水稻静息巯基氧化酶在改善面粉加工品质中的应用
阅读说明：本技术 水稻静息巯基氧化酶在改善面粉加工品质中的应用 (Application of rice resting sulfhydryl oxidase in improving flour processing quality ) 是由 刘光 张名位 魏振承 张雁 唐小俊 邓媛元 王佳佳 李萍 于 2019-10-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种水稻静息巯基氧化酶在改善面粉加工品质中的应用,属于基因工程和谷物科学领域。本发明通过原核表达系统,制备了具有巯基氧化活性的重组水稻静息巯基氧化酶,具有表达量高,纯化简便,易于放大,适合工业化应用等特点。本发明首次提供了一种应用重组水稻静息巯基氧化酶改善面粉加工品质的方法,直接添加该重组酶到面粉中能够显著延长面粉的稳定时间,有效增强面粉粉质特性,改善面包的烘焙品质,其改善效果优于化学强筋剂溴酸钾,因此,可发展成为替代溴酸钾的新型生物面粉改良酶制剂,用于与其它生物改良剂的复配,促进面制品加工行业的发展。(The invention discloses application of resting thiol oxidase of rice in improving the processing quality of flour, belonging to the fields of genetic engineering and grain science. The recombinant rice resting thiol oxidase with thiol oxidation activity is prepared by a prokaryotic expression system, and has the characteristics of high expression quantity, simple and convenient purification, easy amplification, suitability for industrial application and the like. The invention provides a method for improving the processing quality of flour by applying recombinant rice resting sulfhydryl oxidase for the first time, the recombinase is directly added into the flour, the stability time of the flour can be obviously prolonged, the flour quality characteristic is effectively enhanced, the baking quality of bread is improved, and the improvement effect is better than that of a chemical strengthening agent potassium bromate, so that the recombinase can be developed into a novel biological flour improving enzyme preparation for replacing potassium bromate, is used for compounding with other biological modifiers, and promotes the development of the flour product processing industry.)
技术领域
本发明属于基因工程和谷物科学领域，具体涉及一种水稻静息巯基氧化酶在改善面粉加工品质中的应用。
背景技术
小麦是世界三大粮食作物之一，我国小麦的总产量居世界之首，占世界总产量的六分之一，但受品种、气候、土壤等的制约，我国生产的小麦多以中低筋小麦为主，适用于馒头、蛋糕但不适用于面包的制作。然而，随着人们生活水平的提高，对面包的消费需求逐年上升，低品质的中低筋小麦制约了我国面包等面制品行业的发展。此外，小麦生长环境、病虫害和采后处理导致面粉的加工品质参差不齐。
决定面粉加工品质主要是面筋蛋白网络，而分子间二硫键是形成该网络结构的基础。近年来，面制品加工行业通过添加促进分子间二硫键形成的面粉改良剂来改善面制品加工品质。在很长一段时间里，廉价、高效的“化学”面粉改良剂如溴酸钾、偶氮甲酰胺等在面制品加工行业得到广泛应用。然而，“化学”改良剂带来的食品安全隐患逐渐被重视和证实，如溴酸盐被发现具有致癌和遗传毒性。因此，寻找新型的面粉改良剂成为面制品加工领域的发展方向，而安全、高效、绿色的生物酶制剂符合这种发展趋势。
水稻静息巯基氧化酶(rice quiescin sulfhydryl oxidase，rQSOX)是含有辅基FAD的巯基氧化酶，能够直接催化二硫键的形成，在辅基FAD的作用下，自身被还原的二硫键可以重新氧化，从而实现巯基氧化活性的持续发挥。而且，QSOX属于巯基氧化酶家族成员，而巯基氧化酶被美国食药局(FDA)认定为GRAS(Generally Recognized as Safe，一般认为安全)，因此，QSOX具有发展成为安全高效面粉改良剂的潜质。目前，国内外有关QSOX的研究集中在酶学活性、反应机理和结构表征等方面，而将QSOX作为一种面粉改良剂应用到面制品品质改良中未见报道。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种水稻静息巯基氧化酶在改善面粉加工品质中的应用。
通过构建最佳表达体系，获得了具有巯基氧化活性的重组水稻静息巯基氧化酶。面粉品质改良试验结果表明，重组水稻静息巯基氧化酶能够显著延长面粉稳定时间，改善面包焙烤品质。
本发明的另一目的在于提供一种应用重组水稻静息巯基氧化酶改善面粉加工品质的方法。该方法为我国面制品的改良开创一条新途径。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一种水稻静息巯基氧化酶在改善面粉加工品质中的应用，特别是单独添加以水稻静息巯基氧化酶为主的酶制剂在改善面粉加工品质中的应用。
具体的，水稻静息巯基氧化酶在改善面团及面包品质中的应用。
仅在面粉中添加水稻静息巯基氧化酶即能达到增强面粉粉质特性，改善面包烘焙品质的目的。
所述的水稻静息巯基氧化酶在面粉中的添加水平为0.05％～1.0％(w/w，面粉基)，进一步为0.2％～0.5％(w/w)，更进一步为0.5％(w/w)；可以增加面粉的稳定时间和质量数，降低面粉的弱化度，降低面包的硬度和黏性。
所述的水稻静息巯基氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者，如SEQ IDNO：2的第31-476位氨基酸所示；其基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者，如SEQ IDNO：1的第91-1428位碱基所示。
一种应用重组水稻静息巯基氧化酶改善面粉加工品质的方法，将重组水稻静息巯基氧化酶、面粉、糖、盐(NaCl)、植物油、酵母粉和水搅拌均匀，形成的面团经分割称重、成形以及醒发后，焙烤得到面包成品。其中，所述各组分添加量为：面粉90～110重量份，酵母粉0.6～1.8重量份，盐1～3重量份，水50～70重量份，糖5～10重量份，植物油2～5重量份。
所述的重组水稻静息巯基氧化酶的添加水平为0.05％～1.0％(w/w，面粉基)，进一步为0.2％～0.5％(w/w)，更进一步为0.5％(w/w)。
所述的应用重组水稻静息巯基氧化酶改善面粉加工品质的方法，包括如下具体步骤：
(1)材料：面粉90～110重量份，酵母粉0.6～1.8重量份，盐1～3重量份，水50～70重量份，糖5～10重量份，植物油2～5重量份，重组水稻静息巯基氧化酶0.05％～1.0％(w/w，面粉基)；
(2)和面：将上述材料混合，以150～180r/min的速度搅拌10～15min，使其形成均匀的面团；
(3)成型：将和好的面团分割成40～60重量份/个，搓圆，成形装盘；
(4)发酵：将装有面团的醒发盘置于醒发箱中醒发，温度控制在30～35℃，相对湿度75％～85％，发酵时间60～80min；
(5)烘焙：将醒发后的面团，烘焙10～15min，烤箱温度为180～200℃，得到面包成品。
所述的重组水稻静息巯基氧化酶的制备方法，采用大肠杆菌表达体系表达，并采用柱层析方法纯化重组rQSOX蛋白；按照rQSOX：FAD＝1：1～5的摩尔比添加FAD到纯化的重组rQSOX蛋白溶液中，获得具有巯基氧化活性的重组水稻静息巯基氧化酶。
所述的大肠杆菌表达体系中采用的出发表达载体为pMAL-c5x，出发表达菌株为大肠杆菌Rosetta-gami B(DE3)。
包括如下步骤：
(1)利用全基因合成技术，合成了水稻静息巯基氧化酶的全基因序列(SEQID NO：1)，通过PCR扩增，得到91-1428位碱基片段，使用的扩增引物分别为引物F和引物P；将纯化得到的目的基因片段连接至载体质粒pMAL-c5x上，酶切位点为NdeI和EcoRI，构建出了水稻静息巯基氧化酶重组表达质粒pMAL-c5x-rqsox；
引物F：5′-GGCCCATATGCGCTCGCTCGGCGGCAGGGA-3′，其中，下划线部分为NdeI限制性酶切位点；
引物P：5′-GGCCGAATTCGCTTGCAGCATTAGAAATCGATG-3′；其中，下划线部分为EcoRI限制性酶切位点；
(2)将重组表达质粒pMAL-c5x-rqsox转入到大肠杆菌Rosetta-gami B(DE3)感受态细胞中，得到重组表达菌；将重组表达菌接种到LB液体培养基培养至OD600达到0.6～0.8，在16～37℃条件下添加0.2～1.0mM IPTG诱导重组蛋白表达8～12小时后收集菌体；
(3)收集的菌体经冰浴超声破碎后，离心收集上清液，利用Ni-NTA纯化重组水稻静息巯基氧化酶蛋白；
(4)按照rQSOX：FAD＝1：1～5的摩尔比添加FAD到纯化的重组水稻静息巯基氧化酶蛋白溶液中，低温孵育过夜，经透析脱盐处理去除多余的FAD，获得具有巯基氧化活性的重组水稻静息巯基氧化酶。重组蛋白浓缩处理后，冻藏于-20℃备用。
优选地，重组水稻静息巯基氧化酶按0.5％(w/w，面粉基)比例添加至面包中，经面包质构分析发现，重组水稻静息巯基氧化酶在改善面包品质效果方面优于化学改良剂溴酸钾。
本发明的机理是：本发明通过原核表达系统，制备了具有巯基氧化活性的重组水稻静息巯基氧化酶。直接添加重组水稻静息巯基氧化酶到面粉中能够显著延长面粉的稳定时间，改善面包的烘焙品质。重组水稻静息巯基氧化酶改善面粉品质效果优于化学改良剂溴酸钾，因此，可发展成为一种新型的生物面粉改良酶制剂，用于与其它生物改良剂的复配，促进面制品加工行业的发展。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明首次提供了一种应用重组水稻静息巯基氧化酶改善面粉加工品质的方法。该重组酶能有效增强面粉粉质特性，改善面包的烘焙品质，其改善效果优于化学强筋剂溴酸钾，可发展成为替代溴酸钾的新型生物面粉改良剂，用于面制品加工行业。
(2)本发明提供了一种采用原核表达制备具有巯基氧化活性的重组水稻静息巯基氧化酶，具有表达量高，纯化简便，易于放大，适合工业化应用等特点。
附图说明
图1是重组菌的菌落PCR鉴定；其中，泳道M：DNA Marker D5000；泳道1-6：挑取的单克隆菌。
图2是重组rQSOX的表达及可溶性分析；其中，泳道M：分子量Marker；泳道1：未诱导菌液；泳道2：诱导后菌液；泳道3：细胞破碎液上清；下划线为重组rQSOX蛋白。
图3是亲和层析后重组rQSOX的SDS-PAGE分析；其中，泳道M：分子量Marker；泳道1：细胞破碎上清液；泳道2：Ni-NTA亲和层析后目的蛋白；泳道3：脱盐处理后目的蛋白。
图4是使用氧电极检测重组rQSOX的巯基氧化活性。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。本发明的实施例中使用的面粉购于粮食市场；限制性内切酶NdeI和EcoRI购于Thermo FisherScientific公司；pMAL-c5x质粒购于美国纽英伦生物技术；大肠杆菌DH5α和Rosetta-gami B(DE3)感受态细胞购于Novagen公司；全基因序列合成由广州英赞生物科技有限公司完成。
实施例1重组水稻静息巯基氧化酶表达载体构建
水稻静息巯基氧化酶全基因序列(SEQ ID NO：1)合成于广州英赞生物科技有限公司，并连接至克隆载体pGSI上。由于N-端带有信号肽序列，C-端带有跨膜序列，为了不影响蛋白的可溶表达，选择31-476位氨基酸进行表达，对应的碱基序列为91-1428位，长度为1338bp，序列扩展的上下游引物分别为引物F和引物P。取1ng重组克隆质粒，加入上下游引物和2×PfuMix进行PCR反应，扩增结束后，对PCR产物进行电泳分析和回收纯化处理。
引物F：5′-GGCCCATATGCGCTCGCTCGGCGGCAGGGA-3′，其中，下划线部分为NdeI限制性酶切位点；
引物P：5′-GGCCGAATTCGCTTGCAGCATTAGAAATCGATG-3′；其中，下划线部分为EcoRI限制性酶切位点；
用NdeI和EcoRI限制性内切酶对回收得到的扩展片段进行双酶切，酶切反应(37℃，30min)结束后，纯化回收带有粘性末端的水稻静息巯基氧化酶基因片段。将20μg基因片段与5μg经相同限制酶酶切的质粒pMAL-c5x混合，在T4DNA连接酶作用下于20℃连接1h。连接后产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含卡那霉素的LB固体培养基上培养12～16h。挑取形态饱满的单克隆菌落进行菌落PCR鉴定，阳性克隆菌组将出现明显条带。从图1中可看出，挑取的6颗单克隆除了第5个外，其余都扩增出了特异性条带，且条带大小约1350bp左右，与目的基因理论大小接近。因此，该结果表明pMAL-c5x-rqsox重组表达载体被成功构建。
实施例2重组水稻静息巯基氧化酶(rQSOX)的诱导表达及纯化
1、诱导表达
将构建好的重组质粒pMAL-c5x-rqsox转化至Rosetta-gami B(DE3)中，挑取3颗单克隆菌落到含50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，200r/min条件下培养至OD600到0.6～0.8左右，加入0.2～1mM IPTG诱导表达8～12h，诱导温度范围在16～37℃之间。经SDS-PAGE分析(图2)，重组rQSOX能够大量表达(泳道2)，且破碎上清液中有目的蛋白(泳道3)，说明获得了可溶表达。
2、亲和纯化
收集表达后的菌体，加入缓冲液重悬，利用探头式超声仪破碎菌体细胞，超声条件为350w，占空比0.4:0.6，超声15min。超声完全后，8000r/m离心20min后收集上清液。
上清液缓慢注入Ni-NTA亲和层析柱中，利用线性洗脱方式纯化目的蛋白，收集各流出峰组分，并利用SDS-PAGE检测重组蛋白纯度(图3)。
合并目的蛋白溶液，按rQSOX：FAD＝1：1～5的摩尔比加入FAD，4℃处理过夜，再经脱盐、浓缩后冻藏于-20℃备用。
以上结果表明，重组rQSOX获得可溶表达，经一步亲和层析获得高纯度目的蛋白。
实施例3重组rQSOX的巯基氧化活性
rQSOX的巯基氧化活性可用多种方法测定，本研究使用液相氧电极测定重组蛋白的巯基氧化活性。其原理为rQSOX催化二硫键形成过程中，其自身催化活性位点二硫键被还原，在其辅基FAD的作用下，被还原的活性位点二硫键将重新氧化，形成二硫键，此过程中伴随溶液氧的消耗，因此，通过测定溶液氧变化可以表征rQSOX巯基氧化活性。
酶活测定反应体系如下：10μmol/L rQSOX加入到50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲溶液中，加入10mmol/L DTT(二硫苏糖醇)启动反应，使用液相氧电极检测氧浓度变化。
结果如图4所示，单独添加DTT或者rQSOX对溶液氧影响较小，但同时添加DTT和rQSOX后，溶液氧浓度明显降低，表明rQSOX具有显著的巯基氧化活性。
实施例4重组rQSOX对面粉粉质特性的影响
采用微量粉质仪表征重组rQSOX对面粉粉质特性影响。4g面粉加入粉钵中，63r/min预混1min后，加入57％的水，相同速度持续搅拌15min后得到了粉质参数。以不添加任何物质为阴性对照组，以添加溴酸钾(20μg/g)为阳性对照组，以添加重组rQSOX蛋白(0.2％，w/w，面粉基)的为实验组。
结果：与阴性对照相比，加入溴酸钾和rQSOX后，粉质参数变化显著，面团的稳定时间和质量数都显著提高。然而，相比于添加溴酸钾组，加入重组rQSOX对面粉稳定时间和质量数影响更大(表1)，表明重组rQSOX在提高粉质特性方面优于“化学”改良剂溴酸钾。
表1重组rQSOX和溴酸钾对面粉粉质参数的影响比较
稳定时间(min)
弱化度(FU)
质量数
对照
0.73±0.06b
178±6a
34±1.3b
溴酸钾
1.03±0.06a
149±0b
43±2.1a
rQSOX
1.16±0.05a
138±3c
46±1.7a
注：溴酸钾添加水平为20μg/g，重组rQSOX添加水平为0.2％(w/w，面粉基)。同一列中不同字母表示差异显著(P＜0.05)。
实施例5rQSOX改善面包焙烤品质的方法
利用上述重组水稻静息巯基氧化酶改善面包焙烤品质的方法，不同之处在于，采用以下工艺流程：
(1)材料：面粉100重量份，酵母粉(安琪高活性干酵母，市售)1.5重量份，盐2重量份，水60重量份，糖7重量份，植物油(金龙鱼食用调和油，市售)4重量份，重组水稻静息巯基氧化酶0.5％(w/w，面粉基)。
(2)和面：将上述材料加入到和面钵中，以180r/min的速度搅拌15min，使其形成均匀的面团。
(3)成型：将和好的面团置于天平上，分割成50重量份/个，在面包成型机上搓圆，成形装盘。
(4)发酵：将装有面团的醒发盘置于醒发箱中醒发，温度控制在32℃，相对湿度80％，发酵时间70min。
(5)烘焙：将醒发后的面团放于烤箱中烘焙12min，烤箱温度为190℃，得到面包成品。
将制得的面包室温下冷却2h后进行面包质构品质分析。将面包竖切成2cm/块，面包质构测定条件：p/25探头，测前和测试速度1mm/s，测后速度5mm/s，压缩比50％，下压间隔10s。以不添加任何物质为阴性对照组，以添加溴酸钾(20μg/g)为阳性对照组。
面包质构结果表明，添加溴酸钾或重组rQSOX都能够显著降低面包硬度和黏性，提高面包弹性，表明两者都能提高面包的质量。而且，添加重组rQSOX和溴酸钾的面包之间不具有差异显著性(表2)。因此，质构结果进一步表明，重组rQSOX能够替代溴酸钾，发挥与之相当的改善面包品质能力。
表2重组rQSOX和溴酸钾对面包焙烤品质影响
硬度
黏性
弹性
对照
715±12a
418±16a
0.92±0.04b
溴酸钾
620±23b
375±12b
0.95±0.09a
rQSOX
580±17c
346±11c
0.96±0.11a
注：溴酸钾添加水平为20μg/g，重组rQSOX添加水平为0.5％(w/w，面粉基)。同一列中不同字母表示差异显著(P＜0.05)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所
<120> 水稻静息巯基氧化酶在改善面粉加工品质中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1542
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 水稻静息巯基氧化酶的核苷酸序列
<400> 1
atggctgcgg cggcggtggc gcgccgcgtc gtcctggtgc tcgtcctcgc cgccgcctcc 60
ctcgccgcgg cgccgcgcgg ggcggccgct cgctcgctcg gcggcaggga gggccccggg 120
gaggtcgacg ccgacgccgc cgtcgacctc aacgccacca acttcgacgc cttcctcaag 180
gcctcgctgg agccctgggc cgtcgtcgag ttcttcgccc actggtgtcc agcttgcaga 240
aactacaagc ctcattatga gaaggttgca aaactattca atggtcggga cgctgcacat 300
ccagggttaa tactgatggc tagggttgat tgtgcatcaa aggtgaacat cgatctttgc 360
aatagattct cagttgacca ttaccctttc ctactttggg gtccaccaac aaaatttgct 420
tctgctaagt gggatcccaa gcaagagaat aatgaaataa agttaattga tgatggaaga 480
acagcagaac gtttactgaa gtggataaat aatcagatga aaagctcttt cagtttagaa 540
gacaaaaagt acgagaatga aaatatgctt ccaaagaatg cttcggatcc tgagcagatt 600
gttcaagcaa tttacgatgt tgaggaagca acagctcaag cgttacagat aattttggag 660
cgcaagacga tcaaaccaaa gaatcgtgat tcgctcatca gatttttaca aattttggtg 720
gctcgtcacc catccaagag gtgccgaagg ggatctgctg agctacttat taacttcgat 780
gatcactggt catcgaatct gtcgttaagt tcacaagagg gttctaaatt gttggaaagt 840
gttgcggaag agaaccactg gatctgtgga aaagaggtgc cacgtggata ttggctgttc 900
tgccgcggca gtaaaagtga aacaagagga tttagctgtg gtctatgggt tttgatgcat 960
tcactaaccg tccgaattgg ggatggagag agccagtcaa cctttacatc aatatgtgat 1020
tttattcaca acttcttcat ctgtgaggaa tgccgcaagc acttttatga aatgtgttca 1080
agcgtgtcag cccccttcag aactgctcgt gagctcagtc tctggttatg gagcacacat 1140
aacaaagtca atatgagatt gatgaaagaa gaaaaggata tgggaactgg tgatcccttg 1200
tttccgaagg ttacctggcc tccaaatcag ctctgcccat cttgctaccg ctcaagcaag 1260
gtcaccgatg gagctgtgga ctggaacgag gatgcagtgt atcaattctt ggttaactac 1320
tatggaaaga agcttgtatc atcctacaag gagacctaca tggagtctct tcagcaacaa 1380
gagaagaaga tagtttcaga ggattcatcg atttctaatg ctgcaagcgt cccaattgga 1440
gctgccctgg gtgttgcgat tgccagctgt acatttgggg cgctggcttg cttctggagg 1500
gcccagcaga agaacagaaa gcaaagaaag aactggaact ga 1542
<210> 2
<211> 513
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 水稻静息巯基氧化酶的氨基酸序列
<400> 2
Met Ala Ala Ala Ala Val Ala Arg Arg Val Val Leu Val Leu Val Leu
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ser Leu Ala Ala Ala Pro Arg Gly Ala Ala Ala Arg Ser
20 25 30
Leu Gly Gly Arg Glu Gly Pro Gly Glu Val Asp Ala Asp Ala Ala Val
35 40 45
Asp Leu Asn Ala Thr Asn Phe Asp Ala Phe Leu Lys Ala Ser Leu Glu
50 55 60
Pro Trp Ala Val Val Glu Phe Phe Ala His Trp Cys Pro Ala Cys Arg
65 70 75 80
Asn Tyr Lys Pro His Tyr Glu Lys Val Ala Lys Leu Phe Asn Gly Arg
85 90 95
Asp Ala Ala His Pro Gly Leu Ile Leu Met Ala Arg Val Asp Cys Ala
100 105 110
Ser Lys Val Asn Ile Asp Leu Cys Asn Arg Phe Ser Val Asp His Tyr
115 120 125
Pro Phe Leu Leu Trp Gly Pro Pro Thr Lys Phe Ala Ser Ala Lys Trp
130 135 140
Asp Pro Lys Gln Glu Asn Asn Glu Ile Lys Leu Ile Asp Asp Gly Arg
145 150 155 160
Thr Ala Glu Arg Leu Leu Lys Trp Ile Asn Asn Gln Met Lys Ser Ser
165 170 175
Phe Ser Leu Glu Asp Lys Lys Tyr Glu Asn Glu Asn Met Leu Pro Lys
180 185 190
Asn Ala Ser Asp Pro Glu Gln Ile Val Gln Ala Ile Tyr Asp Val Glu
195 200 205
Glu Ala Thr Ala Gln Ala Leu Gln Ile Ile Leu Glu Arg Lys Thr Ile
210 215 220
Lys Pro Lys Asn Arg Asp Ser Leu Ile Arg Phe Leu Gln Ile Leu Val
225 230 235 240
Ala Arg His Pro Ser Lys Arg Cys Arg Arg Gly Ser Ala Glu Leu Leu
245 250 255
Ile Asn Phe Asp Asp His Trp Ser Ser Asn Leu Ser Leu Ser Ser Gln
260 265 270
Glu Gly Ser Lys Leu Leu Glu Ser Val Ala Glu Glu Asn His Trp Ile
275 280 285
Cys Gly Lys Glu Val Pro Arg Gly Tyr Trp Leu Phe Cys Arg Gly Ser
290 295 300
Lys Ser Glu Thr Arg Gly Phe Ser Cys Gly Leu Trp Val Leu Met His
305 310 315 320
Ser Leu Thr Val Arg Ile Gly Asp Gly Glu Ser Gln Ser Thr Phe Thr
325 330 335
Ser Ile Cys Asp Phe Ile His Asn Phe Phe Ile Cys Glu Glu Cys Arg
340 345 350
Lys His Phe Tyr Glu Met Cys Ser Ser Val Ser Ala Pro Phe Arg Thr
355 360 365
Ala Arg Glu Leu Ser Leu Trp Leu Trp Ser Thr His Asn Lys Val Asn
370 375 380
Met Arg Leu Met Lys Glu Glu Lys Asp Met Gly Thr Gly Asp Pro Leu
385 390 395 400
Phe Pro Lys Val Thr Trp Pro Pro Asn Gln Leu Cys Pro Ser Cys Tyr
405 410 415
Arg Ser Ser Lys Val Thr Asp Gly Ala Val Asp Trp Asn Glu Asp Ala
420 425 430
Val Tyr Gln Phe Leu Val Asn Tyr Tyr Gly Lys Lys Leu Val Ser Ser
435 440 445
Tyr Lys Glu Thr Tyr Met Glu Ser Leu Gln Gln Gln Glu Lys Lys Ile
450 455 460
Val Ser Glu Asp Ser Ser Ile Ser Asn Ala Ala Ser Val Pro Ile Gly
465 470 475 480
Ala Ala Leu Gly Val Ala Ile Ala Ser Cys Thr Phe Gly Ala Leu Ala
485 490 495
Cys Phe Trp Arg Ala Gln Gln Lys Asn Arg Lys Gln Arg Lys Asn Trp
500 505 510
Asn
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物F
<400> 3
ggcccatatg cgctcgctcg gcggcaggga 30
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物P
<400> 4
ggccgaattc gcttgcagca ttagaaatcg atg 33
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