的培养基。将制得的水凝胶前驱液平铺于12格孔板中，之后用405nm蓝光照射10秒固化，得到光交联重组胶原蛋白水凝胶。
将重悬的小鼠胚胎成纤维细胞种植于12格孔板中固化后的水凝胶，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养，隔天换液，并在显微镜(日本Olympus，参照其厂商说明条件进行相关操作)下观察细胞的生长状态。
小鼠胚胎成纤维细胞在光交联重组胶原蛋白水凝胶组织工程支架上的培养结果如图2所示。结果显示小鼠胚胎成纤维细胞适应光交联胶原蛋白水凝胶的环境，正常增殖、细胞形态良好。
实施例8照射固化后的载有小鼠胚胎成纤维细胞的光交联胶原蛋白水凝胶共聚焦显微镜观测
小鼠胚胎成纤维细胞的培养基，培养基中含有以下组分：每100ml完全培养基含有15ml胎牛血清、1ml青链霉素混合液(100×)、84mlDMEM。
将实施例3制得的照射固化后的载有小鼠胚胎成纤维细胞的光交联胶原蛋白水凝胶放入6格孔板中，加入完全培养基后置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养，隔天换液。
培养24小时与72小时后，将载有小鼠胚胎成纤维细胞的水凝胶用吖啶橙/溴乙锭染色，然后在共聚焦显微镜下观察。
细胞染色结果如图3所示。结果显示小鼠胚胎成纤维细胞适应光交联胶原蛋白水凝胶的环境，正常增殖且无细胞毒性。
实施例9MTT细胞毒性测试
根据ISO10993细胞毒性体外实验法，使用MTT法进行测试。通过以下公式计算相对增殖率，进行毒性分级。相对增殖率＝试验组吸光值/对照组吸光值。样品毒性分级标准：0级≥1；1级≥0.8；2级≥0.5；3级≥0.3；4级≥0。样品合格与否判定标准：0级和1级判为合格，2级者结合形态分析综合评价，3级和4级者判为不合格。
将实施例1制备的水凝胶制备为直径为8mm，厚度为3mm的圆柱，按3cm2/ml的浸提比例分别浸泡于含15％胎牛血清的F12培养基与含15％胎牛血清的DMEM培养基中，37℃浸提24h，制备两种水凝胶浸提液。取人脐静脉内皮细胞(HUVEC)与小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)进行测试，实验组为细胞在水凝胶浸提液培养，对照组为细胞在相应完全培养基中培养。结果如图4所示，两种细胞的相对增殖率均大于≥0.8，属于1级，说明本发明的光交联重组胶原蛋白水凝胶的生物安全性合格。