阅读说明：本技术 苯乳酸尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶的应用 (Application of phenyllactic acid uridine diphosphate glucosyltransferase ) 是由 廖志华 陈敏 杨春贤 曾俊岚 邱飞 于 2019-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了苯乳酸尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(Phenyllactate UDP-Glycosyltransferase,PLA-UGT)基因的应用,苯乳酸尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶PLA-UGT的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；编码苯乳酸尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶PLA-UGT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；本发明首次发现苯乳酸尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶PLA-UGT以尿苷二磷酸葡萄糖为糖基供体,将苯乳酸糖基化形成苯乳酰葡萄糖酯,对于提高药用植物中托品烷生物碱含量和发展托品烷生物碱合成生物学具有重要的意义。(The invention discloses an application of phenyllactic acid uridine diphosphate glucosyltransferase (PLA-UGT) gene, wherein the amino acid sequence of the phenyllactic acid uridine diphosphate glucosyltransferase (PLA-UGT) is shown in SEQ ID No. 4; the nucleotide sequence of the PLA-UGT gene for encoding the phenyllactic acid uridine diphosphate glucosyltransferase is shown as SEQ ID NO. 3; the invention discovers for the first time that the phenyllactic acid uridine diphosphate glucosyltransferase PLA-UGT takes uridine diphosphate glucose as a glycosyl donor, glycosylates the phenyllactic acid to form phenyllactyl glucose ester, and has important significance for improving the content of tropane alkaloid in medicinal plants and developing the synthetic biology of tropane alkaloid.)

苯乳酸尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及苯乳酸尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因的应用。

背景技术

托品烷生物碱(tropane alkaloids，TAs)是一类具有巨大医疗价值的抗胆碱药物，广泛 用于麻醉、镇痛、止咳、平喘和抗晕动病，也用于控制帕金森病的僵直和震颤。临床上常用 的托品烷生物碱是莨菪碱(hyoscyamine)和东莨菪碱(scopolamine)，两者的市场需求均十 分巨大。目前TAs都是从少数茄科TAs资源植物中提取，包括颠茄(Atropabelladonna)、曼 陀罗(Datura stramonium)和莨菪(Hyoscyamus niger)，颠茄是东莨菪碱和莨菪碱最主要的 商业栽培药源，也是药典收录的TAs药源植物。野生颠茄植株中莨菪碱质量分数为0.02％～ 0.17％(干重)，东莨菪碱含量极低，仅为干重的0.01％～0.08％。因此，培育托品烷生物碱 高产颠茄一直是该行业长期追求的目标。

苯乳酰葡萄糖是托品烷生物碱生物合成途径中的中间产物，苯乳酰葡萄糖和托品发生酯 化缩合形成海螺碱，而海螺碱是莨菪碱生物合成的重要前体物质。因此，苯乳酰葡萄糖的生 物合成对托品烷生物碱生物合成至关重要。此前，未见相关研究的报道，极大地阻碍了托品 烷生物碱合成生物学的发展。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种以尿苷二磷酸葡萄糖为糖基供体，将苯乳酸酯化 形成苯乳酰葡萄糖的糖基转移酶PLA-UGT，对于提高TAs资源植物药用成分含量和发展TAs 合成生物学具有重要的意义，反应过程如下：

本发明的目的之二在于提供苯乳酸尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶在提高茄科TAs资源植物 生物碱含量中的应用；本发明的目的之三在于提供苯乳酸尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶在植物 或微生物中重建苯乳酸反应生成苯乳酰葡萄糖代谢途径中的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、苯乳酸尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶在体内或体外催化苯乳酸反应生成苯乳酰葡萄糖中 的应用。

本发明中，所述苯乳酸尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示； 或将SEQ ID NO.4中的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且 具有苯乳酸尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶功能的氨基酸酸序列。

优选的，编码所述苯乳酸尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示； 或将SEQ ID NO.3中的核苷酸经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具有苯乳酸 尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶功能的核苷酸序列。

本发明中，苯乳酸尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶催化反应体系为以苯乳酸和尿苷二磷酸葡 萄糖为底物，苯乳酸尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶蛋白为催化剂。

优选的，所述反应体系中还含有MnCl₂和反应缓冲液，所述反应缓冲液为pH7.0、2mM 的Tris-HCl。

2、苯乳酸尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶在提高茄科TAs资源植物生物碱含量中的应用。

优选的，所述生物碱为海螺碱、莨菪碱、山莨菪碱或东莨菪碱。

优选的，所述茄科TAs资源植物为颠茄、曼陀罗或莨菪。

3、苯乳酸尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶在植物或微生物中重建苯乳酸反应生成苯乳酰葡萄 糖代谢途径中的应用，所述苯乳酸尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4 所示；或将SEQ ID NO.4中的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且具有苯乳酸尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶功能的氨基酸酸序列。

优选的，所述微生物为细菌或真菌。

本发明的有益效果在于：本发明首次发现苯乳酸尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶PLA-UGT 以尿苷二磷酸葡萄糖为糖基供体，将苯乳酸糖基化形成苯乳酰葡萄糖酯，通过干扰表达发现 PLA-UGT的表达水平受到抑制后，颠茄中海螺碱、莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱的合成减少， 表明PLA-UGT参与了托品烷生物碱的生物合成，因此可以通过调控PLA-UGT的表达水平调 控托品烷生物碱的含量，对调控TAs资源植物药用成分含量和发展TAs合成生物学具有重要 的意义。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为毛状根获得过程和分子检测结果(a：外植体诱导毛状根；b：毛状根单克隆单独 培养；c：毛状根液体培养；d：发根基因rolB和rolC检测结果；e：抗性基因(NPTII)检测结果；f：35S引物和PLA-UGT-RNAi下游引物检测结果；M：Marker；P：阳性对照；N： 阴性对照；C：空质粒对照；1～5：转基因毛状根)；

图2为qPCR分别检测PLA-UGT抗性毛状根中的基因相对表达水平；

图3为UPLC-MS/MS测定了PLA-UGT转基因干扰毛状根中托品烷生物碱含量(A：海螺碱；B：莨菪碱；C：山莨菪碱；D：东莨菪碱)。

图4为大肠杆菌重组PLA-UGT蛋白检测及催化活性分析(a：PLA-UGT蛋白质利用SDS-PAGE凝胶分析；b：热失活的PLA-UGT加入到酶催化体系反应结果；c：PLA-UGT加 入酶催化体系；d：提取离子色谱结果)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的 理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、苯乳酸尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因克隆

颠茄须根总RNA的提取：取适量颠茄须根组织，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的 1.5mL Eppendorf(EP)离心管中，充分振荡后，按照TIANGEN试剂盒的说明书抽提总RNA。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，在分光光度计上测定RNA浓度。

PLA-UGT基因的克隆：以所提取的总RNA为模板，按照天根FastKing cDNA第一链合成试剂盒说明书合成cDNA；设计基因特异性引物，具体引物如下：

PLA-UGT-F：5’-atgggatctcaaggtaccaa-3’(SEQ ID NO.1)；

PLA-UGT-R：5’-ctaattggatagaggtgcta-3’(SEQ ID NO.2)；

通过PCR从总cDNA中扩增PLA-UGT基因，并测序。

通过上述步骤，获得了颠茄PLA-UGT基因的全长编码序列如SEQ ID NO.3所示，其蛋 白编码序列如SEQ ID NO.4所示。其中，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。

实施例2、PLA-UGT干扰的毛状根获得及检测

根据PLA-UGT基因的全长设计干扰PLA-UGT表达的引物，具体引物如下：

PLA-UGT Ri-F：5’-cgcggtaccaagcttgtgactcactgtggatggaa-3’(SEQ ID NO.5)；

PLA-UGT Ri-R：5’-cgcctcgagggatcccacacgacctttgtttattta-3’(SEQ ID NO.6)；

然后以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列为引物，实施例1扩增获得的PLA-UGT基因 或cDNA为模板进行PCR扩增获得495bp的片段，然后将获得的片段用KpnⅠ和XhoⅠ酶切连 入pBin19载体的相同酶切位点处，获得pBin19-PLA-UGT-RNAi干扰质粒。然后将获得的pBin19-PLA-UGT-RNAi干扰质粒转化发根农杆菌C58C1，获得可用于颠茄基因转化的工程菌。 将工程菌转化颠茄无菌苗叶片，经共培养2天后将颠茄外植体转入到筛选培养基(MS+Kan 100mg/L+Cb 500mg/L)上于25℃暗培养，每周继代培养一次，经过1-2次继代后即可获得Kan 抗性毛状根。将生长良好的毛状根剪下转入培养基(MS+Cb 200mg/L)上培养至完全无菌， 从而获得Kan抗性颠茄毛状根。同时以pBin19空载体转化的毛状根作为对照，结果如图1所示。 结果显示，在黑暗条件下，25℃培养4周后，颠茄叶片外植体开始长出大量毛状根(图1，a)。 将每一根毛状根作为单克隆单独培养，每隔两周更换一次培养基，生长良好的毛状根表现出 生长迅速和多分支的特征(图1，b)。

根据毛状根特性设计检测NPTII、rolB、rolC和PLA-UGT干扰片段的引物，具体引物如 表1所示。

表1、抗性毛状根进行分子检测引物

名字	引物序列(5′→3′)
		NPTII-F	cgcttgggtggagaggctatt(SEQ ID NO.7)
NPTII-R	gatcatcgccgtcgggcatg(SEQ ID NO.8)
		rolB-F	gctcttgcagtgctagattt(SEQ ID NO.9)
rolB-R	gaaggtgcaagctacctctc(SEQ ID NO.10)
		rolC-F	taacatggctgaagacgacc(SEQ ID NO.11)
rolC-R	aaacttgcactcgccatgcc(SEQ ID NO.12)
		F-35S	gacgcacaatcccactatcc(SEQ ID NO.13)

选取除菌彻底的毛状根提取基因组DNA进行PCR检测，结果显示在所有毛状根中均能够 检测到发根基因rolB和rolC以及抗性基因(NPTII)(图1，d，图1，e)，用35S引物和PLA-UGT -RNAi下游引物检测基因组DNA，在PLA-UGT-RNAi的株系中检测到了目的条带，而在以pBin19空质粒作为对照的毛状根株系中没有相应的目的条带(图1，f)。将PCR检测为阳性以及空质粒对照的毛状根接种至液体MS培养基中，每个独立毛状根株系接种5条5-8cm长的根。 毛状根在液体培养基中培养30天(图1，c)，收获材料用于分子检测和相关代谢产物测定。

利用qPCR分别检测PLA-UGT抗性毛状根中的基因相对表达水平，结果如图2所示。在 PLA-UGT干扰的毛状根株系中，PLA-UGT的表达量与对照相比均受到不同程度的抑制，基因表达水平仅为对照的18.74％到41.92％。qPCR结果说明，获得的抗性毛状根确为转基因毛 状根，在这些毛状根中PLA-UGT的表达水平都得到显著性抑制。

实施例3、UPLC-MS/MS检测转基因毛状根中代谢物的含量

将毛状根在液体MS培养基中培养30d后收获，装在锡箔袋中，样品置于冷冻干燥机中 干燥至恒重，干燥的样品研磨成粉末。对于海螺碱和莨菪碱含量测定，取25mg干燥粉末，加入1mL代谢物提取液(20％甲醇水，0.1％甲酸)，加入终浓度100ng/mL的替米沙坦作为 内标。样品置于水平摇床提取3小时，离心后取上清用于代谢物分析。

海螺碱和莨菪碱含量测定使用Waters UPLC-Xevo TQD质谱检测器，色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH色谱柱(2.1×50mm,1.7μm)，柱温设定为40℃，进样量为2μL，样品采用二元梯度分离，其中流动相A为0.1％的甲酸水，流动相B为乙腈，流动相流速为0.4mL/min。梯度洗脱程序如表2所示：

表2、梯度洗脱程序

时间程序(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	99	1
1	99	1
			6.5	80	20
7.5	5	95
			7.6	99	1
10	99	1

质谱参数设定如下，离子源电压：3kV；离子源温度：500℃；气体流速：1000L/h；圆锥气体流速：50L/h。使用ESI在正离子(ESI+)模式下进行测定，使用优化的MRM参数检 测，MRM参数设定如表3所示：

表3、MRM参数

检测结果如图3所示。结果显示，在PLA-UGT干扰的株系中，海螺碱和莨菪碱的含量均显著低于对照组。海螺碱在对照毛状根中的含量为234.00μg/g干重，而在PLA-UGT干扰的毛状根株系中，其含量为16.65–50.31μg/g干重，仅为对照株系中含量的7.1–21.5％(图3， A)。PLA-UGT被抑制后，阻断了毛状根中海螺碱的生物合成。海螺碱是托品烷生物碱生物合成途径中非常重要的中间体，由于海螺碱的减少，莨菪碱在PLA-UGT抑制的毛状根株系中的含量显著性减少。对照毛状根中，莨菪碱的含量为3.01mg/g干重，而在PLA-UGT抑制 的毛状根株系中，莨菪碱的含量分别为0.11-0.43mg/g干重，仅为对照株系中含量的7.1–21.5％ (图3，B)。在转基因毛状根中，山莨菪碱和东莨菪碱的生物合成也受显著性抑制。PLA-UGT 被沉默后，两个生物碱的含量分别是对照株系中含量的7.1–21.5％和7.1–21.5％，含量下降 至0.11-0.43mg/g干重和0.05-0.21mg/g干重，而在对照中，两种生物碱的含量分别为0.11-0.43 mg/g干重和0.05-0.21mg/g干重(图3，C和图3，D)。生物碱含量分析进一步确证了PLA-UGT 参与了托品烷生物碱的生物合成。

实施例4、大肠杆菌重组PLA-UGT及催化活性分析

将PLA-UGT编码区用高保真聚合酶扩增，用BamHI和SalI限制性内切酶酶切后构建至 pET28a，并转化大肠杆菌BL21，获得PLA-UGT原核表达工程菌株。由于构建载体中在大肠杆菌中获得了N-末端含有6×组氨酸标签的融合PLA-UGT蛋白，用镍离子亲和层析纯化目标蛋白质。将亲和纯化获得蛋白质利用SDS-PAGE凝胶分析，检测到一个单一的蛋白质条带，其分子量为58.1kDa，与其预测的分子量大小一致(图4，a)。

酶活分析方法如下，反应体系包含2mM苯乳酸、5mM尿苷二磷酸葡萄糖和2mMMnCl₂，反应缓冲液为50mM Tris-HCl(pH7.0)，加入20μg重组PLA-UGT蛋白，以煮沸失 活的重组PLA-UGT蛋白作为阴性对照，反应时间为30分钟。检测结果发现在反应体系中有 新的产物生成(图4，c)，提取离子色谱显示新生成产物的质荷比327.1083(m/z，[M-H]^-) (图4，d)，这和预期的负离子模式下苯乳酰葡萄糖的质荷比一致。当把热失活(煮沸失活) 的PLA-UGT加入到上述酶催化体系中时，反应产物利用质谱检测，在提取离子色谱中并未 检测到苯乳酰葡萄糖(图4，b)。这些数据表明PLA-UGT能够利用UDP-葡萄糖使苯乳酸发 生糖基化，生成苯乳酰葡萄糖。

实施例5、在烟草叶片中重建海螺碱的生物合成

将PLA-UGT和LS(海螺碱合成酶，littorine synthase，SEQ ID NO.14)的全长编码区利 用高保真DNA聚合酶扩增，上下游引物引入AgeI和XhoI限制性内切酶酶切位点。扩增产物 用AgeI和XhoI限制性内切酶酶切后克隆至pEAQ-HT载体中，获得PLA-UGT和LS的瞬时高表达载体pEAQ-PLA-UGT-HT和pEAQ-LS-HT并分别转化为农杆菌GV3101，以 pEAQ-YFP-HT转化GV3101作为阴性对照。GV3101-pEAQ-PLA-UGT、GV3101-pEAQ-LS 和GV3101-pEAQ-YFP三个植物转化工程菌分别扩大培养后，菌体用缓冲液(10mM MES、 10mM MgCl₂和150μM AS)重悬，调节OD₆₀₀至0.6，于室温放置3小时，在注射烟草之前， 三个菌液按表4组合等体积混合：

表4、菌液混合

菌液均匀混合后，注射烟草，烟草放置于弱光环境下继续培养96小时后，注射海螺碱合 成需要的底物：托品和苯乳酸。托品和苯乳酸溶解在0.1％DMSO的水中，最终浓度均为1mM， 底物注射后继续培养24小时后收获烟草叶片，叶片采用冷冻干燥后用于后续检测分析。冷冻 干燥的叶片研磨粉碎后，准确称取50mg，加入1mL 80％的甲醇水溶液，样品置于水平摇床 提取3小时，离心后取上清用于代谢物分析。代谢物分析UPLC-MS/MS仪器，仪器为LC-30AD UPLC系统(岛津，日本)配备AB SCIEX Triple Quad 5500三重四级杆质谱检测器。样品分 离使用Waters Symmetry C18色谱柱(2.1×100mm,3.5μm)，柱温箱设置为40℃，采用二元 梯度洗脱，其中流动相A为0.1％的甲酸水，流动相B为乙腈，流动相流速为0.4mL/min。 梯度洗脱程序如表5所示：

表5、洗脱程序

时间程序(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	99	1
2	99	1
			6	80	20
7	5	95
			7.5	5	95
7.6	99	1
			10	99	1

质谱参数设定如下，离子喷雾电压：5.5kV；离子源温度：500℃；气帘气体压力：40psi； 离子源气体压力：50psi。使用ESI在正离子(ESI+)模式下进行测定，使用优化的MRM参 数检测，MRM参数设定如表6所示：

表6、MRM参数设定

质谱检测结果所示，不同组间托品和海螺碱的含量存在极显著变化。托品的海螺碱的保 留时间分别为0.63min和5.45min。空质粒对照组未检测到海螺碱的生成。单表达PLA-UGT 组也未检测到海螺碱的生成。单表达LS组检测到少量海螺碱的生成。而PLA-UGT和LS共 表达组中海螺碱的合成能力极大幅度增强。以上结果表明，PLA-UGT对于推动海螺碱生物合 成中起着非常重要的作用，在托品烷生物碱代谢工程和合成生物学中具有不可替代的重要价 值。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限 于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范 围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 西南大学

<120> 苯乳酸尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶的应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggatctc aaggtaccaa 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctaattggat agaggtgcta 20

<210> 3

<211> 1473

<212> DNA

<213> 颠茄(Atropa belladonna)

<400> 3

atgggatctc aaggtaccaa tatagattca atcattcatg tctttctgat atcatttcct 60

ggtcaaggac atgtcaatcc attgctccga cttggcaaac gccttgcctc gaaaggtgtt 120

ctggtcagtt tctgcgcacc tgaatgtgtc ggcaaggaca tgagagcagc caacaacaac 180

ataattagtg atgagccaac tccttatgga gatggtttca tccgatttga gttcttcgat 240

ggttgggaat acactcagcc taaagagaat cgtcaactcg agatagagct ggcgaatctc 300

gaagttgtag ggagagcagt gctccctgca atgctaaaag agaatgaagc aaaagggcgt 360

cccgtttcat gtctaatcaa caatccattc attccatggg tatgtgatgt ggctgacagc 420

cttggtatac cttgtgctgt cctatgggtc caatcttgtg ctagtttctc tgcttattat 480

cactatcatt tcaatcttgc tcctttccca aatgaatcaa atccaaacat tgatgttcac 540

ttgcctaaca tgccaattct caagtgggat gaacttccta gcttcttgct accatctaat 600

ccatatcctg ccttagcaaa tgccattttg agacaattca attacctctc taaacccatt 660

cgtattttca tcgaatcatt cgatgagctc gaaaaagaca ttgtggacta catgtccgat 720

tttttgccaa tcaagaccgt cggtccacta ctagtcgaag atccaaaaat cgaacaagtc 780

gttcgtgctg acttggtcaa ggctgatagc tcaatcactc aatggctcaa ttccaagcca 840

ccatcctctg ttgtatacat ttctttcggg agtattgttg ttccgagcca ggaacaagtt 900

gatgagatcg cctacggtat attgaattcg gggctaaatt tcttgtggat catgaagcca 960

ccccgaaaaa actcgtcctt ccccacagtg gtcttgccac aaggctattt ggacaaaatt 1020

ggagataaag gaaaagttgt ggaatggtgt ttgcaagaac aggttttagc acatccatct 1080

ttagcctgtt ttgtgactca ctgtggatgg aattcgtcga tggaggtcat cgctaacggc 1140

gtccctatcg tagcatttcc ccaatggggt gatcaagtga cggatgctaa gtacctggtg 1200

gatgaattca aaataggggt aagactttct agaggtgtga cagagaacag ggttattcct 1260

cgggacgaag ttgaacgatc tttgcatgac gtgacgagtg gtcctaaggt ggcggagatg 1320

aaagagaatg cgttgaaatg gaagatgaaa gcaacggagg cagtggcgga aggtggttca 1380

tccgatctga atttgaagtc ctttgttgat gagcttagaa cactgcaaaa cagcaacaaa 1440

aatttggcca agttagcacc tctatccaat tag 1473

<210> 4

<211> 490

<212> PRT

<213> 颠茄(Atropa belladonna)

<400> 4

Met Gly Ser Gln Gly Thr Asn Ile Asp Ser Ile Ile His Val Phe Leu

1 5 10 15

Ile Ser Phe Pro Gly Gln Gly His Val Asn Pro Leu Leu Arg Leu Gly

20 25 30

Lys Arg Leu Ala Ser Lys Gly Val Leu Val Ser Phe Cys Ala Pro Glu

35 40 45

Cys Val Gly Lys Asp Met Arg Ala Ala Asn Asn Asn Ile Ile Ser Asp

50 55 60

Glu Pro Thr Pro Tyr Gly Asp Gly Phe Ile Arg Phe Glu Phe Phe Asp

65 70 75 80

Gly Trp Glu Tyr Thr Gln Pro Lys Glu Asn Arg Gln Leu Glu Ile Glu

85 90 95

Leu Ala Asn Leu Glu Val Val Gly Arg Ala Val Leu Pro Ala Met Leu

100 105 110

Lys Glu Asn Glu Ala Lys Gly Arg Pro Val Ser Cys Leu Ile Asn Asn

115 120 125

Pro Phe Ile Pro Trp Val Cys Asp Val Ala Asp Ser Leu Gly Ile Pro

130 135 140

Cys Ala Val Leu Trp Val Gln Ser Cys Ala Ser Phe Ser Ala Tyr Tyr

145 150 155 160

His Tyr His Phe Asn Leu Ala Pro Phe Pro Asn Glu Ser Asn Pro Asn

165 170 175

Ile Asp Val His Leu Pro Asn Met Pro Ile Leu Lys Trp Asp Glu Leu

180 185 190

Pro Ser Phe Leu Leu Pro Ser Asn Pro Tyr Pro Ala Leu Ala Asn Ala

195 200 205

Ile Leu Arg Gln Phe Asn Tyr Leu Ser Lys Pro Ile Arg Ile Phe Ile

210 215 220

Glu Ser Phe Asp Glu Leu Glu Lys Asp Ile Val Asp Tyr Met Ser Asp

225 230 235 240

Phe Leu Pro Ile Lys Thr Val Gly Pro Leu Leu Val Glu Asp Pro Lys

245 250 255

Ile Glu Gln Val Val Arg Ala Asp Leu Val Lys Ala Asp Ser Ser Ile

260 265 270

Thr Gln Trp Leu Asn Ser Lys Pro Pro Ser Ser Val Val Tyr Ile Ser

275 280 285

Phe Gly Ser Ile Val Val Pro Ser Gln Glu Gln Val Asp Glu Ile Ala

290 295 300

Tyr Gly Ile Leu Asn Ser Gly Leu Asn Phe Leu Trp Ile Met Lys Pro

305 310 315 320

Pro Arg Lys Asn Ser Ser Phe Pro Thr Val Val Leu Pro Gln Gly Tyr

325 330 335

Leu Asp Lys Ile Gly Asp Lys Gly Lys Val Val Glu Trp Cys Leu Gln

340 345 350

Glu Gln Val Leu Ala His Pro Ser Leu Ala Cys Phe Val Thr His Cys

355 360 365

Gly Trp Asn Ser Ser Met Glu Val Ile Ala Asn Gly Val Pro Ile Val

370 375 380

Ala Phe Pro Gln Trp Gly Asp Gln Val Thr Asp Ala Lys Tyr Leu Val

385 390 395 400

Asp Glu Phe Lys Ile Gly Val Arg Leu Ser Arg Gly Val Thr Glu Asn

405 410 415

Arg Val Ile Pro Arg Asp Glu Val Glu Arg Ser Leu His Asp Val Thr

420 425 430

Ser Gly Pro Lys Val Ala Glu Met Lys Glu Asn Ala Leu Lys Trp Lys

435 440 445

Met Lys Ala Thr Glu Ala Val Ala Glu Gly Gly Ser Ser Asp Leu Asn

450 455 460

Leu Lys Ser Phe Val Asp Glu Leu Arg Thr Leu Gln Asn Ser Asn Lys

465 470 475 480

Asn Leu Ala Lys Leu Ala Pro Leu Ser Asn

485 490

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgcggtacca agcttgtgac tcactgtgga tggaa 35

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgcctcgagg gatcccacac gacctttgtt tattta 36

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgcttgggtg gagaggctat t 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gatcatcgcc gtcgggcatg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gctcttgcag tgctagattt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaaggtgcaa gctacctctc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

taacatggct gaagacgacc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaacttgcac tcgccatgcc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gacgcacaat cccactatcc 20

<210> 14

<211> 1431

<212> DNA

<213> 颠茄(Atropa belladonna)

<400> 14

atgaagaaaa caattgtggt tccaatcttg aagtaccata agattttgct tctctttgtt 60

ttaatactag tactcttgct ttgcccactg attgaagctg caggtacacc agtcaagtat 120

cttcctggat ttggaccact tccttttgaa tttgaaactg gttatgtagg attaggtgaa 180

tcagaggaag tgcaactctt ctattacttt ttcaagtcag agtcgaatcc agaagttgac 240

cccctcattc tttggatcac tggaggccct ggttgtggtg cacttaatgc aataactact 300

gaactcggac cagtgctact tgatgctaag gagtacgatg ggagcttgcc aacattgtca 360

ttgaatcctt actcatacac aaaggtcgca aatattatct ttctagattc acctgtgact 420

ggtggatttt catatgcaac aactaaagaa gctaatcatt cagataatgt acaaatggct 480

ctacacactc atcaatttgt tcaaaagtgg ttagttgacc attcggagta tttatcaaat 540

gatttttatg tggctggaga ctcatactcg ggaatttcag ttccaattat cactcaggtg 600

atatcagatg gtaatgaagc tggaaataag ccatggataa atcttaaggg atacatactt 660

ggaaatgcag taacatttcg tccagatgaa caaaattata ggataccaca cgctcatgga 720

ttggccctta tatccgacga actttacaag tcattggagt caagctgtgg aggggagtat 780

caatacatag atcaaactaa tacacattgt ttgcagcacg ttcagacttt caatcggttg 840

gtttctggaa tatattttga acacatacta gagcccattt gcaaccctgt ttctacaaaa 900

gctcgtcact tgtctcctca gagaagatat cttaatcaga aacttggaca attgaaaaat 960

cctactatgc ttcctggagt gaaatgtcga gatgagtggc acttgctatc agaaatatgg 1020

gttaatgatg aaactgttca agaagctctt catgttcgaa aggggacaca tggaatatgg 1080

aagcaatgcc caaattatga aaaaatgcct ttcactagaa ctatcaacaa taccataccc 1140

tttcatgcat ctctaagcaa aaaaggttat aggtctttaa tatacagtgg tgattatgat 1200

ctctatgtac catttctttc aacacaagca tggataagat cattaaatta ctctattgat 1260

acggaatgga gacggtggtt cgttgatggt caagttgctg ggtatgtgac aacttactca 1320

aatcaaatga catttacaac cattaagggt gcaggacata ctgctccaga gtacaagcct 1380

gctgagtgtc tggccatgct caagagatgg atatattatc aacctctata a 1431