阅读说明：本技术 一种梅鱼加工副产品的抗真菌肽的制备方法 (Preparation method of antifungal peptide of meiyu processing byproduct ) 是由 陈美龄 胡嘉惠 于 2019-10-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术提取领域,针对现有技术的抗真菌肽抗菌活性较低及抑菌种类有限的问题,公开了一种梅鱼加工副产品的抗真菌肽制备方法,包括以下步骤：(1)、预处理；(2)、酶解；(3)、过滤得澄清液；(4)、分离纯化；(5)、多肽分级；(6)、培养观察抑菌圈。本发明提供了一种梅鱼加工副产品的抗真菌肽制备方法,该抗真菌肽具有较高的抗菌活性,且是初次从梅鱼中提取抗真菌肽；该抗真菌肽是从梅鱼的加工副产品鱼头中进行提取,实现废物再利用,成本较低；丰富了抗真菌肽的种类,能更好的对食品进行保质保鲜,助于了解利用梅鱼副产物蛋白质水解后的抗真菌肽保存食物、防止腐败和病原微生物。(The invention relates to the field of biotechnological extraction, and discloses a preparation method of antifungal peptide of a meiyu processing byproduct, aiming at the problems of low antibacterial activity and limited antibacterial types of antifungal peptide in the prior art, wherein the preparation method comprises the following steps: (1) and (4) preprocessing; (2) carrying out enzymolysis; (3) filtering to obtain clear liquid; (4) separating and purifying; (5) classifying the polypeptide; (6) and culturing and observing the bacteriostatic zone. The invention provides a preparation method of antifungal peptide of a meiyu processing byproduct, wherein the antifungal peptide has higher antibacterial activity and is extracted from the meiyu for the first time; the antifungal peptide is extracted from the fish head which is a processing byproduct of the mermaid, so that the waste is recycled, and the cost is low; the variety of the antifungal peptide is enriched, the food can be better preserved and fresh, the understanding of food preservation by the antifungal peptide after the hydrolysis of the meiyu byproduct protein is facilitated, and the putrefaction and pathogenic microorganisms are prevented.)

一种梅鱼加工副产品的抗真菌肽的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术提取领域，尤其是涉及一种梅鱼加工副产品的抗真菌肽的制备方法。

背景技术

食品安全是公共卫生领域的一个重要问题，随着我国居民生活水平的不断提高，人们对食品质量和安全的关注程度越来越高，而由微生物引起的食品腐败和食物中毒是食品安全的首要问题，尤其是含糖和淀粉高的食品容易受真菌污染，且在一定的条件下可产生有毒代谢产物—真菌毒素。

抗菌肽是小分子化合物，通常有10-50个氨基酸，抗菌肽来源非常广泛，昆虫、哺乳类、两栖类、细菌和真菌及植物体内都有发现；海洋动物生活于富含各种各样微生物的水环境中长期的生存适应使其形成了有效防御功能，抗菌肽已被认为鱼、虾、贝等防御系统的主要成分之一；这些肽可以通过酶促水解或者化学水解在体外产生，在食品工业中抗菌肽发挥着积极的作用，它可以抑制病原细菌和真菌在食品中的生长，抗真菌肽是抗菌肽中的一个子部分。

梅鱼是一种小型海洋鱼类，有重要的经济价值，这种鱼常被用来制作罐头制品，在加工过程中会产生大量的抗真菌肽。

专利号CN200910175405.8，专利名称为“一种抗真菌肽及其制备方法和应用”，本发明提供了一种抗真菌肽，是从苦荞种子水溶性提取物中纯化得到的，分子量为3.909kDa的多肽。该抗真菌肽的制备方法是取苦荞种子粉碎，脱脂，使用缓冲液抽提，经抽提获得粗蛋白后，经过热处理，蛋白质层析分离即Resource S阳离子交换和Superdex peptide凝胶排阻层析纯化而获得。该抗真菌肽对白腐菌，绿色木霉和链格孢霉的生长有显著的抑制作用。

其不足之处在于，上述抗真菌肽为植物提取物，其抗菌活性较低，且只对特定菌种有一定的抑制作用。

发明内容

本发明是为了克服现有技术的抗真菌肽抗菌活性较低及抑菌种类有限的问题，提供一种梅鱼加工副产品的抗真菌肽的制备方法，该抗真菌肽具有较高的抗菌活性，且该抗真菌肽是从梅鱼的加工副产品鱼头中进行提取，实现废物再利用，且是初次从梅鱼中提取，丰富了抗真菌肽的种类，能更好的对食品进行保质保鲜。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种梅鱼加工副产品的抗真菌肽的制备方法，包括以下制备步骤：

（1）、预处理：将梅鱼鱼头进行清洗后绞碎，在料液比为1:6-9 (m/v)，温度为48-52℃的条件下，用94-96%的甲醇水浴脱脂2-2.2h；脱脂后将上清液倒掉，用纯水将沉淀洗净，将脱脂鱼肉在0-4℃、11900-12000 r/min条件下离心20-25min，收集沉淀；

（2）、酶解：将鱼肉加到含有中性蛋白酶的酶解液中进行酶解；其中，中性蛋白酶的浓度为0.05-0.25wt%，酶解液质量为鱼肉质量的2-4倍，酶解温度为30-45℃，酶解液pH至控制在5-6，酶解时间为5-5.4h；

（3）、过滤得澄清液：向酶解液中添加质量为酶解液1-2wt%的改性果木活性炭，并将酶解液加热并脱色；将脱色后的酶解液转移至板框过滤池内进行过滤，取澄清液；

（4）、分离纯化：将澄清液鼓气起泡，并收集泡沫液，在鼓气的同时注水；待收集的泡沫液灭泡后，对泡沫液进行重金属分离；向重金属分离后的泡沫液中添加质量为泡沫液1-2%的磁性亲和微球并分散均匀，静置亲和吸附50-60min后利用磁场使磁性亲和微球聚集；分离出磁性亲和微球后，用pH值为7-7.2的缓冲液对磁性亲和微球进行洗脱，得到洗脱液，再将洗脱液的pH调至6-8之间，然后用乙酸乙酯提取，并于35-40℃下进行蒸干浓缩，使得浓缩液浓度为25-30%；

（5）、多肽分级：多肽分级：采用膜对浓缩液按分子量进行分离，得到目标分子量的抗真菌肽；

（6）、培养观察抑菌圈：琼脂扩散法筛选多肽的抗真菌活性，将肽物质添加至含有黑曲霉标准菌株的培养基，观察抑菌区域，测量抑菌直径。

初次从梅鱼中提取抗真菌肽，扩种了抗菌肽的提取来源，丰富了抗菌肽种类，对食品防腐具有显著的促进作用，通过多次分离纯化，提取得到纯度较高的抗真菌肽，多次分离筛选得到最优活性的抗真菌肽。

抗真菌肽对真菌的作用机理通常为抗真菌肽对真菌细胞壁、细胞膜、和真菌内细胞器的作用。真菌的细胞壁由几丁质、葡聚糖、脂质组成，肽***到蛋白质基质中，真菌的细胞壁明显受到内压，细胞壁受到破损、真菌裂解；肽穿过细胞膜后与细胞内目标特异性结合，抑制DNA、RNA以及蛋白质的合成，从而使细胞膜完整性受到破坏，从而达到抗菌的目的。

作为优选，步骤（3）所述改性果木活性炭的制备步骤为：

对果壳活性炭，先用0.5-0.8mol/L 稀硫酸于60-65℃ 浸泡果木活性炭1.8-2.2h，将样品过滤后再缓慢加入0.8-1mol/L的盐酸，于60-70℃浸泡8-10h 后用去离子水洗涤至中性，后加入去离子水98-100℃煮沸1.8-2.2h，之后用纯水冲洗2-3次后，置于98-102℃烘箱中烘干；称取预处理后的果壳活性炭，分别用15-18%的氨水浸泡并磁力搅拌1.8-2.2 h，再用去离子水将上述果壳活性炭冲洗至pH值达到6.8-7为止，然后在98-102℃下干燥22-24 h，即可得到改性后的果壳活性炭。

选用果壳活性炭是因为其极性较小，避免其吸附抗真菌肽等大分子，改性后能够增加果壳活性炭的小孔和表面的沟壑，增加活性炭的吸附能力，能够将色素都吸附掉，改性处理使得活性炭的吸附能力达到一个平衡值，既能充分的将色素去除，又不会吸收溶液中的抗真菌肽。

作为优选，步骤（4）鼓气速率为3-4L/min，注水速率为0.2-0.3L/min，澄清液温度保持在25-35℃。

作为优选，步骤（3）中加热温度为70-80℃，脱色时间为30-40min。

作为优选，步骤（5）分级所得抗真菌肽目标分子量为1200-3800Da。

作为优选，所述抗真菌肽从梅鱼的加工副产品中提取。

能够实现物尽其用，将废弃的鱼头再次充分使用，对实物抑菌防腐有极大的促进作用，降低了添加防腐剂等带来的身体损伤。

作为优选，步骤（5）所述的膜为孔径为10-50nm的超滤膜或纳滤膜。

作为优选，步骤（6）所述的培养条件为36-38℃培养70-72h。

因此，本发明具有如下有益效果：

（1）提供一种梅鱼加工副产品的抗真菌肽的制备方法，该抗真菌肽具有较高的抗菌活性，且是初次从梅鱼中提取抗真菌肽；

（2）该抗真菌肽是从梅鱼的加工副产品鱼头中进行提取，实现废物再利用，成本较低；

（3）丰富了抗真菌肽的种类，能更好的对食品进行保质保鲜，助于了解利用梅鱼副产物蛋白质水解后的抗真菌肽保存食物、防止腐败和病原微生物；

（3）并且该制备工艺的可控性好，易于实际大规模工业化量产，制得的产品收率高，纯度高，活性好。

附图说明

图1是中性蛋白酶水解获得抗菌肽在黑曲霉上的抑菌圈图。

图2是胃蛋白酶水解获得抗菌肽在黑曲霉上的抑菌圈图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步的描述。

实施例1

一种梅鱼加工副产品的抗真菌肽的制备方法，其特征是，包括以下制备步骤：

（1）、预处理：将梅鱼鱼头进行清洗后绞碎，在料液比为1:7.5 (m/v)，温度为50℃的条件下，用95%的甲醇水浴脱脂2.1h；脱脂后将上清液倒掉，用纯水将沉淀洗净，将脱脂鱼肉在2℃、11950 r/min条件下离心23min，收集沉淀；

（2）、酶解：将鱼肉加到含有中性蛋白酶的酶解液中进行酶解；其中，中性蛋白酶的浓度为0.2wt%，酶解液质量为鱼肉质量的3倍，酶解温度为40℃，酶解液pH至控制在5.5，酶解时间为5.2h；

（3）、过滤得澄清液：向酶解液中添加质量为酶解液1.5wt%的改性果木活性炭，并将酶解液加热并脱色，加热温度为75℃，脱色时间为35min；将脱色后的酶解液转移至板框过滤池内进行过滤，取澄清液；

所述改性果木活性炭的制备步骤为：

对果壳活性炭，先用0.65mol/L 稀硫酸于62℃ 浸泡果木活性炭2h，将样品过滤后再缓慢加入0.9mol/L的盐酸，于65℃浸泡9h 后用去离子水洗涤至中性，后加入去离子水99℃煮沸2h，之后用纯水冲洗2次后，置于100℃烘箱中烘干；称取预处理后的果壳活性炭，分别用17%的氨水浸泡并磁力搅拌2 h，再用去离子水将上述果壳活性炭冲洗至pH值达到6.9为止，然后在100℃下干燥23h，即可得到改性后的果壳活性炭。

（4）、分离纯化：将澄清液鼓气起泡，并收集泡沫液，在鼓气的同时注水；鼓气速率为3.5L/min，注水速率为0.25L/min，澄清液温度保持在30℃；待收集的泡沫液灭泡后，对泡沫液进行重金属分离；向重金属分离后的泡沫液中添加质量为泡沫液1.5%的磁性亲和微球并分散均匀，静置亲和吸附50-60min后利用磁场使磁性亲和微球聚集；分离出磁性亲和微球后，用pH值为7.1的缓冲液对磁性亲和微球进行洗脱，得到洗脱液，再将洗脱液的pH调至7之间，然后用乙酸乙酯提取，并于38℃下进行蒸干浓缩，使得浓缩液浓度为28%；

（5）、多肽分级：采用30nm的超滤膜或纳滤膜对膜过滤后的浓缩液按分子量进行分离，得到目标分子量的抗真菌肽，所得抗真菌肽目标分子量为1400-3000Da；

（6）、培养观察抑菌圈：琼脂扩散法筛选多肽的抗真菌活性，将肽物质添加至含有黑曲霉标准菌株的培养基，培养条件为37℃培养71h，观察抑菌区域，测量抑菌直径。

结果：所得抑菌圈直径为22.2±1.4mm。

实施例2

一种梅鱼加工副产品的抗真菌肽的制备方法，其特征是，包括以下制备步骤：

（1）、预处理：将梅鱼鱼头进行清洗后绞碎，在料液比为1:6 (m/v)，温度为48℃的条件下，用94%的甲醇水浴脱脂2h；脱脂后将上清液倒掉，用纯水将沉淀洗净，将脱脂鱼肉在0℃、11900 r/min条件下离心20min，收集沉淀；

（2）、酶解：将鱼肉加到含有中性蛋白酶的酶解液中进行酶解；其中，中性蛋白酶的浓度为0.05wt%，酶解液质量为鱼肉质量的2倍，酶解温度为30℃，酶解液pH至控制在5，酶解时间为5h；

（3）、过滤得澄清液：向酶解液中添加质量为酶解液1wt%的改性果木活性炭，并将酶解液加热并脱色，加热温度为70℃，脱色时间为30min；将脱色后的酶解液转移至板框过滤池内进行过滤，取澄清液；

所述改性果木活性炭的制备步骤为：

对果壳活性炭，先用0.5mol/L 稀硫酸于60℃ 浸泡果木活性炭1.8h，将样品过滤后再缓慢加入0.8mol/L的盐酸，于60℃浸泡8h 后用去离子水洗涤至中性，后加入去离子水98℃煮沸1.8h，之后用纯水冲洗2次后，置于98℃烘箱中烘干；称取预处理后的果壳活性炭，分别用15%的氨水浸泡并磁力搅拌1.8h，再用去离子水将上述果壳活性炭冲洗至pH值达到6.8为止，然后在98℃下干燥22h，即可得到改性后的果壳活性炭。

（4）、分离纯化：将澄清液鼓气起泡，并收集泡沫液，在鼓气的同时注水；鼓气速率为3L/min，注水速率为0.2L/min，澄清液温度保持在25℃；待收集的泡沫液灭泡后，对泡沫液进行重金属分离；向重金属分离后的泡沫液中添加质量为泡沫液1%的磁性亲和微球并分散均匀，静置亲和吸附50min后利用磁场使磁性亲和微球聚集；分离出磁性亲和微球后，用pH值为7的缓冲液对磁性亲和微球进行洗脱，得到洗脱液，再将洗脱液的pH调至6之间，然后用乙酸乙酯提取，并于35℃下进行蒸干浓缩，使得浓缩液浓度为25%；

（5）、多肽分级：采用10nm的超滤膜或纳滤膜对膜过滤后的浓缩液按分子量进行分离，得到目标分子量的抗真菌肽，所得抗真菌肽目标分子量为1200Da；

（6）、培养观察抑菌圈：琼脂扩散法筛选多肽的抗真菌活性，将肽物质添加至含有黑曲霉标准菌株的培养基，培养条件为36℃培养70h，观察抑菌区域，测量抑菌直径。

结果：所得抑菌圈直径为21.8±1.2mm。

实施例3

一种梅鱼加工副产品的抗真菌肽的制备方法，其特征是，包括以下制备步骤：

（1）、预处理：将梅鱼鱼头进行清洗后绞碎，在料液比为1:9 (m/v)，温度为52℃的条件下，用96%的甲醇水浴脱脂2.2h；脱脂后将上清液倒掉，用纯水将沉淀洗净，将脱脂鱼肉在4℃、12000 r/min条件下离心25min，收集沉淀；

（2）、酶解：将鱼肉加到含有中性蛋白酶的酶解液中进行酶解；其中，中性蛋白酶的浓度为0.25wt%，酶解液质量为鱼肉质量的4倍，酶解温度为45℃，酶解液pH至控制在6，酶解时间为5.4h；

（3）、过滤得澄清液：向酶解液中添加质量为酶解液2wt%的改性果木活性炭，并将酶解液加热并脱色，加热温度为80℃，脱色时间为40min；将脱色后的酶解液转移至板框过滤池内进行过滤，取澄清液；

所述改性果木活性炭的制备步骤为：

对果壳活性炭，先用0.8mol/L 稀硫酸于65℃ 浸泡果木活性炭2.2h，将样品过滤后再缓慢加入1mol/L的盐酸，于70℃浸泡10h 后用去离子水洗涤至中性，后加入去离子水100℃煮沸2.2h，之后用纯水冲洗3次后，置于102℃烘箱中烘干；称取预处理后的果壳活性炭，分别用18%的氨水浸泡并磁力搅拌2.2 h，再用去离子水将上述果壳活性炭冲洗至pH值达到7为止，然后在102℃下干燥24 h，即可得到改性后的果壳活性炭。

（4）、分离纯化：将澄清液鼓气起泡，并收集泡沫液，在鼓气的同时注水；鼓气速率为4L/min，注水速率为0.3L/min，澄清液温度保持在35℃；待收集的泡沫液灭泡后，对泡沫液进行重金属分离；向重金属分离后的泡沫液中添加质量为泡沫液2%的磁性亲和微球并分散均匀，静置亲和吸附60min后利用磁场使磁性亲和微球聚集；分离出磁性亲和微球后，用pH值为7.2的缓冲液对磁性亲和微球进行洗脱，得到洗脱液，再将洗脱液的pH调至8之间，然后用乙酸乙酯提取，并于40℃下进行蒸干浓缩，使得浓缩液浓度为30%；

（5）、多肽分级：采用50nm的超滤膜或纳滤膜对膜过滤后的浓缩液按分子量进行分离，得到目标分子量的抗真菌肽，所得抗真菌肽目标分子量为3800Da；

（6）、培养观察抑菌圈：琼脂扩散法筛选多肽的抗真菌活性，将肽物质添加至含有黑曲霉标准菌株的培养基，培养条件为38℃培养72h，观察抑菌区域，测量抑菌直径。

结果：所得抑菌圈直径为21.5±1.6mm。

对比例1

与实施例1的区别在于，酶解步骤将中性蛋白酶换成胃蛋白酶。

结果：所得抑菌圈直径为16.385±1.2mm。

分析：酶解过程需要使用对蛋白质水解效果最优的中性蛋白酶，否则将会降低抗真菌肽的活性，影响其抑菌抗菌效果。

对比例2

与实施例1的区别在于，省去了分离纯化步骤。

结果：所得抑菌圈直径为14.46±1.4mm。

分析：未对抗真菌多肽进行分离提纯，含有较多的杂质，抗真菌肽混于杂质中，减少了抗真菌肽与霉菌的接触面积，同时杂质中的营养物质也促使了霉菌的生长，所以抗真菌肽的抑菌效果变差。

对比例3

与实施例1的区别在于，将果木活性炭替换成木质活性炭。

结果：所得抑菌圈直径为13.84±1.2mm。

分析：木质活性炭的极性较大，在除去色素的同时也将大分子抗真菌肽吸附掉，到最终提取出来的抗真菌肽，含量较低，致使抗真菌肽整体的活性较差，所以其抑菌效果大大降低。

图1中N为中性蛋白酶，0为阴性对照（蒸馏水）；图2中P为胃蛋白酶，0为阴性对照（蒸馏水）；观察抑菌区域，测量抑菌直径，中性蛋白酶水解蛋白质获得抗真菌肽的抑菌圈直径为22.2±1.4mm，胃蛋白酶水解后的抑菌圈直径16.385±1.2mm，测量获得的抑制区的直径，直径越大，在特定浓度下抗菌化合物越强，说明梅鱼加工副产品提取的抗真菌肽具有较好的抗菌效果，且中性蛋白酶水解蛋白质获得抗真菌肽具有更优的抗菌性能。

由上述实施例1-3和对比例1-3相关的数据可知，只有在本发明权利要求范围内的方案，才能够在各方面均能满足上述要求，得出最优化的方案，得到最优的活性的抗真菌肽。而对于配比的改动、原料的替换/加减，或者加料顺序的改变，均会带来相应的负面影响。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。