阅读说明：本技术 一种苏云金芽孢杆菌在防治根螨属昆虫中的应用 (Application of bacillus thuringiensis in prevention and treatment of rootworm insects ) 是由 杜立新 宋健 曹伟平 贾海民 李敏 何运转 于 2019-10-23 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种苏云金芽孢杆菌在防治根螨属昆虫中的应用。其中,所述苏云金芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.9763。所述根螨属(Rhizoglyphus)昆虫可以为刺足根螨(Rhizoglyphus echinopus)。(The invention provides an application of bacillus thuringiensis in preventing and treating root mite insects. Wherein the bacillus thuringiensis is preserved in the China general microbiological culture Collection center with the preservation number of CGMCC No. 9763. The insects of the genus Rhizopus (Rhizoxyphus) may be Rhizopus spiniferus (Rhizoxyphus echinopus).)

一种苏云金芽孢杆菌在防治根螨属昆虫中的应用

技术领域

本发明提供了一种苏云金芽孢杆菌在防治根螨属(Rhizoglyphus)昆虫中的应用，特 别是在防治刺足根螨中的应用。

背景技术

刺足根螨学名Rhizoglyhus echinopus，别名球根粉螨、葱螨，隶属于蜱螨亚纲(Acari)、 粉螨目(Astigmata)粉螨科(Acaridae)根螨属(Rhizoglyhus)，是球根、球茎、鳞茎及块 茎类作物、花卉和中药材在生产及储藏过程中的重要害虫。刺足根螨繁殖和生存能力很强， 其每雌可产300～600粒卵，在温室及仓库中可全年发生，在田间可长期存活，适当温湿度 条件下即可群集为害植物地下部，取食组织，诱发、刺激病菌发生，导致植物叶片枯黄、 植株矮化、凋萎、腐烂、死亡。刺足根螨为世界性害虫，可危害十多个科、三十余种植物，主要为害空心菜、藠头、麝香、韭黄、韭菜、葱蒜类、百合、郁金香、水仙、半夏、芋、 甜菜、马铃薯、唐菖蒲、贝母、萝卜、葡萄、蘑菇、玉米、麦类、豆类等。洋葱严重受害 时，株受害率高达50％，整株死亡率可超过30％。

目前对于刺足根螨的防治方法主要是化学防治。生产上主要采用化学杀螨剂，由于根 螨寄主范围广，主要为害鳞茎、球茎、块茎、块根和根茎类植物个体小，繁殖快，抗逆性强，生活环境复杂，一旦发生即很难根除，导致菜农过量、频繁使用农药，造成农药残留 超标、污染环境、危害人类健康以及杀害有益鸟类等问题；另一方面，长期大量使用化学 农药增强害虫抗药性、污染环境、杀伤有益鸟类、造成害虫再度猖獗的恶性循环，不能达 到对害虫种群的有效控制。

生物防治方法由于具有专一性强、对人畜无害、不存在产生抗药性以及无环境污染等 优点，日益受到人们的青睐。因此，筛选对刺足根螨高效的生防微生物是防治刺足根螨的 最佳途径。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种从土壤或死亡昆虫体内分离 出来的***，此类菌在芽胞形成时期能产生一种或多种具有杀虫作用的伴孢晶 体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，简称ICPs)，可对鳞翅目、鞘翅目等多种害虫具有杀 虫活性。这种杀虫晶体蛋白对人畜无害、不污染环境、对目标害虫高效专一，因而苏云金 芽孢杆菌在害虫生物防治中得到广泛应用。

然而，到目前为止，尚未有对刺足根螨具有杀虫效果的苏云金芽孢杆菌。

发明内容

本发明之一提供了一种苏云金芽孢杆菌在防治危害植物的根螨属(Rhizoglyphus)昆 虫中的至少一种中的应用，其中，所述苏云金芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9763。

在一个

具体实施方式

中，所述根螨属(Rhizoglyphus)昆虫为刺足根螨(Rhizoglyphus echinopus)。

在一个具体实施方式中，所述植物为半夏(Pinellia ternata)、空心菜、藠头、麝香、 韭黄、韭菜、百合、郁金香、水仙、芋、甜菜、马铃薯、唐菖蒲、贝母、萝卜、葡萄、蘑 菇、玉米、葱蒜类(例如大葱、洋葱、蒜等)、麦类(例如小麦、燕麦等)、豆类(例如黄 豆)中的至少一种。

在一个具体实施方式中，通过浸泡所述植物的种子来防治所述根螨属(Rhizoglyphus) 昆虫中的至少一种。

本领域的技术人员熟知，在对一株微生物进行人工遗传改造时，一般会保留或提高其 有益特性；或者减弱或去除其有害特性；至于对该菌株生长或有益特性无关的其他特性方 面的改变一般并不受人们的关注。因此，本发明之二提供了一种苏云金芽孢杆菌的工程菌 在防治根螨属(Rhizoglyphus)昆虫中的至少一种中的应用，其中，所述工程菌为经由本 发明之一所述的应用中的所述苏云金芽孢杆菌遗传改良得到的第一工程菌；且所述第一工 程菌与如本发明之一所述的应用中的所述苏云金芽孢杆菌具有相同的功能。其中，在此所 述的相同的功能指的是可以与遗传改造前的野生菌株CGMCC No.9763在相同功能(例如 其对根螨属(Rhizoglyphus)昆虫中的至少一种中的杀虫效果)方面具有差异不显著的效 果(即改造前后效果相当)；也可以比遗传改造前的野生菌株CGMCC No.9763在相同功能方面具有更优的技术效果；在某些特别的情况下，还可以比遗传改造前的野生菌株CGMCC No.9763在相同功能方面具有稍差的技术效果。需要指出的是，经过遗传改造后 所得到的第一工程菌株，可以是在不影响其原功能的基础之上增加了新功能方面的效果， 例如通过转入携带新的功能基因的质粒而赋予第一工程菌株新的特性。以上这些都是本领域的技术人员比较容易做到的，特别是在测序技术已经比较普遍的当下，可以对通过全基因组测序获得的微生物基因组DNA信息分析之后，再对该微生物进行改造，例如，影响 基因组DNA稳定性的转座子序列普遍存在于微生物中，一般来讲对转座子基因进行改造 是有利的，例如在转座子基因序列中***功能基因，或敲除该序列等。

在一个具体实施方式中，所述根螨属(Rhizoglyphus)昆虫为刺足根螨(Rhizoglyphus echinopus)。

本领域的技术人员熟知，任何生物都存在自发突变的特性，特别是在一些微生物中， 中，有的具有较高的自发突变频率，但无论自发突变到何种程度，只要其保留了其有益功 能，即该有益功能与发生自发突变之前的功能在效果上相当(可以经过标准地活性测定来 确定)，甚至是高于自发突变之前，或者在一些特别的可接受的情况下，其有益功能低于自发突变之前，那么其也在本发明的保护范围之内。因此，本发明之三提供了一种苏云金芽孢杆菌自发突变株在防治根螨属(Rhizoglyphus)昆虫中的至少一种中的应用，其中， 所述自发突变株为经由如本发明之一所述的应用中的所述苏云金芽孢杆菌自发突变得到 的第一自发突变株，和/或经由如本发明之二所述的应用中的所述第一工程菌经自发突变得到的第二自发突变株；且所述第一自发突变株和所述第二自发突变株与如本发明之一所述的应用中的所述苏云金芽孢杆菌独立地具有相同的功能。

在一个具体实施方式中，所述根螨属(Rhizoglyphus)昆虫为刺足根螨(Rhizoglyphus echinopus)。

本发明之四提供了一种苏云金芽孢杆菌工程菌在防治根螨属(Rhizoglyphus)昆虫中 的至少一种中的应用，其中，所述工程菌为经由如本发明之三所述的应用中的所述第一自 发突变株遗传改良得到的第二工程菌，和/或经由如本发明之三所述的应用中的所述第二自 发突变株遗传改良得到的第三工程菌；且所述第二工程菌和所述第三工程菌与如本发明之 一所述的应用中的所述苏云金芽孢杆菌独立地具有相同的功能。

在一个具体实施方式中，所述根螨属(Rhizoglyphus)昆虫为刺足根螨(Rhizoglyphus echinopus)。

在本发明中，属于植物的“种子”为用于繁殖所述植物的器官，例如半夏的球茎。

本发明的有益效果：

本发明首次发现了一株对根螨属害虫有活性的苏云金芽孢杆菌，72小时的LC₅₀为6.471×10⁶cfu/mL。田间1×10⁸cfu/mL浓度，精准淋灌，防治效果达到90％以上，优于现有常规的生物源农药，比如阿维菌素；甚至优于现有的化学农药，比如哒螨灵。并且本发明 的生物农药具有对环境更为友好的优点，因此，随着根螨属害虫对阿维菌素和哒螨灵等现 有农药产生抗药性，本发明的苏云金芽孢杆菌可以作为阿维菌素和哒螨灵代替药剂。

细胞保藏

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株JQD117保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9763，保藏日期为2014年10月14日。 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明实施例仅为示例性的说明，该实施 方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

实施例1

对刺足根螨成虫室内杀虫效果试验

(1)菌种活化：将低温保存的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株JQD117 在LB平板培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g， 琼脂粉15g，加水定容至1L，121℃灭菌30min)上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基 上30℃培养3天，得活化的菌株。

(2)种子液的制备：用无菌接种环刮取一环步骤(1)活化的菌株，接种到50ml LB液体培养基中，在30℃、摇床转速为200rpm条件下培养12h，得种子液。

(3)发酵培养：按照体积比为1％的比例将步骤(2)的种子液接入到黄豆饼淀粉粉培养基(其组成成分及其重量百分比为：黄豆饼粉2.5％、棉籽饼粉1.2％、玉米淀粉1.5％、酵母粉0.5、KH₂PO₄ 0.03％、MgSO₄ 0.05％，其余为水，pH 7.2，121℃灭菌30min)中， 在温度30℃，转速200rpm摇床培养48h，检测发酵液中菌体和芽胞数量，待发酵液中胞 晶分离达到95％时停止发酵培养，得发酵液；经稀释平板计数法计数发酵液中的活菌数 为5.45×10⁹cfu/ml(每毫升溶液中含有的活芽胞个数)。

(4)将步骤(3)所得的JQD117菌株的发酵液兑水稀释成5×10⁸、1×10⁸、5×10⁷、1×10⁷、 5×10⁶、1×10⁶cfu/mL共6个浓度梯度。

(5)将灭菌的一次性塑料盒中，加入灭菌干燥土100g，厚度为5cm，每个塑料盒中分别装入半夏(Pinellia ternata)球茎3个，接入刺足根螨30头；

(6)将步骤(4)的6个浓度梯度的菌悬液分别倒入步骤(5)的塑料盒(一个浓度 对应一个塑料盒，为一个重复)中，每盒倒入菌悬液18mL。以无菌水作为阴性对照。

(7)置于25℃、光周期14L：10D条件下饲养。每处理设3次重复。

72小时后通过显微镜定期调查死活虫数。数据统计分析应用SPSS24.0软件进行数据 处理。结果见表1。

表1

由表1可知，JQD117对刺足根螨成虫72小时的LC₅₀为6.471×10⁶cfu/mL，说明JQD117 菌株对刺足根螨成虫有很高的杀虫活性。

实施例2

对刺足根螨田间杀虫效果试验

(1)将实施例1步骤(3)的发酵液经后处理浓缩离心后，调节pH值至5.0，添加0.06％ 的苯甲酸钠，制成7.0×10⁹cfu/mL的JQD117水剂。

(2)2019年5月为刺足根螨发生初期，在河北省安国半夏种植区，先调查根螨虫口数，调查完毕后，施药处理：

(2-1)将步骤(1)的JQD117水剂稀释至1×10⁸cfu/mL，采用根部淋灌法进行施药，每亩用药4L，小区面积为1亩。

(2-2)以浇灌清水作为空白对照，小区面积为1亩。

(2-3)以1.8％阿维菌素乳油(河北威远生物化工有限公司)为作为生物源农药阳性 对照，采用根部淋灌法进行施药，每亩用药1L，小区面积为1亩。

(2-4)以15％哒螨灵乳油(石家庄市深泰化工有限公司)为化学农药阳性对照，采用 根部淋灌法进行施药，每亩用药均为1L，小区面积为1亩。

(3)7d后再次调查各小区的刺足根螨虫口数。

计算平均虫口减退率和平均防治效果。计算公式为：

虫口减退率％＝(施药前虫口密度－施药后虫口密度)/施药前虫口密度×100％。

防治效果％＝(处理的虫口减退率－空白对照虫口减退率)/(1-空白对照虫口减退率) ×100％。

结果见表2。

表2

从表2的结果可以看出，JQD117水剂对刺足根螨的虫口减退率可以达到83.18％，防 治效果达到90.71％，优于阿维菌素；甚至优于哒螨灵。这说明本发明的苏云金芽孢杆菌JQD117对刺足根螨的田间防治效果显著，可用于刺足根螨的生物防治。

实施例3

对带刺足根螨半夏的浸种(球茎)试验

待测微生物杀虫剂：将实施例2步骤(1)制备的JQD117水剂稀释200倍，得到稀释液。将带螨半夏种子(浸种前调查种子带螨数量)浸泡至稀释液中，浸泡10min，后取出， 然后晾干，显微镜下观察螨的存活情况。重复3次。

以1.8％阿维菌素乳油(河北威远生物化工有限公司)作为生物源农药阳性对照，15％ 哒螨灵乳油(石家庄市深泰化工有限公司)作为化学农药阳性对照。将1.8％阿维菌素乳油 和15％哒螨灵乳油分别稀释2000倍，得到各自的稀释液。同样地，将带螨半夏种子(浸种前调查种子带螨数量)浸泡至各稀释液中，浸泡10min，后取出，然后晾干，显微镜下 观察螨的存活情况。重复3次。

以清水作为空白对照。同样地，将带螨半夏种子(浸种前调查种子带螨数量)浸泡至 稀释液中，浸泡10min，后取出，然后晾干，显微镜下观察螨的存活情况。重复3次。

根据实施例2的公式计算平均虫口减退率和平均防治效果，结果见表3。

表3

从结果可以看出，刺足根螨在JQD117水剂中浸泡后，虫口减退率为93.17％，防治效 果为93.00％，优于阿维菌素；甚至优于哒螨灵。说明本发明苏云金芽孢杆菌JQD117菌株可用于处理半夏的种子以防治刺足根螨。

虽然本发明已经参照具体实施方式进行了描述，但是本领域的技术人员应该理解在没 有脱离本发明的真正的精神和范围的情况下，可以进行的各种改变。此外，可以对本发明 的主体、精神和范围进行多种改变以适应特定的情形、材料、材料组合物和方法。所有的 这些改变均包括在本发明的权利要求的范围内。