重组人结合珠蛋白β亚基蛋白的表达和纯化方法
阅读说明：本技术 重组人结合珠蛋白β亚基蛋白的表达和纯化方法 (Expression and purification method of recombinant human haptoglobin beta subunit protein ) 是由 段瑞峰 邓炳楠 张源 蒲玲玲 刘伟丽 王新兴 王天辉 陈照立 于 2019-10-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种重组人结合珠蛋白β亚基蛋白的表达和纯化方法。本发明人工合成人结合珠蛋白全长基因,利用PCR技术扩增人结合珠蛋白β亚基基因,然后利用原核表达系统将该基因在大肠杆菌Shuffle T7-B中进行表达,随后利用His标签可溶性蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化,获得重组人结合珠蛋白β亚基的重组蛋白。根据本发明所述方法制备的重组人结合珠蛋白β亚基蛋白具有可溶性蛋白产率高及操作简便的特点,可用于进一步研究该蛋白体外结合血红蛋白的功能及应用于清除血浆中游离血红蛋白。(The invention discloses an expression and purification method of recombinant human haptoglobin beta subunit protein. The inventor synthesizes the human haptoglobin full-length gene in a synthetic way, utilizes the PCR technology to amplify the human haptoglobin beta subunit gene, then utilizes a prokaryotic expression system to express the gene in escherichia coli Shuffle T7-B, and then utilizes a His label soluble protein purification kit to carry out protein purification, so as to obtain the recombinant protein of the recombinant human haptoglobin beta subunit. The recombinant human haptoglobin beta subunit protein prepared by the method has the characteristics of high yield of soluble protein and simplicity and convenience in operation, and can be used for further researching the function of the protein for binding hemoglobin in vitro and removing free hemoglobin in blood plasma.)
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体是重组人结合珠蛋白β亚基蛋白的表达和纯化方法。
背景技术
结合珠蛋白(Haptoglobin；Hp)广泛存在于人类和许多哺乳动物的血清及其他体液中,其主要功能是通过与游离血红蛋白(heamoglobin；Hb)结合形成结合珠蛋白-血红蛋白复合物,将血红蛋白运至肝中代谢,血红蛋白含有铁离子，结合珠蛋白结合血浆游离血红蛋白不但能够使血红蛋白在体内降解后得到重新利用，从而避免血红蛋白和铁从肾脏丢失以及对肾脏的损伤。结合珠蛋白是机体防止游离血红蛋白损伤非常重要的内源性保护因子，主要由肝细胞合成并分泌到血浆中。结合珠蛋白可以在血浆中循环3.5天，但是一旦和游离血红蛋白结合后就可以和单核细胞的CD163受体结合并在10-20分钟内被运送到肝中在溶酶体中被降解。长期低氧、烧伤、透析治疗等都可引起血浆游离血红蛋白水平升高，极端情况下能使结合珠蛋白耗竭，从而危害机体健康。研究表明输血所用血液在体外保存时间越长，其游离血红蛋白浓度将升高，所含结合珠蛋白减少，因此对输血患者不利。结合珠蛋白结合血红蛋白的部位是其β亚基，因此方便地获得人结合珠蛋白β亚基从而结合并清除游离血红蛋白具有重大的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有可溶性蛋白产率高及操作简便的重组人结合珠蛋白β亚基原核表达和纯化的方法，有助于进一步研究该蛋白结合血红蛋白的功能及其在清除血浆游离血红蛋白中的应用。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：提供一种重组人结合珠蛋白的基因，其核苷酸序列见附件SEQ NO.1所示。
重组人结合珠蛋白β亚基的氨基酸序列见附件SEQ NO.2所示。
所述的重组人结合珠蛋白β亚基的表达方法，包括：
将合成的人结合珠蛋白β亚基基因构建到原核表达载体pET32a(+)上，构建重组表达载体pET32a(+)-HPβ，并将构建成功的重组表达载体转化到Shuffle T7-B感受态细胞中，制备固态琼脂糖凝胶板进行筛选后得到重组工程菌株；挑选所述的重组工程菌株克隆进行LB培养基培养后加入蛋白表达诱导剂IPTG进行诱导表达人重组结合珠蛋白β亚基蛋白。
所述的表达载体pET32a(+)含有T7启动子、硫氧还蛋白融合表达结构域和蛋白纯化His标签序列。与硫氧还蛋白融合表达可以增加人结合珠蛋白β亚基重组蛋白的可溶性，与His标签融合表达使得可溶性蛋白的纯化操作简便。
所述的重组人结合珠蛋白β亚基基因为PCR扩增获得，利用PCR技术以合成的人结合珠蛋白全长基因为模板进行PCR扩增，其上游引物序列为：CAAGGCCATGGCTCGGATCCTGGGTGGACACC(划线部分为Nco I酶切位点)；其下游引物序列为：GTGCTCGAGTTAGTTCTCAGCTATGGTCTTC(划线部分为Xho I酶切位点)。
所述的构建重组人结合珠蛋白β亚基原核表达载体的方法为：将PCR扩增获得的全长人结合珠蛋白β亚基基因与表达载体pET32a(+)分别用Nco I和Xho I核酸内切酶进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳和DNA纯化试剂盒纯化，然后将两个纯化产物利用T4DNA连接酶进行连接，构建重组表达载体pET32a(+)-HPβ，随后利用该载体转化Shuffle T7-B感受态细胞，获得表达菌株。
所述的基因重组工程菌株为Shuffle T7-B-HPβ。
重组人结合珠蛋白诱导表达的条件为：37℃，150rpm转速条件下培养大约3h至菌液的OD600达到0.5-0.7，并且OD600最好接近0.6时加入终浓度为1mM的IPTG诱导表达4h，诱导表达的重组人结合珠蛋白为可溶性蛋白和包涵体的混合物。
诱导表达的重组人结合珠蛋白的纯化方法为：超声破碎菌体，离心后用SolubleBinding Buffer将含有可溶性蛋白的上清液等倍稀释后负载到Ni琼脂糖凝胶层析柱上，先用Soluble Binding Buffer洗柱子，再用含500mM咪唑浓度的Soluble Elution Buffer洗脱，收集洗脱液；将洗脱液用10KDa超滤管浓缩并更换为PBS溶液。
诱导表达的重组人结合珠蛋白的纯化方法，所述的Soluble Binding Buffer的组份是：20mM Tris-HCL(pH7.9)，500mM NaCL，10mM咪唑；SolubleElution Buffer的组份是：20mM Tris-HCL(pH7.9)，500mM NaCL，500mM咪唑。
所述诱导表达并进行纯化而获得的重组人结合珠蛋白β亚基蛋白可用于其结合游离血红蛋白的功能研究及其在结合并去除血浆游离血红蛋白中的应用。
本发明突出的优点是：
利用基因工程方法构建了能够稳定诱导表达人结合珠蛋白β亚基重组蛋白的大肠杆菌工程菌株。人结合珠蛋白β亚基与硫氧还蛋白融合表达可以增加人结合珠蛋白β亚基重组蛋白的可溶性。Shuffle T7-B菌株细胞内组成型表达的二硫键异构酶DsbC有利于重组人结合珠蛋白β亚基形成正确的二硫键，帮助蛋白正确折叠。表达产物可以方便地通过Ni琼脂糖凝胶柱纯化，操作简单，成本低。获得的可溶性重组人结合珠蛋白β亚基可用于研究其体外结合血红蛋白的功能及应用于清除血浆游离血红蛋白。
附图说明
图1是合成的人结合珠蛋白基因片段，***UC57质粒，利用EcoRI和SphI核酸内切酶进行双酶切后的鉴定图(片段大小符合预期大小)；
泳道M：表示DNA Marker；泳道1：EcoRI和SphI核酸内切酶进行双酶切后的pUC57-HP；pUC57质粒大小2710bp，合成基因大小1062bp；
图2是pET32a(+)-HPβ质粒的测序图(部分)(测序结果表明该质粒正确***了HPβ亚基基因片段)；
图3是利用Shuffle T7-B-HPβ菌株进行重组人结合珠蛋白β亚基蛋白的诱导表达电泳图；
其中泳道M显示蛋白Marker，KDa代表蛋白分子质量；泳道1：pET32a(+)-HPβ菌株不进行诱导的蛋白电泳图；泳道2：pET32a(+)-HPβ菌株1mM IPTG诱导后的蛋白电泳图(诱导后在大约45KDa处蛋白特异性显著增多)；
图4是重组人结合珠蛋白蛋白β亚基非变性纯化电泳图；
其中泳道M显示蛋白Marker，KDa代表蛋白分子质量；泳道1：纯化后重组人结合珠蛋白β亚基(分子量约45KDa，与预期分子量符合)。
具体实施方式
实施例1
重组表达载体pET32a(+)-HPβ的构建
1.1利用化学合成DNA模板及PCR方法得到人结合珠蛋白β亚基基因
在通用生物系统(安徽)有限公司合成人结合珠蛋白DNA模板，***pUC57克隆载体中，序列长度为1062bp，见附件SEQ NO.1所示。以此为模板扩增得到人结合珠蛋白β亚基的全长基因片段。其上游引物序列为：CAAGGCCATGGCTCGGATCCTGGGTGGACACC(划线部分为Nco I酶切位点)；其下游引物序列为：
GTGCTCGAGTTAGTTCTCAGCTATGGTCTTC(划线部分为Xho I酶切位点)。PCR反应体系：上下游引物各1μL，质粒模板0.2μL，2xPfu PCR MasterMix(天根生化科技有限公司，KP201)12.5μL，ddH2O 10.3μL；94℃预变性3min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸5min。PCR产物取6μL进行1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，在约0.7Kb处有一条清晰的条带，与预期人结合珠蛋白β亚基基因片段大小相符。
1.2表达载体pET32a(+)-HPβ的构建
(1)将上述的PCR产物经DNA纯化试剂盒纯化后，对pET32a(+)质粒和纯化后的人结合珠蛋白β亚基基因PCR片段同时进行Nco I和Xho I双酶切，37℃酶切2h，然后利用天根生化科技有限公司的DNA纯化试剂盒进行纯化并回收酶切后的DNA片段；使用碧云天生物技术公司的快速酶连接试剂将酶切并纯化后的质粒片段与人结合珠蛋白基因片段进行连接，室温连接40分钟。连接体系为:pET32a(+)质粒溶液1.5μL，人结合珠蛋白基因β亚基基因片段溶液3μL，快速连接缓冲液5μL，快速T4DNA连接酶0.5μL。
(2)将连接产物转化到Shuffle T7-B感受态细胞中，获得转化菌落。转化条件为：连接产物10μL加入100μL Shuffle T7-B感受态细胞溶液中，轻弹混匀，在冰浴中静置30分钟，随后42℃热激90s，然后快速转移到冰浴中，使细胞冷却3min，该过程不要摇动离心管。加入900μL无菌的LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床振荡培养45min(150rpm)，然后吸取100μL已转化的感受态细胞涂布于含氨苄抗性的LB平板，37℃倒置培养过夜。
(3)挑取单菌落培养后进行PCR验证，筛选阳性克隆菌落进行测序，测序结果表明***人结合珠蛋白基因核苷酸序列正确，从而获得表达pET32a(+)-HPβ的基因工程菌，即Shuffle T7-B-pET32a(+)-HPβ。
实施例2
重组人结合珠蛋白的表达与鉴定
2.1挑取重组基因工程菌Shuffle T7-B-pET32a(+)-HPβ单菌落接种于10ml LB培养基中(含氨苄100μg/mL)，37℃，150rpm摇床振荡培养过夜。
2.2按1:9的比例将过夜培养的菌液接种到10ml新鲜LB培养基中(含氨苄100μg/mL)，
37℃，150rpm转速条件下培养大约3h至菌液的OD600达到0.5-0.7，并且OD600最好接近0.6时加入终浓度为1mM的IPTG诱导表达4h，诱导表达的重组人结合珠蛋白为可溶性蛋白和包涵体的混合物。同时设立工程菌ShuffleT7-B-pET32a(+)-HPβ不进行IPTG诱导组进行对照。
2.3诱导培养结束后将培养液于4℃，12,000g离心1min，弃去上清，收集下层菌体沉淀。用1mL PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎至菌液由浑浊变清亮。4℃，12,000g离心5min，吸取上清到新的离心管中即为上清部分；沉淀用100μL PBS重悬即为沉淀部分。利用PBS重悬菌体进行12％SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色，结果如图2所示，在约45KDa处有一特异性表达增加的蛋白条带，与预期的重组人结合珠蛋白β亚基分子量相符，诱导表达的重组人结合珠蛋白β亚基为可溶性蛋白和包涵体蛋白的混合物。
实施例3
重组人结合珠蛋白β亚基蛋白的纯化
3.1根据实施例2方法，诱导表达200mL重组基因工程菌株ShuffleT7-B-pET32a(+)-HPβ，用适量预冷的PBS缓冲液重悬菌体，冰浴超声破碎至菌液由浑浊变清亮后于4℃，12,000g离心5min，收集上清。将上清溶液加入等倍体积预冷的Soluble Binding Buffer(20mMTris-HCL(pH7.9)，500mMNaCL，10mM咪唑)，利用康为世纪的His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)进行纯化。
3.2将含有可溶性蛋白的用Soluble Binding Buffer等倍稀释的上清液负载到Ni琼脂糖凝胶层析柱上，先用15倍柱体积的Soluble Binding Buffer洗柱子，再用含500mM咪唑浓度的Soluble Elution Buffer(20mM Tris-HCL(pH7.9)，500mM NaCL，500mM咪唑。)洗脱，收集洗脱液；利用PBS溶液将洗脱液用10KDa超滤管每次浓缩10x，共3次来更换为PBS溶液，即为纯化的蛋白溶液。经12％SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝凝胶染色，结果如图3所示，在大约45KDa处有一特异性蛋白条带，与预期的重组人结合珠蛋白β亚基蛋白的分子量大小相符。通过进一步的质谱鉴定，验证该重组蛋白为人结合珠蛋白β亚基蛋白。最后将纯化蛋白置于-70℃冰箱保存。
所述诱导表达并经过纯化的重组人结合珠蛋白β亚基蛋白在研究其结合血红蛋白的功能及在清除血浆游离血红蛋白中的应用。
附件SEQ NO.1
合成的重组人结合珠蛋白基因序列
CTAGCTAGCATGAGTGCCCTGGGAGCTGTCATTGCCCTCCTGCTCTGGGGACAGCTTTTTGCAGTGGACTCAGGCAATGATGTCACGGATATCGCAGATGACGGCTGCCCGAAGCCCCCCGAGATTGCACATGGCTATGTGGAGCACTCGGTTCGCTACCAGTGTAAGAACTACTACAAACTGCGCACAGAAGGAGATGGAGTGTACACCTTAAACAATGAGAAGCAGTGGATAAATAAGGCTGTTGGAGATAAACTTCCTGAATGTGAAGCAGTATGTGGGAAGCCCAAGAATCCGGCAAACCCAGTGCAGCGGATCCTGGGTGGACACCTGGATGCCAAAGGCAGCTTTCCCTGGCAGGCTAAGATGGTTTCCCACCATAATCTCACCACAGGTGCCACGCTGATCAATGAACAATGGCTGCTGACCACGGCTAAAAATCTCTTCCTGAACCATTCAGAAAATGCAACAGCGAAAGACATTGCCCCTACTTTAACACTCTATGTGGGGAAAAAGCAGCTTGTAGAGATTGAGAAGGTTGTTCTACACCCTAACTACTCCCAGGTAGATATTGGGCTCATCAAACTCAAACAGAAGGTGTCTGTTAATGAGAGAGTGATGCCCATCTGCCTACCTTCAAAGGATTATGCAGAAGTAGGGCGTGTGGGTTATGTTTCTGGCTGGGGGCGAAATGCCAATTTTAAATTTACTGACCATCTGAAGTATGTCATGCTGCCTGTGGCTGACCAAGACCAATGCATAAGGCATTATGAAGGCAGCACAGTCCCCGAAAAGAAGACACCGAAGAGCCCTGTAGGGGTGCAGCCCATACTGAATGAACACACCTTCTGTGCTGGCATGTCTAAGTACCAAGAAGACACCTGCTATGGCGATGCGGGCAGTGCCTTTGCCGTTCACGACCTGGAGGAGGACACCTGGTATGCGACTGGGATCTTAAGCTTTGATAAGAGCTGTGCTGTGGCTGAGTATGGTGTGTATGTGAAGGTGACTTCCATCCAGGACTGGGTTCAGAAGACCATAGCTGAGAACTAACTCGAGCGG
附件SEQ NO.2
重组人结合珠蛋白β亚基氨基酸序列
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMARILGGHLDAKGSFPWQAKMVSHHNLTTGATLINEQWLLTTAKNLFLNHSENATAKDIAPTLTLYVGKKQLVEIEKVVLHPNYSQVDIGLIKLKQKVSVNERVMPICLPSKDYAEVGRVGYVSGWGRNANFKFTDHLKYVMLPVADQDQCIRHYEGSTVPEKKTPKSPVGVQPILNEHTFCAGMSKYQEDTCYGDAGSAFAVHDLEEDTWYATGILSFDKSCAVAEYGVYVKVTSIQDWVQKTIAEN
序列的162-407部分为人结合珠蛋白β亚基氨基酸序列，序列的1-109部分为硫氧还蛋白部分，序列的117-122部分为His蛋白标签部分。DS Gene 1.1软件计算的重组蛋白分子量为44.75KDa。
序列表
<110> 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所
<120> 重组人结合珠蛋白β亚基蛋白的表达和纯化方法
<130> 2019.10.18
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 407
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1 5 10 15
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
20 25 30
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
35 40 45
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
50 55 60
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
85 90 95
Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
115 120 125
Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln
130 135 140
His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met
145 150 155 160
Ala Arg Ile Leu Gly Gly His Leu Asp Ala Lys Gly Ser Phe Pro Trp
165 170 175
Gln Ala Lys Met Val Ser His His Asn Leu Thr Thr Gly Ala Thr Leu
180 185 190
Ile Asn Glu Gln Trp Leu Leu Thr Thr Ala Lys Asn Leu Phe Leu Asn
195 200 205
His Ser Glu Asn Ala Thr Ala Lys Asp Ile Ala Pro Thr Leu Thr Leu
210 215 220
Tyr Val Gly Lys Lys Gln Leu Val Glu Ile Glu Lys Val Val Leu His
225 230 235 240
Pro Asn Tyr Ser Gln Val Asp Ile Gly Leu Ile Lys Leu Lys Gln Lys
245 250 255
Val Ser Val Asn Glu Arg Val Met Pro Ile Cys Leu Pro Ser Lys Asp
260 265 270
Tyr Ala Glu Val Gly Arg Val Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Asn
275 280 285
Ala Asn Phe Lys Phe Thr Asp His Leu Lys Tyr Val Met Leu Pro Val
290 295 300
Ala Asp Gln Asp Gln Cys Ile Arg His Tyr Glu Gly Ser Thr Val Pro
305 310 315 320
Glu Lys Lys Thr Pro Lys Ser Pro Val Gly Val Gln Pro Ile Leu Asn
325 330 335
Glu His Thr Phe Cys Ala Gly Met Ser Lys Tyr Gln Glu Asp Thr Cys
340 345 350
Tyr Gly Asp Ala Gly Ser Ala Phe Ala Val His Asp Leu Glu Glu Asp
355 360 365
Thr Trp Tyr Ala Thr Gly Ile Leu Ser Phe Asp Lys Ser Cys Ala Val
370 375 380
Ala Glu Tyr Gly Val Tyr Val Lys Val Thr Ser Ile Gln Asp Trp Val
385 390 395 400
Gln Lys Thr Ile Ala Glu Asn
405
<210> 2
<211> 1062
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
ctagctagca tgagtgccct gggagctgtc attgccctcc tgctctgggg acagcttttt 60
gcagtggact caggcaatga tgtcacggat atcgcagatg acggctgccc gaagcccccc 120
gagattgcac atggctatgt ggagcactcg gttcgctacc agtgtaagaa ctactacaaa 180
ctgcgcacag aaggagatgg agtgtacacc ttaaacaatg agaagcagtg gataaataag 240
gctgttggag ataaacttcc tgaatgtgaa gcagtatgtg ggaagcccaa gaatccggca 300
aacccagtgc agcggatcct gggtggacac ctggatgcca aaggcagctt tccctggcag 360
gctaagatgg tttcccacca taatctcacc acaggtgcca cgctgatcaa tgaacaatgg 420
ctgctgacca cggctaaaaa tctcttcctg aaccattcag aaaatgcaac agcgaaagac 480
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tttgataaga gctgtgctgt ggctgagtat ggtgtgtatg tgaaggtgac ttccatccag 1020
gactgggttc agaagaccat agctgagaac taactcgagc gg 1062