阅读说明：本技术 西伯利亚鲟球形脂联素蛋白基因原核表达的方法及应用 (Method for prokaryotic expression of acipenser baerii globular adiponectin protein gene and application ) 是由 李志琼 唐妮 徐少奇 李娅 刘晏伶 王美 陈虎 汪斌 田正志 张鑫 周朝伟 陈 于 2019-10-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种西伯利亚鲟球形脂联素蛋白基因原核表达的方法及应用,包括：(1)成熟肽基因的克隆；(2)重组质粒的构建；(3)重组质粒诱导表达。本发明的方法使西伯利亚鲟脂联素蛋白能够在原核生物内实现大批量、低成本生产,最后可用于功能验证等注射试验及添加剂。(The invention discloses a method for prokaryotic expression of a spherical adiponectin protein gene of Acipenser sibirica and application thereof, wherein the method comprises the following steps: (1) cloning mature peptide gene; (2) constructing a recombinant plasmid; (3) the recombinant plasmid induces expression. The method of the invention enables the Siberian sturgeon adiponectin protein to realize mass and low-cost production in prokaryotes, and can be finally used for injection tests and additives such as functional verification and the like.)

西伯利亚鲟球形脂联素蛋白基因原核表达的方法及应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种西伯利亚鲟球形脂联素蛋白基因原核表达的方法及应用。

背景技术

西伯利亚鲟(Acipenser baerii Brandt)属鲟科(Acipenserdae)鲟属(Acipenser)，具有食谱广、易驯养、生长快，鱼子酱质量高等特点，已被推广到世界许多国家和地区养殖。同时，中国是最大的鲟鱼鱼子酱生产国和出口国。可以看出西伯利亚鲟具有较高的经济价值。但西伯利亚鲟养殖周期长，对饲料营养全面性及均衡性要求高。在漫长的养殖过程中容易发生各种代谢相关的慢性疾病，如脂肪肝。因脂肪积累而产生的脂肪肝将会影响鲟鱼的生长和发育，导致鱼子酱的产量和质量下降，影响经济效益。

脂联素(Adiponectin,AdipoQ)是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质，主要在脂肪降解和葡萄糖水平调节中发挥作用，也在抗炎和动脉粥样、促血管形成因子和抗血管形成因子中发挥作用。因此，若能将脂联素蛋白应用到西伯利亚鲟的养殖中，可减少该鱼在养殖中发生代谢性疾病的可能性，从而提升养殖效率和经济效益。因此，脂联素蛋白具有广泛的应用前景。

西伯利亚鲟脂联素蛋白包括球形脂联素(global adiponectin，gAd)，该蛋白常被应用于脂联素蛋白的功能验证试验。球形脂联素的合成主要依靠人工合成，成本较高，产量较低，仅可用于试验，而无法满足实际养殖生产过程中的需求。

发明内容

本发明的目的在于：针对现有技术中人工合成球形脂联素，成本高，产量低，无法满足实际养殖生产过程中的需求的问题，提供一种西伯利亚鲟球形脂联素蛋白基因原核表达的方法及应用。

本发明采用的技术方案如下：

一种西伯利亚鲟球形脂联素蛋白基因原核表达的方法，包括：

(1)成熟肽基因的克隆：根据球形脂联素蛋白的氨基酸序列，设计分别带有BamHI酶切位点和HindⅢ酶切位点的上下游引物，进行PCR扩增，得到目的核苷酸片段；

(2)重组质粒的构建：将原核表达载体与目的核苷酸片段进行重组，构成能表达出氨基酸序列的重组质粒；

(3)重组质粒诱导表达：将重组质粒导入表达菌株中，并利用诱导剂诱导重组质粒在表达菌株中表达。

进一步地，(3)中表达菌株为E.coli BL21，诱导剂为异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷。

进一步地，将重组质粒转化到表达菌株E.coli BL21中，在37℃，200rpm/min条件下于含氨苄霉素的液体LB培养基中培养至OD₆₀₀值达0.4～0.6，再添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导培养，使重组质粒在表达菌株中表达。

进一步地，诱导培养的条件为：温度为37℃，诱导剂浓度为1.0-1.2mmol/L，诱导时间为6-8h。

上述的方法在蛋白功能试验或制备添加剂中的应用。

用于上述的方法中的上下游引物，具体为：

上游引物：5'-AAAGGATCCGCCCTCCTCTACCGC-3'；

下游引物：5'-GGAAGCTTGCGATCTCCGTTTACTGT-3'。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、本发明通过基因工程技术合成西伯利亚鲟球形脂联素蛋白，选择了一种可用于西伯利亚鲟脂联素蛋白体外表达的原核载体，获得的能够用于量化生产的重组质粒，让西伯利亚鲟脂联素可以在原核生物内实现大批量和低成本生产，在普通分子实验室即可制备，因而本发明具有产量高、成本低和方法简单的突出优势；

2、本发明通过对诱导条件进行优化，选择出最适宜的温度和时间以及诱导剂浓度，诱导表达效果良好；

3、本发明所生产的蛋白可用于蛋白功能试验或作为添加剂应用于实际养殖生产中，有效提升经济效益。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为gAd基因PCR产物电泳图谱；其中，M为DL2000 Marker；1-4为gAd基因的PCR产物；

图2为gAd/pET32a表达的IPTG诱导浓度优化的结果图；其中，M：蛋白marker；1：pET-32α(+)诱导；2：pET-32a-gAd未诱导样品；3-8：分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2mmol/L的IPTG浓度诱导pET-32a-gAd表达；

图3为gAd/pET32a表达的IPTG诱导时间优化的结果图；其中，M：蛋白marker；1:pET-32α(+)诱导；2：pET-32a-gAd未诱导样品；3-8：pET-32a-gAd转化菌分别诱导1.5、3、4.5、6、7.5和9h样品；

图4为重组成熟蛋白的可溶性检测结果图；其中，Marker、pET32a空载(1)、gAd-32a超生破碎后溶液(5)、gAd-32a超生破碎后沉淀(6)、gAd-32a超生破碎后上清液(7)；

图5为重组蛋白的纯化图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例

本发明较佳实施例提供的一种西伯利亚鲟球形脂联素蛋白基因原核表达的方法，具体步骤如下：

(1)成熟肽基因的克隆

用试剂盒提取西伯利亚鲟全脑总RNA，反转录合成第一链cDNA。根据克隆所得西伯利亚鲟脂联素序列，经与其他鱼类脂联素基因进行比对分析，得到球形脂联素(gAd)的成熟肽的基因序列，然后设计上游引物gAd-F(P1)：5'-AAAGGATCCGCCCTCCTCTACCGC-3'与下游引物gAd-R(P2)：5'-GGAAGCTTGCGATCTCCGTTTACTGT-3'。在P1的5'端增加BamHI酶切位点(GGATCC)及保护性碱基，在P2的5'端增加HindⅢ酶切位点(AAGCTT)及保护性碱基。采用上述引物进行PCR扩增，PCR扩增条件：94℃，5min变性，35个循环(94℃，30s；67℃，30s；72℃，50s)，72℃延伸10min。将目的片段切胶回收后连接到pMD19-T载体上，挑选阳性克隆测序验证。

PCR反应后的凝胶电泳图如图1所示。

(2)重组质粒的构建

抽提重组的gAd克隆质粒和表达载体pET-32a，分别用BamHI和HindⅢ双酶切，切胶回收，以T4连接酶连接得到表达重组质粒gAd/pET32a，转化至DH5α感受态细胞中，菌液培养后进行PCR检测和双酶切验证，对正确的重组质粒进行测序。

(3)重组质粒在表达菌株中的表达

将测序正确的表达重组质粒转化到表达菌株E.coli BL21(DE3)中，在液体LB培养基中(含氨苄青霉素)培养至OD₆₀₀值达0.4～0.6(37℃，200rpm/min)，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，1mmol/L)诱导培养,使重组质粒在表达菌株中表达。

预估pET32a-gAd重组表达质粒大小为36.807kD。

(4)诱导条件优化

菌液在37℃条件下培养至OD₆₀₀值为0.4～0.6时，分别加入IPTG至终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2mmol/L，震荡培养6小时，研究不同IPTG浓度对重组蛋白表达的诱导作用。

结果如图2显示：当IPTG诱导浓度为1.2mM时，pET32a-gAd重组蛋白的表达量高于其他浓度的IPTG处理组。

参照浓度优化的方法，菌液在37℃条件下培养至OD₆₀₀值为0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度1.0mmol/L，设置时间梯度1.5、3.0、4.5、6.0、7.5和9.0小时。随后进行SDS-PAGE电泳，研究不同诱导时间对重组蛋白表达的诱导作用。

结果如图3显示：pET32a-gAd蛋白的诱导时间为1.5h-9h均可。

(5)重组成熟蛋白的可溶性检测

菌液在37℃条件下培养至OD₆₀₀值为0.4～0.6时，加入1.2mM的IPTG诱导6h。在离心机上10000g离心5min，收集沉淀，用30mL的PBS洗涤一次。再加入30mL的PBS重悬沉淀，在超声波中进行破碎，超声破碎条件为冰水浴，30％振幅，超声5s、停歇5s，反复循环10min。超声波操作完后，在离心机上10000g离心5min，同时收集上清和沉淀，最后进行SDS-PAGE电泳，观察目的基因的表达产物主要存在于上清液还是沉淀，从而判定表达产物的是可溶性蛋白还是包涵体蛋白。如图4所示。

(5)重组蛋白的Western-blotting验证

收集以IPTG(1.2mmol/L)诱导6h的表达菌体，经SDS-PAGE电泳后，利用湿转印法将蛋白转移至PVDF膜上，洗膜后用封闭液(Solarbio)封闭。以6His单抗(TransGen)为一抗，4℃孵育。以HRP标记的山羊抗小鼠IgG(TransGen)为二抗，室温下孵育1h。用ECL试剂盒(Solarbio)显影2分钟后，通过凝胶电泳成像系统(Bio-rad)拍照。

(6)重组蛋白的纯化和复性

取37℃条件下IPTG(1.2mmol/L)诱导表达6h的重组菌，离心(10000g/min,5min)，收集沉淀并以PBS洗涤，用1/10体积的超声波破碎液重悬菌体，重悬后的菌液于冰浴中进行超声破碎，收集沉淀，将沉淀溶解于6M盐酸胍溶液中，用0.45μm微孔滤膜过滤，用Ni²⁺-NTA亲和层析柱(GE)分离纯化融合蛋白，通过SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度。结果如图5所示，将纯化获得的蛋白洗脱液，经透析袋梯度复性，利用BCA蛋白定量试剂盒检测得到的纯化重组蛋白浓度，再以0.22μm微孔滤膜过滤除菌后置于-80℃超低温冰箱保存备用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 西伯利亚鲟球形脂联素蛋白基因原核表达的方法及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 795

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaagctgg ttcggaccct tttcctttgc ctggtgttgg tggtgaagct gtcctactct 60

caggaggagg gtgaagaggt ggaggcggag gcccccgaag agcatgcaga aggcccaggc 120

ggtgaggtag tggatgagag gaagccatgt gccggctgga tgggaggcgt gccaggaacc 180

ccgggacaca atggagcctc cgggagagac ggcagagacg gacgagatgg aacaaaggga 240

gacacaggag aaccaggtgc acctggagag aagggtgaca ccggagagcc tggccttact 300

ggtccagagg gaccccgcgg cttccctggc accccaggcc tgaagggcga ccaaggggag 360

agcgccctcc tctaccgctc tgccttcagt gtggggctga cagaccgcac ccccatgccc 420

aacgtgccca tcaagttcag caagatcttc tacaacggcc agaggcacta cgatgacagc 480

acaggcaagt tccgctgctc cattcctgga gtgtactact tcacctacca cctcaccgtc 540

tacctgaaag acgtcaaggt cagcctgtac aagagtgaca agaccatcat gttcactttc 600

gaccagttcc aggaaaacaa cgtcgaccag gcttcaggct ccatcgtcct gcacctggag 660

acaggggagg aggtctggct tcaggtgtac ggagaagagg cctatgcagg aatctacgcc 720

gataacatca acgattccac gttttctgga ttccttctct accctgatat gaaaacagta 780

aacggagatc gctaa 795

<210> 3

<211> 264

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Lys Leu Val Arg Thr Leu Phe Leu Cys Leu Val Leu Val Val Lys

1 5 10 15

Leu Ser Tyr Ser Gln Glu Glu Gly Glu Glu Val Glu Ala Glu Ala Pro

20 25 30

Glu Glu His Ala Glu Gly Pro Gly Gly Glu Val Val Asp Glu Arg Lys

35 40 45

Pro Cys Ala Gly Trp Met Gly Gly Val Pro Gly Thr Pro Gly His Asn

50 55 60

Gly Ala Ser Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly

65 70 75 80

Asp Thr Gly Glu Pro Gly Ala Pro Gly Glu Lys Gly Asp Thr Gly Glu

85 90 95

Pro Gly Leu Thr Gly Pro Glu Gly Pro Arg Gly Phe Pro Gly Thr Pro

100 105 110

Gly Leu Lys Gly Asp Gln Gly Glu Ser Ala Leu Leu Tyr Arg Ser Ala

115 120 125

Phe Ser Val Gly Leu Thr Asp Arg Thr Pro Met Pro Asn Val Pro Ile

130 135 140

Lys Phe Ser Lys Ile Phe Tyr Asn Gly Gln Arg His Tyr Asp Asp Ser

145 150 155 160

Thr Gly Lys Phe Arg Cys Ser Ile Pro Gly Val Tyr Tyr Phe Thr Tyr

165 170 175

His Leu Thr Val Tyr Leu Lys Asp Val Lys Val Ser Leu Tyr Lys Ser

180 185 190

Asp Lys Thr Ile Met Phe Thr Phe Asp Gln Phe Gln Glu Asn Asn Val

195 200 205

Asp Gln Ala Ser Gly Ser Ile Val Leu His Leu Glu Thr Gly Glu Glu

210 215 220

Val Trp Leu Gln Val Tyr Gly Glu Glu Ala Tyr Ala Gly Ile Tyr Ala

225 230 235 240

Asp Asn Ile Asn Asp Ser Thr Phe Ser Gly Phe Leu Leu Tyr Pro Asp

245 250 255

Met Lys Thr Val Asn Gly Asp Arg

260

<210> 3

<211> 432

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gccctcctct accgctctgc cttcagtgtg gggctgacag accgcacccc catgcccaac 60

gtgcccatca agttcagcaa gatcttctac aacggccaga ggcactacga tgacagcaca 120

ggcaagttcc gctgctccat tcctggagtg tactacttca cctaccacct caccgtctac 180

ctgaaagacg tcaaggtcag cctgtacaag agtgacaaga ccatcatgtt cactttcgac 240

cagttccagg aaaacaacgt cgaccaggct tcaggctcca tcgtcctgca cctggagaca 300

ggggaggagg tctggcttca ggtgtacgga gaagaggcct atgcaggaat ctacgccgat 360

aacatcaacg attccacgtt ttctggattc cttctctacc ctgatatgaa aacagtaaac 420

ggagatcgct aa 432

<210> 4

<211> 143

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ala Leu Leu Tyr Arg Ser Ala Phe Ser Val Gly Leu Thr Asp Arg Thr

1 5 10 15

Pro Met Pro Asn Val Pro Ile Lys Phe Ser Lys Ile Phe Tyr Asn Gly

20 25 30

Gln Arg His Tyr Asp Asp Ser Thr Gly Lys Phe Arg Cys Ser Ile Pro

35 40 45

Gly Val Tyr Tyr Phe Thr Tyr His Leu Thr Val Tyr Leu Lys Asp Val

50 55 60

Lys Val Ser Leu Tyr Lys Ser Asp Lys Thr Ile Met Phe Thr Phe Asp

65 70 75 80

Gln Phe Gln Glu Asn Asn Val Asp Gln Ala Ser Gly Ser Ile Val Leu

85 90 95

His Leu Glu Thr Gly Glu Glu Val Trp Leu Gln Val Tyr Gly Glu Glu

100 105 110

Ala Tyr Ala Gly Ile Tyr Ala Asp Asn Ile Asn Asp Ser Thr Phe Ser

115 120 125

Gly Phe Leu Leu Tyr Pro Asp Met Lys Thr Val Asn Gly Asp Arg

130 135 140

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaaggatccg ccctcctcta ccgc 24

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggaagcttgc gatctccgtt tactgt 26