发明详述

I.概述

本发明提供了用于控制一种或多种植物害虫和/或用于改善至少一种目标农艺性状的组合物和方法。生物试剂、生物控制试剂、细菌菌株、经修饰的细菌菌株、经修饰的生物试剂、或经修饰的生物控制试剂或者其活性变体在本文中用于描述微生物有机体，该微生物有机体用于控制植物害虫和/或改善至少一种目标农艺性状。

II.细菌菌株

本发明提供多种生物控制试剂或细菌菌株，其可以用于控制一种或多种植物害虫和/或改善至少一种目标农艺性状。此类细菌菌株包括AIP045885(绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)菌株)、AIP075655(绿针假单胞菌菌株)、AIP009474(枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilus)菌株)、AIP0024525(苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)菌株)、AIP033287(枯草芽孢杆菌菌株)、AIP0093798(枯草芽孢杆菌菌株)、AIP061639(绿针假单胞菌菌株)、AIP082862(绿针假单胞菌菌株)、AIP058187(绿针假单胞菌菌株)、AIP059286(绿针假单胞菌菌株)和AIP036706(绿针假单胞菌菌株)。本发明提供了包括AIP045885、AIP075655、AIP09474、AIP024525、AIP033287、AIP093798、AIP061639、AIP082862、AIP058187、AIP059286和AIP036706的一种或多种的细胞群体，以及由这些菌株的每一种衍生的孢子的群体，或者其任何制备物。

因此，本文提供的多种细菌菌株和/或杀虫组合物包含细胞群体作为活性成分，所述细胞群体包括AIP045885、AIP075655、AIP09474、AIP024525、AIP033287、AIP093798、AIP061639、AIP082862、AIP058187、AIP059286和AIP036706中的一种或多种，或其中任何菌株的活性变体。

AIP045885于2018年8月3日保藏于the Patent Depository of the NationalCenter for Agricultural Utilization Research Agricultural Research Service,U.S.Department of Agriculture，1815 North University Street,Peoria，Illinois61604U.S.A，并且编号为NRRL No.B-67650。

AIP075655于2018年8月3日保藏于the Patent Depository of the NationalCenter for Agricultural Utilization Research Agricultural Research Service,U.S.Department of Agriculture，1815 North University Street,Peoria，Illinois61604U.S.A，并且编号为NRRL No.B-67651。

AIP09474于2018年8月3日保藏于the Patent Depository of the NationalCenter for Agricultural Utilization Research Agricultural Research Service,U.S.Department of Agriculture，1815 North University Street,Peoria，Illinois61604 U.S.A，并且编号为NRRL No.B-67657。

AIP024525于2018年8月3日保藏于the Patent Depository of the NationalCenter for Agricultural Utilization Research Agricultural Research Service,U.S.Department of Agriculture，1815 North University Street,Peoria，Illinois61604 U.S.A，并且编号为NRRL No.B-67661。

AIP033287于2018年8月3日保藏于the Patent Depository of the NationalCenter for Agricultural Utilization Research Agricultural Research Service,U.S.Department of Agriculture，1815 North University Street,Peoria，Illinois61604 U.S.A，并且编号为NRRL No.B-67659。

AIP093798于2018年8月3日保藏于the Patent Depository of the NationalCenter for Agricultural Utilization Research Agricultural Research Service,U.S.Department of Agriculture，1815 North University Street,Peoria，Illinois61604 U.S.A，并且编号为NRRL No.B-67660。

AIP061639于2018年8月3日保藏于the Patent Depository of the NationalCenter for Agricultural Utilization Research Agricultural Research Service,U.S.Department of Agriculture，1815 North University Street,Peoria，Illinois61604 U.S.A，并且编号为NRRL No.B-67654。

AIP082862于2018年8月3日保藏于the Patent Depository of the NationalCenter for Agricultural Utilization Research Agricultural Research Service,U.S.Department of Agriculture，1815 North University Street,Peoria，Illinois61604 U.S.A，并且编号为NRRL No.B-67656。

AIP058187于2018年8月3日保藏于the Patent Depository of the NationalCenter for Agricultural Utilization Research Agricultural Research Service,U.S.Department of Agriculture，1815 North University Street,Peoria，Illinois61604 U.S.A，并且编号为NRRL No.B-67655。

AIP059286于2018年8月3日保藏于the Patent Depository of the NationalCenter for Agricultural Utilization Research Agricultural Research Service,U.S.Department of Agriculture，1815 North University Street,Peoria，Illinois61604 U.S.A，并且编号为NRRL No.B-67653。

AIP036706于2018年8月3日保藏于the Patent Depository of the NationalCenter for Agricultural Utilization Research Agricultural Research Service,U.S.Department of Agriculture，1815 North University Street,Peoria，Illinois61604 U.S.A，并且编号为NRRL No.B-67652。

上述鉴定的每一种保藏物都是根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约(the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit ofMicroorganisms for the Purposes of Patent Procedure)的条款维持的。每一种保藏物仅是为了便于本领域技术人员而准备的，并非承认保藏物是根据35U.S.C.§112条款所需要的。

术语“分离的”涵盖了这样的细菌、孢子、其他实体或物质，它们已经⑴与其在最初产生时(无论是天然的或者是实验背景下)相关的至少一些组分分离，和/或(2)通过人工方式产生、制备、纯化和/或制造。分离的细菌可以与它们初始相关的其他组分的至少大约10％、大约20％、大约30％、大约40％、大约50％、大约60％、大约70％、大约80％、大约90％或更高分离。

如本文所用，如果物质基本不含其他组分，则该物质是“纯的”。术语“纯化”、“经纯化”和“纯化的”是指这样的细菌、孢子或其他材料，它们已经与在其最初产生或生成时(例如无论是天然的或者是实验背景下)、或者在其最初产生后的任何时间期间与其相关的至少一些组分分离。如果细菌、孢子、细菌群体或孢子群体在产生时或者在产生后是分离的(例如从包含细菌或细菌群体或孢子的材料或环境)，可以认为该细菌或孢子或细菌群体或孢子群体是纯化的，并且纯化的细菌或细菌群体或孢子可以包含多至大约10％、大约20％、大约30％、大约40％、大约50％、大约60％、大约70％、大约80％、大约90％或高于大约90％的其他材料，并且仍然认为是纯化的。在一些实施方案中，纯化的细菌或孢子以及细菌群体或孢子群体是高于大约80％、大约85％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或者高于大约99％纯的。在具体的实施方案中，细菌培养物不包含可以通过正常的细菌学技术检测的量的其他细菌物种。

在一些实施方案中，本发明的组合物包含细菌菌株AIP045885、AIP075655、AIP09474、AIP024525、AIP033287、AIP093798、AIP061639、AIP082862、AIP058187、AIP059286或AIP036706的基本上纯的培养物。本发明的组合物还提供了细菌菌株AIP045885、AIP075655、AIP09474、AIP024525、AIP033287、AIP093798、AIP061639、AIP082862、AIP058187、AIP059286或AIP036706的基本上纯的培养物的后代，其中所述培养物分别具有AIP045885、AIP075655、AIP09474、AIP024525、AIP033287、AIP093798、AIP061639、AIP082862、AIP058187、AIP059286或AIP036706的所有生理和形态特征。“群体”是指包含2个或更多个(即10、100、1,000、10,000、1x10⁶、1x10⁷、或1x10⁸或更高)个体的组或集合。本文提供了包含至少一种细菌菌株的群体或来自多于一种细菌菌株的个体的混合群体的多种组合物。在具体的实施方案中，至少一种细菌菌株(即AIP045885、AIP075655、AIP09474、AIP024525、AIP033287、AIP093798、AIP061639、AIP082862、AIP058187、AIP059286和AIP036706或者其中任何菌株的活性变体的细胞；或者由AIP045885、AIP075655、AIP09474、AIP024525、AIP033287、AIP093798、AIP061639、AIP082862、AIP058187、AIP059286和AIP036706或者其中任何菌株的活性变体的一种或多种形成的孢子或前孢子或者细胞、前孢子和/或孢子的组合)的群体包含至少大约10⁵CFU/ml至大约10¹¹CFU/ml、大约10⁵CFU/ml至大约10¹⁰CFU/ml、大约10⁵CFU/ml至大约10¹²CFU/ml、大约10⁵CFU/ml至大约10⁶CFU/ml、大约10⁶CFU/ml至大约10⁷CFU/ml、大约10⁷CFU/ml至大约10⁸CFU/ml、大约10⁸CFU/ml至大约10⁹CFU/ml、大约10⁹CFU/ml至大约10¹⁰CFU/ml、大约10¹⁰CFU/ml至大约10¹¹CFU/ml、大约10¹¹CFU/ml至大约10¹²CFU/ml的浓度。在其他实施方案中，本文提供的细菌菌株或其活性变体的浓度包括至少大约10⁵CFU/ml、至少大约10⁶CFU/ml、至少大约10⁷CFU/ml、至少大约10⁸CFU/ml、至少大约10⁹CFU/ml、至少大约10¹⁰CFU/ml、至少大约10¹¹CFU/ml或至少大约10¹²CFU/ml。

“孢子”是指细菌物种的至少一种休眠的(在应用时)但是有活性的生殖单元。从AIP045885、AIP075655、AIP09474、AIP024525、AIP033287、AIP093798、AIP061639、AIP082862、AIP058187、AIP059286和AIP036706(或者其中任何菌株的变体)中的每一种形成孢子的非限制性方法在本文的其他处公开。进一步认识到本文公开的群体可以包含营养细胞(vegetative cell)和前孢子(孢子形成的中间阶段的细胞)的组合；前孢子和孢子的组合；或者前孢子、营养细胞和/或孢子的组合。

如本文所用，“衍生自”是指直接从特定来源分离或获得，或者替代地具有从特定来源分离或获得的物质或生物体的鉴定特征。在“来源”是生物体的情况下，“衍生自”是指可以其可以从所述生物体本身或用于培养或生长所述生物体的培养肉汤、悬浮液或介质中分离或获得。“衍生自”或“可从……获得”的化合物或组合物是指所述化合物或组合物可以从细胞培养物或全细胞肉汤或者从细胞培养物或全细胞肉汤衍生的悬浮液、滤液、上清液、级分或提取物中分离或生产。

如本文所用，“全肉汤培养物”或“全细胞肉汤”是指包含细胞和培养基两者的液体培养物。如果细菌在平板上生长，则可以在水或其他液体的全培养物中收获细胞。术语“全肉汤培养物”和“全细胞肉汤”可互换使用。

如本文所用，“上清液”是指当细胞在肉汤中生长或从琼脂平板中收获到另一种液体中并通过离心、过滤、沉降或本领域公知的其他手段除去时，残留的液体。在一些实施方案中，上清液可以用另一种组合物稀释，例如水、缓冲剂、新鲜培养基和/或制剂。稀释的上清液仍被认为是本发明的上清液。

如本文所用，“滤液”是指来自全肉汤培养物的已经通过膜的液体。与全肉汤培养物或上清液中有效化合物或代谢产物的浓度相比，滤液可包含浓缩量的有效化合物或代谢产物。如本文所用，“提取物”是指通过溶剂(例如水、去污剂、缓冲剂和/或有机溶剂)从细胞中取出并通过离心、过滤或本领域已知的其他方法与细胞分离的液体物质。与提取前细胞中有效化合物或代谢物的浓度相比，提取物可包含浓缩量的所述有效化合物或代谢物。可替代地，滤液或提取物然后可以用另一种组合物稀释，例如水、缓冲剂、新鲜培养基和/或制剂。这种稀释的滤液或提取物仍被认为是本发明的滤液和提取物。

如本文所用，“代谢物”是指细菌菌株(即AIP045885、AIP075655、AIP09474、AIP024525、AIP033287、AIP093798、AIP061639、AIP082862、AIP058187、AIP059286、AIP036706或其中任何菌株的活性变体中的至少一种)的发酵的化合物、物质或副产物。有效化合物或代谢物是存在于上清液、全细胞肉汤或细菌菌株中的化合物，当将其以有效量应用于目标植物时，可以改善植物的任何目标农艺性状，或控制引起植物疾病的植物害虫或植物病原体。

在一些实施方案中，本发明的组合物包含衍生自细菌菌株发酵的滤液或提取物，其中与所述细菌菌株的全细胞肉汤或上清液中的量相比，所述组合物包含浓缩量的有效化合物或代谢物，其中所述细菌是AIP045885、AIP075655、AIP09474、AIP024525、AIP033287、AIP093798、AIP061639、AIP082862、AIP058187、AIP059286、AIP036706或其中任何菌株的活性变体中的至少一种。在其他实施方案中，本发明的组合物包含衍生自细菌菌株发酵的稀释的滤液、稀释的提取物或稀释的上清液，其中与所述细菌菌株的全细胞肉汤或未稀释上清液的量相比，所述组合物包含稀释量的所述有效化合物或代谢产物，其中所述细菌是AIP045885、AIP075655、AIP09474、AIP024525、AIP033287、AIP093798、AIP061639、AIP082862、AIP058187、AIP059286、AIP036706或其中任何菌株的活性变体中的至少一种。所述稀释的滤液、稀释的提取物或稀释的上清液仍可以包含有效量的所述有效化合物或代谢产物。

本文所述的组合物和方法包含或衍生自细菌菌株(即AIP045885、AIP075655、AIP09474、AIP024525、AIP033287、AIP093798、AIP061639、AIP082862、AIP058187、AIP059286、AIP036706或其中任何菌株的活性变体中的至少一种，或者来自AIP045885、AIP075655、AIP09474、AIP024525、AIP033287、AIP093798、AIP061639、AIP082862、AIP058187、AIP059286、AIP036706或其中任何菌株的活性变体中任何一种的孢子或前孢子或者细胞、前孢子或/和孢子的组合)。方法包括培养这些细菌菌株中的至少一种。在一些实施方案中，培养这些细菌菌株中的至少一种，并通过从这些细菌菌株中至少一种的培养物中分离这些化合物和/或组合物来获得所述化合物和/或组合物。

在一些实施方案中，使用本领域已知的方法在营养培养基中培养至少一种细菌菌株。所述细菌菌株可以通过摇瓶培养或通过在合适的培养基中并在允许细菌细胞生长的条件下在实验室或工业发酵罐中进行的小规模或大规模发酵(包括但不限于连续、分批、补料分批或固态发酵)进行培养。可以使用本领域已知的程序在包含碳和氮源以及无机盐的合适的营养培养基中进行培养。合适的培养基可从商业来源获得或根据本领域公知的出版物制备。

培养后，可以从培养肉汤中提取化合物、代谢物和/或组合物。提取物可以通过色谱法进行分级分离。提取物可以使用本领域众所周知的方法进一步纯化。提取物也可以使用本领域众所周知的方法进行稀释。

包含细菌菌株(即AIP045885、AIP075655、AIP09474、AIP024525、AIP033287、AIP093798、AIP061639、AIP082862、AIP058187、AIP059286、AIP036706或其中任何菌株的活性变体中的至少一种，或者衍生自AIP045885、AIP075655、AIP09474、AIP024525、AIP033287、AIP093798、AIP061639、AIP082862、AIP058187、AIP059286、AIP036706或其中任何菌株的活性变体中的任何一种的孢子或前孢子或者细胞、前孢子和/或孢子的组合)的细胞的组合物可以进一步包含农业上可接受的载体。术语“农业上可接受的载体”旨在包括有助于将组合物应用于预定对象(即，易感由植物害虫引起的损害或疾病的植物或植物部分或者用于改善目标农艺性状的植物或植物部分)的任何材料。用于应用于植物和植物部位的组合物中使用的载体优选地是非植物毒性的或仅是轻度植物毒性的。取决于所需的制剂，合适的载体可以是固体、液体或气体。在一个实施方案中，载体包括极性或非极性液体载体，例如水、矿物油和植物油。其他载体在本文其他处公开。

A.细菌菌株的活性变体

本发明进一步提供了AIP045885、AIP075655、AIP09474、AIP024525、AIP033287、AIP093798、AIP061639、AIP082862、AIP058187、AIP059286和AIP036706的活性变体。此类变体将保留控制一种或多种植物害虫或者改善植物的一种或多种目标农艺性状的能力。因此，在一些实施方案中，本文提供的细菌菌株的活性变体将保留针对植物害虫的杀虫活性。如本文所用，“杀虫活性”是指针对一种或多种害虫的活性，从而杀灭或控制害虫，所述害虫包括昆虫、真菌、细菌、线虫、病毒或类病毒、原生动物病原体等。在一些实施方案中，变体将保留控制一种或多种昆虫害虫或线虫害虫的能力。在特定实施方案中，变体将保留控制鞘翅目害虫的能力，包括玉米根虫(例如，西方玉米根虫)、科罗拉多马铃薯甲虫、象鼻虫(例如，甘薯象鼻虫)或半翅目昆虫害虫。

本文提供的多种细菌菌株的活性变体包括例如AIP045885、AIP075655、AIP09474、AIP024525、AIP033287、AIP093798、AIP061639、AIP082862、AIP058187、AIP059286和AIP036706的任何分离物或突变体。

术语“突变体”是指亲本株的变体以及用于获得其中杀虫活性大于由亲本株表达的杀虫活性的突变体或变体的方法。“亲本株”是诱变之前的原始株。为了获得这样的突变体，可以用诸如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍、乙基甲砜(EMS)之类的化学剂，或者通过使用γ射线，x射线或UV辐照的辐照，或者通过其他本领域公知的手段处理亲本株。

在一些实施方案中，相对于保藏的菌株，所述活性变体在至少一个基因中至少包含突变。所述基因可能在例如生物膜形成、运动性、趋化性、细胞外分泌，转运(例如ABC转运蛋白)、应激应答、挥发物、转录(例如替代的sigma因子和全局转录调节子)、根定殖，刺激植物中诱导的全身抗性的能力和/或次级代谢(包括脂肽、聚酮化合物、大分子水解酶(例如蛋白酶和/或糖酶)和/或抗微生物化合物(包括抗生素)的合成)中起作用。次级代谢是指抗微生物化合物，包括环状脂肽、聚酮化合物、伊枯草菌素(iturins)、细菌素(例如植物唑啉和淀粉环素)和二肽(例如杆菌肽)的非核糖体和核糖体合成。

活性变体的实例是细菌菌株AIP045885、AIP075655、AIP09474、AIP024525、AIP033287、AIP093798、AIP061639、AIP082862、AIP058187、AIP059286或AIP036706的细胞，其中所述细胞进一步包含在swrA基因中导致丧失功能的突变。影响生物膜形成的swrA突变(Kearns等人，Molecular Microbiology(2011)52(2)：357-369)可导致本发明菌株的活性变体，其具有增强的控制植物害虫或改善植物的目标农艺性状的能力。其他与生物膜形成有关的基因，例如sfp、epsC、degQ和称为rapP的质粒基因(参见例如McLoon等人，J ofBacteriology，(2011)193(8)：2027-2034)也可以在本发明的细菌菌株的活性变体中突变。

在具体的实施方案中，所述细菌菌株与杀生物剂是相容的。杀生物剂是能够通过化学或生物手段对有机体发挥控制作用的化学物质。杀生物剂包括杀虫剂，例如杀真菌剂或杀昆虫剂；除草剂；其他的农作物保护化学品等。此类化合物在本发明的其他处详细讨论。当细菌菌株能够在有效量的目标杀生物剂存在下生存和/或生殖时，该细菌菌株与杀生物剂是相容的。在其中细菌菌株与目标杀生物剂不相容的情况下，如果需要，可以采取方法对所述细菌菌株进行修饰，以赋予目标相容性。用于产生经修饰的细菌菌株的此类方法包括选择技术和/或转化技术两者。

“经修饰的细菌菌株”是指其中菌株经已被修饰(通过选择和/或转化)而具有一种或多种其他目标性状的群体。在一些情况下，所述经修饰的细菌菌株包括AIP045885、AIP075655、AIP09474、AIP024525、AIP033287、AIP093798、AIP061639、AIP082862、AIP058187、AIP059286和AIP036706或其中任何菌株的活性变体中的任意一种。在具体的实施方案中，所述经修饰的细菌菌株与目标杀生物剂是相容的，包括但不限于对除草剂、杀真菌剂、杀虫剂或其他的农作物保护化学品的抗性。经修饰的杀生物剂抗性的菌株具有与原始的易感性菌株相同的鉴定特征，除了它们对所述特定的除草剂、杀真菌剂、杀虫剂或其他农作物保护化学品具有更显著的抗性。通过与已知的敏感菌株的特征比较，它们的鉴定是容易可行的。因此，本发明提供了经修饰的细菌菌株的分离的群体。

对杀生物剂的抗性(例如对除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀虫剂或其他的农作物保护化学品的抗性)的增强是指有机体(即，细菌细胞或孢子)在暴露于一定剂量的杀生物剂(例如除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀虫剂或其他的农作物保护化学品)后生存和繁殖的能力，其中所述剂量在正常情况下对于未修饰的有机体是致死性的或者实质上降低未修饰的有机体的生长。在具体的实施方案中，对杀生物剂抗性的增强是在农业有效量的杀生物剂的存在下证明的。

在这种情况下，对一种或多种杀生物剂具有抗性的经修饰的细菌菌株可以用于增强细菌菌株特别地相对于对除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀虫剂或其他农作物保护化学品不具有抗性的其他微生物试剂的竞争性。因此，本发明提供的组合物包括选择的或工程化的细菌菌株和经修饰的细菌菌株群体。这些细菌菌株或经修饰的细菌菌株可以用作植物的接种物。它们还可以用作喷洒施用直接应用于植物的空气中部分或作为种子涂层进行应用，并且可以与除草剂或所述菌株已被修饰而对其已变得耐受的其他化学品混合。

因此，本发明公开的细菌菌株的活性变体包括例如经修饰的菌株，使得活性变体控制植物害虫，并进一步能够在至少一种杀生物剂存在下生长。可以通过基因工程技术制备对除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀虫剂或其他的农作物保护化学品具有抗性的重组细菌菌株，并且此类改造的或重组的细菌菌株生长从而产生经修饰的细菌菌株群体。通过转化将多核苷酸引入细菌宿主中而产生重组细菌菌株。用于转化微生物有机体的方法是本领域已知且可利用的。通常参见Hanahan,D.(1983)Studies on transformation ofEscherichia coli with plasmids J.MoI.Biol.166,557-77；Seidman，C.E.(1994)In:Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel,F.M.等人eds.,John Wiley andSons,NY；Choi等人(2006)J.Microbiol.Methods 64:391-397；Wang等人2010.J.Chem.Technol.Biotechnol.85:775-778。转化可以通过实验室中由感受态细胞从其环境自然吸收裸DNA而发生。可替代地，细胞可以通过在冷的条件下暴露于二价阳离子、通过电穿孔、通过暴露于聚乙二醇、通过使用纤维状纳米颗粒处理或者通过本领域公知的其他方法形成感受态。

用于转化重组细菌菌株的除草剂抗性基因包括但不限于伏马菌素脱毒基因(美国专利号5,792,931)；乙酰乳酸合酶(ALS)突变体，其导致除草剂抗性，特别是磺脲型除草剂，例如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶的抑制剂，例如草丁膦或basta(例如bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因)；gluphosinate和HPPD抗性(WO 96/38576、美国专利号6,758,044；7,250,561；7,935,869和8,124,846)或者本领域已知的其他此类基因。WO 96/38576；美国专利号5,792,931；美国专利号6,758,044；美国专利号7,250,561；美国专利号7,935,869和美国专利号8,124,846的公开内容以引用方式并入本文。bar基因编码对除草剂basta的抗性，nptII基因编码对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，而ALS基因突变体编码对磺脲除草剂(包括氯磺隆、甲磺隆、嘧磺隆、烟嘧磺隆、玉嘧磺隆、啶嘧磺隆、磺酰磺隆和醚苯磺隆)和对imadizolinone除草剂(包括咪唑乙烟酸、咪唑喹啉酸、咪唑烟酸和咪草酯)的抗性。

为了通过选择鉴定并产生经修饰的细菌菌株群体，使所述细菌菌株在除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀虫剂或其他的农作物保护化学品(作为选择压力)存在下生长。易感者(Susceptible agent)被杀死，而抗性者(resistant agent)在没有竞争的情况下生存而生殖。当细菌菌株在除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀虫剂或其他的农作物保护化学品存在下生长时，抗性细菌菌株成功地生殖，并且在群体中占优势，成为经修饰的细菌菌株群体。用于选择抗性菌株的方法是已知的，并且包括美国专利号4,306,027和4,094,097，这些文献以引用方式并入本文。所述细菌菌株的活性变体(包括经修饰的细菌菌株群体)具有与原始敏感菌株相同的鉴定特征，除了它们对特定的除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀虫剂或其他农作物保护化学品有更显著的耐受性。因此，通过与已知的敏感菌株的特征比较，它们的鉴定是容易可行的。

本文提供的多种细菌的其他活性变体可以通过采用以下方法鉴定，例如测定16S核糖体RNA之间的序列一致性的相关性(sequence identity relatedness)的方法，鉴定几组衍生的和功能一致的或接近一致的菌株的方法，包括多基因座序列分型(MLST)，连锁共享基因树，全基因组比对(WGA)，平均核苷酸一致性和MinHash(Mash)距离度量。

在一个方面中，细菌菌株AIP045885、AIP075655、AIP09474、AIP024525、AIP033287、AIP093798、AIP061639、AIP082862、AIP058187、AIP059286和AIP036706的活性变体包括通过使用Bishop等人(2009)BMC Biology 7(1)1741-7007-7-3中定义的有机体分类的Bishop MLST方法与所述公开的任意菌株密切相关的菌株。因此，在具体的实施方案中，本文公开的细菌菌株的活性变体包括使用Bishop等人(2009)BMC Biology 7(1)1741-7007-7-3中列出的有机体分类的Bishop方法落入至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、98.8％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列临界值内的细菌菌株，其中所述文献以引用方式全文并入本文。通过此类方法鉴定的细菌的活性变体在以有效量应用于植物、植物部分或栽培地区时，将保留控制至少一种植物害虫和/或改善至少一种农艺性状的能力，包括例如减少植物害虫、降低植物害虫的感染和/或增加害虫抗性包括昆虫害虫抗性(例如鞘翅目昆虫例如西方玉米根虫、科罗拉多马铃薯甲虫和/或甘薯象鼻虫)。

在另一个方面中，本文公开的细菌菌株的活性变体包括基于有机体分类的平均核苷酸一致性(ANI)方法与任意所述公开的菌株密切相关的菌株。ANI(例如参见Konstantinidis，K.T.,等人，(2005)PNAS USA 102(7):2567-72；和Richter,M.,等人，(2009)PNAS 106(45):19126-31)和变体(例如参见Varghese,N.J.，等人,Nucleic AcidsResearch(July 6,2015)：gkv657)是基于WGA中比对的菌株基因组之间共有的平均核苷酸的总和。因此，在具体的实施方案中，本文公开的细菌菌株AIP045885、AIP075655、AIP09474、AIP024525、AIP033287、AIP093798、AIP061639、AIP082862、AIP058187、AIP059286和AIP036706的活性变体包括使用Konstantinidis,K.T.，等人·，(2005)PNASUSA102(7):2567-72中列出的有机体分类的ANI方法落入至少90％、95％、96％、97％、97.5％、98％、98.5％、98.8％、99％、99.5％或99.8％序列临界值内的细菌菌株，其中所述文献以引用方式全文并入本文。通过此类方法鉴定的细菌的活性变体在以有效量应用于植物、植物部分或栽培地区时，将保留控制至少一种植物害虫和/或改善至少一种农艺性状的能力，包括例如减少植物害虫、降低植物害虫的感染和/或增加害虫抗性包括昆虫害虫抗性(例如鞘翅目昆虫例如西方玉米根虫、科罗拉多马铃薯甲虫和/或甘薯象鼻虫)。

在另一个方面中，本文公开的分离的细菌菌株的活性变体包括基于16S rDNA序列一致性与上述任意菌株密切相关(例如与AIP045885、AIP075655、AIP09474、AIP024525、AIP033287、AIP093798、AIP061639、AIP082862、AIP058187、AIP059286或AIP036706密切相关)的菌株。关于用于测定细菌相关性的16S rDNA序列一致性的用途，参见StackebrandtE,等人,“Report of the ad hoc committee for the re-evaluation of the speciesdefinition in bacteriology,”Int J Syst Evol Microbiol.52(3):1043-7(2002)。在一个实施方案中，活性变体基于16S rDNA序列一致性与上述任意菌株是至少95％一致的，基于16S rDNA序列一致性与上述任意菌株是至少96％一致的，基于16S rDNA序列一致性与上述任意菌株是至少97％一致的，基于16S rDNA序列一致性与上述任意菌株是至少98％一致的，基于16S rDNA序列一致性与上述任意菌株是至少98.5％一致的，基于16S rDNA序列一致性与上述任意菌株是至少99％一致的，基于16S rDNA序列一致性与上述任意菌株是至少99.5％一致的，或者基于16S rDNA序列一致性与上述任意菌株是至少100％一致的。通过此类方法鉴定的细菌的活性变体在以有效量应用于植物、植物部分或栽培地区时，将保留控制至少一种植物害虫和/或改善至少一种农艺性状的能力，包括例如减少植物害虫、降低植物害虫的感染和/或增加害虫抗性包括昆虫害虫抗性(例如鞘翅目昆虫例如西方玉米根虫、科罗拉多马铃薯甲虫和/或甘薯象鼻虫)。

The MinHash(Mash)距离度量是一种比较方法，其以高分辨率定义了用于微生物有机体的层次分类的阈值，并需要少量参数和步骤(Ondov等人(2016)Genome Biology 17:132)。Mash距离从其MinHsh草图直接估计两个序列之间的突变率(Ondov等人(2016)GenomeBiology 17:132)。Mash距离强烈地对应于用于层次分类的平均核苷酸一致性方法(ANI)(参见Konstantinidis，K.T.等人(2005)PNAS USA 102(7):2567-72，该文献以引用方式全文并入本文)。换言之，97％的ANI大致等于0.03的Mash距离，使得ANI文献中作为有用的分类阈值提出的值可以与Mash距离直接应用。

本文公开的细菌菌株的活性变体包括基于全基因组DNA序列之间的Minhash(Mash)距离与AIP045885、AIP075655、AIP09474、AIP024525、AIP033287、AIP093798、AIP061639、AIP082862、AIP058187、AIP059286或AIP036706密切相关的菌株。因此，在具体的实施方案中，本文公开的细菌菌株的活性变体包括具有与公开的菌株的Mash距离小于大约0.015的基因组的细菌菌株。在其他的实施方案中，本文公开的细菌菌株的活性变体包括小于大约0.001、0.0025、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025或0.030的距离量度。由于基因组与Mash距离有关，所以其包括细菌染色体DNA和细菌质粒DNA。在其他的实施方案中，细菌菌株的活性变体具有高于与公开菌株的Mash距离阈值(其高于由于技术变化而引起的差异)的基因组。在其他的实例中，细菌菌株的活性变体具有高于与公开菌株的Mash距离阈值(其高于由于技术改变而引起的差异)的基因组，并具有小于大约0.015的Mash距离。在其他的实例中，细菌菌株的活性变体具有高于与公开菌株的Mash距离阈值(其高于由于技术改变而引起的差异)的基因组，并具有小于大约0.001、0.0025、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025或0.030的Mash距离。

如本文所用，“高于技术变化”是指在基因组装配中，高于由于错误引起的两种菌株之间的Mash距离，前提条件是所比较的基因组是使用Illumina HiSeq2500DNA测序技术具有至少20x覆盖率测序的每个DNA，并且所述基因组是至少99％完整的，并证明具有低于2％的污染。20x覆盖率是本领域公认的术语，为了清楚起见，20x覆盖率的实例如下：对于5兆碱基(MB)的基因组尺寸而言，需要由给定基因组的100MB的DNA测序，从而在沿着基因组的各位置处平均具有20x的测序覆盖率。有用于基因组完整性计算的标记基因的多种合适的集合，包括在Campbell等人(2013)PNAS USA 110(14)：5540-45，Dupont等人(2012)ISMEJ6:1625-1628和CheckM framework(Parks等人(2015)Genome Research 25:1043-1055)中发现的几组；这些参考文献每一个的全部内容并入本文。污染定义为在给定基因组序列中以多拷贝形式存在的通常为单拷贝标记基因的百分率(例如Parks等人(2015)GenomeResearch 25:1043-1055)；这些参考文献每一个的全部内容并入本文。使用标记基因的相同的集合计算完整性和污染。除非另外指明，否则在完整性和污染测定法中使用的集合标记的组是Campbell等人(2013)PNAS USA 110(14):5540-45中列出的，该文献以引用方式并入本文。

获得所考虑的基因组之间的距离估计的示例性步骤如下：(1)必须产生用于比较的足够品质的基因组。足够品质的基因组定义为使用足够的DNA序列(其量达到使用Illumina HiSeq 2500技术的至少20x基因组覆盖率)创建的基因组装配。所述基因组必须是至少99％完整的，并且与所要求保护的微生物基因组相比，污染低于2％。(2)使用Minhash工作流程比较基因组，如Ondov等人(2016)Genome Biology 17:132中所证明的，该文献通过引用将其全部内容并入本文。除非另外陈述，否则所用的参数如下：“草图(sketch)”尺寸为1000,“k-mer长度”为21。(3)证明2个基因组之间的Mash距离小于0.001、0.0025、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025或0.030。使用如上所述的参数和方法，两个基因组之间的Mash距离为0.015表示预期突变率是每个同源位置0.015个突变。通过此类方法鉴定的细菌的活性变体在以有效量应用于植物、植物部分或栽培地区时，将保留控制至少一种植物害虫和/或改善至少一种农艺性状的能力，包括例如减少植物害虫、降低植物害虫的感染和/或增加害虫抗性包括昆虫害虫抗性(例如鞘翅目昆虫例如西方玉米根虫、科罗拉多马铃薯甲虫和/或甘薯象鼻虫)。

III.配制物

本文提供的细菌菌株(即AIP045885、AIP075655、AIP09474、AIP024525、AIP033287、AIP093798、AIP061639、AIP082862、AIP058187、AIP059286、AIP036706或者其任何活性变体的细胞；或者衍生自AIP045885、AIP075655、AIP09474、AIP024525、AIP033287、AIP093798、AIP061639、AIP082862、AIP058187、AIP059286、AIP036706或其任何活性变体中任何一种的孢子或前孢子或者细胞、前孢子和/或孢子的组合)可以配制成细胞糊剂、可润湿的粉末、细胞团块、粉尘、颗粒、浆液、干燥粉末、水性或油性基液体产物等。此类配制物将包含本文提供的细菌或其活性变体和/或由其衍生的组合物，还有载体和其他试剂。配制物可以用于本文其他处公开的多种方法中。

本发明公开的细菌菌株及其活性变体可以配制成包含增容剂、溶剂、自发性促进剂、载体、乳化剂、分散剂、抗冻保护剂、增稠剂和/或佐剂的至少一种或多种。在一些实施方案中，增容剂、溶剂、自发性促进剂、载体、乳化剂、分散剂、抗冻保护剂、增稠剂和/或佐剂是非天然的或合成的增容剂、溶剂、自发性促进剂、载体、乳化剂、分散剂、抗冻保护剂、增稠剂和/或佐剂。在特定的实施方案中，本文公开的细菌菌株及其活性变体可以配制成包括增容剂、溶剂、自发性促进剂、载体、乳化剂、分散剂、抗冻保护剂、增稠剂和/或佐剂的至少一种或多种。

典型的配制物的实例包括水溶性液体(SL)、可乳化浓缩物(EC)、水乳剂(EW)、悬浮浓缩物(SC)、悬浮乳剂(SE)、用于种子处理的可流动浓缩物(FS)、油分散物(OD)、水分散性颗粒(WG)、颗粒(GR)、胶囊浓缩剂(CS)、水分散颗粒(WG)、颗粒(GR)、块状饵料(BB)、水溶性颗粒(SG)以及CS和SC的混合配制物(ZC)。这些和其他可行的配制物类型通过例如农作物国际协会(Crop Life International)以及在FAO/WHO Joint Meeting on PesticideSpecifications,2004,ISBN:9251048576准备的Pesticide Specifications,Manual ondevelopment and use of FAO and WHO specifications for pesticides,FAO PlantProduction and Protection Papers-173中所述。所述配制物可以包含除本发明的一种或多种活性化合物以外的活性农用化学化合物。

多种细菌菌株或其活性变体的配制物或应用形式可以包含但不限于辅助物质，例如增容剂、溶剂、自发性促进剂、载体、乳化剂、分散剂、抗冻保护剂、杀生物剂、固体载体、表面活性剂、增稠剂和/或其他辅助物质(例如佐剂)。在该内容中，佐剂是增强配制物生物作用的组分，而该组分本身不具有生物作用。佐剂的实例为促进保留、散布、附着在叶表面上或者渗透的试剂。

非限定性增容剂为例如水，例如得自以下类别的极性和非极性有机化学液体，例如芳香族和非芳香族烃(例如石蜡、烷基苯、烷基萘、氯苯)，醇和多元醇(如果合适，则还可以被取代、醚化和/或酯化)，酮(例如丙酮、环己酮)，酯(包括脂肪和油)，和(聚)醚，未取代的和取代的胺、酰胺、内酰胺(例如N-烷基吡咯烷酮)和内酯，砜和亚砜(例如二甲基亚砜)。如果所用的增容剂为水，则还可以使用例如有机溶剂作为辅助溶剂。根本上，非限定性液体溶剂为：芳香族例如二甲苯、甲苯或烷基萘，氯化的芳香族和氯化的脂肪族烃例如氯苯、氯乙烯或二氯甲烷，脂肪族烃例如环己烷或石蜡，例如石油级份、矿物油和植物油，醇例如丁醇或乙二醇以及它们的醚和酯，酮例如丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮或环己酮，强极性溶剂例如二甲基甲酰胺和二甲基亚砜，还有水。原则上，可以使用任何合适的溶剂。非限定性溶剂为例如芳香族烃，例如二甲苯、甲苯或烷基萘，例如氯化的芳香族或脂肪族烃，例如氯苯、氯乙烯或二氯甲烷，例如脂肪族烃，例如环己烷，例如石蜡、石油级份、矿物油和植物油，醇，例如甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇或乙二醇，例如还有它们的醚和酯，酮例如丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮或环己酮，例如强极性溶剂，例如二甲基亚砜，以及水。

合适的载体的非限定性实例包括例如铵盐和研磨的天然矿物质，例如高岭土、黏土、滑石、白垩、石英、坡缕石、蒙脱石或硅藻土；以及研磨的合成矿物质，例如细分的硅石、氧化铝、以及天然或合成的硅酸盐、树脂、蜡和/或固体肥料。同样，可以使用此类载体的混合物。适用于颗粒的载体包括如下:例如压碎的和分级的天然矿物，例如方解石、大理石、浮石、海泡石、白云石；还有无机和有机粗粉的合成颗粒；还有有机材料的颗粒，例如木屑、纸、椰子壳、玉米轴和烟草杆。

还可以使用液化的气体增容剂或溶剂。非限定性实例为在标准的温度下和在标准的压力下为气体的那些增容剂或载体，实例为气溶胶推进剂，例如卤化烃，还有丁烷、丙烷、氮和二氧化碳。乳化剂和/或泡沫形成剂，分散剂或润湿剂(具有离子或非离子性质)，或者这些表面活性物质的混合物的实例为聚丙烯酸的盐，木质磺酸的盐，酚磺酸或萘磺酸的盐，环氧乙烷与脂肪醇或与脂肪酸或与脂肪胺或者与具有取代的酚(优选为烷基酚或芳基酚)的缩聚物，磺基琥珀酸酯的盐，牛磺酸衍生物(优选为烷基牛磺酸盐)，聚乙氧基化的醇或酚的磷酸酯，多元醇的脂肪酸酯，以及包含硫酸盐、磺酸盐和磷酸盐的化合物的衍生物，实例为烷基芳基聚乙二醇醚、烷基磺酸盐、烷基硫酸盐、芳基磺酸盐、蛋白质水解产物、木质素-亚硫酸盐废液和甲基纤维素。如果一种活性化合物和/或一种惰性载体不溶于水，并且如果应用在水中发生，则表面活性物质的存在是有利的。

可以存在于配制物中并且存在于由其衍生的应用形式中的其他辅助物质包括着色剂，例如无机颜料，实例为氧化铁、氧化钛、普鲁士蓝，和有机染料，例如茜素染料、偶氮染料和金属酞菁染料，以及营养物和痕量营养物(例如铁、锰、硼、铜、钴、钼和锌的盐)。

稳定剂(例如低温稳定剂)、防腐剂、抗氧化剂、光稳定剂或者改善化学和/或物理稳定性的其他试剂也可以存在。此外，可以存在泡沫形成剂或消泡剂。

此外，配制物以及由其衍生的应用形式还可以包含粘合剂(例如羧甲基纤维素)，粉末、颗粒或乳胶形式的天然和合成聚合物(例如阿拉伯树胶、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯)，还有天然的磷脂(例如脑磷脂和卵磷脂)和合成的磷脂作为其他的辅助物质。其他可行的辅助物质包括矿物油和植物油。

在所述配制物及其衍生的应用形式中可以存在其他的辅助物质。此类添加剂的实例包括香料、保护性胶体、粘结剂、粘附剂、增稠剂、触变物质、渗透剂、保留促进剂、稳定剂、螯合剂、络合剂、保湿剂和展开剂。一般而言，活性化合物可以与常用于配制物目的的任何固体或液体添加剂结合。

合适的保留促进剂包括降低动力学表面张力的所有那些物质(例如磺基琥珀酸二辛酯)，或增加粘弹性的所有那些物质(例如羟丙基瓜尔胶聚合物)。

在本