使用γ谷氨酰基转肽酶松弛面团
阅读说明：本技术 使用γ谷氨酰基转肽酶松弛面团 (Relaxing dough using gamma glutamyl transpeptidase ) 是由 L·卡卢 S·M·兰德维克 I·V·马特维 S·T·约根森 K·延森 于 2018-06-20 设计创作，主要内容包括：一种用于改善面团拉伸性的方法,该方法包括a)将γ谷氨酰基转肽酶添加至面粉或至包含面粉的面团中；以及b)制作该面团。这些γ谷氨酰基转肽酶可获得自地衣芽孢杆菌和堀越氏芽孢杆菌。(A method for improving the stretchability of a dough, the method comprising a) adding gamma glutamyl transpeptidase to the flour or to the dough comprising the flour; and b) preparing the dough. These gamma glutamyl transpeptidases can be obtained from bacillus licheniformis and bacillus horikoshii.)
序列表的引用
本申请包含计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及当生产例如面包、扁平面包、梳打饼干、披萨、意式面、面条、层压烘焙产品、饼干、法式长棍面包和汉堡包时改善面团(例如扁平的面团)拉伸性的方法。
背景技术
当前，在工业性面团制作方法中，已知向面团中添加面团改良添加剂，以改善面团的质地、体积、拉伸性和机械能力等参数。
还原剂如谷胱甘肽(gluthathione)、半胱氨酸、麦芽、蛋白酶、山梨酸和非发酵酵母是已知的面团改良添加剂，用于改善面团的拉伸性。
在制作例如面包、扁平面包、梳打饼干、披萨、意式面、面条、层压烘焙产品、饼干、法式长棍面包和汉堡包等产品时，仍然需要寻找改善面团生产中的拉伸性但对其他面团参数没有或仅有很少影响的方案。
发明内容
令人惊讶地的是，诸位发明人已发现γ谷氨酰基转肽酶(E.C.2.3.2.2)增加面团的拉伸性对其他面团参数没有或仅有很少的影响，因此我们要求保护：
一种用于改善面团拉伸性的方法，该方法包括
a)将γ谷氨酰基转肽酶添加至面粉或包含面粉的面团；以及
b)制作该面团。
在一个实施例中，扁平的面团生产自该面团。
在一个实施例中，该面团被制成选自下组的可食用产品，该组由以下组成：面包、扁平面包、梳打饼干、披萨、意式面、面条、层压烘焙产品、饼干、法式长棍面包和汉堡包。
在一个实施例中，该面粉选自下组，该组由以下组成：小麦面粉、玉米面粉、黑麦面粉、大麦面粉、燕麦面粉、大米面粉、高粱面粉及其组合。
在一个实施例中，该γ谷氨酰基转肽酶是细菌γ谷氨酰基转肽酶，特别是芽孢杆菌γ谷氨酰基转肽酶。
在一个实施例中，该γ谷氨酰基转肽酶与SEQ ID NO:1具有至少60％同一性。
在一个实施例中，将该γ谷氨酰基转肽酶以0.01-100mg的酶蛋白/kg面粉的量进行添加。
在一个实施例中，将另外的添加至谷胱甘肽至面团中。
在一个实施例中，该面团具有的拉伸性优于在相同条件下制备但未用γ谷氨酰基转肽酶处理的面团的拉伸性。
在一个实施例中，该面团进一步包含一种或多种选自下组的酶，该组由以下组成：淀粉酶、麦芽糖淀粉酶、β-淀粉酶、氨肽酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素分解酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶、葡聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、ɑ-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、半纤维素分解酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和木聚糖酶。
在一个实施例中，该扁平面包选自下组，该组由以下组成：玉米饼、皮塔饼、***式面包、印度式扁平面包(包括小麦制扁平面包、和无面筋扁平面包)。
在一个实施例中，要求保护预混料，该预混物包含γ谷氨酰基转肽酶(E.C.2.3.2.2)和面粉。
在一个实施例中，该预混物进一步包含一种或多种选自下组的酶，该组由以下组成：淀粉酶、麦芽糖淀粉酶、β-淀粉酶、氨肽酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素分解酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、葡聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、ɑ-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、半纤维素分解酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和木聚糖酶。
在一个实施例中，要求保护一种用于增加面团的拉伸性的γ谷氨酰基转肽酶(E.C.2.3.2.2)的用途。
在一个实施例中，我们要求保护一种组合物，该组合物包含γ谷氨酰基转肽酶(E.C.2.3.2.2)，其中该γ谷氨酰基转肽酶与SEQ ID NO:1具有至少60％同一性。
具体实施方式
定义
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，所述算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,TrendsGenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：
(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
变体：术语“变体”意指具有γ谷氨酰基转肽酶活性的、在一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变(即，取代、***和/或缺失)的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占用某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；并且***意指邻近于并且紧跟着占据一个位置的氨基酸之后添加一个或多个氨基酸。
改善的特性：与不添加酶的面粉和/或面团相比，当将根据本发明的γ谷氨酰基转肽酶以有效量掺入面粉和/或面团中时，一种或多种特性得以改善。
该改善的特性可以通过比较根据下文描述的方法、添加和不添加本发明的酶制备的面团和/或烘焙产品来确定。
感官品质可以使用在烘焙行业中已很好地确立的程序来评估，并且可以包括例如使用一组受过训练的味觉测试者。
改善的拉伸性：术语“面团的改善的拉伸性”在本文中定义为如下面团的特性，其可以经受增加的拉伸而不破裂。
增加的拉伸性是非常重要的参数，因为它是意指有可能，例如，获得非常薄的面团。
增加的强度：术语“面团的增加的强度”在本文中定义为如下面团的特性，其通常具有更大的弹性特性和/或需要更多的工作输入以模制和成型。
增加的弹性：术语“面团的增加的弹性”在本文中定义为如下面团的特性，其在经受一定的物理应力后具有更高的恢复其原始形状的趋势。
面团的增加的稳定性：术语“面团的增加稳定性”在本文中定义为如下面团的特性，其不易受机械滥用影响，因此更好地保持其形状和体积，并且通过与在正常和/或延伸醒发之后面包的横截面的高度:宽度的比率进行评估。
面团的降低的粘性：术语“面团的降低的粘性”在本文中定义为如下面团的特性，其例如在面团生产机器中具有较少的粘附表面的趋势，并且由熟练的测试面包师依靠经验评估或使用如本领域已知的质地分析器(例如，TAXT2)来测量。
改善的机械能力：术语“面团的改善的机械能力”在本文中定义为如下面团的特性，其通常具有较小粘性和/或更硬和/或更有弹性。
面团/烘焙产品的增加的体积:术语“面团/烘焙产品的增加的体积”如对面团的体积或给定一条面包的体积进行测量。体积可以通过油菜籽置换法，或者通过熟练的面包师，或者通过使用如实例2所述的食品体积测定仪(Volscan profiler)600确定。
烘焙产品的改进的瓤结构：术语“烘焙产品的改善的瓤结构”在本文中定义为如下关于烘焙产品的特性：瓤均匀性、气孔壁厚度、和面包切片上各个气泡孔的大小。
烘焙产品的瓤结构通常通过面包师从视觉上或通过如本领域已知的数字图像分析(例如，C-孔室(C-cell)，国际精密控制有限公司(Calibre Control InternationalLtd)，阿普尔顿(Appleton)，沃灵顿(Warrington)，英国)评估。
烘焙产品的改善的柔软度：术语“烘焙产品的改善的柔软度”与“硬度”相反，并且在本文中定义为如下烘焙产品的特性，其更容易被压缩，并且由熟练的测试面包师依靠经验评估或使用如本领域已知的质地分析器(例如，来自英国萨里的稳定微系统公司(StableMicro Systems Ltd)的TAXT2或TA-XT Plus)来测量。
用于制作面团的面团组合物
如本文所使用的，“面团”意指用来制备烘焙产品或烹调产品的任何面团。
根据本发明，用来制备烘焙产品或烹调产品的面团可以由任何适合的包含面粉的面团成分制成。
如本文所使用的，“扁平的面包”意指通常具有一毫米到几厘米的厚度的面团。
根据本发明，该扁平的面团可以用于制作，例如，扁平面包、梳打饼干、披萨、意式面、面条、层压面团和饼干。
扁平面包可以由面粉、水和盐的简单混合物制成，并且然后充分的卷曲成扁平的面团。扁平面包具有非常快的烘焙时间(通常<2分钟)。
扁平面包可以是未发酵的(即在无酵母的情况下制成)或发酵的(例如，用酵母制作)。
扁平面包可以进一步包括任选的成分，例如橄榄油、芝麻油、起酥油和香料。
扁平面包的实例包括玉米饼、皮塔饼、***式面包、和印度式扁平面包，包括小麦制扁平面包和无面筋扁平面包。
另外的扁平面包的非限制性实例包括亚美尼亚式面包(lavash)、巴拉迪面包(baladi)、巴尔巴里面包(barbari)、桑卡面包(Sangak)、塔诺面包(tanoor)、塔夫顿面包(taftoon)、沙米面包(shami)、哈拉比面包(halabi)、玛芙路德面包(mafrood)、布尔面包(burr)、百瑞提面包(bairuti)、口袋面包(pocket bread)、印度烤饼(naan)、印度博饼(phulka)、hapati、印度抛饼(paratha)、***语皮塔饼(Arabic pita)、黎巴嫩面包(Lebanese)、玛芙路德面包(mafrood)、恰巴提薄饼(chapati)、桑卡面包(Sangak)、泰国煎饼(roti)、中东烤饼(taboon)、shrak、mashrouh、纳西尔面包(nasir)、tannoor、亚美尼亚式面包(lavash)和塔弗坦面包(taftan)。
用来制备扁平面包产品的面团可以由任何适合的面粉来源制成，例如来源于谷物的面粉，如小麦面粉、玉米面粉、黑麦面粉、大麦面粉、燕麦面粉、大米面粉、或高粱面粉，马铃薯面粉，大豆面粉，来自豆类的面粉以及其组合。
任何扁平面包方法都可以用于制备扁平面包。制备扁平面包的方法总体上涉及以下顺序步骤：制作面团(与任选的醒发(proofing)步骤)，对该面团进行压片(sheeting)或分割、成形和/或滚压(rolling)、以及醒发，这些步骤在本领域中是熟知的。
根据本发明的扁平的面团还可以用于制作披萨。披萨是典型的酵母扁面包，上面盖着，例如番茄酱和奶酪，并且在烤箱中烘焙。
根据本发明的扁平的面团还可以用于制作梳打饼干。梳打饼干是由扁平的面团制成的烘焙食物产品。如本领域已知的，可以在烘焙前将调味品或调味料(例如盐、草药、种子、和/或奶酪)添加至或喷洒在面团上面。梳打饼干有很多形状和大小-圆形、方形、三角形等。饼干是一种古老的扁平面包。
根据本发明的扁平的面团还可以用于制作面条和意式面。
面条由未发酵的面团制成，该面团被拉伸、挤压或压扁，然后切成各种形状中的一种。面条通常是在沸水中煮熟，有时要添加食用油和/或盐。它们可以油煎或深层油炸。
意式面通常是面条，该面条由硬质小麦面粉的未发酵的面团与水和/或鸡蛋混合制成，并形成片状或各种形状，然后通过煮沸煮熟。意式面还可以用来自其他谷类(cereal)或谷物(grain)的面粉制成。
根据本发明的扁平的面团还可以用于制备层压烘焙产品。
层压面团是通过反复折叠和滚动产生的、由许多黄油分离的面团的薄层组成的烹饪用的制备(culinary preparation)。此类面团可以含有多层，即，超过10层。在烘焙过程中，黄油中的水分会蒸发和膨胀，导致面团膨胀和分离，而黄油中的脂质基本上是将面团炸开，从而产生轻的薄片产品。层压面团的实例包括早餐牛角包和其他糕点，如丹麦甜糕饼(Danish pastry)、千层酥饼(Flaky pastry)和千层饼(Puff pastry)。
根据本发明的扁平的面团还可以用于制作饼干。
根据本发明的面团还可以用于生产任何烘焙或烹调产品，特别是面包、扁平面包、梳打饼干、披萨、意式面、面条、层压烘焙产品、饼干、法式长棍面包和汉堡包。
根据本发明的面团还可以包含其他常规面团松弛成分，如谷胱甘肽、蛋白酶、麦芽、山梨酸、L-半胱氨酸和/或酵母提取物。
γ谷氨酰基转肽酶和谷胱甘肽之间可以存在协同作用。
γ谷氨酰基转肽酶与蛋白酶之间可以存在协同作用。
γ谷氨酰基转肽酶与麦芽之间可以存在协同作用。
γ谷氨酰基转肽酶与山梨酸之间可以存在协同作用。
γ谷氨酰基转肽酶与L-半胱氨酸之间可以存在协同作用。
γ谷氨酰基转肽酶与酵母提取物之间可以存在协同作用。
根据本发明的面团还可以包含一种或多种乳化剂。乳化剂可用于提高面团的拉伸性。适合的乳化剂的实例是甘油单酯或甘油二酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、甘油单酯的二乙酰酒石酸酯、脂肪酸的糖酯、脂肪酸的丙二醇酯、脂肪酸的聚甘油酯、甘油单酯的乳酸酯、甘油单酯的乙酸酯、卵磷脂或磷脂、或乙氧基化甘油单酯。具体的乳化剂包括甘油单酯、甘油单酯的二乙酰酒石酸酯(DATEM)和硬脂酰乳酸钠(SSL)。
可以添加至面团的其他常规成分包括蛋白质，例如奶粉、面筋、以及大豆；蛋(全蛋、蛋黄或蛋白)；氧化剂，例如抗坏血酸、溴化钾、碘化钾、偶氮二甲酰胺(ADA)、过硫酸铵或过硫酸钾；糖，例如蔗糖、右旋糖等；盐，例如氯化钠、乙酸钙、硫酸钠或硫酸钙、稀释剂(如二氧化硅)、不同来源的淀粉。其他常规成分还包括水胶体，例如CMC、瓜耳胶、黄原胶、槐树豆胶等。还可以使用改性淀粉。
根据本发明的面团可以是纤维面团，例如该面团可以含有谷物(例如全麦)和/或富含以例如谷类麸(例如小麦麸)形式的另外的纤维。小麦麸作为将小麦研磨成白面粉的副产品而产生。
通常，如本领域已知的，将纤维分成细纤维、中纤维和粗纤维。细纤维在本发明中是特别有用的。
除了制备新鲜的扁平的面团或新鲜的扁平面团产品之外，本发明还涉及用于制备冷冻的扁平面团或冷冻的扁平面团产品的方法。
本发明特别有用于在工业化方法中制备扁平的面团和获得自扁平的面团的产品，其中这些产品是使用自动化或半自动化的设备机械地制备的。
酶
γ谷氨酰基转肽酶
γ谷氨酰基转肽酶(E.C.2.3.2.2)在谷胱甘肽代谢中起重要作用，其中该酶催化γ谷氨酰基基团从γ谷氨酰基化合物转移至氨基酸、肽受体或水(Tate和Meister,1981,Mol.Cell.Biochem.[分子与细胞生物化学]39:357-368)。例如，γ谷氨酰基转肽酶催化谷胱甘肽的水解以产生谷氨酸，并将谷胱甘肽的γ谷氨酰基基团转移至氨基酸。
例如已经从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(JP 4281787)、纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)(JP 2065777)、和粘琼脂芽孢杆菌(Bacillus agaradhaerens)(WO 02/077009)中报道了γ谷氨酰基转肽酶。
根据本发明，优选的γ谷氨酰基转肽酶是细菌γ谷氨酰基转肽酶；特别是，芽孢杆菌γ谷氨酰基转肽酶；特别是，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)或堀越氏芽孢杆菌(Bacillus horikoshii)γ谷氨酰基转肽酶。
优选地，γ谷氨酰基转肽酶是与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的酶。
在一个实施例中，该γ谷氨酰基转肽酶是具有本文SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的酶：
在另一个实施例中，该γ谷氨酰基转肽酶是具有本文SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的酶：
这些氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或***；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一官能(例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。
保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],Academic Press[学术出版社],纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
可以按有效量(如从0.01-100mg酶蛋白/kg面粉，例如0.1-50mg酶蛋白/kg面粉、例如0.5-50mg酶蛋白/kg面粉、例如1-50mg酶蛋白/kg面粉的范围内)典型地添加γ谷氨酰基转肽酶。
另外的酶
任选地，一种或多种另外的酶(如淀粉酶、麦芽糖淀粉酶、β淀粉酶、氨肽酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素分解酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶、葡聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、ɑ-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、半纤维素分解酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和木聚糖酶)可以与根据本发明的酶组合物一起使用。
一种或多种另外的酶可以是任何来源的，包括哺乳动物来源的、植物来源的、和微生物(细菌、酵母或真菌)来源的。
适合的商业α-淀粉酶组合物包括例如BAKEZYME P 300(可获得自DSM公司)和FUNGAMYL 2500BG、FUNGAMYL 4000BG、FUNGAMYL 800L、FUNGAMYL ULTRA BG和FUNGAMYLULTRA SG(可获得自诺维信公司(Novozymes A/S))。
麦芽糖α-淀粉酶(EC 3.2.1.133)可以来自芽孢杆菌。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的麦芽糖α-淀粉酶是从诺维信公司在商标名下可商购的。
该麦芽糖α-淀粉酶还可以是来自嗜热脂肪芽孢杆菌的麦芽糖α-淀粉酶的变体，例如在如WO 1999/043794、WO 2006/032281、或WO 2008/148845中所披露的，例如
用于本发明的抗老化淀粉酶还可以是淀粉酶(葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶(EC3.2.1.60))，来自嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophilia)或其变体，如WO 1999/050399、WO 2004/111217或WO 2005/003339中披露的任何淀粉酶。
用于本发明的葡糖淀粉酶包括黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等人.(1984),EMBOJ.[欧洲分子生物学学会杂志]3(5),第1097-1102页)，WO 84/02921中披露的泡盛曲霉葡糖淀粉酶，或米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.[农业、生物学与化学](1991),55(4),第941-949页)。适合的商业葡糖淀粉酶是可获得自诺维信公司的
葡萄糖氧化酶可以是真菌葡萄糖氧化酶，具体地是黑曲霉葡萄糖氧化酶(例如
木聚糖酶可以是微生物来源的，例如衍生自细菌或真菌，例如曲霉属(特别是棘孢曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉或塔宾曲霉)的菌株，或衍生自木霉属(例如，里氏木霉)的菌株，或衍生自腐质霉属(例如，特异腐质霉)的菌株。
用于本发明的适合的可商购的木聚糖酶制剂包括PANZEA BG、PENTOPAN MONO BG和PENTOPAN 500BG(可获得自诺维信公司)、GRINDAMYL POWERBAKE(可获得自丹尼斯科公司(Danisco))、以及BAKEZYME BXP 5000和BAKEZYME BXP 5001(可获得自DSM公司)。
蛋白酶可以来自芽孢杆菌属，例如解淀粉芽孢杆菌。适合的蛋白酶可以是获得自
磷脂酶可以具有磷脂酶A1、A2、B、C、D或溶血磷脂酶活性；它可能有也可能没有脂肪酶活性。它可以具有动物来源，例如来自胰腺、蛇毒或蜂毒，或它可以具有微生物来源，例如来自丝状真菌、酵母或细菌，例如曲霉属或镰孢属，例如黑曲霉、米曲霉或尖孢镰孢菌。来自尖孢镰孢菌的优选的脂肪酶/磷脂酶披露于WO 98/26057中。而且，可以使用描述于WO00/32758中的变体。
适合的磷脂酶组合物是LIPOPAN F和LIPOPAN XTRA(可获得自诺维信公司)或PANAMORE GOLDEN和PANAMORE SPRING(可获得自DSM公司)。
酶处理
将根据本发明的γ谷氨酰基转肽酶添加至面团成分中，例如，通过将其添加至用于制备面团的面粉中而间接地添加至该面团中，或直接地添加至面团本身中。
γ谷氨酰基转肽酶能以任何适合的形式，诸如例如以液体形式(特别是稳定化的液体)添加至面粉或面团中，或其可以作为实质上干的粉末或颗粒被添加至面粉或面团中，因此，我们还要求保护一种颗粒，该颗粒包含根据本发明的γ谷氨酰基转肽酶、和包含根据本发明的γ谷氨酰基转肽酶的稳定化的液体。
例如，颗粒可以如在美国专利号4,106,991和美国专利号4,661,452中所披露的来生产。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的程序添加糖或糖醇或乳酸来稳定化。其他酶稳定剂在本领域中是熟知的。
预混物
通常有利的是提供在本发明的处理中使用的一种或多种酶与用于改善面团产品特性的其他成分的混合物。这些在本领域中通常被称为“预混物”，其通常包含面粉。
因此，在另外的方面，本发明涉及用于改善面团(用于制备一种扁平面包产品或多种扁平面包产品)质量的预混物，该预混物包含γ谷氨酰基转肽酶和一种或多种面团成分，尤其是面粉，例如来自谷物的面粉，如小麦面粉、玉米面粉、黑麦面粉、大麦面粉、燕麦面粉、大米面粉、或高粱面粉及其任何组合。
该预混物还包含一种或多种选自下组的酶，该组由以下组成：淀粉酶、麦芽糖淀粉酶、β-淀粉酶、氨肽酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素分解酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶、葡聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、ɑ-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、半纤维素分解酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和木聚糖酶。
在另一个实施例中，本发明涉及预混合物，该预混合物包含本发明的γ谷氨酰基转肽酶和面粉，例如来自谷物的面粉，例如小麦面粉、玉米面粉、黑麦面粉、大麦面粉、燕麦面粉、大米面粉、高粱面粉及其任何组合，以及一种或多种如先前所描述的另外的酶。
预混物组合物可以呈液体形式或者干或实质上干的形式。
本文中所描述和要求保护的本发明并不局限于本文中所披露的具体实施例的范围，因为这些实施例旨在作为本发明的若干方面的说明。任何等同的实施例连同这些实施例中一个或多个的组合旨在包含在本发明的范围内。
本文引用了多个参考，其披露内容通过援引以其全部内部结合本文。进一步通过以下实例来描述本发明，所述实例不应理解为限制本发明的范围。
实例
实例1
γ谷氨酰基转肽酶(GGT)表达(SEQ ID NO:1)
将γ谷氨酰基转肽酶(GGT)基因在编码GGT蛋白(SEQ ID NO:1)的地衣芽孢杆菌((ATCC PTA-7992)中鉴定。
设计两个寡核苷酸引物(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)，其允许PCR扩增整个GGT可读框(ORF)，该可读框具有***GGT信号肽前的来自克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)碱性蛋白酶基因的核糖体结合位点(RBS)。
上游引物(SEQ ID NO:3)在GGT起始前的碱性蛋白酶RBS前掺入了EcoRI和SacI位点。
下游引物(SEQ ID NO:4)在GGT终止密码子后掺入MluI和BamHI。
SEQ ID NO:3：
5'-GACTGAATTCGAGCTCTATAAAAATGAGGAGGGAACCGAATGAGACGGTTAGCTTTCTTAG-3'
SEQ ID NO:4：
5'-GACTGGATCCACGCGTTACTATTTAGCCGATGTCTTAATGT-3'
将来自地衣芽孢杆菌PL1980(US 8431382)的染色体DNA在具有引物SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的PCR反应中用作模板，其中退火温度从62℃逐步降低到52℃(每步降低1℃)，然后在57℃保持恒定20个循环。
获得大约1.8 kb的PCR片段，用SacI+MluI消化，并克隆到来自pSJ6814的3.3kb的SacI-MluI载体片段上(EP 1766002 B1中描述)。
通过电穿孔将连接混合物转化到大肠杆菌实验室菌株(对氨苄青霉素抗性进行选择)，并保留具有PCR扩增的区段的正确的DNA序列的转化体。
将含有cryIIIA_stab-ggt构建体的2.35 kb EcoRI-MluI片段从转化体中切下，并连接到pSJ6869的4.75kb MluI-EcoRI片段上(在美国20140106457中描述的)。
将连接混合物转化到枯草芽孢杆菌实验室菌株，在30℃下对红霉素(2微克/ml)抗性进行选择，并保留正确的转化体。
将正确的转化体转化到枯草芽孢杆菌接合供体菌株PP289-5(US 6066473)，从而产生用作与地衣芽孢杆菌宿主菌株PP1897-3(US 8431382)接合的供体的菌株。
分离四环素敏感的反式接合体，在50℃下质粒整合后，用ErmR选择，分离出具有非常弱或缺失的淀粉酶表型的菌落。这些整合体在30℃下进行繁殖，以允许质粒复制和损失，并获得淀粉酶阴性、红霉素敏感菌株。
这种地衣芽孢杆菌菌株如本领域中已知的生长，且如本领域中已知的回收GGT(SEQ ID NO:1)。
实例2
烘焙中γ谷氨酰基转肽酶(SEQ ID NO:1)
根据以下配方和方法条件，使用直接面团发酵(straight dough)程序来制备面包。所有施用的化学品均为食品级。Fungamyl 2500BG(2500FAU/g)可获得自诺维信公司。
如实例1中所述的制备γ谷氨酰基转肽酶(GGT-SEQ ID NO:1)。
表1：面团配方
程序：
称出所有成分。将盐、蔗糖、酵母、抗坏血酸、丙酸钙和酶添加到搅拌碗中。称出自来水，并用冰调节温度(至大约9℃-10℃，以便在混合后达到27℃的面团温度)并添加到搅拌碗中。将2500g面粉(2000g Kolibri和500g Victory)添加到搅拌碗中，并使用螺旋混合器(Spiral mixer)(DIOSNA Dierks&
将面团分成每块450g，用手做成圆状，此后在室温静置15min后用塑料覆盖。将静置后的面团块在压片机(MO671 MPB-001，Glimek公司，瑞典)中成形为面包，并转移到涂有油脂的1400ml盘(顶部230x 115x 68mm)中。将面包在32℃、86％湿度醒发60min。将醒发后的面包在柜式烤炉(Piccolo公司，瓦赫特尔(Wachtel)，德国)中在225℃用蒸汽烘焙35min。将面包从盘中取出并允许冷却至室温。如在体积确定中描述的确定面包的体积。
表2：手动面团评估
在混合后大约5min对面团特性进行了评估。使用0-10之间的标度，并相对于未添加GGT的对照评估面团特性。给出对照值为5。关于定义、评估和标度的详细信息在下表发现。
体积确定：
使用在食品体积测定仪软件上运行的食品体积测定仪600(稳定微系统公司(Stable microsystems)，英国)测量比容。每个面包都嵌放在机器中。每条面包的重量由Volscan仪器的内置天平自动确定。当每条面包以每秒1.5转的速度旋转的同时用激光束以每转3mm垂直步长(vertical steps)扫描，从通过仪器创建的3D图像计算每条面包的体积。根据以下公式来计算每个面包的比容：
比容(ml/g)＝体积(ml)/重量(g)
报告的值是来自同一面团的2个面包的平均值。
表3：结果
结论
令人惊讶的是，GGT的添加导致显著地更可延伸面团，而观察到对其他面团特性没有影响。观察到对面包体积没有影响。
实例3
γ谷氨酰基转肽酶(SEQ ID NO:2)
γ谷氨酰基转肽酶(GGT)基因在堀越氏芽孢杆菌菌株中鉴定。
堀越氏芽孢杆菌菌株在新西兰发现，注册日期为1982年5月15日。
堀越氏芽孢杆菌γ谷氨酰基转肽酶(SEQ ID NO:2)具有如下成熟蛋白质序列：
如本领域已知的，SEQ ID NO:2在枯草芽孢杆菌中表示为胞外蛋白。
SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:1显示了68％的序列同一性。
实例4
烘焙中γ谷氨酰基转肽酶(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)
根据以下配方和方法条件，使用直接面团发酵(straight dough)程序来制备面团。所有施用的化学品均为食品级。如以表4中所述的浓度添加γ谷氨酰基转肽酶(GGT)。
表4：面团配方：
程序：
称出所有成分。在自来水中制备了包含盐、蔗糖和抗坏血酸的储备溶液，并将其储存使用冰中直至使用。进一步在自来水中制备了酵母储备溶液。称出自来水；调节温度(为了混合后达到26℃的面团温度)，然后添加至搅拌碗中。
将100g面粉(80g Kolibri和20g Victory)、盐/糖/抗坏血酸储备溶液、GGT和酵母溶液添加至搅拌碗中并且使用100g混合器((国家制造公司(National MFG Co)，内布拉斯(Nebraska)，模型100-200A)混合5min。将混合的面团从搅拌碗中取出，滚圆以形成球形，并记录温度。通过手手动确定面团参数。
手动面团评估：
在混合后大约2min对面团特性进行了评估。
使用0-10之间的标度，并相对于未添加GGT的对照评估面团特性。对照一式三份进行，并给出值5。
首先评估柔软度和弹性,然后使用尖刀将面团球切成两半。在新鲜的切口上测量粘性。对每个面团球的拉伸性评估两次(2个半块)。关于定义、评估和标度的进一步详细信息在下表5中发现。
表5：面团评估参数
表6：结果
结论
SEQ ID No.1和SEQ ID No.2两者对面团拉伸性均显示明显增加，而观察到对其他面团特性没有影响或有很小影响。
序列表
<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）
<120> 使用γ谷氨酰基转肽酶松弛面团
<130> 14491-WO-PCT
<160> 4
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 585
<212> PRT
<213> 地衣芽孢杆菌
<400> 1
Met Arg Arg Leu Ala Phe Leu Val Val Ala Phe Cys Leu Ala Val Gly
1 5 10 15
Cys Phe Phe Ser Pro Val Ser Lys Ala Glu Gly Val Met Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Asp Lys Val Ala Val Gly Lys Asp Gly Met Val Ala Thr Ala
35 40 45
His Pro Leu Ala Ser Lys Ile Gly Ala Glu Val Leu Lys Lys Gly Gly
50 55 60
Asn Ala Ile Asp Ala Ala Ile Ala Ile Gln Tyr Ala Leu Asn Val Thr
65 70 75 80
Glu Pro Met Met Ser Gly Ile Gly Gly Gly Gly Phe Met Met Val Tyr
85 90 95
Asp Gly Glu Thr Lys Glu Thr Ser Ile Ile Asn Ser Arg Glu Arg Ala
100 105 110
Pro Glu Gly Ala Lys Pro Asp Met Phe Leu Asp Gly Asp Gly Lys Val
115 120 125
Ile Pro Phe Ser Glu Arg Ser Arg His Gly Asn Ala Val Gly Val Pro
130 135 140
Gly Thr Leu Lys Gly Leu Glu Ala Ala His Lys Lys Trp Gly Thr Lys
145 150 155 160
Lys Met Glu Asp Leu Ile Ser Pro Ser Ile Lys Leu Ala Glu Glu Gly
165 170 175
Phe Pro Ile Asp Ser Val Leu Ala Asp Ala Ile Lys Asp His Gln Asp
180 185 190
Lys Leu Ser Lys Thr Ala Ala Lys Asp Ile Phe Leu Pro Asp Gly Glu
195 200 205
Pro Leu Lys Glu Gly Asp Ile Leu Val Gln Lys Asp Leu Ala Lys Thr
210 215 220
Phe Lys Leu Ile Arg Lys Glu Gly Ser Lys Ala Phe Tyr Asp Gly Glu
225 230 235 240
Ile Gly Arg Ala Ile Ala Asp Val Val Gln Asp Phe Gly Gly Ser Met
245 250 255
Thr Pro Asp Asp Leu Ser Arg Tyr Glu Val Thr Thr Asp Lys Pro Ile
260 265 270
Trp Gly Glu Tyr His Gly Tyr Asp Ile Ala Ser Met Pro Pro Pro Ser
275 280 285
Ser Gly Gly Val Phe Met Leu Gln Met Leu Lys Leu Ile Asp Asp Phe
290 295 300
His Leu Ser Gln Tyr Asp Pro Lys Ser Phe Glu Lys Tyr His Leu Leu
305 310 315 320
Ala Glu Thr Met His Leu Ser Tyr Ala Asp Arg Ala Ala Tyr Ala Gly
325 330 335
Asp Pro Glu Phe Val Asp Val Pro Leu Arg Gly Leu Leu Asp Pro Asp
340 345 350
Tyr Ile Lys Glu Arg Gln Lys Leu Ile Ser Leu Asp Ser Met Asn Arg
355 360 365
Asp Val Lys Glu Gly Asp Pro Trp Lys Tyr Glu Glu Gly Glu Pro Asn
370 375 380
Tyr Glu Ile Val Pro Gln Pro Glu Asp Lys Thr Ile Gly Glu Thr Thr
385 390 395 400
His Phe Thr Val Thr Asp Gln Trp Gly Asn Val Val Ser Tyr Thr Thr
405 410 415
Thr Ile Glu Gln Leu Phe Gly Thr Gly Ile Leu Val Pro Gly Tyr Gly
420 425 430
Leu Phe Leu Asn Asn Glu Leu Thr Asp Phe Asp Ala Val Pro Gly Gly
435 440 445
Ala Asn Glu Val Gln Pro Asn Lys Arg Pro Leu Ser Ser Met Thr Pro
450 455 460
Thr Ile Val Phe Lys Asp Glu Lys Pro Val Leu Thr Val Gly Ser Pro
465 470 475 480
Gly Gly Thr Thr Ile Ile Ala Ser Val Phe Gln Thr Ile Leu Asn Tyr
485 490 495
Phe Glu Tyr Gly Met Ser Leu Gln Asp Ala Ile Glu Glu Pro Arg Ile
500 505 510
Tyr Thr Asn Ser Leu Thr Ser Tyr Arg Tyr Glu Ser Gly Met Pro Glu
515 520 525
Asp Val Arg Arg Lys Leu Asn Asp Phe Gly His Lys Phe Gly Ala Asn
530 535 540
Pro Val Asp Ile Gly Asn Val Gln Ser Ile Phe Ile Asp Arg Glu Asn
545 550 555 560
Lys Thr Phe Met Gly Val Ala Asp Ser Ser Arg Asn Gly Thr Ala Val
565 570 575
Gly Val Asn Ile Lys Thr Ser Ala Lys
580 585
<210> 2
<211> 558
<212> PRT
<213> 堀越氏芽孢杆菌
<400> 2
Gln Lys Pro Val Lys Gly Ser Asn Glu Val Ala Val Gly Lys Asp Gly
1 5 10 15
Met Val Ser Thr Ser His Pro Leu Ala Ser Glu Ile Gly Ala Asp Ile
20 25 30
Leu Arg Lys Gly Gly Asn Ala Met Asp Ala Ala Ile Ala Val Gln Phe
35 40 45
Ala Leu Asn Val Val Glu Pro Met Met Ser Gly Ile Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Phe Met Met Val Tyr Asp Ala Glu Thr Asp Glu Thr Thr Ile Val Asn
65 70 75 80
Ser Arg Glu Arg Ala Pro Ala Gly Ala Thr Pro Asp Met Phe Leu Asn
85 90 95
Pro Asp Gly Ser Leu Ile Pro Phe Gln Glu Arg Val Arg His Gly Asn
100 105 110
Ser Val Gly Val Pro Gly Thr Leu Lys Gly Leu Glu Ala Ala His Glu
115 120 125
Lys Trp Gly Thr Arg Pro Phe Gln Gln Leu Ile Thr Pro Ala Phe Gln
130 135 140
Leu Ala Gln Asn Gly Phe Ser Val Asp Arg Gln Leu Ala Leu Gln Ile
145 150 155 160
Glu Asn Asn Lys Glu Lys Leu Ala Gly Thr Ala Ala Lys Glu Val Phe
165 170 175
Leu Pro Lys Gly Glu Pro Ile Lys Glu Gly Asp Trp Leu Val Gln Lys
180 185 190
Asp Leu Ala Lys Thr Phe Lys Leu Ile Arg Ser His Gly Ser Glu Val
195 200 205
Phe Tyr Asp Gly Glu Ile Gly Glu Ala Leu Ala Ala Thr Val Gln Asp
210 215 220
Phe Gly Gly Ser Met Thr Ile Glu Asp Leu Gln Asn Tyr Gly Val Thr
225 230 235 240
Glu Asp Glu Pro Val Trp Gly Glu Tyr Lys Gly Tyr Asp Ile Ala Ser
245 250 255
Met Pro Pro Pro Ser Ser Gly Gly Leu Phe Leu Leu Gln Met Leu Lys
260 265 270
Thr Leu Asp Ser Phe Asp Ile Ser Gln Tyr Asp Arg Arg Ser Lys Glu
275 280 285
Val Tyr His Leu Leu Ala Glu Ala Met His Leu Ser Tyr Ala Asp Arg
290 295 300
Gly Ala Tyr Ala Gly Asp Pro Glu Phe Val Glu Val Pro Met Ile Gly
305 310 315 320
Leu Leu His Pro Asp Tyr Ile Ala Glu Arg Ser Ala Leu Ile Asp Ile
325 330 335
Asn Ser Val Asn Thr Asn Pro Gln Pro Gly Asp Pro Trp Gln Tyr Glu
340 345 350
Asp Val Asp Pro Asn Tyr Asn Val Ile Lys Gln Asn Asp Glu Lys Asp
355 360 365
Ile Gly Glu Thr Thr His Phe Thr Val Ala Asp Arg Trp Gly Asn Leu
370 375 380
Val Ser Tyr Thr Thr Thr Ile Glu Gln Val Phe Gly Ser Gly Ile Met
385 390 395 400
Val Pro Gly Tyr Gly Phe Met Leu Asn Asn Glu Leu Thr Asp Phe Asp
405 410 415
Ala Arg Pro Gly Gly Ala Asn Glu Val Gln Pro Asn Lys Arg Pro Leu
420 425 430
Ser Ser Met Thr Pro Thr Ile Val Phe Glu Asp Gly Lys Pro Ile Met
435 440 445
Ser Val Gly Ser Pro Gly Gly Pro Thr Ile Ile Thr Ser Val Leu Gln
450 455 460
Val Val Leu Asn Val Met Asp Tyr Glu Met Gly Leu Glu Glu Ala Ile
465 470 475 480
Ala Glu Pro Arg Ile Tyr Thr Asn Thr Ile Asn Ser Tyr Arg Tyr Glu
485 490 495
Asp Gly Ile Ser Ala Glu Val Leu Ser Glu Leu Asn Ala Met Gly His
500 505 510
Arg Phe Pro Ser Asn Ser Glu Leu Ile Gly Asn Val Gln Ser Ile Leu
515 520 525
Ile Asp Tyr Glu Lys Asp Glu Tyr Val Gly Val Ala Asp Ala Arg Arg
530 535 540
Asp Gly Ala Ser Val Gly Tyr Thr Arg Pro Gly Lys Arg Lys
545 550 555
<210> 3
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
gactgaattc gagctctata aaaatgagga gggaaccgaa tgagacggtt agctttctta 60
g 61
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
gactggatcc acgcgttact atttagccga tgtcttaatg t 41
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