一种诱导多能干细胞分化为间充质干细胞的培养基组合及方法
阅读说明：本技术 一种诱导多能干细胞分化为间充质干细胞的培养基组合及方法 (Culture medium combination and method for inducing pluripotent stem cells to differentiate into mesenchymal stem cells ) 是由 严庆丰 陈虹 贾则晓 齐念民 王皓 于 2019-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种诱导多能干细胞分化为间充质干细胞的培养基组合及方法。所述培养基组合包括第一阶段的间充质干细胞诱导分化培养基和第二阶段的间充质干细胞支持培养基,所述间充质干细胞诱导分化培养基包括STEMdiff<Sup>TM</Sup>-ACF间充质诱导培养基；所述间充质干细胞支持培养基包括基础培养基、血清和添加剂,所述添加剂包括：L-谷氨酰胺、L-Ascorbic acid、丙酮酸钠、MEM NEEA。所述方法为使用所述培养基组合进行培养,包括：使用间充质干细胞诱导分化培养基诱导培养多能干细胞3天；第4天开始换成间充质干细胞支持培养基进行培养直到获得成熟的间充质干细胞。(The invention discloses a culture medium combination and a method for inducing pluripotent stem cells to differentiate into mesenchymal stem cells. The culture medium combination comprises a first-stage mesenchymal stem cell induced differentiation culture medium and a second-stage mesenchymal stem cell support culture medium, and the mesenchymal stem cell induced differentiation culture medium comprises STEMdiff TM -ACF mesenchymal induction medium; the mesenchymal stem cell support medium comprises a basal medium, serum and additives, wherein the additives comprise: l-glutamine, L-Ascorbic acid, sodium pyruvate, MEM NEEA. The method is to culture by using the culture medium combination, and comprises the following steps: inducing and culturing the pluripotent stem cells for 3 days by using a mesenchymal stem cell induced differentiation culture medium; and starting to change to the mesenchymal stem cell supporting culture medium on the 4 th day until the mature mesenchymal stem cells are obtained.)
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种诱导多能干细胞分化为间充质干细胞的培养基组合及方法。
背景技术
诱导多能干细胞(iPSCs)是由体细胞经转录因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)导入重编程而来的并且具有与胚胎干细胞相似分化能力的细胞，成为研究人类疾病发病机制、组织细胞替代治疗的重要细胞来源，并且不存在伦理问题。以iPSCs作为来源细胞，可以将其在体外扩增并诱导分化为特定的组织细胞。
间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。目前可用于临床应用以治疗多种疾病，因此引起了广泛的关注。间充质干细胞具有独特的生物学特性。即间充质干细胞具有分化成中胚层来源的各种组织的能力，使其非常适合用于再生疗法。此外，间充质干细胞能够通过分泌抗炎分子调节体液和细胞免疫反应，这意味着间充质干细胞非常适合用于治疗一系列基于免疫系统的疾病。最后，间充质干细胞不表达II类抗原或其共刺激分子，这些分子允许细胞逃避宿主的免疫系统，使其可用于异基因移植环境。因此间充质干细胞在临床上具有巨大的应用前景。而如何有效的获取间充质干细胞是亟待解决的问题。
目前国内间充质干细胞的主要来源分为自体来源(骨髓、脂肪组织等)和异体来源(脐带和胎盘等)。但是，使用自体或异体来源的间充质干细胞，普遍存在着一些问题：1、难以取材；2、保存期限较短，取下来的细胞及组织需要立即处理，并进行体外扩增；3、随供者的年龄增大，间充质干细胞数量和扩增潜力显著降低，而体外扩增更会加速间充质干细胞老化(骨髓来源的间充质干细胞一般只能扩增至5～10代)；4、不同供者年龄的间充质干细胞分化潜力不同(年轻人的间充质干细胞易分化成软骨等细胞，而老人的间充质干细胞分化倾向于脂肪细胞)；5、制备过程不易质控。这些缺点很大程度上导致了成体来源的间充质干细胞疗效的不稳定性。
目前，从iPSCs诱导分化为间充质干细胞的方法主要有两种。目前使用较多的方法是首先将多能干细胞诱导成为拟胚体(EB)，随后通过转移拟胚体至培养皿中并使用间充质干细胞诱导培养基诱导而使其分化为间充质干细胞样细胞[Hwang NS,et al.2008]。在分化为间充质干细胞样细胞后需要进行流式分选，筛选出带有间充质干细胞表面标志物的细胞。这种方法主要存在诱导过程复杂、时间长和效率不高等缺点。
直接分化法：直接分化法是将iPSCs先分化为间充质祖细胞(或称前体间充质干细胞)再诱导为成熟的间充质干细胞。这段时间大约6～10天(这个阶段的时长由于各个实验室使用的不同的诱导培养基会略有差异)。此阶段是分化的关键，若诱导培养基和支持培养基配置不合理容易导致随着传代时间延长，死细胞增多，细胞分化潜能丧失。因此需要改进培养基条件来促进细胞分化成均一间充质干细胞。
目前使用较多的方法是拟胚体法。以其中一篇文献为例[Dmitriy Sheyn etal.2016]：将iPSCs消化并接种到非粘附的反应板中，10000个细胞/孔，改良的Dulbecco's培养基(IMDM)(MDM基础培养基，17％KnockOut血清替代品，1％非必需氨基酸，110mmol/L2-巯基乙醇和1％PSA抗真菌-抗菌溶液)。在第2天，将EB转移至非粘附的2.4μg/cm2聚-HEMA涂覆的烧瓶并再培养3天。在第5天，将EB转移至1％明胶处理的烧瓶中再培养3天。在第8天，一些EB附着在表面，细胞从EB向外生长。将未附着的EB转移到另一个1％明胶包被的烧瓶中。在第8-10天之后，将培养基换成含有10％胎牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺和100U/mL青霉素/链霉素的DMEM培养基。每周更换培养基两次，并在汇合时以1∶3的比例传代。最后用流式细胞筛选出带有间充质干细胞特异性表面标记物的细胞。这种方法的局限在于：①形成的EB由于初始不同的细胞数目或者分化所持续的时间影响前体间充质干细胞产生的数量；②EB是一个近似球形，存在EB不同层的细胞在培养基中存在不同浓度梯度，导致不同胚层组织不同发展阶段的细胞产生，影响细胞纯度。
饲养层细胞共培养法[Ran Kang,et al.2015]：饲养层细胞通过分泌细胞因子，促进培养体系中目的细胞的生长。将iPSCs与饲养层细胞共培养，这些细胞分泌一些细胞因子以支持细胞分化。在将iPSCs传代至饲养层细胞培养3天，用间充质干细胞培养基替换KSR培养基。将iPSCs在间充质干细胞培养基中维持2周，每隔一天更换培养基。随后，通过胰蛋白酶消化(0.25％胰蛋白酶/1mmol/L EDTA)将细胞传代至明胶包被(0.1％明胶，室温，2小时)组织培养容器。在第一次传代后将细胞定义为第1代(P1)。为了维持iPSC-间充质干细胞，将细胞在90％汇合时传代并以1.6×104个细胞/cm2的密度接种到新的培养皿中。这种方法的局限在于：①饲养层细胞分泌的因子不确定，不同批次分化出来的细胞的质量参差不齐；②一个培养皿分化出来的细胞会混杂饲养层细胞，导致细胞纯度下降。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种诱导多能干细胞分化为间充质干细胞的培养基组合及方法，以解决现有技术中间充质干细胞诱导分化成本高、效率低且不稳定等技术问题。
本发明首先提供了一种诱导多能干细胞分化为间充质干细胞的培养基组合，包括第一阶段的间充质干细胞诱导分化培养基和第二阶段的间充质干细胞支持培养基，所述间充质干细胞诱导分化培养基包括STEMdiffTM-ACF间充质诱导培养基；所述间充质干细胞支持培养基包括基础培养基、血清和添加剂，所述添加剂包括：L-谷氨酰胺、L-Ascorbicacid、丙酮酸钠、MEM NEEA。
优选的，所述添加剂包括：终浓度为2mmol/L的L-谷氨酰胺、100μmol/L的L-Ascorbic acid、1mmol/L的丙酮酸钠和体积比为1％的MEM NEEA。
优选的，所述基础培养基为DMEM/F-12基础培养基，所述血清为胎牛血清，所述基础培养基中胎牛血清的加入体积为10％。
优选的，所述间充质干细胞诱导分化培养基和间充质干细胞支持培养基中均添加体积比为1％的双抗。双抗包括青霉素和链霉素，可以直接买成品进行使用，抗生素加入主要用于防止细胞污染。
本发明又提供了一种诱导多能干细胞分化为间充质干细胞的方法，使用所述培养基组合进行培养，包括：使用间充质干细胞诱导分化培养基诱导培养多能干细胞3天；第4天开始换成间充质干细胞支持培养基进行培养直到获得成熟的间充质干细胞。
优选的，所述的方法，包括以下步骤：
(1)准备多能干细胞；
(2)使用所述间充质干细胞诱导分化培养基进行诱导培养，每天更换一次培养基，共诱导培养3天；
(3)第4天开始更换为所述间充质干细胞支持培养基进行诱导培养，每天更换一次培养基，当细胞密度达到70～90％之间时进行传代(在第一次传代时可将剩余细胞进行冻存)，传代培养5～8代，获得成熟的间充质干细胞。
更优选的，步骤(1)中使用的多能干细胞为诱导多能干细胞。
更优选的，步骤(1)中在诱导培养前2天将多能干细胞接种到包被Matrigel的培养器皿中，进入步骤(2)诱导培养时，细胞密度达到40％～60％。
更优选的，步骤(3)中传代时细胞接种到包被0.1％明胶的培养器皿中。
更优选的，第6天时获得前体间充质干细胞。
与现有技术相比，本发明有如下增益效果：
(1)本发明通过采用间充质干细胞诱导分化培养基和间充质干细胞支持培养基两种培养基依次对多能干细胞诱导分化成前体间充质干细胞以及成熟间充质干细胞，提高了诱导多能干细胞分化成间充质干细胞的效率。
(2)在前体间充质干细胞诱导分化后(即分化第6天)可进行细胞冻存，冻存细胞可进行下一次诱导分化，缩短了分化时间。
附图说明
图1：比较了两种诱导分化方式的不同时期的细胞生长状态：实施例1中细胞增殖良好，P6代细胞形态和增殖能力依然很好。对比组每次传代死细胞较多，在P3～P6代之后增殖能力开始衰退。
图2：对比了实施例1和对比组的分化效率。在分化的不同时期对细胞进行计数，相比之下实施例1的细胞分化效率明显大于对比组。
图3：iPSCs分化的间充质干细胞(诱导培养27天后)高表达间充质干细胞特异性marker：CD73、CD105、CD90和CD146；(诱导培养第10天和第27天)均低表达胚胎干细胞特异性marker：4-Oct、Nanog、Sox2和EPCAM。以上结果表示，实施例1的iPSCs诱导间充质干细胞成功。
图4：对分化第27天的间充质干细胞进行CD73的免疫荧光。结果显示CD73在间充质干细胞中高表达。通过免疫荧光染色可以看出通过上述方法分化的间充质干细胞CD73阳性，证明间充质干细胞分化成功。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的诱导多能干细胞分化成间充质干细胞培养基及方法作进一步详细说明。本实例采用的培养基及补充剂均可在市面购得。
本发明旨在提供一种间充质干细胞诱导分化培养基及间充质干细胞诱导分化方法，根据本发明的一个方面，提供了第一阶段的一种间充质干细胞诱导分化培养基和第二阶段的间充质干细胞支持培养基。
第一阶段的间充质干细胞诱导分化培养基为STEMdiffTM-ACF MesenchymalInduction Medium(STEMdiffTM-间充质诱导培养基，cat#05241)，1％双抗(包括青霉素和链霉素，GIBCO，cat#15140122)。
第二阶段的间充质干细胞支持培养基包括90％基础培养基，10％胎牛血清和添加剂；其中基础培养基为DMEM/F-12培养基；添加剂为2mmol/L L-谷氨酰胺(GIBCO，cat#25030081)，100μmol/L L-Ascorbic acid(sigma，cat#A92902)，1mmol/L丙酮酸钠(GIBCO，cat#11360070)，1％MEM NEEA(MEM非必须氨基酸，GIBCO，cat#11140050)和1％双抗(包括青霉素和链霉素，GIBCO，cat#15140122)。
上述添加剂及组分含量是指在间充质干细胞诱导分化培养基中的浓度含量或添加的体积比。
STEMdiffTM-ACF Mesenchymal Induction Medium(STEMdiffTM-间充质诱导培养基)配置和储存，间充质干细胞诱导分化培养基在室温(15～25℃)下解冻或在2-8℃下解冻过夜。使用前彻底混匀或分装储存于-20℃。融化后4℃储存不超过2周。
第二阶段间充质干细胞支持培养基所述的基础培养基和各添加剂保存于4℃，L-Ascorbic acid按照终浓度1000X的比例稀释后分装，-20℃储存。间充质干细胞支持培养基配置好后4℃储存不超过4周。
实施例1
实验一
1、实验材料：诱导多能干细胞(iPSCs)。(细胞来源于实验室体系诱导的iPSCs，原始细胞来源于正常人体细胞)
2、实验相关培养基及试剂：mTeSRTM1(Stemcell，cat#85850)，DMEM/F-12(Gibco，cat#11320033)，Accutase(InvitrogenTM，cat#00-4555-56)，Y-27632(Sigma，cat#Y0503)，Matrigel(BD，Cat#356243)，D-PBS(Gibco，cat#C14190500BT)。
3、实验步骤：
在第-2天，预热(15-25℃)足量的iPSCs培养基mTeSRTM1，DMEM/F-12和胰酶替代物，进行传代。mTeSRTM1中添加Y-27632以促进iPSCs贴壁，Y-27632的终浓度为10μmol/L。
实验开始前半小时预先将1mL Matrigel包被于6孔板。
用1mL D-PBS(不含Ca++和Mg++)洗涤孔以进行传代。洗涤丢弃。
加入1mL Accutase(胰酶替代物)以消化iPSCs。
在37℃孵育3～5分钟。
轻轻地上下吹打以获得单细胞悬浮液。
将单细胞悬浮液转移至含有等体积培养基(DMEM/F-12)的15mL离心管。用2mL培养基冲洗孔并将冲洗液加入离心管中。
300×g离心细胞5分钟。
将细胞重悬于1mL mTeSRTM1中，并使用台盼蓝和血细胞计数器进行活细胞计数。
将细胞铺板到已包被Matrigel的6孔板上，20万/孔。如果需要，调整细胞密度，在第0天达到约30～50％的汇合度。
在37℃孵育24小时。
在第-1天，温热(15～25℃)mTeSRTM1。
从孔中吸出培养基并用2mL新鲜mTeSRTM1替换。在37℃孵育24小时。
继续实验二部分。
实验二
实验相关培养基及试剂：STEMdiffTM-ACF间充质干细胞诱导分化培养基(Stemcell，cat#05241)，0.1％明胶(Stemcell，cat#07903)，D-PBS(Gibco，cat#C14190500BT)，
在第0天，温热(15～25℃)解冻的STEMdiffTM-ACF间充质干细胞诱导分化培养基。
从孔中吸出培养基。用1mL D-PBS(不含Ca++和Mg++)轻轻洗涤。丢弃。
每孔加入3mL STEMdiffTM-ACF间充质干细胞诱导分化培养基。
37℃孵育24小时。
在第1～3天，用3mL STEMdiffTM-ACF间充质干细胞诱导分化培养基进行每日培养基更换。
在第4天，温热(15～25℃)间充质干细胞支持培养基。
从孔中吸出培养基。用1mL D-PBS(不含Ca++和Mg++)轻轻洗涤。丢弃洗涤。
加入2mL间充质干细胞支持培养基。
在37℃孵育24小时。
在第5天，用2mL间充质干细胞支持培养基进行培养基更换。在37℃孵育24小时。
在第6天，获得前体间充质干细胞。将细胞传代到预先包被有明胶的6孔板上，如下所述：
复温(15-25℃)间充质干细胞支持培养基。添加Y-27632(终浓度10μmol/L)。
用2.5mL D-PBS(不含Ca++和Mg++)洗涤孔以传代一次。丢弃洗涤。
加入1mL胰酶替代物，在37℃孵育3～5分钟。
1mL移液器轻轻吹打细胞。转移至含有等体积的的15mL离心管。
300×g离心7分钟。
弃去上清液，将细胞沉淀重悬于3mL含有10μmol/L Y-27632的间充质干细胞支持培养基中。并使用台盼蓝和血细胞计数器进行活细胞计数。
上述细胞置于预包被有明胶的6孔板，10～15万/孔。如果需要，调整细胞密度，在第4天达到约60～80％的汇合度。剩余细胞可用
在37℃孵育。每天进行半量换液，约3～6天。当细胞大约80％汇合时，进行传代。
实验三
实验相关试剂：间充质干细胞支持培养基，0.1％明胶(Stemcell，cat#07903)，D-PBS(Gibco，cat#C14190500BT)，胰酶替代物(Gibco，cat#12605036)
第二次及以上的传代方式如下：
用2.5mL D-PBS(不含Ca++和Mg++)洗涤孔一次。丢弃洗涤。
加入1mL的胰酶替代物以消化细胞(37℃孵育3～5min)。
加入2mL的间充质干细胞支持培养基终止消化。
300×g离心8分钟。
丢弃上清液。将细胞沉淀重悬于2mL间充质干细胞支持培养基中。
细胞汇合度到达80％左右即可进行传代。
每次传代细胞铺板密度应为前一次铺板密度的60～70％。
在经过3～5次实验三的传代(从开始诱导到结束约27天)即获得成熟的间充质干细胞。
图1比较了两种诱导分化方式的不同时期的细胞生长状态：实例1中细胞增殖良好，P6代细胞形态和增殖能力依然很好。对比组每次传代死细胞较多。在P3～P6代之后增殖能力开始衰退。需要开始重新分化。对比组的具体实验方法同实例1，区别在于培养基不一样。对比组使用的是传统的间充质干细胞诱导分化培养基和间充质干细胞支持培养基：间充质干细胞诱导分化培养基：10％FBS+90％aMEM+10μM SB431542；人诱导多能干细胞来源间充质干细胞维持培养基：25ml UltraGROTM-Advanced添加物+475ml aMEM。对比组在细胞诱导过程中不能进行冻存(冻存后细胞分化失败)。
图2对比了两组细胞的分化效率。在分化的不同时期对细胞进行计数，相比之下实施例1获得的细胞分化效率明显大于对比组。
实验四
对于实验二中冻存的前体间充质干细胞(诱导开始后第6天)，可遵循以下步骤进行实验。
实验相关试剂：间充质干细胞支持培养基，0.1％明胶(Stemcell，cat#07903)，D-PBS(Gibco，cat#C14190500BT)，DMEM/F-12(Gibco，cat#11320033)。
将冻存的细胞置于37℃快速融化。
从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到15ml离心管并滴加10倍以上培养液，混匀。
1000rpm，5min离心。
弃去上清液，用10mL间充质干细胞支持培养基重悬。
每孔2mL的细胞悬液置于6孔板，37℃培养。
20～24h后，2mL间充质干细胞支持培养基换液。
继续培养3～5天，期间不换液，当细胞密度达到80％左右可根据步骤三进行传代。
实施例2
1、实验目的：人间充质干细胞荧光定量PCR鉴定。
2、实验材料：iPSCs和实施例1中分化的间充质干细胞(Day表示从诱导开始的天数)。
3、实验步骤：
(1)样品RNA提取。
(2)RNA浓度和质量测定。
(3)样品cDNA合成，按照逆转录标准体系合成cDNA。
(4)稀释样品模板，按照qPCR标准体系进行。每个样品重复三次。
(5)计算目的基因的相对表达量。
Oct、Naong、SOX2、EPCAM是胚胎干细胞特异性标记物，而CD73、CD90、CD105以及CD146是间充质干细胞特异性的标记物。通过荧光定量PCR结果可看出分化成熟的间充质干细胞高表达特异性标记物，而低表达胚胎干细胞表面标记物。说明分化得到的是间充质干细胞。
图3：iPSCs分化的间充质干细胞(诱导培养27天后)高表达表达间充质干细胞特异性marker:CD73，CD105和CD90和CD146；低表达胚胎干细胞特异性marker：4-Oct、Nanog、Sox2和EPCAM。以上结果表示，实施例1的iPSCs诱导间充质干细胞成功。
实施例3
1、实验目的：人间充质干细胞免疫荧光染色鉴定。
2、实验材料：实施例1中诱导完成的间充质干细胞(Day27)。
3、实验步骤：
24孔板里加细胞爬片，包被明胶，37℃2h。
将间充质干细胞铺到爬片上，37℃，5％CO2培养1～2天。
弃去培养基，用PBS洗1遍，每遍5min。
加4％甲醛，每孔500μl，室温固定15min。
用PBS洗3遍，每遍5min，30rpm摇晃。
0.2％Triton-X100室温通透15min，每孔500μl。
用PBS洗3遍，每遍5min，30rpm摇晃。
3％BSA室温封闭1～2h，每孔500μl。
加一抗CD73(Abcam，cat#ab133582)4℃过夜：抗体用3％BSA稀释，按照每个爬片可以用40～50μl。用胶条固定在培养皿盖子上，滴一滴一抗，将爬片盖在一抗上，细胞面向下。放入湿盒，放入冰箱，保持平稳。
从冰箱例取出湿盒，PBS加入培养皿，每孔500μl，轻取爬片，细胞面向上，将爬片放入有PBS的孔板，PBS洗3遍，每次5min，30rpm摇晃。此时一抗可以回收，用EP管做好标记。
加二抗(Abcam，cat#ab150077)，室温避光孵育2h。用PBS洗3遍，每次5min，30rpm摇晃。
加入终浓度为1μg/mL DAPI，0.5mL每孔，室温避光放置5min。
PBS洗1遍，每次5min，30rpm摇晃。
将细胞爬片置载玻片上用封片剂封片。
共聚焦显微镜下观察结果。
图4：对分化第27天的间充质干细胞进行CD73的免疫荧光。结果显示CD73在间充质干细胞中高表达。通过免疫荧光染色可以看出通过上述方法分化的间充质干细胞CD73阳性，证明间充质干细胞分化成功。
从以上描述中，可以看出，本发明的实施实现了如下的技术效果：
1、本发明的间充质干细胞支持培养基成分明确；
2、分化过程不需要动物源细胞作饲养层；
3、分化过程无须形成拟胚体；
4、培养基成分简单；
5、分化效率高；
6、在分化第6天可进行前体间充质干细胞冻存，节约成本和时间。
以上所述仅为本发明的实例方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出一些变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围以所附属权利要求为准。
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