一种枯草芽孢杆菌的光敏微胶囊杀菌剂及其制备方法
阅读说明：本技术 一种枯草芽孢杆菌的光敏微胶囊杀菌剂及其制备方法 (Photosensitive microcapsule bactericide of bacillus subtilis and preparation method thereof ) 是由 陈宏伟 庞秋雯 钱贞舟 刘思琪 刘航 于 2021-08-10 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物农药领域,公开了一种枯草芽孢杆菌的光敏微胶囊杀菌剂,包括：以枯草芽孢杆菌为核心的芯材；以明胶及阿拉伯胶为囊壁的壁材；其中,壁材中含有具备光响应特性的邻硝基苄基丙烯酸酯修饰的葡聚糖。该杀菌剂在遇光后囊壁会破裂,从而释放枯草芽孢杆菌使其生长繁殖,其能在田间施用时,保证杀菌物质的活性,从而具有较高的杀菌效果。(The invention belongs to the field of biological pesticides, and discloses a photosensitive microcapsule bactericide of bacillus subtilis, which comprises the following components in part by weight: a core material taking bacillus subtilis as a core; gelatin and Arabic gum are used as wall materials of the capsule wall; wherein the wall material contains glucan modified by ortho-nitrobenzyl acrylate with photoresponse characteristics. The capsule wall of the bactericide can be broken after being exposed to light, so that the bacillus subtilis is released to grow and reproduce, and the activity of a bactericidal substance can be ensured when the bactericide is applied in the field, so that the bactericide has a higher bactericidal effect.)
技术领域
本发明涉及生物农药领域，特别涉及一种枯草芽孢杆菌的光敏微胶囊杀菌剂及其制备方法。
背景技术
枯草芽孢杆菌是现有的一种生物杀菌剂，其主要通过竞争作用抑菌。枯草芽孢杆菌通过在植物根际、体表或体内及土壤中快速、大量繁衍和定殖，有效地排斥、阻止和干扰病原微生物在植物的定殖与浸染，从而达到抑菌和防病的效果。其次，枯草芽孢杆菌在生长过程中能产生多种具有抑菌、溶菌作用的物质，从而抑制病原菌的生长和繁殖，甚至破坏细菌结构，杀死病原菌。其中，枯草芽孢杆菌的的活性影响着杀菌效果，其在生长过程中所表现的抗菌活性最强，因此如何在施用时保证枯草芽孢杆菌的活性，避免其因过度生长而影响抗菌活性是一个亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌的光敏微胶囊杀菌剂及其制备方法，微胶囊具备光响应特性，能够在光照时使枯草芽孢杆菌得以释放，以发挥枯草芽孢杆菌的最大作用。
为了实现根据本发明的上述目的和其他优点，本发明的第一目的是提供一种枯草芽孢杆菌的光敏微胶囊杀菌剂，包括：以枯草芽孢杆菌为核心的芯材；
以明胶及阿拉伯胶为囊壁的壁材；
其中，壁材中含有具备光响应特性的邻硝基苄基丙烯酸酯修饰的葡聚糖。
作为优选，芯材与壁材的质量比为1:1～3。
作为优选，明胶与阿拉伯胶的质量比为1:1～3。
作为优选，邻硝基苄基丙烯酸酯修饰的葡聚糖与壁材的质量比为1:15。
本发明的第二目的是提供一种上述的枯草芽孢杆菌的光敏微胶囊杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
将枯草芽孢杆菌的菌种经活化、摇床培养后，经高速离心形成菌浆，之后向菌浆中加入吐温80溶液混合后形成菌悬液；
取一定量的明胶及阿拉伯胶溶解于无菌水中形成明胶水溶液及阿拉伯胶水溶液；
向明胶水溶液中添加枯草芽孢杆菌的菌悬液，之后加入阿拉伯胶水溶液进行复凝聚反应，形成第一乳化液；
向第一乳化液中加入邻硝基苄基丙烯酸酯修饰的葡聚糖并搅拌形成第二乳化液
调节第二乳化液的pH至酸性，之后向其中加入转谷氨酰胺酶发生固化交联反应形成微胶囊分散液；
将微胶囊分散液经沉淀水洗后抽滤得到湿囊，将湿囊冷冻干燥后得到枯草芽孢杆菌的光敏微胶囊杀菌剂。
作为优选，菌浆在吐温80溶液中的质量浓度为0.1g/mL，吐温80溶液中吐温80的质量浓度为0.05％；阿拉伯胶水溶液和明胶水溶液的质量浓度为0.5～2％。
作为优选，复凝聚反应包括如下所述的反应步骤：40℃下，将明胶水溶液与菌悬液混合，搅拌均匀；反应5min后向其中加入阿拉伯胶水溶液，搅拌均匀，得到水包油的第一乳化液。
作为优选，邻硝基苄基丙烯酸酯修饰的葡聚糖采用如下的方法制备：将重量份38～43份的4-(4-(1-(丙烯酰氧基)乙基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸溶解在重量份9～12份的二甲基亚砜中，再添加重量份1～15份的N,N'-二环已基碳二亚胺和重量份0.05～0.1份的4-二甲基吡啶对甲磺酸盐得混合物，向混合物汇总添加重量份9～12份的葡萄糖质量浓度为60～90g/L的葡萄糖二甲基亚砜溶液，并在室温下搅拌24～48h，过滤后将绿叶放入透析管中，用二甲基亚砜和水进行透析，透析完成后，冷冻干燥得到邻硝基苄基丙烯酸酯修饰的葡聚糖。
作为优选，固化交联反应包括以下步骤：使用体积浓度为10％的醋酸水溶液调节第二乳化液的pH至4.5～5，之后将第二乳化液转移至冰水中水浴降温至15℃以下，随后向第二乳化液中加入转谷氨酰胺酶搅拌发生交联固化反应直至观察到有胶囊析出为止，所述固化时需保持100～200r/min的搅拌速度。
作为优选，添加转谷氨酰胺酶后需用质量浓度为10％的NaOH溶液调节pH至8～9。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明将枯草芽孢杆菌作为杀菌剂，纯天然污染，并将该杀菌剂制成了微胶囊，而且在微胶囊中添加了光敏物质邻硝基苄基丙烯酸酯修饰的葡聚糖，该微胶囊在接受光后，其壁材会破裂，使核心的枯草芽孢杆菌释放并生长繁殖，发挥了较好的生物活性，该发明中枯草芽孢杆菌的杀菌性能能得到较大的利用，解决了运输及储存过程中，菌活性已达最高，在后续施用后活性降低，杀菌效果差的问题。
具体实施方式
为了理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明。以下所述仅为本发明较好的实施例，仅仅用于描述本发明，不能理解为对本发明的范围的限制。应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明提供的枯草芽孢杆菌的光敏微胶囊杀菌剂通过如下所述的方法制备：
S1:将枯草芽孢杆菌的菌种经活化、摇床培养后，经高速离心形成菌浆，之后向菌浆中加入质量浓度为0.05％的吐温80溶液混合后形成菌悬液，其中，菌浆在吐温80溶液中的质量浓度为0.1g/mL。
S2:取质量比为1:1～3的明胶及阿拉伯胶溶解于无菌水中形成明胶质量浓度为0.5～2％的明胶水溶液及阿拉伯胶质量浓度为0.5～2％的阿拉伯胶水溶液，其中，
S3:向明胶水溶液中添加枯草芽孢杆菌的菌悬液，之后加入阿拉伯胶水溶液进行复凝聚反应，形成第一乳化液，其中枯草芽孢杆菌的菌悬液与阿拉伯胶及明胶总质量的质量比为1:1～3。
S4:在无光条件下，向第一乳化液中加入的邻硝基苄基丙烯酸酯修饰的葡聚糖并搅拌形成第二乳化液，所形成的的第二乳化液中，邻硝基苄基丙烯酸酯修饰的葡聚糖与明胶及阿拉伯胶质量总和的质量比为1:15。其中的邻硝基苄基丙烯酸酯修饰的葡聚糖采用如下方式制备：将重量份38～43份的4-(4-(1-(丙烯酰氧基)乙基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸溶解在重量份9～12份的二甲基亚砜中，再添加重量份1～15份的N,N'-二环已基碳二亚胺和重量份0.05～0.1份的4-二甲基吡啶对甲磺酸盐得混合物，向混合物汇总添加重量份9～12份的葡萄糖质量浓度为60～90g/L的葡萄糖二甲基亚砜溶液，并在室温下搅拌24～48h，过滤后将绿叶放入透析管中，用二甲基亚砜和水进行透析，透析完成后，冷冻干燥得到邻硝基苄基丙烯酸酯修饰的葡聚糖。
S5:使用体积浓度为10％的醋酸水溶液调节第二乳化液的pH至4.5～5，之后将第二乳化液转移至冰水中水浴降温至15℃以下，随后向第二乳化液中加入转谷氨酰胺酶搅拌15min，随后使用质量浓度为10％的NaOH溶液调节pH至8～9，随后发生交联固化反应直至观察到有胶囊析出为止，固化时需保持100～200r/min的搅拌速度。
S6:将微胶囊分散液经沉淀水洗后抽滤得到湿囊，将湿囊冷冻干燥后得到枯草芽孢杆菌的光敏微胶囊杀菌剂。
本发明以枯草芽孢杆菌作为杀菌有效物质，其在杀灭细菌方面具有较好的饿性质，此外，枯草芽孢杆菌的抗逆性最强、功能最多、适应性最广、效果最稳定。而且枯草芽孢杆菌对土壤中的菲与苯并芘有吸附和生物降解功能，有利于降解土壤汇总的此类剧毒化合物。因此，以枯草芽孢杆菌作为杀菌有效物质，不仅能够杀灭有害菌，还能改善土壤换环境，促进农作物生长。
该杀菌剂为光明微胶囊结构，在接触光后，其中的光敏材料邻硝基苄基丙烯酸酯修饰的葡聚糖会被降解，是囊壁破裂，最终使芯材枯草芽孢杆菌接触土壤环境，进行生长繁殖，从而发挥其作用，理论上能够在相同质量的枯草芽孢杆菌下，使杀菌效果达到最大化；解决了枯草芽孢杆菌在施用前就过度生长，导致活性下降的问题。因此，该杀菌剂在使用前应避光保存及运输，以使在使用时发挥其最大效力。此外，采用复合凝聚法制备微胶囊杀菌剂，具有操作简单、条件温和的优点。本发明的壁材选自明胶及阿拉伯胶，其为天然材料，具有无污染，不会造成环境负担的优点。
实施例1
S11:将枯草芽孢杆菌的菌种经活化、摇床培养后，经高速离心形成菌浆，之后向1质量份的菌浆中加入10质量份的质量浓度为0.05％的吐温80溶液中混合后形成菌悬液。
S12:取0.5质量份的明胶及0.5质量份的阿拉伯胶分别溶解于200质量份的无菌水中形成明胶质量浓度为0.5％的明胶水溶液及阿拉伯胶水溶液。
S13:向明胶水溶液中添加枯草芽孢杆菌的菌悬液，之后加入阿拉伯胶水溶液进行复凝聚反应，形成第一乳化液。
S14:在无光条件下，向第一乳化液中加入0.07质量份的邻硝基苄基丙烯酸酯修饰的葡聚糖并搅拌形成第二乳化液，其中的邻硝基苄基丙烯酸酯修饰的葡聚糖采用如下方式制备：将质量份38份的4-(4-(1-(丙烯酰氧基)乙基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸溶解在质量份9份的二甲基亚砜中，再添加质量份1份的N,N'-二环已基碳二亚胺和质量份0.05份的4-二甲基吡啶对甲磺酸盐得混合物，向混合物中添加质量份9份的葡萄糖质量浓度为60g/L的葡萄糖二甲基亚砜溶液，并在室温下搅拌24h，过滤后将绿叶放入透析管中，用二甲基亚砜和水进行透析，透析完成后，冷冻干燥得到邻硝基苄基丙烯酸酯修饰的葡聚糖。
S15:使用体积浓度为10％的醋酸水溶液调节第二乳化液的pH至4.5，之后将第二乳化液转移至冰水中水浴降温至15℃以下，随后向第二乳化液中加入0.0005质量份的转谷氨酰胺酶搅拌15min，随后使用质量浓度为10％的NaOH溶液调节pH至8，随后发生交联固化反应直至观察到有胶囊析出为止，固化时需保持100r/min的搅拌速度。
S16:将微胶囊分散液经沉淀水洗后抽滤得到湿囊，将湿囊冷冻干燥后得到枯草芽孢杆菌的光敏微胶囊杀菌剂。
实施例2
S21:将枯草芽孢杆菌的菌种经活化、摇床培养后，经高速离心形成菌浆，之后向1.5质量份的菌浆中加入15质量份的质量浓度为0.05％的吐温80溶液中混合后形成菌悬液。
S22:取1质量份的明胶溶解于100质量份的无菌水中形成明胶质量浓度为1％的明胶水溶液，取2质量份的阿拉伯胶分别溶解于200质量份的无菌水中形成明胶质量浓度为1％的阿拉伯胶水溶液。
S23:向明胶水溶液中添加枯草芽孢杆菌的菌悬液，之后加入阿拉伯胶水溶液进行复凝聚反应，形成第一乳化液。
S24:在无光条件下，向第一乳化液中加入0.2质量份的邻硝基苄基丙烯酸酯修饰的葡聚糖并搅拌形成第二乳化液，其中的邻硝基苄基丙烯酸酯修饰的葡聚糖采用如下方式制备：将质量份40份的4-(4-(1-(丙烯酰氧基)乙基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸溶解在质量份11份的二甲基亚砜中，再添加质量份8份的N,N'-二环已基碳二亚胺和质量份0.07份的4-二甲基吡啶对甲磺酸盐得混合物，向混合物中添加质量份11份的葡萄糖质量浓度为80g/L的葡萄糖二甲基亚砜溶液，并在室温下搅拌24h，过滤后将绿叶放入透析管中，用二甲基亚砜和水进行透析，透析完成后，冷冻干燥得到邻硝基苄基丙烯酸酯修饰的葡聚糖。
S25:使用体积浓度为10％的醋酸水溶液调节第二乳化液的pH至5，之后将第二乳化液转移至冰水中水浴降温至15℃以下，随后向第二乳化液中加入0.0015质量份的转谷氨酰胺酶搅拌15min，随后使用质量浓度为10％的NaOH溶液调节pH至9，随后发生交联固化反应直至观察到有胶囊析出为止，固化时需保持150r/min的搅拌速度。
S26:将微胶囊分散液经沉淀水洗后抽滤得到湿囊，将湿囊冷冻干燥后得到枯草芽孢杆菌的光敏微胶囊杀菌剂。
实施例3
S31:将枯草芽孢杆菌的菌种经活化、摇床培养后，经高速离心形成菌浆，之后向1.3质量份的菌浆中加入13质量份的质量浓度为0.05％的吐温80溶液中混合后形成菌悬液。
S32:取1质量份的明胶溶解于50质量份的无菌水中形成明胶质量浓度为2％的明胶水溶液，取3质量份的阿拉伯胶分别溶解于150质量份的无菌水中形成明胶质量浓度为2％的阿拉伯胶水溶液。
S33:向明胶水溶液中添加枯草芽孢杆菌的菌悬液，之后加入阿拉伯胶水溶液进行复凝聚反应，形成第一乳化液。
S34:在无光条件下，向第一乳化液中加入0.27质量份的邻硝基苄基丙烯酸酯修饰的葡聚糖并搅拌形成第二乳化液，其中的邻硝基苄基丙烯酸酯修饰的葡聚糖采用如下方式制备：将质量份43份的4-(4-(1-(丙烯酰氧基)乙基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸溶解在质量份12份的二甲基亚砜中，再添加质量份15份的N,N'-二环已基碳二亚胺和质量份0.1份的4-二甲基吡啶对甲磺酸盐得混合物，向混合物中添加质量份12份的葡萄糖质量浓度为80g/L的葡萄糖二甲基亚砜溶液，并在室温下搅拌24h，过滤后将绿叶放入透析管中，用二甲基亚砜和水进行透析，透析完成后，冷冻干燥得到邻硝基苄基丙烯酸酯修饰的葡聚糖。
S35:使用体积浓度为10％的醋酸水溶液调节第二乳化液的pH至5，之后将第二乳化液转移至冰水中水浴降温至15℃以下，随后向第二乳化液中加入0.002质量份的转谷氨酰胺酶搅拌15min，随后使用质量浓度为10％的NaOH溶液调节pH至9，随后发生交联固化反应直至观察到有胶囊析出为止，固化时需保持150r/min的搅拌速度。
S36:将微胶囊分散液经沉淀水洗后抽滤得到湿囊，将湿囊冷冻干燥后得到枯草芽孢杆菌的光敏微胶囊杀菌剂。
防治效果测试
通过在田间施用杀菌剂，并通过观察施药7天及30天的防治效果及比对空白对照组的水稻病态情况进行防治效果测试，实验前，向田间抑制相同数量的患有水稻纹枯病的植株以控制变量，防治效果通过如下所述的公式进行比较。实施例及对比例均避光保存。
防治效果(％)＝(X0-X1)/X0×100
式中，X0为空白对照组的病株数，X1为实施例及对比例的病株数。
该防治效果测试中对比例1为空白对照组，对比例2为施用枯草芽孢杆菌的对比组，对比例3为在实施例1的基础上不添加邻硝基苄基丙烯酸酯修饰的葡聚糖的对比例。
表1
由表1可以看出，通过对比实施例及对比例2，本发明提供的杀菌剂的杀菌效果明显，表明，以微胶囊的形式制备杀菌剂能够有效的提升杀菌剂的杀菌效果。哦通过对比实施例及对比例3，可以看到，实施例的杀菌剂依旧有较优的杀菌效果，表明实施例的杀菌剂的生物活性较高，能够保证枯草芽孢杆菌的活性，也表明了在施用时，使微胶囊破裂，能过有效的保证细菌活性，证明了添加光明物质邻硝基苄基丙烯酸酯修饰的葡聚糖，在使用时使微胶囊破裂能够有效的提升植物农药杀菌剂的杀菌效果。
以上，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；凡本行业的普通技术人员均可按说明书所示和以上而顺畅地实施本发明；但是,凡熟悉本专业的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时,凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变等，均仍属于本发明的技术方案的保护范围之内。
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