阅读说明：本技术 一种功能性混合饲料添加剂及其制备的方法 (Functional mixed feed additive and preparation method thereof ) 是由 常艺海 于 2019-10-18 设计创作，主要内容包括：本发明提出了一种功能性混合饲料添加剂,添加剂为蛹虫草菌先对玉米芯进行第一阶段发酵后,再利用红法夫酵母菌对发酵后的玉米芯进行第二阶段发酵的产物；其中添加剂中蛹虫草素不少于100mg/kg,虾青素不少于300mg/kg。本发明充分结合了生物工程发酵技术中不同菌种的特性,根据蛹虫草菌和红法夫酵母菌的生理特性,结合固体发酵技术的应用,制备出含有虫草素和虾青素的新型发酵玉米芯功能性饲料添加剂。(The invention provides a functional mixed feed additive, which is a product obtained by first-stage fermentation of corncobs by cordyceps militaris and then second-stage fermentation of the fermented corncobs by using phaffia rhodozyma; wherein the additive contains Cordyceps militaris essence not less than 100mg/kg, and astaxanthin not less than 300 mg/kg. The invention fully combines the characteristics of different strains in the bioengineering fermentation technology, prepares the novel fermented corncob functional feed additive containing cordycepin and astaxanthin according to the physiological characteristics of cordyceps militaris and phaffia rhodozyma and by combining the application of the solid fermentation technology.)

一种功能性混合饲料添加剂及其制备的方法

技术领域

本发明涉及饲料添加剂技术领域，具体而言，涉及一种功能性混合饲料添加剂及其制备的方法。

背景技术

我国是农业大国，玉米产量极其丰富。玉米产量每年在1.1～1.3亿吨，可以副产2000万吨的玉米芯，然而玉米芯作为一种农业废弃物，在很长时间内不能被广泛利用，绝大部分作为农家燃料被白白烧掉，造成很大的浪费。近年来，随着我国科技实力的不断增强,玉米芯的工业深加工领域不断扩大,糠醛、木糖、木糖醇、低聚木糖等一系列高附价值的产品相继实现了工业化生产，使得玉米芯资源得到了充分的利用。

但是，玉米芯主要成分是纤维素、半纤维素和木质素。其中纤维素占32%～36%、多缩戊糖占35%～40%、木质素占25%，其次还含有少量的灰分等。纤维素和半纤维素都很难被畜禽吸收和利用，在饲料中只可以少量的添加，严重影响了玉米芯的饲料化利用范围。

提供一种新型饲料添加剂，即蛹虫草菌可以利用纤维素和木质素等的腐生生物，能够代谢产生虫草素，虫草多糖，虫草酸等生物活性物质，此外分解产生一些糖醇等物质，其特有的香味可以改善畜禽的适口性。红法夫酵母能够将蛹虫草菌发酵过的玉米芯后，进行二次发酵，能够产生大量的虾青素，用于畜牧饲料添加剂方面。既解决了玉米芯综合利用的问题，又增加了新型绿色环保的饲料添加剂的种类，能够产生巨大的经济效益，更好地服务畜牧业的健康发展。此新型饲料添加剂中包含了虫草素，虫草多糖，虫草酸和虾青素等多种有益的生物活性物质，实现玉米芯的综合化，饲料化应用的解决方案。

发明内容

本发明正是基于上述技术问题至少之一，提出了一种功能性混合饲料添加剂及其制备的方法，本发明充分结合了生物工程发酵技术中不同菌种的特性，根据蛹虫草菌和红法夫酵母菌的生理特性，结合固体发酵技术的应用，制备出含有虫草素和虾青素的新型发酵玉米芯功能性饲料添加剂。采用分阶段发酵的方式，能过够显著提高生物活性物质的含量，其中，虫草素≥100mg/kg，虾青素≥300mg/kg。

有鉴于此，本发明提出了一种功能性混合饲料添加剂，添加剂为蛹虫草菌先对玉米芯进行第一阶段发酵后，再利用红法夫酵母菌对发酵后的玉米芯进行第二阶段发酵的产物；其中添加剂中蛹虫草素不少于100mg/kg，虾青素不少于300mg/kg。

根据本发明第二个方向，本发明功能性混合饲料添加剂在畜禽养殖中应用

根据本发明第三个方向提出了制备添加剂的方法，包括如下步骤：

（1）将蛹虫草菌液与玉米芯按照1：1.3-1.5的质量比混合后，25-28℃进行固体发酵；

（2）每隔2-4h通气；同时每隔1-2h搅拌翻料；120-144h后完成第一阶段的发酵；

（3）将红法夫酵母菌液与步骤（2）中经过发酵后的玉米芯按照1：0.4-0.6的质量比混合后，26-30℃进行固体发酵；

（4）每隔4-6h通气；同时每隔30-40min搅拌翻料；48-60h后完成第二阶段的发酵；

（5）将步骤（4）中得到的发酵产物灭菌后，得到添加剂成品。

本发明中采用蛹虫草菌和红法夫酵母菌分步发酵，是利用微生物的协同作用，彻底发酵玉米芯。其中玉米芯主要成分是玉米芯中含糖54.5%、粗蛋白质2.2%、粗脂肪0.4%、粗纤维29.7%、矿物质1.2%。其中，糖主要以糖醇的形式存在，虫草菌可以将糖醇发酵成大分子多糖，然后红法夫酵母发酵进一步发酵成小分子寡糖，充分发挥菌种的协同作用。

进一步的，蛹虫草菌液的制备方法为将蛹虫草菌接种于种子培养基中，25℃-27℃、黑暗环境中150rpm-180rpm摇床培养3d-5d；将种子液照体积百分比为10%-15%的量接入发酵培养基中，96h-120h，转速为160rpm-220rpm；pH值为3.5时，停止发酵。

进一步的，蛹虫草菌种子培养基为马铃薯110-130g，蚕蛹粉4-8g，麦芽3-8g、葡萄糖9-15g，蛋白胨6-10g，酵母提取物4-8g，磷酸二氢钾1.0-1.5g，硫酸镁1.0-1.4g，维生素B10.02-0.05g。

优选的，蛹虫草菌种子培养基为马铃薯120g，蚕蛹粉5g，麦芽5g、葡萄糖10g，蛋白胨7.5g，酵母提取物6g，磷酸二氢钾1.2g，硫酸镁1.2g，维生素B1 0.03g。

将马铃薯，蚕蛹粉，麦芽煮30min过滤残渣，得到上清液体，加入葡萄糖，蛋白胨，酵母提取物，磷酸二氢钾，硫酸镁，维生素B1，加水定容到1000ml混匀，pH7.2，121℃灭菌30min，得到蛹虫草菌种子培养基。

进一步的，蛹虫草菌发酵培养基为黄豆饼粉5%-10%，蔗糖3%-6%，蚕蛹脱脂粉4%-8%，硫酸铵0.2%-0.5%,碳酸钠0.1%-0.3%，维生素B1 0,003%-0.005%。

进一步的，红法夫酵母菌液的制备方法为将红法夫酵母菌接种于种子培养基中，26℃-28℃、130rpm-160rpm摇床培养1d-2d；将种子液照体积百分比为8%-18%的量接入发酵培养基中，36h-48h，转速为130rpm-180rpm；pH值为4.5时，停止发酵。

进一步的，红法夫酵母种子培养基为麦芽浸粉10-12g，葡萄糖10-15g，蛋白胨8-12g，蔗糖10-20g，硫酸镁1.1-1.7g，氯化钠1.1-1.8g，pH值7.0-7.5。

优选的，红法夫酵母种子培养基为麦芽浸粉10g，葡萄糖10g，蛋白胨8.5g，蔗糖15g，硫酸镁1.3g，氯化钠1.5g，加水定容到1000ml混匀，pH7.2。

麦芽浸粉，葡萄糖，蛋白胨，蔗糖，硫酸镁，氯化钠，加水定容到1000ml混匀，pH6.5，pH7.2，121℃灭菌30min，得到红法夫酵母种子培养基。

进一步的，红法夫酵母发酵培养基为酵母提取物6%-10%，果糖4%-7%，苹果原醋4%-8%，硫酸铵0.1%-0.3%，磷酸二氢钾0.2%-0.4%。

通过以上技术方案，本发明提出了一种功能性混合饲料添加剂及其制备的方法，其具有以下优点：

（1）本方法率先将生物工程的发酵技术结合不同菌种的生理代谢特点，采取分阶段发酵的方式，最大程度的发挥各菌种的特点，生产出新型的以玉米芯为主要原料的饲料添加剂，其含有丰富的虫草素，虫草多糖及虾青素等活性物质，能过够很好的在畜牧养殖业使用，经过多次实验，实验的效果较好，具有工艺流程简单，安全环保无残留，成本低廉，具有很高的市场前景和经济效益。

（2）本发明对玉米芯两个阶段的固体发酵优化等，能够最大程度地发挥菌种的代谢特点，大幅度提高蛹虫草菌和红法夫酵母在发酵玉米芯过程中的协同作用，产生虫草素，虫草多糖，虫草酸和虾青素等多种物质，其中虫草素≥100mg/kg，虾青素≥300mg/kg，所得到的产品环境友好，符合国家产业政策。

附图说明

图1示出了本发明蛹虫草菌显微图。

图2示出了本发明红法夫酵母菌显微图。

图3示出了虫草素标准曲线HPLC图片。

图4示出了本发明实施例7中虫草菌发酵产生虫草素HPLC图片。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。

蛹虫草菌和红法夫酵母菌均为市购菌种，其显微结构如图1-2，购自广东省微生物菌种保藏中心，蛹虫草菌买编号是GIM5.269，红法夫酵母菌购买编号为2.177。酵母提取物为市购酵母粉YEAST EXTRACT，产地：OXOID。

实施例1

蛹虫草菌液的制备

将马铃薯120g，蚕蛹粉5g，麦芽5g煮30min过滤残渣，得到上清液体，加入葡萄糖10g，蛋白胨7.5g，酵母提取物6g，磷酸二氢钾1.2g，硫酸镁1.2g，维生素B1 0.03g，加水定容到1000ml混匀，pH7.2，121℃灭菌30min，得到蛹虫草菌种子培养基。

将挑取直径大小约4mm大小的3个菌块接种至种子培养基装载量为200mL/1000mL的三角瓶中蛹虫草菌接种于种子培养基中，26℃、黑暗环境中165rpm摇床培养4d；将种子液照体积百分比为12%的量接入发酵培养基中，105h，转速为180rpm；pH值为3.5时，停止发酵，得到发酵蛹虫草菌的菌液，备用。

其中培养基成分为黄豆饼粉7%，蔗糖5%，蚕蛹脱脂粉6%，硫酸铵0.4%,碳酸钠0.25%，维生素B1 0.004%。

实施例2

蛹虫草菌液的制备

将马铃薯120g，蚕蛹粉5g，麦芽5g煮30min过滤残渣，得到上清液体，加入葡萄糖10g，蛋白胨7.5g，酵母提取物6g，磷酸二氢钾1.2g，硫酸镁1.2g，维生素B1 0.03g，加水定容到1000ml混匀，pH7.2，121℃灭菌30min，得到蛹虫草菌种子培养基。

将挑取直径大小约4mm大小的3个菌块接种至种子培养基装载量为200mL/1000mL的三角瓶中蛹虫草菌接种于种子培养基中，25℃、黑暗环境中150rpm摇床培养3d；将种子液照体积百分比为10%的量接入发酵培养基中，96h，转速为160rpm；pH值为3.5时，停止发酵，得到发酵蛹虫草菌的菌液，备用。

其中培养基成分为黄豆饼粉5%，蔗糖3%，蚕蛹脱脂粉4%，硫酸铵0.2%，碳酸钠0.1%，维生素B1 0.003%。

实施例3

蛹虫草菌液的制备

将马铃薯120g，蚕蛹粉5g，麦芽5g煮30min过滤残渣，得到上清液体，加入葡萄糖10g，蛋白胨7.5g，酵母提取物6g，磷酸二氢钾1.2g，硫酸镁1.2g，维生素B1 0.03g，加水定容到1000ml混匀，pH7.2，121℃灭菌30min，得到蛹虫草菌种子培养基。

将挑取直径大小约4mm大小的3个菌块接种至种子培养基装载量为200mL/1000mL的三角瓶中蛹虫草菌接种于种子培养基中，25℃、黑暗环境中180rpm摇床培养5d；将种子液照体积百分比为15%的量接入发酵培养基中，120h，转速为220rpm；pH值为3.5时，停止发酵，得到发酵蛹虫草菌的菌液，备用。

其中培养基成分为黄豆饼粉10%，蔗糖6%，蚕蛹脱脂粉8%，硫酸铵0.5%，碳酸钠0.3%，维生素B1 0.005%。

实施例4

红法夫酵母菌液的制备

麦芽浸粉10g，葡萄糖10g，蛋白胨8.5g，蔗糖15g，硫酸镁1.3g，氯化钠1.5g，加水定容到1000ml混匀，pH6.5，pH7.2，121℃灭菌30min，得到红法夫酵母种子培养基。

将红法夫酵母菌接种于种子培养基中，27℃、150rpm摇床培养1d；将种子液照体积百分比为11.6%的量接入发酵培养基中，42h，转速为155rpm；pH值为4.5时，停止发酵。

红法夫酵母所述发酵培养基为酵母提取物8.5%，果糖4.9%，苹果原醋6.5%，硫酸铵0.25%，磷酸二氢钾0.35%。

实施例5

红法夫酵母菌液的制备

麦芽浸粉10g，葡萄糖10g，蛋白胨8.5g，蔗糖15g，硫酸镁1.3g，氯化钠1.5g，加水定容到1000ml混匀，pH6.5，pH7.2，121℃灭菌30min，得到红法夫酵母种子培养基。

将红法夫酵母菌接种于种子培养基中，26℃、130rpm摇床培养1d；将种子液照体积百分比为8%的量接入发酵培养基中，36h，转速为130rpm；pH值为4.5时，停止发酵。

红法夫酵母所述发酵培养基为酵母提取物6%，果糖4%，苹果原醋4%，硫酸铵0.1%，磷酸二氢钾0.2%。

实施例6

红法夫酵母菌液的制备

麦芽浸粉10g，葡萄糖10g，蛋白胨8.5g，蔗糖15g，硫酸镁1.3g，氯化钠1.5g，加水定容到1000ml混匀，pH6.5，pH7.2，121℃灭菌30min，得到红法夫酵母种子培养基。

将红法夫酵母菌接种于种子培养基中，28℃、160rpm摇床培养2d；将种子液照体积百分比为18%的量接入发酵培养基中，48h，转速为180rpm；pH值为4.5时，停止发酵。

红法夫酵母所述发酵培养基为酵母提取物10%，果糖7%，苹果原醋8%，硫酸铵0.3%，磷酸二氢钾0.4%。

实施例7

添加剂的制备

（1）将实施例2中得到的蛹虫草菌液与玉米芯按照1：1.3的质量比混合后，放入固体发酵罐中，进行固体发酵，其中发酵条件为25℃；

（2）每隔2h对给固体发酵罐通气，每隔1h对固体发酵管进行耙式搅拌翻料一次，发酵120h后，虫草素含量为168mg/kg；

（3）将实施例4中得到的红法夫酵母菌液与步骤（2）中经过发酵后的玉米芯按照1：0.4的质量比混合后，放入固体发酵罐中，进行固体发酵，其中发酵条件为26℃；

（4）每隔4h对给固体发酵罐通气，每隔30min对固体发酵管进行耙式搅拌翻料一次；发酵48h后，虾青素含量为340mg/kg，完成第二阶段的发酵即得到半成品；

（5）将步骤（4）中得到的发酵产物经过巴氏灭菌后，得到添加剂成品。

本实施例中，虫草素采用的是“NY/T 2116-2012 虫草制品中虫草素和腺苷的测定高效液相色谱法”进行测定，测定图谱如图3-4。

虾青素采用的是紫外检测法，取待测样品100毫克干粉至250毫升棕色容量瓶中，加5毫升去离子水，在50摄氏度条件下超声溶解5min，冷却后，加100毫升无水乙醇摇匀，再用氯仿定容，过滤。取5毫升上述溶液至50毫升容量瓶中，再用氯仿定容至刻度。用氯仿做空白。在474nm处测最大吸收值。公式如下：

C=A*2500/（1830*W）

A为吸光系数

W为样品重量

本实施例中，虫草素≥100mg/kg，虾青素≥300mg/kg，符合预定的要求，是一种以玉米芯为主发酵的功能性饲料添加剂新品。

实施例8

添加剂的制备

（1）将实施例1中得到的蛹虫草菌液与玉米芯按照1：1.38的质量比混合后，放入固体发酵罐中，进行固体发酵，其中发酵条件为26℃；

（2）每隔2.8h对给固体发酵罐通气，每隔1.6h对固体发酵管进行耙式搅拌翻料一次，发酵133h后，虫草素含量为185mg/kg；

（3）将实施例3中得到的红法夫酵母菌液与步骤（2）中经过发酵后的玉米芯按照1：0.52的质量比混合后，放入固体发酵罐中，进行固体发酵，其中发酵条件为28℃；

（4）每隔5.5h对给固体发酵罐通气，每隔35min对固体发酵管进行耙式搅拌翻料一次；发酵55h后，虾青素含量为432mg/kg，完成第二阶段的发酵即得到半成品；

（5）将步骤（4）中得到的发酵产物经过巴氏灭菌后，得到添加剂成品。

实施例9

添加剂的制备

（1）将实施例3中得到的蛹虫草菌液与玉米芯按照1：1.5的质量比混合后，放入固体发酵罐中，进行固体发酵，其中发酵条件为28℃；

（2）每隔4h对给固体发酵罐通气，每隔2h对固体发酵管进行耙式搅拌翻料一次，发酵144h后，虫草素含量为142mg/kg；

（3）将实施例6中得到的红法夫酵母菌液与步骤（2）中经过发酵后的玉米芯按照1：0.6的质量比混合后，放入固体发酵罐中，进行固体发酵，其中发酵条件为30℃；

（4）每隔6h对给固体发酵罐通气，每隔40min对固体发酵管进行耙式搅拌翻料一次；发酵60h后，虾青素含量为360mg/kg，完成第二阶段的发酵即得到半成品；

（5）将步骤（4）中得到的发酵产物经过巴氏灭菌后，得到添加剂成品。

对比例1

添加剂的制备

（1）将实施例1中得到的蛹虫草菌液与玉米芯按照1：1.12的质量比混合后，放入固体发酵罐中，进行固体发酵，其中发酵条件为30℃；

（2）每隔5.2h对给固体发酵罐通气，每隔3.2h对固体发酵管进行耙式搅拌翻料一次，发酵155h后，虫草素含量为45mg/kg；

（3）将实施例3中得到的红法夫酵母菌液与步骤（2）中经过发酵后的玉米芯按照1：0.72的质量比混合后，放入固体发酵罐中，进行固体发酵，其中发酵条件为33℃；

（4）每隔6.8h对给固体发酵罐通气，每隔48min对固体发酵管进行耙式搅拌翻料一次；发酵72h后，虾青素含量为189mg/kg，完成第二阶段的发酵即得到半成品；

（5）将步骤（4）中得到的发酵产物经过巴氏灭菌后，得到添加剂成品。

本实施例中，虫草素＜100mg/kg，虾青素小于300mg/kg，不符合预定的要求，无法达到一种以玉米芯为主发酵的功能性饲料添加剂新品的要求。两步发酵法中的因素需要同时满足，才能达到合适的含量。

对比例2

添加剂的制备

（1）将实施例1中得到的蛹虫草菌液与玉米芯按照1：1.72的质量比混合后，放入固体发酵罐中，进行固体发酵，其中发酵条件为35℃；

（2）每隔1.5h对给固体发酵罐通气，每隔0.5h对固体发酵管进行耙式搅拌翻料一次，发酵86h后，虫草素含量为38mg/kg；

（3）将实施例3中得到的红法夫酵母菌液与步骤（2）中经过发酵后的玉米芯按照1：0.74的质量比混合后，放入固体发酵罐中，进行固体发酵，其中发酵条件为38℃；

（4）每隔2.2h对给固体发酵罐通气，每隔15min对固体发酵管进行耙式搅拌翻料一次；发酵28h后，虾青素含量为157mg/kg，完成第二阶段的发酵即得到半成品；

（5）将步骤（4）中得到的发酵产物经过巴氏灭菌后，得到添加剂成品。

本实施例中，虫草素＜100mg/kg，虾青素＜300mg/kg，不符合预定的要求，不是一种以玉米芯为主发酵的功能性饲料添加剂新品。两步发酵法中的因素需要同时满足，才能达到合适的含量。

实施例10

取实施例7中制备得到的添加剂，自2019年5月15日始，在卫辉市李源屯白河村养殖场，该场该场海兰褐蛋鸡5月感染非典型新城疫和腺肌胃炎，采食量下降200斤左右，产蛋率从91%下降到70%，使用抗病毒药物和腺胃炎药进行治疗，治疗痊愈后产蛋性能上不去，鸡冠发白，常有新母鸡发病。将感染非典型新城疫和腺肌胃炎的237日龄蛋鸡分为实验组和对照组；实验组和对照组各三组；对实验组蛋鸡投食时，1kg添加剂拌料500kg，进行喂料；对照组正常喂料。一周后，实验组鸡冠发白的鸡明显减少，新母鸡病的发生率几乎为零。使用8天后，产蛋率为80%。而对照组8天后新母鸡病发病率30-40%，产蛋率为73%。

对比例3

取实施例7中制备得到的添加剂，自2019年4月25日始，在卫辉市李源屯镇北鲁庄村，该场海兰褐蛋鸡4月感染非典型新城疫（强毒），后继发感染滑液囊支原体和腺肌胃炎，采食量下降斤1/3左右，产蛋率从87%下降到65%。使用抗病毒药物-泰妙菌素，多西环素以及腺肌胃炎药物进行治疗。将感染非典型新城疫的232日龄蛋鸡分为实验组和对照组；实验组和对照组各三组；对实验组蛋鸡投食时，1kg添加剂拌料500kg，进行喂料；对照组正常喂料。一周后，实验组鸡冠开始逐渐转粉，采食量基本正常，高温连续的天气情况下，产蛋率每天都在每天以2-4%的速率恢复，滑液囊支原体不再复发。而对照组产蛋率，以2%-5%的速度在缓慢下降。

本发明中添加剂的主要成分为虫草素和虾青素，其中，虫草素的补中益气，大补血功效能使鸡冠颜色恢复基本正常水平；此外，虫草菌还产生性抗菌抗病毒成分喷司他丁抗病毒效果增加，提高免疫力功能使新母鸡病发生率降低。红法夫酵母产生的虾青素能够有效清除体内的自由基，增强免疫力，提高了采食量。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。