用于乙醇生产的改善的酵母
阅读说明：本技术 用于乙醇生产的改善的酵母 (Improved yeast for ethanol production ) 是由 D·霍格西特 M·塔索内 P·V·哈里斯 C-L·宋 M·G·卡特利特 于 2018-06-01 设计创作，主要内容包括：本文描述了具有编码蛋白酶的异源多核苷酸的重组发酵生物。还描述了用这些重组发酵生物从含淀粉材料或含纤维素材料生产发酵产物如乙醇的方法。(Described herein are recombinant fermenting organisms having heterologous polynucleotides encoding proteases. Methods of using these recombinant fermenting organisms to produce fermentation products, such as ethanol, from starch-containing material or cellulose-containing material are also described.)
序列表的引用
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背景技术
从含淀粉材料和含纤维素材料生产乙醇是本领域中熟知的。
对于含淀粉材料，工业上最常使用的商业方法(通常被称作“传统方法”)包括在高温(约85℃)下典型地使用细菌α-淀粉酶液化经糊化的淀粉，随后典型地在葡糖淀粉酶和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)的存在下厌氧进行同时糖化和发酵(SSF)。
在本领域中存在若干种用于糖化纤维素和半纤维素以及用于发酵含有葡萄糖、甘露糖、木糖和***糖的水解产物的方法。葡萄糖和甘露糖在天然无氧代谢过程中有效地转化为乙醇。为了以工业规模获得经济上相关的方法，在改善水解产物中的发酵木糖方面已经取得了进展。
用于生产用作燃料的乙醇的酵母，如在玉米乙醇工业中，要求若干特性，以确保乙醇有效生产的成本。这些特性包括乙醇耐受性、低副产品产量、快速发酵、和限制残留在发酵中的剩余糖量的能力。这些特性对工业方法的可行性具有明显的作用。
酵母属的酵母表现出生产乙醇所需的许多特性。具体地，酿酒酵母的菌株在燃料乙醇工业中广泛用于乙醇生产。酿酒酵母的菌株被广泛用于燃料乙醇工业，具有在发现于，例如，玉米醪发酵中的发酵条件下生产高产量乙醇的能力。这种菌株的实例是在称为ETHANOL REDTM的可商购乙醇酵母产品中使用的酵母。
向玉米醪中添加外源蛋白酶已成为增加氨基氮的可用性且加快乙醇发酵的速率的战略方法(参见，例如Biomass[生物质]16(1988)2,第77-87页；US 5,231,017；WO 2003/066826；WO 2007/145912；WO 2010/008841；WO 2014/037438；WO 2015/078372)。
尽管在过去数十年乙醇生产方法有显著的改善，但是仍然希望并需要以经济和商业相关的规模，提供改善的从含淀粉材料和含纤维素材料发酵乙醇的方法。
发明内容
本文尤其描述了从含淀粉材料或含纤维素材料生产发酵产物(如乙醇)的方法，以及适用于此类方法的酵母。
第一方面涉及从含淀粉材料或含纤维素材料生产发酵产物的方法，这些方法包括：(a)糖化该含淀粉材料或含纤维素材料；和(b)用发酵生物发酵步骤(a)的经糖化的材料；其中该发酵生物包含编码蛋白酶的异源多核苷酸。
另一个方面涉及从含淀粉材料生产发酵产物的方法，这些方法包括：(a)用α-淀粉酶液化所述含淀粉材料；(b)糖化来自步骤(a)的液化醪；和(c)用发酵生物发酵步骤(b)的经糖化的材料；其中步骤(a)的液化和/或步骤(b)的糖化在外源添加的蛋白酶存在下进行；并且其中该发酵生物包含编码蛋白酶的异源多核苷酸。
在这些方法的一些实施例中，在同时糖化和发酵(SSF)中同时进行发酵和糖化。在其他实施例中，顺序进行发酵和糖化(SHF)。
在这些方法的一些实施例中，该方法包括从该发酵中(例如，通过蒸馏)回收该发酵产物。
在这些方法的一些实施例中，该发酵产物是乙醇。
在这些方法的一些实施例中，发酵在减氮条件下进行(例如，少于1000ppm补充尿素或氢氧化铵，如少于750ppm、少于500ppm、少于400ppm、少于300ppm、少于250ppm、少于200ppm、少于150ppm、少于100ppm、少于75ppm、少于50ppm、少于25ppm、或少于10ppm补充氮)。
在这些方法的一些实施例中，该蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，如属于家族53的丝氨酸蛋白酶。在一些实施例中，蛋白酶衍生自以下属的菌株：亚灰树花菌属(Meripilus)、栓菌属(Trametes)、叉丝孔菌属(Dichomitus)、多孔菌属(Polyporus)、革褶菌属(Lenzites)、灵芝属(Ganoderma)、香菇属(Neolentinus)或芽孢杆菌属(Bacillus)，更具体地大型亚灰树花菌(Meripilus giganteus)、变色栓菌(Trametes versicolor)、污叉丝孔菌(Dichomitussqualens)、漏斗多孔菌(Polyporus arcularius)、桦革褶菌(Lenzites betulinus)、灵芝(Ganoderma lucidum)、洁丽香菇(Neolentinus lepideus)、或芽孢杆菌属物种19138。
在这些方法的一些实施例中，该异源多核苷酸编码蛋白酶，该蛋白酶具有与SEQID NO:9-73中任一个(例如SEQ ID NO:9、14、16、21、22、33、41、45、61、62、66、67和69中任一个；如SEQ NO:9、14、16和69中任一个)的氨基酸序列至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的成熟多肽序列。
在这些方法的一些实施例中，该异源多核苷酸编码蛋白酶，该蛋白酶具有与SEQID NO:9-73中任一个(例如SEQ ID NO:9、14、16、21、22、33、41、45、61、62、66、67和69中任一个；如SEQ NO:9、14、16和69中任一个)的氨基酸序列相差不超过十个氨基酸，例如相差不超过五个氨基酸、相差不超过四个氨基酸、相差不超过三个氨基酸、相差不超过两个氨基酸、或相差一个氨基酸的成熟多肽序列。
在这些方法的一些实施例中，该异源多核苷酸编码蛋白酶，该蛋白酶具有包含SEQID NO:9-73中任一个(例如SEQ ID NO:9、14、16、21、22、33、41、45、61、62、66、67和69中任一个；如SEQ NO:9、14、16和69中任一个)的氨基酸序列或由其组成的成熟多肽序列。
在这些方法的一些实施例中，糖化步骤发生在含淀粉材料上，并且其中该含淀粉材料是糊化的或未糊化的淀粉。
在这些方法的一些实施例中，该发酵生物包含异源多核苷酸，该异源多核苷酸编码葡糖淀粉酶，如密孔菌(Pycnoporus)葡糖淀粉酶(例如，本文所述的血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)葡糖淀粉酶)、粘褶菌(Gloeophyllum)葡糖淀粉酶(例如，本文所述的篱边粘褶菌(Gloeophyllum sepiarium)或密粘褶菌(Gloeophyllum trabeum)葡糖淀粉酶)、或者酵母菌(Saccharomycopsis)葡糖淀粉酶(例如，本文所述的扣囊复膜酵母菌(Saccharomycopsis fibuligera)葡糖淀粉酶，如SEQ ID NO:102或103)。
在这些方法的一些实施例中，该方法包括在糖化之前，通过使该含淀粉材料与α-淀粉酶接触来液化该材料。
在这些方法的一些实施例中，该发酵生物包含异源多核苷酸，该异源多核苷酸编码α-淀粉酶，如芽孢杆菌α-淀粉酶(例如，本文所述的嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶)，或者德巴利酵母(Debaryomyces)α-淀粉酶(例如，本文所述的西方德巴利酵母(Debaryomyces occidentalis)α-淀粉酶)。
在这些方法的一些实施例中，糖化步骤发生在含纤维素材料上，并且其中该含纤维素材料经过预处理(例如，稀酸预处理)。
在这些方法的一些实施例中，糖化发生在含纤维素材料上，并且其中该酶组合物包含一种或多种选自以下的酶：纤维素酶(例如，内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、或β-葡糖苷酶)，AA9多肽，半纤维素酶(例如，木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、***呋喃糖苷酶、木糖苷酶、或葡糖醛酸糖苷酶)，CIP，酯酶，棒曲霉素，木质素分解酶，氧化还原酶，果胶酶，蛋白酶、以及膨胀素。
在这些方法的一些实施例中，该发酵生物是酵母属(Saccharomyces)、红酵母属(Rhodotorula)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、假丝酵母属(Candida)、耶氏酵母属(Yarrowia)、油脂酵母属(Lipomyces)、隐球菌属(Cryptococcus)或德克拉酵母属(Dekkera)菌种细胞。在一些实施例中，该发酵生物是酿酒酵母细胞。
另一个方面涉及包含编码蛋白酶的异源多核苷酸的重组酵母细胞。
在一些实施例中，该重组酵母细胞是酵母属、红酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、红冬孢酵母属、假丝酵母属、耶氏酵母属、油脂酵母属、隐球菌属或德克拉酵母属菌种细胞。在一些实施例中，该重组酵母细胞是酿酒酵母细胞。
在重组酵母细胞的一些实施例中，该蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，如属于家族53的丝氨酸蛋白酶。在一些实施例中，蛋白酶衍生自以下属的菌株：亚灰树花菌属、栓菌属、叉丝孔菌属、多孔菌属、革褶菌属、灵芝属、香菇属或芽孢杆菌属，更具体地大型亚灰树花菌、变色栓菌、污叉丝孔菌、漏斗多孔菌、桦革褶菌、灵芝、洁丽香菇、或芽孢杆菌属物种19138。
在重组酵母细胞的一些实施例中，该异源多核苷酸编码蛋白酶，该蛋白酶具有与SEQ ID NO:9-73中任一个(例如SEQ ID NO:9、14、16、21、22、33、41、45、61、62、66、67和69中任一个；如SEQ NO:9、14、16和69中任一个)的氨基酸序列至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的成熟多肽序列。
在重组酵母细胞的一些实施例中，该异源多核苷酸编码蛋白酶，该蛋白酶具有与SEQ ID NO:9-73中任一个(例如SEQ ID NO:9、14、16、21、22、33、41、45、61、62、66、67和69中任一个；如SEQ NO:9、14、16和69中任一个)的氨基酸序列相差不超过十个氨基酸，例如相差不超过五个氨基酸、相差不超过四个氨基酸、相差不超过三个氨基酸、相差不超过两个氨基酸、或相差一个氨基酸的成熟多肽序列。
在重组酵母细胞的一些实施例中，该异源多核苷酸编码蛋白酶，该蛋白酶具有包含SEQ ID NO:9-73中任一个(例如SEQ ID NO:9、14、16、21、22、33、41、45、61、62、66、67和69中任一个；如SEQ NO:9、14、16和69中任一个)的氨基酸序列或由其组成的成熟多肽序列。
在重组酵母细胞的一些实施例中，该发酵生物包含异源多核苷酸，该异源多核苷酸编码葡糖淀粉酶，如密孔菌葡糖淀粉酶(例如，本文所述的血红密孔菌葡糖淀粉酶)、粘褶菌葡糖淀粉酶(例如，本文所述的篱边粘褶菌或密粘褶菌葡糖淀粉酶)、或者酵母菌葡糖淀粉酶(例如，本文所述的扣囊复膜酵母菌葡糖淀粉酶，如SEQ ID NO:102或103)。
在重组酵母细胞的一些实施例中，该发酵生物包含异源多核苷酸，该异源多核苷酸编码α-淀粉酶，如芽孢杆菌α-淀粉酶(例如，本文所述的嗜热脂肪芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、或地衣芽孢杆菌α-淀粉酶)，或者德巴利酵母α-淀粉酶(例如，本文所述的西方德巴利酵母α-淀粉酶)。
附图说明
图1显示了使用BODIPY-TRX酪蛋白底物，来自污叉丝孔菌和大型亚灰树花菌的纯化的蛋白酶的剂量应答，表明蛋白酶剂量的增加成比例地增加了荧光强度检测。
图2显示了来自实例部分中所示的酵母菌株的酵母培养上清液的分泌葡糖淀粉酶活性。
图3显示了使用BODIPY-TRX酪蛋白作为底物，来自酵母菌株的分泌蛋白酶活性，这些酵母菌株含有来自污叉丝孔菌或大型亚灰树花菌的蛋白酶基因。
图4显示了来自纯化的蛋白酶或酵母培养上清液的水解玉米素蛋白的清除区，该纯化的蛋白酶或酵母培养上清液含有来自污叉丝孔菌或大型亚灰树花菌的分泌蛋白酶。
图5显示了来自玉米醪发酵测定的残余葡萄糖结果，其中相对于缺乏异源蛋白酶的对照菌株(24hr发酵；0ppm外源尿素)，酵母表达来自污叉丝孔菌或大型亚灰树花菌的蛋白酶。
图6显示了来自玉米醪发酵测定的甘油/乙醇比率结果，其中相对于缺乏异源蛋白酶的对照菌株(24hr发酵；0ppm外源尿素)，酵母表达来自污叉丝孔菌或大型亚灰树花菌的蛋白酶。
图7显示了来自玉米醪发酵测定的残余葡萄糖结果，其中相对于缺乏异源蛋白酶的对照菌株(54hr发酵；0ppm外源尿素)，酵母表达来自污叉丝孔菌或大型亚灰树花菌的蛋白酶。
图8显示了来自玉米醪发酵测定的乙醇产率结果，其中相对于缺乏异源蛋白酶的对照菌株(54hr发酵；0ppm外源尿素)，酵母表达来自污叉丝孔菌或大型亚灰树花菌的蛋白酶。
图9显示了来自玉米醪发酵测定的甘油/乙醇比率结果，其中相对于缺乏异源蛋白酶的对照菌株(54hr发酵；0ppm外源尿素)，酵母表达来自污叉丝孔菌或大型亚灰树花菌的蛋白酶。
图10显示了来自尿素剂量应答测定的乙醇产率结果，其中相对于缺乏异源蛋白酶的对照菌株(51hr发酵)，酵母表达来自大型亚灰树花菌的蛋白酶。
图11显示了来自SSF的乙醇产率结果，其中酵母表达来自大型亚灰树花菌的蛋白酶，并且在液化步骤中添加了不同量的蛋白酶。
图12显示了来自SSF的乙醇产率结果，其中蛋白酶表达表18中所示的酵母菌株B2-B32和对照菌株B1。菌株B2-B32不含外源尿素。在没有外源尿素的情况下(左柱)和在具有1000ppm外源尿素的情况下(右柱)测试了对照菌株B1。底部水平线代表无尿素的对照菌株(B1)的性能，而顶部水平线代表添加1000ppm外源尿素的对照菌株(B1)的性能。
图13显示了来自SSF的乙醇产率结果，其中蛋白酶表达表18中所示的酵母菌株B34-B72和对照菌株B1。菌株B2-B32不含外源尿素。在没有外源尿素的情况下(左柱)和在具有1000ppm外源尿素的情况下(右柱)测试了对照菌株B1。底部水平线代表无尿素的对照菌株(B1)的性能，而顶部水平线代表添加1000ppm外源尿素的对照菌株(B1)的性能。
定义
除非由上下文以另外的方式定义或清楚表明，本文使用的所有技术术语和科学术语具有如本领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
辅助活性9：术语“辅助活性9”或“AA9”意指分类为溶解性多糖单加氧酶(Quinlan等人,2011,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]208:15079-15084；Phillips等人,2011,ACS Chem.Biol.[ACS化学生物学]6:1399-1406；Lin等人,2012,Structure[结构]20:1051-1061)的多肽。根据Henrissat,1991,Biochem.J.[生物化学杂志]280:309-316以及Henrissat和Bairoch,1996,Biochem.J.[生物化学杂志]316:695-696，AA9多肽之前被分类为糖苷水解酶家族61(GH61)。
AA9多肽通过具有纤维素分解活性的酶增强含纤维素材料的水解。可以通过测量在以下条件下与不具有纤维素分解增强活性的相等的总蛋白负载的对照水解(1-50mg纤维素分解蛋白/g的PCS中的纤维素)相比，由纤维素分解酶水解含纤维素材料的还原糖的增加或纤维二糖与葡萄糖总量的增加来确定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白/g于预处理的玉米秸秆(PCS)中的纤维素，其中总蛋白由50％-99.5％w/w纤维素分解酶蛋白和0.5％-50％w/w AA9多肽蛋白组成，在适合的温度(如40C-80℃，例如50℃、55℃、60℃、65℃或70℃)和适合的pH(如4-9，例如4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0或8.5)下持续1-7天。
可以使用CELLUCLASTTM 1.5L(诺维信公司(Novozymes A/S)，巴格斯瓦德(Bagsvaerd)，丹麦)和β-葡糖苷酶的混合物作为纤维素分解活性的来源来确定AA9多肽增强活性，其中该β-葡糖苷酶是以纤维素酶蛋白负载的至少2％-5％蛋白质的重量存在的。在一个实施例中，该β-葡糖苷酶是米曲霉(Aspergillus oryzae)β-葡糖苷酶(例如，根据WO02/095014，在米曲霉中重组产生的)。在另一个实施例中，该β-葡糖苷酶是烟曲霉(Aspergillus fumigatus)β-葡糖苷酶(例如，如在WO 02/095014中所述的，在米曲霉中重组产生的)。
AA9多肽增强活性还可以通过以下来确定：在40℃，将AA9多肽与0.5％磷酸溶胀纤维素(PASC)、100mM乙酸钠(pH 5)、1mM MnSO4、0.1％没食子酸、0.025mg/ml的烟曲霉β-葡糖苷酶，以及0.01％
还可以根据WO 2013/028928确定高温组合物的AA9多肽增强活性。
AA9多肽通过将达到相同的水解程度所需要的纤维素分解酶的量降低优选至少1.01倍，例如至少1.05倍、至少1.10倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍，来增强由具有纤维素分解活性的酶催化的含纤维素材料的水解。
β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase)(E.C.3.2.1.21)，该酶催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。可以根据Venturi等人,2002,J.Basic Microbiol.[基础微生物学杂志]42:55-66的程序使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物来确定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃、pH 4.8下，在含有0.01％
β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指β-D-木糖苷木糖水解酶(β-D-xylosidexylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，该酶催化短β(1→4)-低聚木糖的外切水解，以将连续的D-木糖残基从非还原性末端去除。可以在含有0.01％
过氧化氢酶：术语“过氧化氢酶”意指过氧化氢:过氧化氢氧化还原酶(EC1.11.1.6)，该酶催化2H2O2转化为O2+2H2O。出于本发明的目的，根据美国专利号5,646,025确定过氧化氢酶活性。一个单位的过氧化氢酶活性等于在测定条件下催化1微摩尔的过氧化氢氧化的酶的量。
催化结构域：术语“催化结构域”意指酶的含有该酶的催化机构的区域。
纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91和E.C.3.2.1.176)，该酶催化纤维素、纤维低聚糖、或任何含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中1,4-β-D-糖苷键的水解，从而从该链的还原性末端(纤维二糖水解酶I)或非还原性末端(纤维二糖水解酶II)释放纤维二糖(Teeri,1997,Trends inBiotechnology[生物技术趋势]15:160-167；Teeri等人,1998,Biochem.Soc.Trans.[生物化学学会会刊]26:173-178)。可以根据Lever等人,1972,Anal.Biochem.[分析生物化学]47:273-279；van Tilbeurgh等人,1982,FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]149:152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]187:283-288；以及Tomme等人,1988,Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]170:575-581所描述的程序来确定纤维二糖水解酶活性。
纤维素分解酶或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指水解含纤维素材料的一种或多种(例如，若干种)酶。此类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种β-葡糖苷酶、或其组合。用于测量纤维素分解酶活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解酶活性，以及(2)测量个体纤维素分解酶活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如在Zhang等人,2006,Biotechnology Advances[生物技术进展]24:452-481中所述的。可以使用不溶性底物(包括沃特曼1号(Whatman№1)滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、预处理的木质纤维素等)测量总纤维素分解酶活性。最常见的总纤维素分解活性测定是将沃特曼1号滤纸用作底物的滤纸测定。该测定是由国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)建立的(Ghose,1987,Pure Appl.Chem.[纯粹与应用化学]59:257-68)。
可以通过测量在以下条件下与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比，在一种或多种纤维素分解酶对含纤维素材料的水解过程中产生/释放的糖的增加来确定纤维素分解酶活性：1-50mg纤维素分解酶蛋白/g于预处理的玉米秸秆(PCS)中的纤维素(或其他预处理的含纤维素材料)，在适合的温度(如40℃-80℃，例如50℃、55℃、60℃、65℃、或70℃)和适合的pH(如4-9，例如，5.0、5.5、6.0、6.5、或7.0)下持续3-7天。典型条件为：1ml反应，洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固体(干重)，50mM乙酸钠(pH 5)，1mM MnSO4，50℃、55℃、或60℃，72小时，通过
编码序列：术语“编码序列”或“编码区”意指指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸序列。该编码序列的边界一般由开放阅读框决定，该开放阅读框通常以ATG起始密码子或替代起始密码子(如GTG和TTG)开始，并且以终止密码子(如TAA、TAG、和TGA)结束。该编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成的多核苷酸、和/或重组多核苷酸的一个序列。
控制序列：术语“控制序列”意指多肽表达所必需的核酸序列。控制序列对于编码多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，并且彼此可以是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于，前导子序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子序列、信号肽序列及转录终止子序列。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
破坏：术语“破坏”意指参照基因的编码区和/或控制序列被部分或完全修饰(如通过缺失、***和/或取代一个或多个核苷酸)，从而使得编码的多肽的表达不存在(失活)或降低，和/或编码的多肽的酶活性不存在或降低。可以使用本领域已知的技术测量破坏效果，如使用来自本文参照的无细胞提取物测量值检测酶活性的不存在或降低；或通过对应的mRNA的不存在或降低(例如，至少25％降低、至少50％降低、至少60％降低、至少70％降低、至少80％降低或至少90％降低)；具有酶活性的对应多肽的量的不存在或降低(例如，至少25％降低、至少50％降低、至少60％降低、至少70％降低、至少80％降低或至少90％降低)；或具有酶活性的对应多肽的比活性的不存在或降低(例如，至少25％降低、至少50％降低、至少60％降低、至少70％降低、至少80％降低或至少90％降低)。可以通过本领域已知的方法破坏感兴趣的具体基因，例如通过定向同源重组(directed homologousrecombination)(参见Methods in Yeast Genetics[酵母遗传学方法](1997版),Adams,Gottschling,Kaiser和Stems,冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press),(1998))。
内源基因：术语“内源基因”意指对参照宿主细胞而言天然的基因。“内源基因表达”意指内源基因的表达。
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，该酶催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键，混合的β-1,3-1,4葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖以及含有纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切水解。可以通过测量底物粘度的降低或通过还原糖测定所确定的还原性末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性(Zhang等人,2006,Biotechnology Advances[生物技术进展]24:452-481)。还可以根据Ghose,1987,Pure and Appl.Chem.[纯粹与应用化学]59:257-268的程序，在pH 5、40℃下，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来确定内切葡聚糖酶活性。
表达：术语“表达”包括在多肽的生产中涉及的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。可以对表达进行测量—例如，来检测增加的表达—通过本领域已知的技术，如测量mRNA和/或翻译的多肽的水平。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，该分子包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
可发酵的培养基：术语“可发酵的培养基”或“发酵培养基”是指包含一种或多种(例如，两种、若干种)糖的培养基，如葡萄糖、果糖、蔗糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、***糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶性低聚糖，其中该培养基能够部分地被宿主细胞转化(发酵)为希望的产物，如乙醇。在一些情况下，该发酵培养基衍生自天然来源，如甘蔗、淀粉、或纤维素；并且可以来自这种来源的酶水解(糖化)的预处理。术语发酵培养基在本文理解为指在添加发酵生物之前的介质，例如，由糖化过程产生的介质，以及在同时糖化和发酵过程(SSF)中使用的介质。
半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指可对半纤维素材料进行水解的一种或多种(例如，若干种)酶。参见，例如Shallom和Shoham,2003,Current Opinion In Microbiology[微生物学当前观点]6(3):219-228)。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不限于，乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、***聚糖酶、***呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。这些酶的底物(半纤维素)是支链和直链多糖的异质性组，这些多糖经由氢键与植物细胞壁中的纤维素微纤维相结合，从而将它们交联成稳健的网络。半纤维素还共价附接至木质素，从而与纤维素一起形成高度复杂的结构。半纤维素的可变结构和组织要求许多酶的协同作用以使其完全降解。半纤维素酶的催化模块是水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或是水解乙酸或阿魏酸侧基团的酯键的碳水化合物酯酶(CE)。这些催化模块基于其一级序列的同源性可以分配到GH和CE家族。一些家族(具有总体上类似的折叠)可以进一步归类为宗族(clan)，以字母标记(例如，GH-A)。在碳水化合物活性酶(CAZy)数据库中可得到这些以及其他碳水化合物活性酶的最详尽和更新的分类。可以根据Ghose和Bisaria,1987,Pure&AppI.Chem.[纯粹与应用化学]59:1739-1752，在适合的温度(如40℃-80℃，例如50℃、55℃、60℃、65℃或70℃)和适合的pH(如4-9，例如5.0、5.5、6.0、6.5或7.0)下测量半纤维素分解酶活性。
异源多核苷酸：术语“异源多核苷酸”在本文中定义为以下多核苷酸：对该宿主细胞而言不是天然的多核苷酸；已经对编码区做出结构修饰的天然多核苷酸；由于通过重组DNA技术(例如，不同的(外源的)启动子)对DNA的操作而定量改变其表达的天然多核苷酸；或具有该多核苷酸的一个或多个额外的拷贝以定量改变表达的宿主细胞中的天然多核苷酸。“异源基因”是包含异源多核苷酸的基因。
高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。运载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指对包含本文所述的多核苷酸(例如，编码蛋白酶的多核苷酸)的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等敏感的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。术语“重组细胞”在本文中定义为包含一种或多种(例如，两种、若干种)异源多核苷酸的非天然存在的宿主细胞。
低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。运载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。
成熟多肽：术语“成熟多肽”在本文中定义为在翻译和任何翻译后修饰(如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后处于其最终形式的具有生物活性的多肽。
中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。运载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。
中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。运载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指包含一个或多个(例如，两个、若干个)控制序列的多核苷酸。该多核苷酸可以是单-链的或双链的，并且可以分离自天然存在的基因、可以被修饰成以另外的不会在自然界中存在的方式包含核酸的区段、或可以是合成的。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得该控制序列指导该编码序列的表达。
预处理的玉米秸秆：术语“预处理的玉米秸秆”或“PCS”意指通过热和稀硫酸处理、碱预处理、中性预处理、或本领域已知的任何预处理从玉米秸秆得到的含纤维素材料。
蛋白酶：术语“蛋白酶”在本文中定义为水解肽键的酶。它包括属于EC 3.4酶组的任何酶(包括其13个亚类中的每一个)。EC编号参考来自NC-IUBMB的Enzyme Nomenclature1992[1992年酶命名法],Academic Press[学术出版社],圣地亚哥,加利福尼亚州，分别包括在Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊],223:1-5(1994)；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊],232:1-6(1995)；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊],237:1-5(1996)；Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊],250:1-6(1997)；以及Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学期刊],264:610-650(1999)中出版的增刊1-5。术语“枯草杆菌酶”是指根据Siezen等人,1991,Protein Engng.[蛋白质工程]4:719-737和Siezen等人,1997,Protein Science[蛋白质科学]6:501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶是蛋白酶亚组，其特征为在活性位点上具有丝氨酸，与底物形成了共价加合物。另外，枯草杆菌酶(和丝氨酸蛋白酶)的特征为除了丝氨酸以外，还具有两个活性位点氨基酸残基，即组氨酸和天冬氨酸残基。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶(Lantibiotic peptidase)家族、Kexin家族以及Pyrolysin家族。术语“蛋白酶活性”意指蛋白水解活性(EC 3.4)。本发明的蛋白酶是内肽酶(EC 3.4.21)。蛋白酶活性可以使用本领域已知的(例如，US 2015/0125925)本文所述的方法(参见实例)或使用可商购的测定试剂盒(例如，西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))来确定。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列同一性”来描述。
出于本文描述的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]1970,48,443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性的程度，该算法如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite),Rice等人,TrendsGenet.[遗传学趋势]2000,16,276-277)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的。所使用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：
(相同的残基X100)/(参照序列的长度-比对中的空位总数)
出于本文描述的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性的程度，该算法如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件,Rice等人,2000，见上文)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的。所使用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：
(相同的脱氧核糖核苷酸X100)/(参照序列的长度-比对中的空位总数)
信号肽：术语“信号肽”在本文中定义为以符合阅读框的方式连接(融合)至具有生物活性的多肽的氨基末端且指导该多肽进入细胞的分泌途径的肽。
非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。运载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。
非常低严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。运载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。
木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(E.C.3.2.1.8)，该酶催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内切水解。木聚糖酶活性可以在37℃在0.01％X-100和200mM磷酸钠(pH 6)中用0.2％AZCL-***糖基木聚糖作为底物来确定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃、pH 6，在200mM磷酸钠(pH6)中从作为底物的0.2％AZCL-***糖基木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青蛋白(azurine)。
木糖异构酶：术语“木糖异构酶”或“XI”意指可以在体内将D-木糖催化为D-木酮糖，并且在体外将D-葡萄糖转化为D-果糖的酶。木糖异构酶也称为“葡萄糖异构酶”，并且被分类为E.C.5.3.1.5。由于该酶的结构非常稳定，木糖异构酶是研究蛋白质结构和功能之间关系的良好模型之一(Karimaki等人,Protein Eng Des Sel[蛋白质工程、设计与选择],12004,17(12):861-869)。此外，极其重要的工业应用价值使得木糖异构酶被视为蛋白酶和淀粉酶的重要工业酶(Tian Shen等人,Microbiology Bulletin[微生物学通报],2007,34(2):355-358；Bhosale等人,Microbiol Rev[微生物学评论],1996,60(2):280-300)。科学家保持高度关注并对木糖异构酶进行了广泛的研究。自20世纪70年代以来，木糖异构酶的应用已经集中在高果糖浆和燃料乙醇的生产。近年来，科学家已经发现在某些条件下，木糖异构酶可用于生产许多重要的稀有糖，它们是制药工业中的生产材料，如核糖、甘露糖、***糖和来苏糖(Karlmaki等人,Protein Eng Des Sel[蛋白质工程、设计与选择]12004,17(12):861-869)。这些发现在木糖异构酶的研究中带来新的活力。
本文提及“约”值或参数包括指向该值或参数本身的实施例。例如，提及“约X”的描述包括实施例“X”。当与测量值组合使用时，“约”包括涵盖至少与测量该具体数值的方法相关的不确定性的范围，并且可以包括在给定的数值附近正或负两个标准差的范围。
同样，提及“衍生自”另一个基因或多肽X的基因或多肽包括该基因或多肽X。
如本文和所附权利要求书中所用的，单数形式“一种/个(a/an)”、“或”以及“该(the)”包括复数指代物，除非上下文另外清楚表明。
应该理解的是本文所述的实施例包括“由……实施例组成”和/或“基本由……实施例组成”。如本文所用的，除了由于表达语言或必需含义情况下另有要求外，词语“包含(comprise)”或变形如“包含了(comprises)”或“包含着(comprising)”以包容性意义使用，即指定所述特征的存在，但不排除各种实施例中存在或加入了其他特征。
具体实施方式
本文尤其描述了从含淀粉材料或含纤维素材料生产发酵产物如乙醇的方法。
在工业规模发酵期间，酵母遇到各种各样的生理挑战，这些挑战包括可变浓度的糖，高浓度的酵母代谢产物如乙醇、甘油、有机酸、渗透胁迫、以及来自污染微生物(如野生酵母和细菌)的潜在竞争。因此，许多酵母不适合用于工业发酵。酵母属的最广泛使用的可商购的工业菌株(即，用于工业规模发酵)是，例如，在产品ETHANOL REDTM中所使用的酿酒酵母菌株。该菌株非常适合于工业乙醇生产；然而，尚不清楚对酵母的修饰将如何影响性能。具体地，工业相关的酿酒酵母对异源酶的功能表达尚不确定(参见，例如US 9,206,444，其中本申请人无法在功能上表达多种酶/酶类)。
本申请人出乎意料地发现，那些出于发酵而开发的酿酒酵母菌株也能够表达在糖化和发酵过程中功能性分泌的异源蛋白酶。申请人所得的酵母可用于发酵方法中，这些发酵方法可提供高速率和高产率，而无需依赖大量外源添加的蛋白酶和/或尿素作为补充氮源。本申请人进一步发现，在液化过程中使用外源蛋白酶以及在发酵过程中使用表达蛋白酶的酵母减少了对尿素补充剂的需求，以维持高乙醇产率。
在一方面是从含淀粉材料或含纤维素材料生产发酵产物的方法，该方法包括：
(a)糖化该含淀粉材料或含纤维素材料；和
(b)用发酵生物发酵步骤(a)的经糖化的材料；
其中该发酵生物包含编码蛋白酶的异源多核苷酸。
在另一方面是从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括：
(a)用α-淀粉酶液化所述含淀粉材料；
(b)糖化来自步骤(a)的液化醪；和
(c)用发酵生物发酵步骤(b)的经糖化的材料；
其中步骤(a)的液化和/或步骤(b)的糖化在外源添加的蛋白酶存在下进行；并且
其中该发酵生物包含编码蛋白酶的异源多核苷酸。
糖化和发酵步骤可以顺序或同时(SSF)进行。在一个实施例中，糖化和发酵步骤同时(SSF)进行。在另一个实施例中，糖化和发酵步骤顺序进行。
发酵生物
本文所述的发酵生物可以衍生自本领域技术人员已知的能够生产发酵产物(如乙醇)的任何宿主细胞。如本文所用的，菌株的“衍生物”衍生自参照菌株，如通过诱变、重组DNA技术、交配、细胞融合、或在酵母菌株之间的胞导。本领域的技术人员应该理解，遗传改变(包括本文示例的代谢修饰)可以参考适合的宿主生物及其相应的代谢反应或用于希望的遗传材料(如希望的代谢途径的基因)的适合的来源生物加以描述。然而，考虑到多种多样的生物的全基因组测序以及基因组学领域中高水平的技能，本领域的技术人员可以将本文提供的教导和指导应用于其他生物中。例如，可以通过掺入相同的或来自不同于参照物种的物种的类似编码核酸而容易地将本文示例的代谢改变应用于其他物种中。
用于制备本文所述的重组细胞的宿主细胞可以来自任何适合的宿主，如酵母菌株，包括但不限于，酵母属、红酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、红冬孢酵母属、假丝酵母属、耶氏酵母属、油脂酵母属、隐球菌属或德克拉酵母属菌种细胞。具体地，考虑了酵母属宿主细胞，如酿酒酵母、贝酵母(Saccharomyces bayanus)或卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)细胞。优选地，该酵母细胞是酿酒酵母细胞。适合的细胞可以例如，衍生自可商购的菌株和多倍体或非整倍体工业菌株，包括但不限于，来自SuperstartTM、
该发酵生物可以是酵母属菌株，例如是使用美国专利号8,257,959-BB中所描述和涉及的方法产生的酿酒酵母菌株。
该菌株也可以是酿酒酵母菌株NMI V14/004037(参见，WO 2015/143324和WO2015/143317，各自通过引用并入本文)，菌株号V15/004035、V15/004036和V15/004037(参见，WO 2016/153924，通过引用并入本文)，菌株号V15/001459、V15/001460、V15/001461(参见，WO 2016/138437，通过引用并入本文)，或描述于WO 2017/087330(通过引用并入本文)的任何菌株的衍生物。
已经产生了根据本发明的发酵生物，以通过降低酶的成本来提高发酵产率并改善工艺经济性，因为提高方法性能所需的部分或全部必需酶是由发酵生物产生的。
本文所述的发酵生物可以利用以下表达载体，这些表达载体包含一个或多个(例如，两个、若干个)异源基因的编码序列，这些编码序列被连接至一个或多个控制序列，这一个或多个控制序列指导在与这一个或多个控制序列相容的条件下在适合的细胞中的表达。可以在任何本文所述的细胞和方法中使用此类表达载体。本文所述的多核苷酸可以按多种方式操纵，以提供希望的多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸***载体之前对其进行操纵可以是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
可以将构建体或载体(或多个构建体或载体)引入细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所述；该构建体或载体(或这些构建体或载体)包含一个或多个(例如，两个、若干个)异源基因。
各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个(例如，两个、若干个)合宜的限制位点以允许在此类位点***或取代该多核苷酸。可替代地，可以通过将一种或多种多核苷酸或者包含该序列的核酸构建体***用于表达的适当载体中而表达该一种或多种多核苷酸。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该用于表达的适当控制序列可操作地连接。
该重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起该多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。该载体的选择将典型地取决于该载体与待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是直链或闭合环状质粒。
该载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，该载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入到细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
该表达载体可以含有任何适合的启动子序列，该启动子序列可被细胞识别以表达本文所述的基因。该启动子序列含有转录控制序列，这些转录控制序列介导该多肽的表达。该启动子可以是在选择的细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
本文所述的每种异源多核苷酸都可以被可操作地连接至对于该多核苷酸而言外源的启动子上。例如，在一个实施例中，编码己糖转运体的异源多核苷酸被可操作地连接至对于该多核苷酸而言外源的启动子上。这些启动子可以与所选的天然启动子相同或与其具有高度序列同一性(例如，至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％)。
用于指导核酸构建体在酵母细胞中的转录的适合的启动子的实例包括但不限于获得自以下的基因的启动子：烯醇酶(例如，酿酒酵母烯醇酶或东方伊萨酵母(I.orientalis)烯醇酶(ENO1))，半乳糖激酶(例如，酿酒酵母半乳糖激酶或东方伊萨酵母半乳糖激酶(GAL1))，醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(例如，酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶或东方伊萨酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP))，磷酸甘油醛异构酶(例如，酿酒酵母磷酸甘油醛异构酶或东方伊萨酵母磷酸甘油醛异构酶(TPI))，金属硫蛋白(例如，酿酒酵母金属硫蛋白或东方伊萨酵母金属硫蛋白(CUP1))，3-磷酸甘油酸激酶(例如，酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶或东方伊萨酵母3-磷酸甘油酸激酶(PGK))，PDC1，木糖还原酶(XR)，木糖醇脱氢酶(XDH)，L-(+)-乳酸-细胞色素c氧化还原酶(CYB2)，翻译延长因子-1(TEF1)，翻译延长因子-2(TEF2)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，以及乳清酸核苷5'-磷酸脱羧酶(URA3)基因。酵母宿主细胞的其他有用的启动子由Romanos等人,1992,Yeast[酵母]8:423-488描述。
该控制序列也可以是被宿主细胞识别以终止转录的适合的转录终止子序列。该终止子序列被可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的3’-末端。可以使用在选择的酵母细胞中具有功能的任何终止子。该终止子可以与所选的天然终止子相同或与其具有高度序列同一性(例如，至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％)。
酵母宿主细胞的适合的终止子可以获得自以下的基因：烯醇酶(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母烯醇酶)、细胞色素C(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母细胞色素(CYC1))、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd))、PDC1、XR、XDH、转醛醇酶(TAL)、转酮醇酶(TKL)、核糖5-磷酸-酮醇异构酶(RKI)、CYB2、以及半乳糖基因家族(尤其是GAL10终止子)。酵母宿主细胞的其他有用的终止子由Romanos等人,1992,见上文描述。
该控制序列也可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区域的实例从以下获得：苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SP82基因(Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。
该控制序列也可以是适合的前导子序列，其中转录时，该前导子序列是对由宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。该前导子序列可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的5’-末端。可以使用在选择的酵母细胞中具有功能的任何前导子序列。
酵母宿主细胞的适合的前导子获得自以下各项的基因：烯醇酶(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母烯醇酶(ENO-1))、3-磷酸甘油酸激酶(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母3-磷酸甘油酸激酶)、α-因子(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母α-因子)、以及醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP))。
该控制序列还可以是多腺苷酸化序列；与多核苷酸3’末端可操作地连接并在转录时由宿主细胞识别为向转录的mRNA添加聚腺苷酸残基的信号的序列。可以使用在选择的宿主细胞中具有功能的任何多腺苷酸化序列。对于酵母细胞有用的多腺苷酸化序列描述于以下文献：Guo和Sherman,1995,Mol.Cellular Biol.[分子细胞生物学]15:5983-5990。
也可能令人希望的是添加调节序列，该调节序列允许相对于宿主细胞的生长而调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。
这些载体可以含有一个或多个(例如，两个、若干个)允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。
这些载体可以含有一个或多个(例如，两个、若干个)允许将该载体整合进宿主细胞的基因组中或在该细胞中独立于基因组而自主复制的元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合元件应当含有足够数目的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些核酸与对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。这些整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。潜在整合位点包括本领域所描述的那些(例如，参见US 2012/0135481)。
对于自主复制，该载体可以进一步包含使该载体能够在酵母细胞中自主复制的复制起点。该复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。
可以将本文所述的多核苷酸的超过一个的拷贝***到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到酵母细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择含有选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所述的元件以构建本文所述的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如Sambrook等人,1989,见上文)。
本领域已知的用于制备用于乙醇发酵的重组细胞的另外的程序和技术描述于例如WO 2016/045569中，将其内容通过引用特此并入。
该发酵生物可以呈组合物的形式，该组合物包含发酵生物(例如，本文所述的酵母菌株)和天然存在和/或非天然存在的组分。
本文所述的发酵生物可以呈任何活力形式，包括粉碎、干燥，包括活性干燥和即食、压缩、膏状(液体)形式等。在一个实施例中，该发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)是干酵母，如活性干酵母或即食酵母。在一个实施例中，该发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)是粉碎酵母。在一个实施例中，该发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)是压缩酵母。在一个实施例中，该发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)是膏状酵母。
在一个实施例中是组合物，该组合物包含本文所述的发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和选自下组的一种或多种组分，该组由以下组成：表面活性剂、乳化剂、树胶、溶胀剂、以及抗氧化剂和其他加工助剂。
本文所述的组合物可包含本文所述的发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和任何适合的表面活性剂。在一个实施例中，该一种或多种表面活性剂是阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、和/或非离子表面活性剂。
本文所述的组合物可包含本文所述的发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和任何适合的乳化剂。在一个实施例中，该乳化剂是山梨聚糖的脂肪酸酯。在一个实施例中，该乳化剂选自下组：山梨聚糖单硬脂酸酯(SMS)、单双甘酯的柠檬酸酯、聚甘油酯、丙二醇的脂肪酸酯。
在一个实施例中，该组合物包含本文所述的发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和Olindronal SMS、Olindronal SK、或Olindronal SPL，包括欧洲专利号1,724,336(将其通过引用特此并入)中涉及的组合物。针对活性干酵母，这些产品可以从布塞蒂，奥地利商购获得。
本文所述的组合物可包含本文所述的发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和任何适合的树胶。在一个实施例中，该树胶选自下组：槐树豆胶、瓜尔胶、黄芪胶、***胶、黄原胶和***树胶，具体地针对膏状、压缩和干酵母。
本文所述的组合物可包含本文所述的发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和任何适合的溶胀剂。在一个实施例中，该溶胀剂是甲基纤维素或羧甲基纤维素。
本文所述的组合物可包含本文所述的发酵生物(例如，酿酒酵母菌株)和任何适合的抗氧化剂。在一个实施例中，该抗氧化剂是丁羟茴醚(BHA)和/或丁羟甲苯(BHT)、或抗坏血酸(维生素C)，具体地针对活性干酵母。
蛋白酶
表达的蛋白酶和/或外源蛋白酶可以是适用于本文所述的发酵生物和/或其使用方法的任何蛋白酶，如天然存在的蛋白酶(例如，来自另一个物种的天然蛋白酶或从修饰的表达载体表达的内源蛋白酶)、或其保留蛋白酶活性的变体。对于本发明涉及蛋白酶的外源添加的方面，还考虑了由以下描述的发酵生物表达的任何蛋白酶。
蛋白酶根据其催化机制分为以下几类：丝氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)以及未知或还未分类的蛋白酶(U)，参见Handbook ofProteolytic Enzymes[蛋白水解酶手册],A.J.Barrett,N.D.Rawlings,J.F.Woessner(编辑),Academic Press[学术出版社](1998)，特别是概述部分。
可以使用任何适合的测定来测量蛋白酶活性，其中采用这样的底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。测定pH值和测定温度同样适用于所讨论的蛋白酶。测定pH值的实例是pH 6、7、8、9、10或11。测定温度的实例是30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或80℃。
在一些方面，当在相同条件下培养时，与不具有编码蛋白酶的异源多核苷酸的发酵生物相比，包含编码蛋白酶的异源多核苷酸的发酵生物具有增加的蛋白酶活性水平。在一些方面，当在相同条件下培养时，与不具有编码蛋白酶的异源多核苷酸的发酵生物相比，该发酵生物具有增加至少5％，例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％或至少500％的蛋白酶活性水平。
可以与本文所述的发酵生物和使用方法一起表达的示例性蛋白酶包括但不限于表1中所示的蛋白酶(或其衍生物)。
表1.
编码适合的蛋白酶的另外的多核苷酸可以衍生自任何适合属的微生物，包括在UniProtKB数据库(www.uniprot.org)内可容易获得的那些。
该蛋白酶可以是细菌蛋白酶。例如，该蛋白酶可以衍生自***，如芽孢杆菌属、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)或链霉菌属；或者革兰氏阴性细菌，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)。
在一个实施例中，该蛋白酶衍生自嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌。
在另一个实施例中，该蛋白酶衍生自似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、***链球菌(Streptococcus uberis)、或马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)。
在另一个实施例中，该蛋白酶衍生自不产色链霉菌(Streptomycesachromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)。
该蛋白酶可以是真菌蛋白酶。例如，该蛋白酶可以衍生自酵母，如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母、耶氏酵母属、或伊萨酵母属(Issatchenkia)；或者衍生自丝状真菌，如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属、短梗霉属(Aureobasidium)、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、乳白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、香菇属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、黑果菌属(Melanocarpus)、亚灰树花菌属、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、链孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳霉属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)、或炭角菌属(Xylaria)。
在另一个实施例中，该蛋白酶衍生自卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)。
在另一个实施例中，该蛋白酶衍生自解纤维枝顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉、米曲霉、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、带纹金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusariumsulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑根毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙链孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)、产紫青霉菌(Penicilliumpurpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳霉(Thielavia achromatica)、成层梭抱壳菌(Thielavia albomyces)、白毛梭孢壳霉(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳霉(Thielavia australeinsis)、菲美蒂梭抱壳菌(Thielavia fimeti)、小孢梭孢壳霉(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳霉(Thielaviaovispora)、秘鲁梭孢壳霉(Thielavia peruviana)、毛梭孢壳霉(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳霉(Thielavia spededonium)、耐热梭孢壳(Thielavia subthermophila)、土生梭孢壳霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉、或绿色木霉(Trichoderma viride)。
在一个实施例中，该蛋白酶衍生自曲霉属，如SEQ ID NO:9的黑曲霉蛋白酶、SEQID NO:41的溜曲霉蛋白酶、或SEQ ID NO:45的齿状曲霉蛋白酶。
在一个实施例中，该蛋白酶衍生自叉丝孔菌属，如SEQ ID NO:12的污叉丝孔菌蛋白酶。
在一个实施例中，该蛋白酶衍生自青霉属，如SEQ ID NO:14的简青霉蛋白酶、SEQID NO:66的南极青霉蛋白酶、或SEQ ID NO:67的苏门答腊青霉蛋白酶。
在一方面，该蛋白酶衍生自亚灰树花菌属，如SEQ ID NO:16的大型亚灰树花菌蛋白酶。
在一方面，该蛋白酶衍生自篮状菌属，如SEQ ID NO:21的利亚尼篮状菌蛋白酶。
在一方面，该蛋白酶衍生自嗜热子囊菌属，如SEQ ID NO:22的嗜热嗜热子囊菌蛋白酶。
在一方面，该蛋白酶衍生自灵芝属，如SEQ ID NO:33的灵芝蛋白酶。
在一方面，该蛋白酶衍生自半内果菌属，如SEQ ID NO:61的栖土半内果菌蛋白酶。
在一方面，该蛋白酶衍生自木霉属，如SEQ ID NO:69的脐孢木霉蛋白酶。
应理解的是对于前述的种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其他分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而与它们已知的种名无关。本领域的技术人员会容易地识别适当等同物的身份。
这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center，NRRL)。
可以使用本文描述或参照的蛋白酶编码序列或其子序列，以及本文描述或参照的蛋白酶或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴定并克隆编码来自不同属或物种的菌株的蛋白酶的DNA。具体地，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针来与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以鉴定和分离其中的对应基因。此类探针可明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，用于检测对应基因。
可以针对与上文所述的探针杂交并编码亲本的DNA来筛选由此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的运载体材料上。为了鉴定与编码序列或其子序列杂交的克隆或DNA，在DNA印迹中使用该运载体材料。
在一个实施例中，该核酸探针是编码SEQ ID NO:9-73中任一个的蛋白酶或其片段的多核苷酸或其子序列。
出于上述探针的目的，杂交是指，在非常低至非常高严格条件下，多核苷酸杂交至标记的核酸探针或其全长互补链或前述各项的子序列。在这些条件下，核酸探针杂交的分子可以使用例如X-射线胶片而进行检测。严格性和洗涤条件如上述所定义。
在一个实施例中，该蛋白酶由多核苷酸编码，该多核苷酸在至少低严格条件下，例如中严格条件下、中-高严格条件下、高严格条件下、或非常高严格条件下与本文描述或参照的蛋白酶中任一种的编码序列(例如，编码SEQ ID NO:9-73中任一个的编码序列)的全长互补链杂交。(Sambrook等人,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第2版Cold Spring Harbor,New York[冷泉港,纽约])。
也可以使用上述探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水、青贮等)分离的微生物或直接从天然材料(例如，土壤、堆肥、水、青贮等)获得的DNA样品鉴定并获得该蛋白酶。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。随后可以通过类似地筛选另一种微生物的基因组或cDNA文库或混合DNA样品衍生出编码蛋白酶的多核苷酸。
一旦用如本文所述的适合的探针检测到编码蛋白酶的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术来分离或克隆该序列(参见，例如Sambrook等人,1989,见上文)。用于分离或克隆编码蛋白酶的多核苷酸的技术包括从基因组DNA分离、从cDNA制备或其组合。可以例如通过使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从这样的基因组DNA克隆多核苷酸。参见，例如Innis等人,1990,PCR:A Guide to Methods and Application[PCR：方法和应用指南],Academic Press[学术出版社],纽约。还可以使用其他核酸扩增程序，如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。
在一个实施例中，该蛋白酶具有包含SEQ ID NO:9-73中任一个(例如SEQ ID NO:9、14、16、21、22、33、41、45、61、62、66、67和69中任一个；如SEQ NO:9、14、16和69中任一个)的氨基酸序列或由其组成的成熟多肽序列。在另一个实施例中，该蛋白酶具有成熟多肽序列，该成熟多肽序列是SEQ ID NO:9-73中任一个的蛋白酶的片段(例如，其中该片段具有蛋白酶活性)。在一个实施例中，片段中的氨基酸残基数目是参照全长蛋白酶(例如，SEQ IDNO:9-73中任一个)中氨基酸残基数目的至少75％，例如至少80％、85％、90％或95％。在其他实施例中，该蛋白酶可包含本文描述或参照的任何蛋白酶的催化结构域(例如，SEQ IDNO:9-73中任一个的催化结构域)。
该蛋白酶可以是上述蛋白酶中任一种(例如，SEQ ID NO:9-73中任一个)的变体。在一个实施例中，该蛋白酶具有与上述蛋白酶中任一种(例如，SEQ ID NO:9-73中任一个)至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的成熟多肽序列。
在一个实施例中，该蛋白酶具有与SEQ ID NO:9至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的成熟多肽序列。
在一个实施例中，该蛋白酶具有与SEQ ID NO:14至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的成熟多肽序列。
在一个实施例中，该蛋白酶具有与SEQ ID NO:16至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的成熟多肽序列。
在一个实施例中，该蛋白酶具有与SEQ ID NO:21至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的成熟多肽序列。
在一个实施例中，该蛋白酶具有与SEQ ID NO:22至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的成熟多肽序列。
在一个实施例中，该蛋白酶具有与SEQ ID NO:33至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的成熟多肽序列。
在一个实施例中，该蛋白酶具有与SEQ ID NO:41至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的成熟多肽序列。
在一个实施例中，该蛋白酶具有与SEQ ID NO:45至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的成熟多肽序列。
在一个实施例中，该蛋白酶具有与SEQ ID NO:61至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的成熟多肽序列。
在一个实施例中，该蛋白酶具有与SEQ ID NO:62至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的成熟多肽序列。
在一个实施例中，该蛋白酶具有与SEQ ID NO:66至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的成熟多肽序列。
在一个实施例中，该蛋白酶具有与SEQ ID NO:67至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的成熟多肽序列。
在一个实施例中，该蛋白酶具有与SEQ ID NO:69至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的成熟多肽序列。
在一个实施例中，该蛋白酶具有与上述蛋白酶中任一种(例如，SEQ ID NO:9-73中任一个)的氨基酸序列相差不超过十个氨基酸，例如相差不超过五个氨基酸、相差不超过四个氨基酸、相差不超过三个氨基酸、相差不超过两个氨基酸、或相差一个氨基酸的成熟多肽序列。在一个实施例中，该蛋白酶具有上述蛋白酶中任一种(例如，SEQ ID NO:9-73中任一个)的氨基酸序列的一个或多个(例如，两个，若干个)的氨基酸取代、缺失和/或***。在一些实施例中，氨基酸取代、缺失和/或***的总数不超过10，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2或1。
氨基酸改变的性质通常较小，也就是说不会显著影响蛋白质折叠和/或活性的保守氨基酸取代或***；典型地为一个至约30个氨基酸的小缺失；小氨基-末端或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；多至约20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一官能(如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。
保守取代的实例在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],Academic Press[学术出版社],纽约中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
可替代地，这些氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，这些氨基酸改变可以改善蛋白酶的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。
可以根据本领域已知的程序来鉴定必需氨基酸，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。活性部位或其他生物学相互作用还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。参见，例如de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.[欧洲生物化学学会联盟通讯]309:59-64。还可以从与参照蛋白酶相关的其他蛋白酶的同一性分析推断必需氨基酸的身份。
可以使用本领域熟知的多重序列比对(MSA)技术来确定另外的有关本文的蛋白酶的结构-活性关系的指导。基于本文的教导，本领域的技术人员可以与本文所述的或本领域已知的任何数目的蛋白酶做相似的比对。此类比对帮助本领域的技术人员确定潜在相关的结构域(例如，结合结构域或催化结构域)，并且在不同的蛋白酶序列中确定哪些氨基酸残基是保守的和不是保守的。本领域中应理解的是，改变在所披露的多肽之间的特定位置处是保守的氨基酸将更有可能导致生物活性的改变(Bowie等人,1990，Science[科学]247:1306-1310:“Residues that are directly involved in protein functions such asbinding or catalysis will certainly be among the most conserved[直接涉及到蛋白功能如结合或催化的残基将一定是在最保守的残基中]”)。相比之下，取代在多肽之间不是高度保守的氨基酸将不太可能或不显著地改变生物活性。
本领域的技术人员可以在本领域已知的公开的X射线晶体学研究中找到甚至另外的关于结构-活性关系的指导。
使用已知的诱变、重组和/或改组方法，随后进行相关的筛选程序可以做出单或多氨基酸取代、缺失和/或***并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO95/22625披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可以从宿主细胞回收编码活性蛋白酶的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法对其进行快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。
在另一个实施例中，编码蛋白酶的异源多核苷酸包含如下编码序列，该编码序列与上述蛋白酶中任一种的编码序列(例如，编码SEQ ID NO:9-73中任一个的编码序列)具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
在一个实施例中，编码蛋白酶的异源多核苷酸包含上述蛋白酶中任一种的编码序列(例如，编码SEQ ID NO:9-73中任一个的编码序列)或由其组成。在另一个实施例中，编码蛋白酶的异源多核苷酸包含上述蛋白酶中任一种的编码序列(例如，编码SEQ ID NO:9-73中任一个的编码序列)的子序列，其中该子序列编码具有蛋白酶活性的多肽。在另一个实施例中，该编码子序列中的核苷酸残基的数目是参照编码序列的数目的至少75％，例如至少80％、85％、90％或95％。
本文所述的任何相关方面或实施例的参照编码序列可以是天然编码序列或简并序列，例如设计用于特定宿主细胞的密码子优化的(例如，针对在酿酒酵母中表达而优化的)编码序列。
该蛋白酶可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一个多肽在该蛋白酶的N-末端或C-末端处融合。可以通过将编码另一个多肽的多核苷酸与编码蛋白酶的多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，使得它们在阅读框中，并且使该融合多肽的表达在相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。还可使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合物(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。
在一个实施例中，根据本文所述的方法使用的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。在一个具体的实施例中，该蛋白酶是属于家族53的丝氨酸蛋白酶，例如内切蛋白酶，如来自大型亚灰树花菌、污叉丝孔菌、变色栓菌、漏斗多孔菌、桦革褶菌、灵芝、洁丽香菇、或芽孢杆菌属物种19138的S53蛋白酶，在从含淀粉材料生产乙醇的方法中，当糊化的或未糊化的淀粉的糖化和/或发酵期间存在/或添加该S53蛋白酶时，乙醇产率得到提高。在一个实施例中，该蛋白酶选自：(a)属于EC 3.4.21酶组的蛋白酶；和/或(b)属于EC 3.4.14酶组的蛋白酶；和/或(c)肽酶S53家族的丝氨酸蛋白酶，其包含两种不同类型的肽酶：三肽基氨肽酶(外切型)和内切肽酶；如在1993,Biochem.J.[生物化学杂志]290:205-218和在MEROPS蛋白酶数据库，发行9.4(2011年1月31日)(www.merops.ac.uk)中所述的。该数据库描述于Rawlings,N.D.,Barrett,A.J.和Bateman,A.,2010,“MEROPS：肽酶数据库(MEROPS:the peptidasedatabase)”,Nucl.Acids Res.[核酸研究]38:D227-D233中。
为了确定给定的蛋白酶是否为丝氨酸蛋白酶和S53家族蛋白酶，参照上述手册以及其中指示的原则。可以对所有类型的蛋白酶进行这样的确定，而不论其是天然存在的或野生型蛋白酶；还是基因工程化的或合成的蛋白酶。
肽酶S53家族含有酸起作用的内肽酶和三肽基-肽酶。催化三联体的残基是Glu、Asp、Ser，并且在氧阴离子穴中存在另外的酸性残基Asp。这些残基的次序是Glu、Asp、Asp、Ser。该Ser残基在枯草杆菌蛋白酶的Asp、His、Ser三联体中是等同于Ser的亲核体，并且该三联体的Glu是枯草杆菌蛋白酶中的广义碱基His的代替物。
该S53家族的肽酶倾向于在酸性pH下最有活性(不像同源的枯草杆菌蛋白酶)，并且这可归因于羧基残基(尤其是Asp)在氧阴离子穴中的功能重要性。这些氨基酸序列不与家族S8(即丝氨酸内肽酶枯草杆菌蛋白酶和同系物)中的那些密切相似，并且这一点与完全不同的活性位点残基以及关于最大活性的所得的较低的pH一起，为该家族提供了实质性差异。肽酶单元的蛋白质折叠对于这个家族的成员来说与枯草杆菌蛋白酶的类似，具有宗族类型SB。
在一个实施例中，根据本文所述的方法使用的蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶。
在一个实施例中，根据本文所述的方法使用的蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶。天冬氨酸蛋白酶描述于例如Hand-book of Proteolytic En-zymes[蛋白水解酶手册],由A.J.Barrett,N.D.Rawlings和J.F.Woessner编辑,Aca-demic Press[学术出版社],圣地亚哥,1998,第270章。天冬氨酸蛋白酶的适合的实例包括例如披露于以下中的那些：R.M.Berka等人,Gene[基因],96,313(1990)；R.M.Berka等人,Gene[基因],125,195-198(1993)；和Gomi等人,Biosci.Biotech.Biochem.[生物科学、生物科技与生物化学],57,1095-1100(1993)，将其通过引用特此并入。
该蛋白酶还可以是金属蛋白酶，将其定义为选自下组的蛋白酶，该组由以下组成：
(a)属于EC 3.4.24的蛋白酶(金属内肽酶)；优选EC 3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)；
(b)属于以上手册的M组的金属蛋白酶；
(c)尚未指定宗族的金属蛋白酶(指定：宗族MX)，或属于宗族MA、MB、MC、MD、ME、MF、MG、MH中任一种的金属蛋白酶(如以上手册的第989-991页所定义的)；
(d)其他家族的金属蛋白酶(如以上手册的第1448-1452页所定义的)；
(e)具有HEXXH基序的金属蛋白酶；
(f)具有HEFTH基序的金属蛋白酶；
(g)属于家族M3、M26、M27、M32、M34、M35、M36、M41、M43或M47中任一种的金属蛋白酶(如以上手册的第1448-1452页所定义的)；
(h)属于M28E家族的金属蛋白酶；和
(i)属于家族M35的金属蛋白酶(如以上手册的第1492-1495页所定义的)。
在其他具体实施例中，金属蛋白酶是其中肽键上的亲核攻击由被二价金属阳离子活化的水分子介导的水解酶。二价阳离子的实例是锌、钴或锰。可以通过氨基酸配体将金属离子保持在适当位置。配体的数目可以是五、四、三、二、一或零。在具体实施例中，数目是二或三，优选是三。
对于在本发明的方法中使用的金属蛋白酶的起源没有限制。在一个实施例中，将该金属蛋白酶分类为EC 3.4.24、优选EC 3.4.24.39。在一个实施例中，该金属蛋白酶是酸稳定的金属蛋白酶，例如真菌酸稳定的金属蛋白酶，如衍生自嗜热子嚢菌属的菌株，优选橙色嗜热子囊菌的菌株，尤其是橙色嗜热子囊菌CGMCC No.0670(分类为EC 3.4.24.39)的金属蛋白酶。在另一个实施例中，该金属蛋白酶衍生自曲霉属的菌株，优选米曲霉的菌株。
在一个实施例中，该金属蛋白酶与WO 2010/008841的SEQ ID NO:1(橙色嗜热子囊菌金属蛋白酶)的氨基酸-178至177、-159至177或优选氨基酸1至177(成熟多肽)具有至少80％、至少82％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％的序列同一性程度；并且该金属蛋白酶具有金属蛋白酶活性。在具体实施例中，该金属蛋白酶由与上述SEQ ID NO:1具有一定同一性程度的氨基酸序列组成。
橙色嗜热子囊菌金属蛋白酶是适于在本发明的方法中使用的金属蛋白酶的优选实例。另一种金属蛋白酶衍生自米曲霉并且包含披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:11的序列，或其氨基酸-23-353；-23-374；-23-397；1-353；1-374；1-397；177-353；177-374；或177-397，以及披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:10。
另一种适于在本发明的方法中使用的金属蛋白酶是包含WO 2010/008841的SEQID NO:5的米曲霉金属蛋白酶，或作为分离的多肽的金属蛋白酶，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少约80％、至少82％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％同一性程度；并且该多肽具有金属蛋白酶活性。在具体实施例中，该金属蛋白酶由WO2010/008841的SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成。
在具体实施例中，金属蛋白酶具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与橙色嗜热子囊菌或米曲霉金属蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸-178至177、-159至177或+1至177相差四十个、三十五个、三十个、二十五个、二十个或相差十五个氨基酸。
在另一个实施例中，金属蛋白酶具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与这些金属蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸-178至177、-159至177或+1至177相差十个、或相差九个、或相差八个、或相差七个、或相差六个、或相差五个氨基酸，例如，相差四个、相差三个、相差两个、或相差一个氨基酸。
在具体实施例中，该金属蛋白酶a)包含以下或者b)由以下组成：
i)WO 2010/008841的SEQ ID NO:1的氨基酸-178至177、-159至177或+1至177的氨基酸序列；
ii)WO 2010/008841的SEQ ID NO:3的氨基酸-23-353、-23-374、-23-397、1-353、1-374、1-397、177-353、177-374、或177-397的氨基酸序列；
iii)WO 2010/008841的SEQ ID NO:5的氨基酸序列；或
i)、ii)和iii)的具有蛋白酶活性的序列的等位基因变体或片段。
WO 2010/008841的SEQ ID NO:1的氨基酸-178至177、-159至177或+1至177或者WO2010/008841的SEQ ID NO:3的氨基酸-23-353、-23-374、-23-397、1-353、1-374、1-397、177-353、177-374或177-397的片段是具有自这些氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽。在一个实施例中，片段含有至少75个氨基酸残基、或至少100个氨基酸残基、或至少125个氨基酸残基、或至少150个氨基酸残基、或至少160个氨基酸残基、或至少165个氨基酸残基、或至少170个氨基酸残基、或至少175个氨基酸残基。
为了确定给定的蛋白酶是否为金属蛋白酶，参照上述“Handbook of ProteolyticEnzymes[蛋白水解酶手册]”以及其中指示的原则。可以对所有类型的蛋白酶进行这样的确定，而不论其是天然存在的或野生型蛋白酶；还是基因工程化的或合成的蛋白酶。
该蛋白酶可以是例如野生型蛋白酶的变体，该蛋白酶具有本文定义的热稳定性特性。在一个实施例中，该热稳定蛋白酶是金属蛋白酶的变体。在一个实施例中，在本文所述的方法中使用的热稳定蛋白酶是真菌来源的，如真菌金属蛋白酶，如衍生自嗜热子囊菌属的菌株，优选橙色嗜热子囊菌的菌株，尤其是橙色嗜热子囊菌CGMCC No.0670(分类为EC3.4.24.39)的真菌金属蛋白酶。
在一个实施例中，该热稳定蛋白酶是披露于以下的变体：WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2所示的金属蛋白酶的成熟部分或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1的成熟部分，该变体进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
S5*+D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L；
N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L；
T46R+D79L+S87P+T116V+D142L；
D79L+P81R+S87P+A112P+D142L；
A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L；
D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L；
S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L；
A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L；
D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C；
S36P+D79L+S87P+A112P+D142L；
A37P+D79L+S87P+A112P+D142L；
S49P+D79L+S87P+A112P+D142L；
S50P+D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+S87P+D104P+A112P+D142L；
D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L；
D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L；
S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L；
D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L；
Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L；
Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L；
A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
A27K+D79L+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
A27K+D79L+S87P+A112P+D142L；和
D79L+S87P+D142L。
在一个实施例中，该热稳定蛋白酶是披露为以下的金属蛋白酶的变体：WO2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的成熟部分或WO 2010/008841中SEQ ID NO:1的成熟部分，该变体具有以下取代或取代的组合中的一个：
D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+S87P+D142L；和
A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
在一个实施例中，该蛋白酶变体与披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或披露于WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1的成熟部分具有至少75％同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，以及甚至最优选至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％同一性。
该热稳定蛋白酶还可以衍生自任何细菌，只要该蛋白酶具有热稳定性特性。
在一个实施例中，该热稳定蛋白酶衍生自细菌火球菌属(Pyrococcus)的菌株，如强烈火球菌的菌株(pfu蛋白酶)。
在一个实施例中，该蛋白酶是如美国专利号6,358,726-B1(宝酒造公司(TakaraShuzo Company))的SEQ ID NO:1所示的一种。
在一个实施例中，该热稳定蛋白酶是如下蛋白酶，该蛋白酶具有与美国专利号6,358,726-B1中的SEQ ID NO:1至少80％同一性、如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同一性的成熟多肽序列。强烈火球菌蛋白酶可以购买自日本宝酒造生物公司(Takara Bio，Japan)。
该强烈火球菌蛋白酶可以是热稳定蛋白酶，如2017年11月22日提交的PCT/US2017/063159的SEQ ID NO:13中所述。发现此蛋白酶(PfuS)在确定的pH 4.5下具有110％(80℃/70℃)和103％(90℃/70℃)的热稳定性。
在一个实施例中，在本文所述的方法中使用的热稳定蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的、超过20％的热稳定性值，如2017年11月22日提交的PCT/US2017/063159的实例2中所述。
在一个实施例中，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％，如超过105％，如超过110％如超过115％，如超过120％的热稳定性。
在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，在20％与50％之间，如在20％与40％之间，如20％与30％的热稳定性。在一个实施例中，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃下的相对活性的，在50％与115％之间，如在50％与70％之间，如在50％与60％之间，如在100％与120％之间，如在105％与115％之间的热稳定性。
在一个实施例中，该蛋白酶具有确定为在85℃/70℃下的相对活性的、超过10％的热稳定性值，如2017年11月22日提交的PCT/US2017/063159的实例2中所述。
在一个实施例中，该蛋白酶具有确定为在85℃/70℃下的相对活性的，超过10％，如超过12％、超过14％、超过16％、超过18％、超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％、超过110％的热稳定性。
在一个实施例中，该蛋白酶具有确定为在85℃/70℃下的相对活性的，在10％与50％之间，如在10％与30％之间，如在10％与25％之间的热稳定性。
在一个实施例中，该蛋白酶具有超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％的测定为在80℃下的残余活性；和/或该蛋白酶具有超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％的测定为在84℃下的残余活性。
“相对活性”和“残余活性”的测定是如2017年11月22日提交的PCT/US2017/063159的实例2中所述进行的。
在一个实施例中，该蛋白酶在85℃下可以具有高于90，如高于100的热稳定性，如使用2017年11月22日提交的PCT/US 2017/063159的实例3中披露的玉米素-BCA测定法确定的。
在一个实施例中，该蛋白酶在85℃下具有高于60％，如高于90％，如高于100％，如高于110％的热稳定性，如使用2017年11月22日提交的PCT/US 2017/063159的玉米素-BCA测定法确定的。
在一个实施例中，蛋白酶在85℃下具有在60-120之间，如在70％-120％之间，如在80％-120％之间，如在90％-120％之间，如在100％-120％之间，如110％-120％的热稳定性，如使用2017年11月22日提交的PCT/US 2017/063159的玉米素-BCA测定法确定的。
在一个实施例中，通过2017年11月22日提交的PCT/US 2017/063159和本文所述的AZCL-酪蛋白测定确定的，该热稳定蛋白酶具有JTP196蛋白酶变体或蛋白酶Pfu的至少20％，如至少30％、如至少40％、如至少50％、如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少100％的活性。
在一个实施例中，通过2017年11月22日提交的PCT/US 2017/063159和本文所述的AZCL-酪蛋白测定确定的，该热稳定蛋白酶具有蛋白酶196变体或蛋白酶Pfu的至少20％，如至少30％、如至少40％、如至少50％、如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少100％的蛋白酶活性。
基因破坏
本文所述的发酵生物还可以包含一个或多个(例如，两个、若干个)基因破坏，例如以将糖代谢从不希望的产物转移至乙醇。在一些方面，当在相同条件下培养时，与没有这一个或多个破坏的细胞相比，重组宿主细胞产生更大量的乙醇。在一些方面，使被破坏的内源基因中的一个或多个失活。
在某些实施例中，本文提供的发酵生物包含一个或多个内源基因的破坏，这一个或多个内源基因编码在生产替代发酵产物(如甘油)或其他副产物(如乙酸或二醇)中涉及的酶。例如，本文提供的细胞可以包含以下一个或多个中的破坏：甘油3-磷酸脱氢酶(GPD，催化二羟丙酮磷酸反应为甘油3-磷酸)、甘油3-磷酸酶(GPP，催化甘油-3磷酸转化为甘油)、甘油激酶(催化甘油3-磷酸转化为甘油)、二羟丙酮激酶(催化二羟丙酮磷酸转化为二羟丙酮)、甘油脱氢酶(催化二羟丙酮转化为甘油)、和醛脱氢酶(ALD，例如，将乙醛转化为乙酸)。
可以使用模型分析来设计另外的优化途径利用的基因破坏。用于鉴定并设计有利于生物合成希望的产物的代谢改变的一种示例性计算方法是OptKnock计算框架(OptKnockcomputational framework)，Burgard等人,2003,Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程]84:647-657。
可以使用本领域熟知的方法(包括本文描述的那些方法)构建包含基因破坏的发酵生物。可以破坏该基因的一部分，如编码区或为编码区的表达所需的控制序列。该基因的这样一种控制序列可以是启动子序列或其功能部分，即足以影响该基因的表达的部分。例如，可以将启动子序列失活从而无表达或可以将天然启动子替换为较弱的启动子以减少编码序列的表达。可修饰的其他控制序列包括但不限于前导子、前肽序列、信号序列、转录终止子以及转录激活因子。
可以通过基因缺失技术来构建包含基因破坏的发酵生物，以消除或减少该基因的表达。基因缺失技术使得可以部分或完全除去该基因，从而消除其表达。这类方法中，使用已经构建为邻接地含有侧翼于该基因的5'和3'区的质粒，通过同源重组完成该基因的缺失。
还可以通过引入、取代和/或除去该基因中的或为其转录或翻译所需的其控制序列中的一个或多个(例如，两个、若干个)核苷酸来构建包含基因破坏的发酵生物。例如，可以***或除去核苷酸，用于引入终止密码子、除去起始密码子或移码开放阅读框。可以根据本领域已知的方法，通过定点诱变或PCR产生的诱变完成这样的修饰。参见，例如Botstein和Shortle,1985,Science[科学]229:4719；Lo等人,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]81:2285；Higuchi等人,1988,Nucleic Acids Res[核酸研究]16:7351；Shimada,1996,Meth.Mol.Biol.[分子生物学方法]57:157；Ho等人,1989,Gene[基因]77:61；Horton等人,1989,Gene[基因]77:61；以及Sarkar和Sommer,1990,BioTechniques[生物技术]8:404。
还可以通过将破坏性核酸构建体***该基因中而构建包含基因破坏的发酵生物，该破坏性核酸构建体包含与该基因同源的核酸片段，该片段将产生具有同源性的区域的重复并且在重复的区域之间掺入构建体DNA。这样的一种基因破坏可以消除基因表达，如果***的构建体将该基因的启动子与编码区分离或打断编码序列，这样使得产生无功能性基因产物。破坏构建体可以简单地是伴有与该基因同源的5’和3’区的选择性标记基因。该选择性标记使得可以鉴定含有破坏的基因的转化株。
还可以通过基因转化过程构建包含基因破坏的发酵生物(参见，例如Iglesias和Trautner,1983,Molecular General Genetics[分子普通遗传学]189:73-76)。例如，在基因转化方法中，将对应于该基因的核苷酸序列体外诱变，以产生缺陷核苷酸序列，然后将其转化进重组菌株中以产生缺陷基因。通过同源重组，该缺陷核苷酸序列替换该内源基因。该缺陷核苷酸序列还包含用于选择含有缺陷基因的转化株的标记可以是令人希望的。
可以使用本领域熟知的方法(包括但不限于化学诱变)，通过随机或特异诱变进一步构建包含基因破坏的发酵生物(参见，例如Hopwood,The Isolation of Mutants inMethods in Microbiology[微生物学方法中的突变体分离](J.R.Norris和D.W.Ribbons,编辑))第363-433页,Academic Press[学术出版社],纽约,1970)。可以通过使亲本菌株经受诱变并筛选其中该基因的表达已经被减少或失活的突变菌株来修饰该基因。诱变可以是特异的或随机的，例如通过使用适合的物理或化学诱变剂、使用适合的寡核苷酸或使DNA序列经受PCR产生的诱变来进行。此外，诱变可以通过使用这些诱变方法的任何组合来进行。
适合本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射，羟胺，N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)，N-甲基-N'-亚硝基胍(NTG)邻甲基羟胺，亚硝酸，乙基甲磺酸(EMS)，亚硫酸氢钠，甲酸和核苷酸类似物。当使用此类试剂时，诱变典型地是在适合条件下在所选的诱变剂的存在下通过孵育有待诱变的亲本菌株并选择展现出该基因的减少表达或无表达的突变体来进行的。
可以使用来自其他微生物来源的与本文所述的基因同源或互补的核苷酸序列来破坏所选的重组菌株中的对应基因。
在一方面，重组细胞中的基因修饰未用选择性标记加以标记。可以通过将突变体在反向选择培养基中进行培养来除去选择性标记基因。在该选择性标记基因含有侧翼于其5'和3'端的重复序列的情况下，当该突变体菌株经受反向选择时，这些重复序列将有助于该选择性标记基因通过同源重组而环出。还可以通过向该突变体菌株中引入核酸片段，该核酸片段包含缺陷基因的5'和3'区但是缺乏该选择性标记基因，随后在反向选择培养基上进行选择，通过同源重组来除去该选择性标记基因。通过同源重组，含有该选择性标记基因的缺陷基因被缺乏该选择性标记基因的核酸片段替换。还可以使用本领域已知的其他方法。
使用含淀粉材料的方法
在一些方面，本文所述的方法从含淀粉材料生产发酵产物。含淀粉材料在本领域中是熟知的，其含有两种类型的同聚多糖(直链淀粉和支链淀粉)并且通过α-(1-4)-D-糖苷键连接。可以使用任何适合的含淀粉起始材料。通常基于希望的发酵产物(如乙醇)来选择起始材料。含淀粉起始材料的实例包括谷类、块茎或谷物。具体地，该含淀粉材料可以是玉米、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯(cassava)、树薯(tapioca)、高粱、燕麦、水稻、豌豆、豆类、或甘薯、或其混合物。还考虑了糯型(waxy type)与非糯型(non-waxy type)的玉米与大麦。
在一个实施例中，该含淀粉起始材料是玉米。在一个实施例中，该含淀粉起始材料是小麦。在一个实施例中，该含淀粉起始材料是大麦。在一个实施例中，该含淀粉起始材料是黑麦。在一个实施例中，该含淀粉起始材料是买罗高粱。在一个实施例中，该含淀粉起始材料是西米。在一个实施例中，该含淀粉起始材料是木薯。在一个实施例中，该含淀粉起始材料是树薯。在一个实施例中，该含淀粉起始材料是高粱。在一个实施例中，该含淀粉起始材料是水稻。在一个实施例中，该含淀粉起始材料是豌豆。在一个实施例中，该含淀粉起始材料是豆类。在一个实施例中，该含淀粉起始材料是甘薯。在一个实施例中，该含淀粉起始材料是燕麦。
使用含淀粉材料的方法可以包括常规方法(例如，包括以下更详细描述的液化步骤)或粗淀粉水解方法。在使用含淀粉材料的一些实施例中，该含淀粉材料的糖化在高于初始糊化温度的温度下进行。在使用含淀粉材料的一些实施例中，该含淀粉材料的糖化在低于初始糊化温度的温度下进行。
液化
在使用含淀粉材料的方面，这些方法可以进一步包括液化步骤，该液化步骤是通过在高于初始糊化温度的温度下使含淀粉材料经受α-淀粉酶和任选地蛋白酶和/或葡糖淀粉酶来进行的。液化中还可以存在和/或添加其他酶如支链淀粉酶和植酸酶。在一些实施例中，在所述方法的步骤a)和b)之前进行该液化步骤。
液化步骤可以进行0.5-5小时，如1-3小时，如典型地约2小时。
术语“初始糊化温度”意指含淀粉材料糊化开始的最低温度。通常，在水中加热的淀粉在约50℃与75℃之间开始糊化；糊化的准确温度依赖于具体的淀粉，并能够由本领域的技术人员容易地确定。因此，初始糊化温度可以根据植物物种、植物物种的具体品种、以及生长条件而变化。给定的含淀粉材料的初始糊化温度可以是使用Gorinstein和Lii,1992,
液化典型地是在从70℃-100℃范围内的温度下进行的。在一个实施例中，液化中的温度是在75℃-95℃之间，如在75℃-90℃之间，在80℃-90℃之间，或在82℃-88℃之间，如约85℃。
喷射蒸煮步骤可以在液化步骤之前进行，例如，在110℃-145℃、120℃-140℃、125℃-135℃之间、或约130℃的温度下进行约1-15分钟，进行约3-10分钟，或约5分钟。
液化期间的pH可以在4至7之间，如pH 4.5-6.5，pH 5.0-6.5，pH 5.0-6.0，pH 5.2-6.2，或约5.2、约5.4、约5.6或约5.8。
在一个实施例中，在液化之前，该方法进一步包括以下步骤：
i)优选地通过干磨来减小该含淀粉材料的粒度；
ii)形成包含该含淀粉材料和水的浆料。
该含淀粉起始材料(如全谷物)可(例如通过碾磨)减小粒度以打开结构、增大表面积并且允许进一步加工。通常存在两种类型的方法：湿磨和干磨。在干磨中，整个谷粒被碾磨并且使用。湿磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)良好分离。湿磨常常应用于使用淀粉水解物产生例如糖浆的场合(location)。干磨和湿磨在淀粉加工领域中都是众所周知的。在一个实施例中，使该含淀粉材料经受干磨。在一个实施例中，将粒度减小至在0.05至3.0mm之间、例如0.1-0.5mm，或使得至少30％、至少50％、至少70％、或至少90％的含淀粉材料适合通过具有0.05至3.0mm筛网、例如0.1-0.5mm筛网的筛子。在另一个实施例中，至少50％，例如至少70％、至少80％、或至少90％的含淀粉材料适合通过具有#6筛网的筛子。
该水性浆料可以包含含淀粉材料的从10w/w-％-55w/w-％干固体(DS)，例如25w/w-％-45w/w-％干固体(DS)，或30w/w-％-40w/w-％干固体(DS)。
最初，可以将α-淀粉酶，任选地蛋白酶和任选地葡糖淀粉酶添加到该水性浆料中来开始液化(稀化)。在一个实施例中，这些酶中仅有一部分(例如，约1/3)被添加到该水性浆料中，而这些酶中的剩余部分(例如，约2/3)在液化步骤过程中被添加。
液化中使用的α-淀粉酶的非穷尽性列表可以在下面的“α-淀粉酶”部分中找到。液化中使用的适合的蛋白酶的实例包括上文“蛋白酶”部分中描述的任何蛋白酶。液化中使用的适合的葡糖淀粉酶的实例包括在“液化中的葡糖淀粉酶”部分中找到的任何葡糖淀粉酶。
α-淀粉酶
α-淀粉酶可任选地与葡糖淀粉酶和/或支链淀粉酶一起存在于和/或添加到液化中，例如，如WO 2012/088303(诺维信公司)或WO 2013/082486(诺维信公司)中所披露，将参考文献都通过引用并入。
在一些实施例中，该发酵生物包含编码α-淀粉酶的异源多核苷酸，例如，如WO2017/087330中所披露，将其内容通过引用特此并入。考虑本文描述或参照的任何α-淀粉酶用于在发酵生物中表达。
该α-淀粉酶可以是适合宿主细胞和/或本文所述的方法的任何α-淀粉酶，如天然存在的α-淀粉酶或其保留α-淀粉酶活性的变体。
在一些实施例中，当在相同条件下培养时，与不具有编码α-淀粉酶的异源多核苷酸的宿主细胞相比，包含编码该α-淀粉酶的异源多核苷酸的发酵生物具有增加的α-淀粉酶活性水平。在一些实施例中，当在相同条件下培养时，与不具有编码α-淀粉酶的异源多核苷酸的发酵生物相比，该发酵生物具有增加至少5％，例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％或至少500％的α-淀粉酶活性水平。
可以与本文所述的宿主细胞和/或方法一起使用的示例性α-淀粉酶包括细菌、酵母或丝状真菌α-淀粉酶，例如，衍生自本文描述或参照的任何微生物，如上文在与蛋白酶有关的部分下描述的。
术语“细菌α-淀粉酶”意指在EC 3.2.1.1项下分类的任何细菌α-淀粉酶。本文所用的细菌α-淀粉酶可例如衍生自芽孢杆菌属(有时也称作地芽孢杆菌属)的菌株。在一个实施例中，该芽孢杆菌属α-淀粉酶衍生自解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的菌株，但是也可以衍生自其他芽孢杆菌属菌种。
细菌α-淀粉酶的具体实例包括WO 99/19467中的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSG)，WO 99/19467中的SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(BAN)，以及WO 99/19467中的SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(BLA)(所有序列都通过引用特此并入)。在一个实施例中，该α-淀粉酶可以是分别与WO99/19467中的SEQ ID NO:3、4或5所示的任何序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性程度的酶。
在一个实施例中，该α-淀粉酶可以是如下酶，该酶具有与WO 99/19467中的SEQ IDNO:3所示的任何序列至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性程度的成熟多肽序列。
在一个实施例中，该α-淀粉酶衍生自嗜热脂肪芽孢杆菌。该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是成熟野生型或其成熟变体。该成熟嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是在重组产生过程中天然地截短的。例如，该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以在C-末端处被截短，使得其为480-495个氨基酸长，如约491个氨基酸长，例如使得其缺乏功能性淀粉结合结构域(与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3相比)。
该芽孢杆菌α-淀粉酶还可以是变体和/或杂合体。这样的变体的实例可见于以下任一者中：WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059、以及WO02/10355(各自通过引用特此并入)。具体的α-淀粉酶变体在美国专利号6,093,562、6,187,576、6,297,038和7,713,723中披露(通过引用特此并入)并包括具有以下改变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(常常称作BSGα-淀粉酶)变体：在位置R179、G180、I181和/或G182处的一个或两个氨基酸的缺失，优选WO 96/23873中披露的双缺失–参见例如第20页，第1-10行(通过引用特此并入)，如与WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列相比对应于位置I181和G182的缺失，或使用WO 99/19467(该参考文献通过引用特此并入)中的SEQ ID NO:3用于编号的氨基酸R179和G180的缺失。在一些实施例中，该芽孢杆菌α-淀粉酶(如嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶)具有与在WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3所示的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比对应于位置181和182的缺失的双缺失，并且还任选地包含N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。该细菌α-淀粉酶还可以在对应于WO 99/19467中的SEQ ID NO:4所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、或WO 99/19467中的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242和/或E188P变体中的S239的位置处具有取代。
在一个实施例中，该变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242A、E或Q变体，例如S242Q变体。
在一个实施例中，该变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的位置E188变体，例如E188P变体。
在一个实施例中，该细菌α-淀粉酶可以是截短的芽孢杆菌属α-淀粉酶。在一个实施例中，截短是这样的，例如，以使得WO 99/19467中的SEQ ID NO:3所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶是约491个氨基酸长，如从480至495个氨基酸长，或者使得其缺乏功能性淀粉结合结构域。
该细菌α-淀粉酶也可以是杂合细菌α-淀粉酶，例如包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(WO 99/19467的SEQ ID NO:4中所示)的445个C-末端氨基酸残基和衍生自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(WO 99/19467的SEQ ID NO:5中所示)的37个N-末端氨基酸残基的α-淀粉酶。在一个实施例中，该杂合体具有以下取代中的一个或多个，尤其是全部：G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌编号)。在一些实施例中，这些变体具有以下突变(或在其他芽孢杆菌α-淀粉酶中的对应突变)中的一个或多个：H154Y、A181T、N190F、A209V以及Q264S和/或在位置176与179之间的两个残基的缺失，例如E178和G179的缺失(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:5进行位置编号)。
在一个实施例中，该细菌α-淀粉酶是嵌合α-淀粉酶的成熟部分，其披露于Richardson等人(2002),The Journal of Biological Chemistry[生化杂志],277卷,29期,7月19日发表,267501-26507页中，称作BD5088或其变体。此α-淀粉酶与WO 2007134207中的SEQ ID NO:2所示的相同。成熟酶序列在位置1处的起始“Met”氨基酸之后开始。
该α-淀粉酶可以是热稳定α-淀粉酶，如热稳定细菌α-淀粉酶，例如来自嗜热脂肪芽孢杆菌。在一个实施例中，如2017年11月22日提交的PCT/US2017/063159的实例1中所述确定的，在本文所述的方法中使用的α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少15的T1/2(min)。在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少20的T1/2(min)。在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少25的T1/2(min)。在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少30的T1/2(min)。在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mMCaCl2下具有至少40的T1/2(min)。
在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少50的T1/2(min)。在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少60的T1/2(min)。在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在10-70之间的T1/2(min)。在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mMCaCl2下具有在15-70之间的T1/2(min)。在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在20-70之间的T1/2(min)。在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在25-70之间的T1/2(min)。在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在30-70之间的T1/2(min)。在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在40-70之间的T1/2(min)。在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在50-70之间的T1/2(min)。在一个实施例中，该热稳定α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在60-70之间的T1/2(min)。
在一个实施例中，该α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，例如衍生自芽孢杆菌属，如嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，例如，如在WO 99/019467中披露为SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌，其中在位置R179、G180、I181和/或G182处具有一个或两个氨基酸缺失，特别是R179和G180缺失、或具有I181和G182缺失，具有如下突变列表中的突变。
在一些实施例中，该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶具有双缺失I181+G182，以及任选的取代N193F，进一步包含以下取代或取代的组合中的一个：
V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+D269E+D281N；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+I270L；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F；
V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274K；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S；
V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T；
A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
E129V+K177L+R179E；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+L427M；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+I377*；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S；
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T；
E129V+K177L+R179E+S242Q；
E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
K220P+N224L+S242Q+Q254S；
M284V；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；和
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
在一个实施例中，该α-淀粉酶选自下组：嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体，其具有双缺失I181*+G182*，以及任选的取代N193F，并且进一步具有以下取代或取代的组合中的一个：
E129V+K177L+R179E；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；和
E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:1进行编号)。
应理解的是，当提及嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶及其变体时，它们通常以截短的形式产生。具体地，截短可以是这样的，以使得WO 99/19467中的SEQ ID NO:3所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体在C-末端处截短并且典型地是约从480-495个氨基酸长，如约491个氨基酸长，例如使得其缺乏功能性淀粉结合结构域。
在一个实施例中，该α-淀粉酶变体可以是如下酶，该酶具有与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3所示的序列至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％同一性程度的成熟多肽序列。
在一个实施例中，将该细菌α-淀粉酶，例如芽孢杆菌属α-淀粉酶，如尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体，以在0.01-10KNU-A/g DS之间的浓度给出到液化中，例如，在0.02和5KNU-A/g DS之间，如0.03和3KNU-A，优选地0.04和2KNU-A/g DS，如尤其是0.01和2KNU-A/g DS。在一个实施例中，将该细菌α-淀粉酶，例如芽孢杆菌属α-淀粉酶，如尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体，以在0.0001-1mg EP(酶蛋白)/g DS之间的浓度给出到液化中，例如0.0005-0.5mg EP/g DS，如0.001-0.1mg EP/g DS。
在一个实施例中，该细菌α-淀粉酶衍生自SEQ ID NO:76的枯草芽孢杆菌α-淀粉酶、SEQ ID NO:82的枯草芽孢杆菌α-淀粉酶、SEQ ID NO:83的枯草芽孢杆菌α-淀粉酶、SEQID NO:84的枯草芽孢杆菌α-淀粉酶、或SEQ ID NO:85的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、SEQ IDNO:89的发酵植物多糖梭菌(Clostridium phytofermentans)α-淀粉酶、SEQ ID NO:90的发酵植物多糖梭菌α-淀粉酶、SEQ ID NO:91的发酵植物多糖梭菌α-淀粉酶、SEQ ID NO:92的发酵植物多糖梭菌α-淀粉酶、SEQ ID NO:93的发酵植物多糖梭菌α-淀粉酶、SEQ ID NO:94的发酵植物多糖梭菌α-淀粉酶、SEQ ID NO:95的热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)α-淀粉酶、SEQ ID NO:96的嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)α-淀粉酶、SEQ ID NO:97的嗜热裂孢菌α-淀粉酶、SEQ ID NO:98的嗜热厌氧菌、SEQ ID NO:99的嗜热厌氧菌(Anaerocellum thermophilum)、SEQ ID NO:100的嗜热厌氧菌、SEQ ID NO:101的除虫链霉菌、或SEQ ID NO:88的除虫链霉菌。
在一个实施例中，该α-淀粉酶衍生自酵母α-淀粉酶，如SEQ ID NO:77的扣囊复膜酵母菌α-淀粉酶、SEQ ID NO:78的西方德巴利酵母α-淀粉酶、SEQ ID NO:79的西方德巴利酵母α-淀粉酶、SEQ ID NO:80的橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)α-淀粉酶、SEQ IDNO:81的橘林油脂酵母α-淀粉酶。
在一个实施例中，该α-淀粉酶衍生自丝状真菌α-淀粉酶，如SEQ ID NO:86的黑曲霉α-淀粉酶、或SEQ ID NO:87的黑曲霉α-淀粉酶。
考虑与本发明一起使用的另外的α-淀粉酶可以在WO 2011/153516(将其内容并入本文)中找到。
编码适合的α-淀粉酶的另外的多核苷酸可以获得自任何属的微生物，包括在UniProtKB数据库(www.uniprot.org)内可容易获得的那些。
α-淀粉酶编码序列也可用于设计核酸探针以鉴定和克隆编码来自不同属或种的菌株的α-淀粉酶的DNA，如上文所述的。
还可以从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得编码α-淀粉酶的多核苷酸，如上文所述的。
用于分离或克隆编码α-淀粉酶的多核苷酸的技术在上文中描述。
在一个实施例中，该α-淀粉酶具有与本文描述或参照的任何α-淀粉酶(例如，SEQID NO:79的西方德巴利酵母α-淀粉酶)至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的成熟多肽序列。在一方面，该α-淀粉酶成熟多肽序列与本文描述或参照的任何α-淀粉酶(例如，SEQ ID NO:79的西方德巴利酵母α-淀粉酶)相差不超过十个氨基酸，例如相差不超过五个氨基酸、相差不超过四个氨基酸、相差不超过三个氨基酸、相差不超过两个氨基酸、或相差一个氨基酸。在一个实施例中，该α-淀粉酶成熟多肽序列包含以下或由其组成：本文描述或参照的任何α-淀粉酶(例如，SEQID NO:79的西方德巴利酵母α-淀粉酶)的氨基酸序列、等位基因变体、或其具有α-淀粉酶活性的片段。在一个实施例中，该α-淀粉酶具有一个或多个(例如，两个、若干个)氨基酸的氨基酸取代、缺失和/或***。在一些实施例中，氨基酸取代、缺失和/或***的总数不超过10，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2或1。
在一些实施例中，该α-淀粉酶在相同条件下具有本文描述或参照的任何α-淀粉酶(例如，SEQ ID NO:79的西方德巴利酵母α-淀粉酶)的α-淀粉酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
在一个实施例中，该α-淀粉酶编码序列在至少低严格条件下，例如中严格条件下、中-高严格条件下、高严格条件下、或非常高严格条件下与来自本文描述或参照的任何α-淀粉酶(例如，SEQ ID NO:79的西方德巴利酵母α-淀粉酶)的编码序列的全长互补链杂交。在一个实施例中，该α-淀粉酶编码序列与来自本文描述或参照的任何α-淀粉酶(例如，SEQ IDNO:79的西方德巴利酵母α-淀粉酶)的编码序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
在一个实施例中，编码该α-淀粉酶的多核苷酸包含本文描述或参照的任何α-淀粉酶(例如，SEQ ID NO:79的西方德巴利酵母α-淀粉酶)的编码序列。在一个实施例中，编码该α-淀粉酶的多核苷酸包含来自本文描述或参照的任何α-淀粉酶的编码序列的子序列，其中该子序列编码具有α-淀粉酶活性的多肽。在一个实施例中，子序列中的核苷酸残基的数目是参照编码序列的数目的至少75％，例如至少80％、85％、90％或95％。
该α-淀粉酶还可以包括融合多肽或可切割的融合多肽，如上文所述的。
液化中的葡糖淀粉酶
葡糖淀粉酶可任选地存在于和/或添加到液化步骤中。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶与α-淀粉酶和/或任选的蛋白酶和/或支链淀粉酶一起或单独添加。
在一些实施例中，该发酵生物包含编码葡糖淀粉酶的异源多核苷酸，例如，如WO2017/087330中所披露，将其内容通过引用特此并入。考虑本文描述或参照的任何葡糖淀粉酶用于在发酵生物中表达。
该葡糖淀粉酶可以是适合宿主细胞和/或本文所述的方法的任何葡糖淀粉酶，如天然存在的葡糖淀粉酶或其保留葡糖淀粉酶活性的变体。液化中的葡糖淀粉酶可以是本节中描述的任何葡糖淀粉酶和/或以下所述的“糖化和/或发酵中的葡糖淀粉酶”中描述的任何葡糖淀粉酶。
在一些实施例中，当在相同条件下培养时，与不具有编码葡糖淀粉酶的异源多核苷酸的宿主细胞相比，包含编码该葡糖淀粉酶的异源多核苷酸的发酵生物具有增加的葡糖淀粉酶活性水平。在一些实施例中，当在相同条件下培养时，与不具有编码葡糖淀粉酶的异源多核苷酸的发酵生物相比，该发酵生物具有增加至少5％，例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％或至少500％的葡糖淀粉酶活性水平。
可以与本文所述的宿主细胞和/或方法一起使用的示例性葡糖淀粉酶包括细菌、酵母或丝状真菌葡糖淀粉酶，例如，获得自本文描述或参照的任何微生物，如上文在与蛋白酶有关的部分下描述的。
在一个实施例中，如2017年11月22日提交的PCT/US2017/063159的实例4(热稳定性)中所述确定的，该葡糖淀粉酶在85℃下具有至少20％、至少30％，或至少35％的相对活性热稳定性。
在一个实施例中，如2017年11月22日提交的PCT/US 2017/063159的实例4(pH最佳值)中所述确定的，该葡糖淀粉酶在pH 5.0下具有至少90％，例如至少95％、至少97％、或100％的相对活性pH最佳值。
在一个实施例中，如2017年11月22日提交的PCT/US 2017/063159的实例4(pH稳定性)中所述确定的，该葡糖淀粉酶在pH 5.0下具有至少80％、至少85％、至少90％的pH稳定性。
在一个实施例中，液化中使用的葡糖淀粉酶(如草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)葡糖淀粉酶变体)在pH 4.0下具有确定为DSC Td的至少70℃，优选地至少75℃、如至少80℃、如至少81℃、如至少82℃、如至少83℃、如至少84℃、如至少85℃、如至少86℃、如至少87％、如至少88℃、如至少89℃、如至少90℃的热稳定性，如2017年11月22日提交的PCT/US 2017/063159的实例15中所述。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶(如草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体)在pH 4.0下具有确定为DSC Td的在70℃和95℃之间范围内(如在80℃和90℃之间)的热稳定性，如2017年11月22日提交的PCT/US 2017/063159的实例15中所述。
在一个实施例中，液化中使用的葡糖淀粉酶(如草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体)在pH4.8下具有确定为DSC Td的至少70℃，优选地至少75℃、如至少80℃、如至少81℃、如至少82℃、如至少83℃、如至少84℃、如至少85℃、如至少86℃、如至少87％、如至少88℃、如至少89℃、如至少90℃、如至少91℃的热稳定性，如2017年11月22日提交的PCT/US 2017/063159的实例15中所述。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶(如草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体)在pH 4.8下具有确定为DSC Td的在70℃和95℃之间范围内(如在80℃和90℃之间)的热稳定性，如2017年11月22日提交的PCT/US 2017/063159的实例15中所述。
在一个实施例中，液化中使用的葡糖淀粉酶(如草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体)具有确定为至少100％，如至少105％、如至少110％、如至少115％、如至少120％、如至少125％的残余活性，如2017年11月22日提交的PCT/US 2017/063159的实例16中所述。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶(如草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体)具有确定为在100％和130％之间范围内的残余活性，如2017年11月22日提交的PCT/US2017/063159的实例16中所述。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶(例如真菌来源的，如丝状真菌)是来自青霉属的菌株，例如草酸青霉菌的菌株，特别是在WO 2011/127802(将其通过引用特此并入)中披露为SEQ ID NO:2的以及本文的SEQ ID NO:9或14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶具有与WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2所示的成熟多肽至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的成熟多肽序列。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2的以及本文的SEQ ID NO:9和14所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的变体，具有K79V取代(使用本文的SEQ ID NO:14中所示的成熟序列进行编号)。如WO 2013/036526(将其通过引用特此并入)中披露的，该K79V葡糖淀粉酶变体相对于亲本对蛋白酶降解具有降低的敏感度。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶衍生自草酸青霉菌。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的变体。在一个实施例中，该草酸青霉菌葡糖淀粉酶是WO2011/127802中作为SEQ ID NO:2披露的，在位置79处具有Val(V)。
考虑的草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体披露于WO 2013/053801(将其通过引用特此并入)中。
在一个实施例中，这些变体对蛋白酶降解具有降低的敏感度。
在一个实施例中，这些变体与亲本相比具有改善的热稳定性。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶具有对应于PE001变体的K79V取代(使用WO2011/127802的SEQ ID NO:2进行编号)，并且进一步包含以下改变之一或改变的组合：
T65A；Q327F；E501V；Y504T；Y504*；T65A+Q327F；T65A+E501V；T65A+Y504T；T65A+Y504*；Q327F+E501V；Q327F+Y504T；Q327F+Y504*；E501V+Y504T；E501V+Y504*；T65A+Q327F+E501V；T65A+Q327F+Y504T；T65A+E501V+Y504T；Q327F+E501V+Y504T；T65A+Q327F+Y504*；T65A+E501V+Y504*；Q327F+E501V+Y504*；T65A+Q327F+E501V+Y504T；T65A+Q327F+E501V+Y504*；E501V+Y504T；T65A+K161S；T65A+Q405T；T65A+Q327W；T65A+Q327F；T65A+Q327Y；P11F+T65A+Q327F；R1K+D3W+K5Q+G7V+N8S+T10K+P11S+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；R1E+D3N+P4G+G6R+G7A+N8A+T10D+P11D+T65A+Q327F；P11F+T65A+Q327W；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；T65A+Q327F+E501V+Y504T；T65A+S105P+Q327W；T65A+S105P+Q327F；T65A+Q327W+S364P；T65A+Q327F+S364P；T65A+S103N+Q327F；P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S；P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502*；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502T+P563S+K571E；P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+N564D+K571S；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T；P2N+P4S+P11F+T65A+V325T+Q327W；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+I375A+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+K218A+K221D+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+T10D+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+F12Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T568N；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+K524T+G526A；P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+F80*+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+K112S+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+N502T+Y504*；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；P2N+P4S+P11F+T65A+V79A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+V79G+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+V79I+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+V79L+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+V79S+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+L72V+Q327F+E501V+Y504T；S255N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+E74N+V79K+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+G220N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Y245N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q253N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+D279N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S359N+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D370N+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460T+P468T+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T463N+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S465N+E501V+Y504T；和P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T477N+E501V+Y504T。
在一个实施例中，该草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体具有对应于PE001变体的K79V取代(使用WO 2011/127802的SEQ ID NO:2进行编号)，并且进一步包含以下取代或取代的组合中的一个：
P11F+T65A+Q327F；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；
P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；和
P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T。
该葡糖淀粉酶能以从0.1-100微克EP/g，如0.5-50微克EP/g，如1-25微克EP/g，如2-12微克EP/g DS的量添加。
编码适合的葡糖淀粉酶的另外的多核苷酸可以获得自任何属的微生物，包括在UniProtKB数据库(www.uniprot.org)内可容易获得的那些。
葡糖淀粉酶编码序列也可用于设计核酸探针以鉴定和克隆编码来自不同属或种的菌株的葡糖淀粉酶的DNA，如上文所述的。
还可以从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得编码葡糖淀粉酶的多核苷酸，如上文所述的。
用于分离或克隆编码葡糖淀粉酶的多核苷酸的技术在上文中描述。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶具有与本文描述或参照的任何葡糖淀粉酶至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的成熟多肽序列。在一方面，该葡糖淀粉酶具有如下成熟多肽序列，该序列与本文描述或参照的任何葡糖淀粉酶相差不超过十个氨基酸，例如相差不超过五个氨基酸、相差不超过四个氨基酸、相差不超过三个氨基酸、相差不超过两个氨基酸、或相差一个氨基酸。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶具有如下成熟多肽序列，该序列包含以下或由其组成：本文描述或参照的任何葡糖淀粉酶的氨基酸序列、等位基因变体、或其具有葡糖淀粉酶活性的片段。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶具有一个或多个(例如，两个、若干个)氨基酸的氨基酸取代、缺失和/或***。在一些实施例中，氨基酸取代、缺失和/或***的总数不超过10，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2或1。
在一些实施例中，该葡糖淀粉酶在相同条件下具有本文描述或参照的任何葡糖淀粉酶的葡糖淀粉酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶编码序列在至少低严格条件下，例如中严格条件下、中-高严格条件下、高严格条件下、或非常高严格条件下与来自本文描述或参照的任何葡糖淀粉酶的编码序列的全长互补链杂交。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶编码序列与本文描述或参照的任何葡糖淀粉酶的编码序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
在一个实施例中，编码该葡糖淀粉酶的多核苷酸包含本文描述或参照的任何葡糖淀粉酶的编码序列。在一个实施例中，编码该葡糖淀粉酶的多核苷酸包含来自本文描述或参照的任何葡糖淀粉酶的编码序列的子序列，其中该子序列编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽。在一个实施例中，子序列中的核苷酸残基的数目是参照编码序列的数目的至少75％，例如至少80％、85％、90％或95％。
该葡糖淀粉酶还可以包括融合多肽或可切割的融合多肽，如上文所述的。
支链淀粉酶
在一些实施例中，支链淀粉酶是在液化步骤和/或糖化步骤或同时糖化和发酵(SSF)中存在的和/或添加的。
支链淀粉酶(E.C.3.2.1.41，支链淀粉6-葡聚糖-水解酶)是去分支酶，其特征在于它们在例如分枝淀粉和支链淀粉中水解α-1,6-糖苷键的能力。
在一些实施例中，该发酵生物包含编码支链淀粉酶的异源多核苷酸。考虑本文描述或参照的任何支链淀粉酶用于在发酵生物中表达。
该支链淀粉酶可以是适合宿主细胞和/或本文所述的方法的任何支链淀粉酶，如天然存在的支链淀粉酶或其保留支链淀粉酶活性的变体。
在一些实施例中，当在相同条件下培养时，与不具有编码支链淀粉酶的异源多核苷酸的宿主细胞相比，包含编码该支链淀粉酶的异源多核苷酸的发酵生物具有增加的支链淀粉酶活性水平。在一些实施例中，当在相同条件下培养时，与不具有编码支链淀粉酶的异源多核苷酸的发酵生物相比，该发酵生物具有增加至少5％，例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％或至少500％的支链淀粉酶活性水平。
可以与本文所述的宿主细胞和/或方法一起使用的示例性支链淀粉酶包括细菌、酵母或丝状真菌支链淀粉酶，例如，获得自本文描述或参照的任何微生物，如上文在与蛋白酶有关的部分下描述的。
考虑的支链淀粉酶包括来自美国专利号4,560,651(通过引用特此并入)中披露的淀粉脱支芽孢杆菌(Bacillus amyloderamificans)的支链淀粉酶、WO 01/151620(通过引用特此并入)中披露为SEQ ID NO:2的支链淀粉酶、WO 01/151620(通过引用特此并入)中披露为SEQ ID NO:4的脱支芽孢杆菌(Bacillus deramificans)的支链淀粉酶，以及来自WO01/151620(通过引用特此并入)中披露为SEQ ID NO:6的嗜酸性支链淀粉芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)的支链淀粉酶，以及还有描述于FEMS Mic.Let.[FEMS微生物学通讯](1994)115,97-106中的支链淀粉酶。
考虑的另外的支链淀粉酶包括来自沃斯氏热球菌(Pyrococcus woesei)、特别是来自WO 92/02614中披露的沃斯氏热球菌DSM号3773的支链淀粉酶。
在一个实施例中，该支链淀粉酶是GH57家族支链淀粉酶。在一个实施例中，该支链淀粉酶包括X47结构域，如披露于作为WO 2011/087836公开的US 61/289,040(将其通过引用特此并入)中。更具体地，该支链淀粉酶可以衍生自热球菌属的菌株，包括嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)和热水高温球菌(Thermococcus hydrothermalis)，如热水高温球菌支链淀粉酶刚好在X47结构域之后的X4位点截短(即，氨基酸1-782)。该支链淀粉酶还可以是嗜热高温球菌和热水高温球菌支链淀粉酶的杂合体或具有截短位点X4的、披露于作为WO 2011/087836公开的US 61/289,040(将其通过引用特此并入)中的热水高温球菌/嗜热高温球菌杂合酶。
在另一个实施例中，该支链淀粉酶是包含披露于WO 2011/076123(诺维信公司)中的X46结构域的支链淀粉酶。
该支链淀粉酶能以有效量添加，包括约0.0001-10mg酶蛋白/克DS的优选量，优选0.0001-0.10mg酶蛋白/克DS，更优选0.0001-0.010mg酶蛋白/克DS。支链淀粉酶活性可以确定为NPUN。用于确定NPUN的测定法描述于2017年11月22日提交的PCT/US 2017/063159中。
适合的可商购支链淀粉酶产品包括PROMOZYME D、PROMOZYMETM D2(诺维信公司，丹麦)、OPTIMAX L-300(杜邦-丹尼斯克(DuPont-Danisco)，美国)、以及AMANO 8(安能满公司，日本)。
在一个实施例中，该支链淀粉酶衍生自SEQ ID NO:114的枯草芽孢杆菌支链淀粉酶。在一个实施例中，该支链淀粉酶衍生自SEQ ID NO:115的地衣芽孢杆菌支链淀粉酶。在一个实施例中，该支链淀粉酶衍生自SEQ ID NO:116的水稻支链淀粉酶。在一个实施例中，该支链淀粉酶衍生自SEQ ID NO:117的小麦支链淀粉酶。在一个实施例中，该支链淀粉酶衍生自SEQ ID NO:118的发酵植物多糖梭菌支链淀粉酶。在一个实施例中，该支链淀粉酶衍生自SEQ ID NO:119的除虫链霉菌支链淀粉酶。在一个实施例中，该支链淀粉酶衍生自SEQ IDNO:120的肺炎克雷柏氏菌(Klebsiella pneumoniae)支链淀粉酶。
考虑与本发明一起使用的另外的支链淀粉酶可以在WO 2011/153516(将其内容并入本文)中找到。
编码适合的支链淀粉酶的另外的多核苷酸可以获得自任何属的微生物，包括在UniProtKB数据库(www.uniprot.org)内可容易获得的那些。
支链淀粉酶编码序列也可用于设计核酸探针以鉴定和克隆编码来自不同属或种的菌株的支链淀粉酶的DNA，如上文所述的。
还可以从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得编码支链淀粉酶的多核苷酸，如上文所述的。
用于分离或克隆编码支链淀粉酶的多核苷酸的技术在上文中描述。
在一个实施例中，该支链淀粉酶具有与本文描述或参照的任何支链淀粉酶至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的成熟多肽序列。在一方面，该支链淀粉酶具有如下成熟多肽序列，该序列与本文描述或参照的任何支链淀粉酶相差不超过十个氨基酸，例如相差不超过五个氨基酸、相差不超过四个氨基酸、相差不超过三个氨基酸、相差不超过两个氨基酸、或相差一个氨基酸。在一个实施例中，该支链淀粉酶具有如下成熟多肽序列，该序列包含以下或由其组成：本文描述或参照的任何支链淀粉酶的氨基酸序列、等位基因变体、或其具有支链淀粉酶活性的片段。在一个实施例中，该支链淀粉酶具有一个或多个(例如，两个、若干个)氨基酸的氨基酸取代、缺失和/或***。在一些实施例中，氨基酸取代、缺失和/或***的总数不超过10，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2或1。
在一些实施例中，该支链淀粉酶在相同条件下具有本文描述或参照的任何支链淀粉酶的支链淀粉酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
在一个实施例中，该支链淀粉酶编码序列在至少低严格条件下，例如中严格条件下、中-高严格条件下、高严格条件下、或非常高严格条件下与来自本文描述或参照的任何支链淀粉酶的编码序列的全长互补链杂交。在一个实施例中，该支链淀粉酶编码序列与本文描述或参照的任何支链淀粉酶的编码序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
在一个实施例中，编码该支链淀粉酶的多核苷酸包含本文描述或参照的任何支链淀粉酶的编码序列。在一个实施例中，编码该支链淀粉酶的多核苷酸包含来自本文描述或参照的任何支链淀粉酶的编码序列的子序列，其中该子序列编码具有支链淀粉酶活性的多肽。在一个实施例中，子序列中的核苷酸残基的数目是参照编码序列的数目的至少75％，例如至少80％、85％、90％或95％。
该支链淀粉酶还可以包括融合多肽或可切割的融合多肽，如上文所述的。
含淀粉材料的糖化和发酵
在使用含淀粉材料的方面，在糖化步骤a)和/或发酵步骤b)或同时糖化和发酵(SSF)中可存在和/或添加葡糖淀粉酶。糖化步骤a)和/或发酵步骤b)或同时糖化和发酵(SSF)的葡糖淀粉酶典型地不同于任选地在上述任何液化步骤中添加的葡糖淀粉酶。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是与真菌α-淀粉酶一起存在和/或添加的。
在一些方面，该发酵生物包含编码葡糖淀粉酶的异源多核苷酸，例如，如WO 2017/087330中所披露，将其内容通过引用特此并入。
葡糖淀粉酶的实例可以在以下的“糖化和/或发酵中的葡糖淀粉酶”部分中找到。
当依序进行糖化和发酵时，糖化步骤a)可以在本领域中熟知的条件下进行。例如，糖化步骤a)可持续长达从约24至约72小时。在一个实施例中，进行预糖化。预糖化在30℃-65℃，典型地约60℃的温度下典型地进行40-90分钟。在一个实施例中，在同时糖化和发酵(SSF)中，预糖化之后是发酵过程中的糖化。糖化典型地在从20℃-75℃、优选地从40℃-70℃，典型地约60℃的温度下并且典型地在4与5之间的pH下、如约pH 4.5下进行。
如本领域已知并且例如如本文所述，在发酵培养基中进行发酵。该发酵培养基包括发酵底物，即被发酵生物代谢的碳水化合物源。利用本文所述的方法，该发酵培养基可以包含用于一种或多种发酵生物的营养素和一种或多种生长刺激剂。营养素和生长刺激剂在发酵领域中广泛使用，且包括氮源如氨；尿素、维生素和矿物质或其组合。
通常，发酵生物如酵母(包括酿酒酵母)需要充分的氮源用于增殖和发酵。如果必要的话，可以使用许多补充氮源，且这些氮源是本领域熟知的。该氮源可以是有机的，如尿素、DDG、湿滤饼(wet cake)或玉米醪，或无机的，如氨或氢氧化铵。在一个实施例中，该氮源是尿素。
当使用本文所述的表达蛋白酶的酵母时，可以在低氮条件下进行发酵。在一些实施例中，该发酵步骤在以下条件下进行：少于1000ppm补充氮(例如，尿素或氢氧化铵)，如少于750ppm、少于500ppm、少于400ppm、少于300ppm、少于250ppm、少于200ppm、少于150ppm、少于100ppm、少于75ppm、少于50ppm、少于25ppm、或少于10ppm补充氮。在一些实施例中，该发酵步骤在没有补充氮的条件下进行。
同时糖化和发酵(“SSF”)广泛地用于工业规模的发酵产物生产方法中，尤其是乙醇生产方法中。当进行SSF时，同时进行糖化步骤a)和发酵步骤b)。不存在针对糖化的保持阶段，意指可以将发酵生物(如酵母)以及一种或多种酶一同添加。然而，还考虑了分开添加发酵生物以及一种或多种酶。SSF典型地在从25℃至40℃、如从28℃至35℃、如从30℃至34℃、或约32℃的温度下进行。在一个实施例中，发酵进行6至120小时，特别是24至96小时。在一个实施例中，该pH在4-5之间。
在一个实施例中，在糖化、发酵或同时糖化和发酵(SSF)中存在和/或添加纤维素分解酶组合物。此类纤维素分解酶组合物的实例可以在以下的“纤维素分解酶组合物”部分中找到。该纤维素分解酶组合物可以与葡糖淀粉酶一起存在和/或添加，如以下“糖化和/或发酵中的葡糖淀粉酶”部分中所披露的葡糖淀粉酶。
糖化和/或发酵中的葡糖淀粉酶
在糖化、发酵或同时糖化和发酵(SSF)中可以存在和/或添加葡糖淀粉酶。
如上文所述，在一些实施例中，该发酵生物包含编码葡糖淀粉酶的异源多核苷酸，例如，如WO 2017/087330中所披露，将其内容通过引用特此并入。考虑本文描述或参照的任何葡糖淀粉酶用于在发酵生物中表达。
该葡糖淀粉酶可以是适合宿主细胞和/或本文所述的方法的任何α-淀粉酶，如天然存在的葡糖淀粉酶或其保留葡糖淀粉酶活性的变体。
在一些实施例中，当在相同条件下培养时，与不具有编码葡糖淀粉酶的异源多核苷酸的宿主细胞相比，包含编码该葡糖淀粉酶的异源多核苷酸的发酵生物具有增加的葡糖淀粉酶活性水平。在一些实施例中，当在相同条件下培养时，与不具有编码葡糖淀粉酶的异源多核苷酸的发酵生物相比，该发酵生物具有增加至少5％，例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％或至少500％的葡糖淀粉酶活性水平。
可以与本文所述的宿主细胞和/或方法一起使用的示例性葡糖淀粉酶包括细菌、酵母或丝状真菌葡糖淀粉酶，例如，获得自本文描述或参照的任何微生物，如上文在与蛋白酶有关的部分下描述的。
该葡糖淀粉酶可以衍生自任何适合的来源，例如衍生自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自下组，该组由以下组成：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等人,(1984),EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3(5),第1097-1102页)，或其变体，如WO 92/00381、WO 00/04136和WO 01/04273中披露的那些(来自丹麦诺维信公司，(Novozymes，Denmark))；WO 84/02921中披露的泡盛曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.[农业和生物化学],1991,55(4),第941-949页)，或其变体或片段。其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等人,(1996),Prot.Eng.[蛋白质工程]9,499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等人,(1995),Prot.Eng.[蛋白质工程]8,575-582)；N182(Chen等人,(1994),Biochem.J[生物化学杂志]301,275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等人,(1996),Biochemistry[生物化学],35,8698-8704)；以及在A435和S436位置导入Pro残基(Li等人,(1997),Protein Eng.[蛋白质工程]10,1199-1204)。
其他葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)(以前命名为罗尔伏革菌，Corticium rolfsii)葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和Nagasaka等人,(1998),“Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases fromCorticium rolfsii”[来自罗尔伏革菌的生淀粉降解葡糖淀粉酶的纯化和特性],Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]50:323-330)，篮状菌属葡糖淀粉酶，特别是衍生自埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)(WO 99/28448)、雷塞氏篮状菌(Talaromyces leycettanus)(美国专利登记号32,153)、杜氏篮状菌(Talaromycesduponti)、嗜热篮状菌(Talaromyces thermophilus)(美国专利号4,587,215)。在一个实施例中，糖化和/或发酵过程中使用的葡糖淀粉酶是WO 99/28448中披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶。
考虑的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)的葡糖淀粉酶。
考虑的真菌葡糖淀粉酶包括都披露于WO 2006/069289中的瓣环栓菌(Trametescingulate)(SEQ ID NO:20)、纸质厚孢孔菌(Pachykytospora papyracea)、和大白桩菇(Leucopaxillus giganteus)；或披露于WO 2007/124285中的红边隔孢伏革菌(Peniophorarufomarginata)；或其混合物。还考虑了杂合葡糖淀粉酶。实例包括WO 2005/045018中披露的杂合葡糖淀粉酶。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶衍生自密孔菌属的菌株，特别是如描述于WO2011/066576中的密孔菌属的菌株(其中的SEQ ID NO:2、4或6)，包括血红密孔菌葡糖淀粉酶，或者衍生自粘褶菌属的菌株，如篱边粘褶菌或密粘褶菌的菌株，特别是如描述于WO2011/068803中的粘褶菌属的菌株(其中的SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16)。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是WO 2011/068803中的SEQ ID NO:2(即，篱边粘褶菌葡糖淀粉酶)。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是密粘褶菌葡糖淀粉酶(在WO 2014/177546中披露为SEQ ID NO:3)。在另一个实施例中，该葡糖淀粉酶衍生自黑层孔属(Nigrofomes)的菌株，特别是披露于WO 2012/064351中的黑层孔属物种的菌株(其中的SEQ ID NO:2)。
还考虑了如下葡糖淀粉酶，这些葡糖淀粉酶与上述葡糖淀粉酶中的任一种显示高同一性，即，与上述成熟酶序列中的任一个显示至少60％，如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性。
葡糖淀粉酶能以如下量添加到糖化和/或发酵中：0.0001-20AGU/g DS，优选0.001-10AGU/g DS，尤其是在0.01-5AGU/g DS之间，如0.1-2AGU/g DS。
葡糖淀粉酶能以如下量添加到糖化和/或发酵中：1-1,000μg EP/g DS，优选10-500μg/g DS，尤其是在25-250μg/g DS之间。
该葡糖淀粉酶作为进一步包含α-淀粉酶的共混物添加。在一个实施例中，该α-淀粉酶是真菌α-淀粉酶，尤其是酸性真菌α-淀粉酶。该α-淀粉酶典型地是副活性。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是共混物，其包含WO 99/28448中披露为SEQ IDNO:34的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶和WO 06/069289中披露为SEQ ID NO:2的瓣环栓菌葡糖淀粉酶。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是共混物，其包含WO 99/28448中披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶(本文的SEQ ID NO:19)、WO 06/69289中披露为SEQ ID NO:2的瓣环栓菌葡糖淀粉酶、以及α-淀粉酶。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是共混物，其包含披露于WO 99/28448中的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶、披露于WO 06/69289中的瓣环栓菌葡糖淀粉酶、以及在WO 2006/069290的表5中披露为V039的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)α-淀粉酶。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是共混物，其包含如在WO 2011/068803中的SEQID NO:2所示的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，特别是WO 2013/006756中的SEQ IDNO:3披露的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶(特别地具有以下取代：G128D+D143N)。
在一个实施例中，该α-淀粉酶可以是衍生自根毛霉属的菌株，优选微小根毛霉的菌株，如WO 2013/006756中的SEQ ID NO:3所示的，或亚灰树花菌属(Meripilus)，优选大型亚灰树花菌的菌株。在一个实施例中，该α-淀粉酶衍生自在WO 2006/069290的表5中披露为V039的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉。
在一个实施例中，该微小根毛霉α-淀粉酶或具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶具有以下取代或取代组合中的至少一个：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；和G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C(使用WO 2013/006756中的SEQ ID NO:3进行编号)。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶共混物包含篱边粘褶菌葡糖淀粉酶(例如，WO2011/068803中的SEQ ID NO:2)和微小根毛霉α-淀粉酶。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶共混物包含如在WO 2011/068803中的SEQ ID NO:2所示的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶以及WO 2013/006756的SEQ ID NO:3披露的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉(具有以下取代：G128D+D143N)。
包含葡糖淀粉酶的可商购组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SANTM SUPER、SANTMEXTRA L、SPIRIZYMETM PLUS、SPIRIZYMETM FUEL、SPIRIZYMETM B4U、SPIRIZYMETM ULTRA、SPIRIZYMETM EXCEL、SPIRIZYME ACHIEVETM、和AMGTM E(来自诺维信公司)；OPTIDEXTM 300、GC480、GC417(来自杜邦-丹尼斯科公司)；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自帝斯曼公司(DSM))；G-ZYMETM G900、G-ZYMETM和G990 ZR(来自杜邦-丹尼斯科公司)。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶衍生自SEQ ID NO:102的西方德巴利酵母葡糖淀粉酶。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶衍生自SEQ ID NO:103的扣囊复膜酵母菌葡糖淀粉酶。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶衍生自SEQ ID NO:104的扣囊复膜酵母菌葡糖淀粉酶。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶衍生自SEQ ID NO:105的酿酒酵母葡糖淀粉酶。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶衍生自SEQ ID NO:106的黑曲霉葡糖淀粉酶。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶衍生自SEQ ID NO:107的米曲霉葡糖淀粉酶。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶衍生自SEQ ID NO:108的米根霉(Rhizopus oryzae)葡糖淀粉酶。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶衍生自SEQ ID NO:109的热纤维梭菌葡糖淀粉酶。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶衍生自SEQ ID NO:110的热纤维梭菌葡糖淀粉酶。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶衍生自SEQ IDNO:111的Arxula adeninivorans葡糖淀粉酶。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶衍生自SEQID NO:112的树脂枝孢霉(Hormoconis resinae)葡糖淀粉酶。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶衍生自SEQ ID NO:113的出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)葡糖淀粉酶。
考虑与本发明一起使用的另外的葡糖淀粉酶可以在WO 2011/153516(将其内容并入本文)中找到。
编码适合的葡糖淀粉酶的另外的多核苷酸可以获得自任何属的微生物，包括在UniProtKB数据库(www.uniprot.org)内可容易获得的那些。
葡糖淀粉酶编码序列也可用于设计核酸探针以鉴定和克隆编码来自不同属或种的菌株的葡糖淀粉酶的DNA，如上文所述的。
还可以从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得编码葡糖淀粉酶的多核苷酸，如上文所述的。
用于分离或克隆编码葡糖淀粉酶的多核苷酸的技术在上文中描述。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶具有与本文描述或参照的任何葡糖淀粉酶(例如，SEQ ID NO:103或104的扣囊复膜酵母菌葡糖淀粉酶)至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的成熟多肽序列。在一方面，该葡糖淀粉酶具有如下成熟多肽序列，该序列与本文描述或参照的任何葡糖淀粉酶(例如，SEQ ID NO:103或104的扣囊复膜酵母菌葡糖淀粉酶)相差不超过十个氨基酸，例如相差不超过五个氨基酸、相差不超过四个氨基酸、相差不超过三个氨基酸、相差不超过两个氨基酸、或相差一个氨基酸。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶具有如下成熟多肽序列，该序列包含以下或由其组成：本文描述或参照的任何葡糖淀粉酶(例如，SEQ ID NO:103或104的扣囊复膜酵母菌葡糖淀粉酶)的氨基酸序列、等位基因变体、或其具有葡糖淀粉酶活性的片段。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶具有一个或多个(例如，两个、若干个)氨基酸的氨基酸取代、缺失和/或***。在一些实施例中，氨基酸取代、缺失和/或***的总数不超过10，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2或1。
在一些实施例中，该葡糖淀粉酶在相同条件下具有本文描述或参照的任何葡糖淀粉酶(例如，SEQ ID NO:103或104的扣囊复膜酵母菌葡糖淀粉酶)的葡糖淀粉酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶编码序列在至少低严格条件下，例如中严格条件下、中-高严格条件下、高严格条件下、或非常高严格条件下与来自本文描述或参照的任何葡糖淀粉酶(例如，SEQ ID NO:103或104的扣囊复膜酵母菌葡糖淀粉酶)的编码序列的全长互补链杂交。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶编码序列与本文描述或参照的任何葡糖淀粉酶(例如，SEQ ID NO:103或104的扣囊复膜酵母菌葡糖淀粉酶)的编码序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
在一个实施例中，编码该葡糖淀粉酶的多核苷酸包含本文描述或参照的任何葡糖淀粉酶(例如，SEQ ID NO:103或104的扣囊复膜酵母菌葡糖淀粉酶)的编码序列。在一个实施例中，编码该葡糖淀粉酶的多核苷酸包含来自本文描述或参照的任何葡糖淀粉酶的编码序列的子序列，其中该子序列编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽。在一个实施例中，子序列中的核苷酸残基的数目是参照编码序列的数目的至少75％，例如至少80％、85％、90％或95％。
该葡糖淀粉酶还可以包括融合多肽或可切割的融合多肽，如上文所述的。
使用含纤维素材料的方法
在一些方面，本文所述的方法从含纤维素材料生产发酵产物。生物质的初生细胞壁中的主要多糖是纤维素，第二丰富的是半纤维素，而第三丰富的是果胶。细胞停止生长后产生的次生细胞壁也含有多糖，并且它通过与半纤维素共价交联的聚合木质素得到强化。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，因此是直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，如具有一系列取代基以复杂支链结构的木聚糖、木葡聚糖、***糖基木聚糖、以及甘露聚糖。尽管纤维素一般为多形态的，但发现其在植物组织中主要作为平行葡聚糖链的不溶性晶体基质存在。半纤维素通常氢键结合至纤维素以及其他半纤维素，这有助于稳定细胞壁基质。
纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴或树的叶、枝和木材(wood)中。该含纤维素材料可以是，但不限于：农业废弃物、草本材料(包括能量作物)、城市固体废物、纸浆和造纸厂废弃物、废纸、和木材(包括林业废弃物)(参见，例如Wiselogel等人,1995,于Handbook on Bioethanol[生物乙醇手册](Charles E.Wyman编辑),第105-118页,Taylor&Francis[泰勒-弗朗西斯出版集团],华盛顿特区；Wyman,1994,Bioresource Technology[生物资源技术]50:3-16；Lynd,1990,Applied Biochemistry and Biotechnology[应用生物化学与生物技术]24/25:695-719；Mosier等人,1999,Recent Progress inBioconversion of Lignocellulosics[木质纤维素的生物转化的最近进展],Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology[生物化学工程/生物技术的进展],T.Scheper主编,第65卷,第23-40页,纽约斯普林格出版社(Springer-Verlag),纽约)。在本文中应理解的是，该纤维素可以是任何形式的木质纤维素，在混合基质中含有木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。在一个实施例中，该含纤维素材料是任何生物质材料。在另一个实施例中，该含纤维素材料是木质纤维素，该木质纤维素包含纤维素、半纤维素、以及木质素。
在一个实施例中，该含纤维素材料是农业废弃物、草本材料(包括能源作物)、城市固体废物、纸浆和造纸厂废弃物、废纸、或木材(包括林业废弃物)。
在另一个实施例中，该含纤维素材料是芦竹、甘蔗渣、竹子、玉米芯、玉米纤维、玉米秸秆、芒属、稻秸、柳枝稷或麦秸。
在另一个实施例中，该含纤维素材料是山杨、桉树、冷杉、松树、白杨、云杉或柳树。
在另一个实施例中，该含纤维素材料是海藻纤维素、细菌纤维素、棉短绒、滤纸、微晶纤维素(例如，)、或经磷酸处理的纤维素。
在另一个实施例中，该含纤维素材料是水生生物质(aquatic biomass)。如本文所用的，术语“水生生物质”意指在水生环境中通过光合作用过程产生的生物质。水生生物质可以是藻类、挺水植物、浮叶植物、或沉水植物。
该含纤维素材料可按原样使用或可使用本领域已知的常规方法进行预处理，如本文所述的。在一个优选的实施例中，该含纤维素材料进行了预处理。
可以使用本领域常规的方法来完成使用含纤维素材料的方法。此外，这些方法可以使用配置为实施这些方法的任何常规生物质加工装置来执行。
纤维素预处理
在一个实施例中，在糖化之前对该含纤维素材料进行预处理。
在实践本文所述的方法中，可以使用本领域中已知的任何预处理方法来破坏该含纤维素材料的植物细胞壁组分(Chandra等人,2007,Adv.Biochem.Engin./Biotechnol[生化工程/生物技术进展],108:67-93；Galbe和Zacchi,2007,[生化工程/生物技术进展],108:41-65；Hendriks和Zeeman,2009,Bioresource Technology[生物资源技术]100:10-18；Mosier等人,2005,[生物资源技术]96:673-686；Taherzadeh和Karimi,2008,Int.J.Mol.Sci.[分子科学国际杂志],9:1621-1651；Yang和Wyman,2008,BiofuelsBioproducts and Biorefining-Biofpr.[生物燃料、生物制品和生物精炼]2:26-40)。
该含纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行粒度减小、筛分、预浸泡、润湿、洗涤和/或调理。
常规预处理包括但不限于：蒸汽预处理(伴随或不伴随***)、稀酸预处理、热水预处理、碱预处理、石灰预处理、湿氧化、湿***、氨纤维***、有机溶剂预处理、以及生物预处理。另外的预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO2、超临界H2O、臭氧、离子液体、以及γ辐射预处理。
在一个实施例中，在糖化(即水解)和/或发酵之前对该含纤维素材料进行预处理。预处理优选在水解前进行。可替代地，预处理可以与酶水解同时进行，以释放可发酵糖，如葡萄糖、木糖、和/或纤维二糖。在多数情况下，预处理步骤自身导致将生物质转化为可发酵糖(甚至在不存在酶的情况下)。
在一个实施例中，将该含纤维素材料用蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热该含纤维素材料以破坏植物细胞壁组分，包括木质素、半纤维素、以及纤维素，以使纤维素和其他级分(例如半纤维素)可接近酶。该含纤维素材料经过或穿过反应容器，将蒸汽注入该反应容器以增加温度至所需温度和压力，并且将蒸汽保持在其中持续希望的反应时间。优选在140℃-250℃(例如，160℃-200℃或170℃-190℃)进行蒸汽预处理，其中最佳温度范围取决于化学催化剂的任选添加。蒸汽预处理的停留时间优选是1-60分钟，例如1-30分钟、1-20分钟、3-12分钟、或4-10分钟，其中最佳停留时间取决于温度和化学催化剂的任选添加。蒸汽预处理允许相对高的固体加载量，这样使得该含纤维素材料在预处理过程中通常仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的材料的爆发放料(explosive discharge)合并，这被称为蒸汽***，即，快速急骤蒸发至大气压和材料的湍流，以通过破碎增加可接触的表面积(Duff和Murray,1996,Bioresource Technology[生物资源技术]855:1-33；Galbe和Zacchi,2002,Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]59:618-628；美国专利申请号2002/0164730)。在蒸汽预处理过程中，半纤维素乙酰基基团被切割，并且所得的酸自催化半纤维素部分水解成单糖和低聚糖。仅在有限的程度上去除木质素。
在一个实施例中，使该含纤维素材料经受化学预处理。术语“化学处理”是指能促进纤维素、半纤维素和/或木质素分离和/或释放的任何化学预处理。这种预处理可以将结晶纤维素转化为无定形纤维素。适合的化学预处理方法的实例包括例如稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻***(AFEX)、氨渗滤(APR)、离子液体、以及有机溶剂预处理。
有时在蒸汽预处理之前添加化学催化剂(如H2SO4或SO2)(典型地是0.3％至5％w/w)，该化学催化剂减少时间并降低温度、增加回收率、并改善酶水解(Ballesteros等人,2006,Appl.Biochem.Biotechnol[应用生物化学与生物技术]129-132:496-508；Varga等人,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]113-116:509-523；Sassner等人,2006,Enzyme Microb.Technol.[酶与微生物技术]39:756-762)。在稀酸预处理中，该含纤维素材料与稀酸(典型地是H2SO4)和水混合，以形成浆料，由蒸汽加热至希望的温度，并且在停留时间后闪变至大气压。可以用许多反应器设计来进行稀酸预处理，例如活塞流反应器、逆流反应器、或连续逆流收缩床反应器(Duff和Murray,1996,BioresourceTechnology[生物资源技术]855:1-33；Schell等人,2004,Bioresource Technology[生物资源技术]91:179-188；Lee等人,1999,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.[生物化学、工程、生物技术进展]65:93-115)。在一个具体实施例中，在180℃下使用4％w/w硫酸持续5分钟来进行该含纤维素材料的稀酸预处理。
还可以使用碱性条件下的若干种预处理方法。这些碱性预处理包括但不限于：氢氧化钠、石灰、湿氧化、氨渗滤(APR)、以及氨纤维/冷冻***(AFEX)预处理。
用氧化钙或氢氧化钙在85℃-150℃的温度下进行石灰预处理，并且停留时间从1小时到若干天(Wyman等人,2005,Bioresource Technology[生物资源技术]96:1959-1966；Mosier等人,2005,Bioresource Technology[生物资源技术]96:673-686)。WO 2006/110891、WO 2006/110899、WO 2006/110900、和WO 2006/110901披露了使用氨的预处理方法。
湿氧化是一种热预处理，其典型地在添加氧化剂(如过氧化氧或过压氧)的情况下在180℃-200℃下进行5-15分钟(Schmidt和Thomsen,1998,Bioresource Technology[生物资源技术]64:139-151；Palonen等人,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]117:1-17；Varga等人,2004,Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程]88:567-574；Martin等人,2006,J.Chem.Technol.Biotechnol.[化学技术和生物技术杂志]81:1669-1677)。优选地在1％-40％干物质(例如2％-30％干物质或5％-20％干物质)下进行预处理，并且通常通过添加碱(如碳酸钠)提高初始pH。
被称为湿***(湿氧化和蒸汽***的组合)的湿氧化预处理方法的修改方案能够处理高达30％的干物质。在湿***中，在某一停留时间后，在预处理期间引入氧化剂。然后通过闪变至大气压结束预处理(WO 2006/032282)。
氨纤维***(AFEX)涉及在中等温度如90℃-150℃和高压如17巴-20巴下，用液体或气态氨处理该含纤维素材料5-10分钟，其中干物质含量可以高达60％(Gollapalli等人,2002,Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]98:23-35；Chundawat等人,2007,Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程]96:219-231；Alizadeh等人,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]121:1133-1141；Teymouri等人,2005,Bioresource Technology[生物资源技术]96:2014-2018)。在AFEX预处理期间，纤维素和半纤维素保持相对完整。木质素-碳水化合物复合物被切割。
有机溶剂预处理通过使用含水乙醇(40％-60％乙醇)在160℃-200℃下提取30-60分钟而将该含纤维素材料脱木质素(Pan等人,2005,Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程]90:473-481；Pan等人,2006,Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程]94:851-861；Kurabi等人,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]121:219-230)。通常添加硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，大部分半纤维素和木质素被去除。
适合的预处理方法的其他实例由Schell等人,2003,Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]105-108:69-85，和Mosier等人,2005,BioresourceTechnology[生物资源技术]96:673-686，以及美国专利申请2002/0164730进行了描述。
在一个实施例中，化学预处理作为稀酸处理，并且更优选作为连续稀酸处理进行。酸典型地是硫酸，但也可以使用其他酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢、或其混合物。弱酸处理优选地在1-5(例如，1-4或1-2.5)的pH范围内进行。在一方面，酸浓度优选地在从0.01wt.％至10wt.％酸(例如，0.05wt.％至5wt.％酸或0.1wt.％至2wt.％酸)的范围内。使酸与该含纤维素材料相接触，并且保持在优选地140℃-200℃(例如165℃-190℃)范围内的温度下，持续从1至60分钟范围内的时间。
在另一个实施例中，预处理在水性浆料中进行。在优选方面，在预处理过程中该含纤维素材料以优选在10wt.％-80wt.％之间，例如20wt.％-70wt.％或30wt.％-60wt.％，如约40wt.％的量存在。预处理的含纤维素材料可以不洗涤或使用本领域已知的任何方法洗涤，例如，用水洗涤。
在一个实施例中，使该含纤维素材料经受机械或物理预处理。术语“机械预处理”或“物理预处理”是指促进颗粒粒度减小的任何预处理。例如，这种预处理可以涉及多种类型的研磨或碾磨(例如，干磨、湿磨、或振动球磨)。
该含纤维素材料可以物理地(机械地)且化学地预处理。机械或物理预处理可以与蒸汽/蒸汽***、水热解(hydrothermolysis)、稀酸或弱酸处理、高温、高压处理、辐射(例如，微波福射)或其组合相结合。在一方面，高压意指在优选约100至约400psi(例如约150至约250psi)的范围内的压力。在另一方面，高温意指在约100℃至约300℃(例如约140℃至约200℃)的范围内的温度。在一个优选的方面，机械或物理预处理在分批期间使用蒸***水解器系统，例如从瑞典的顺智公司(Sunds Defibrator AB)可获得的顺智水解器(SundsHydrolyzer)来进行，该系统使用如上所定义的高压和高温。根据需要，可以顺序或同时进行物理和化学预处理。
因此，在一个实施例中，使该含纤维素材料经受物理(机械)或化学预处理、或其任何组合，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。
在一个实施例中，使该含纤维素材料经受生物预处理。术语“生物预处理”是指促进纤维素、半纤维素、和/或木质素从该含纤维素材料中分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以涉及应用溶解木质素的微生物和/或酶(参见，例如Hsu,T.-A.,1996,Pretreatment of biomass[生物质的预处理],于Handbook on Bioethanol:Productionand Utilization[生物乙醇手册：生产和利用]中,Wyman,C.E.编辑,[泰勒-弗朗西斯出版集团],华盛顿特区,179-212；Ghosh和Singh,1993,Adv.Appl.Microbiol.[应用微生物学进展]39:295-333；McMillan,J.D.,1994,Pretreating lignocellulosic biomass:a review[预处理木质纤维素生物质：综述],于Enzymatic Conversion of Biomass for FuelsProduction[用于燃料生产的生物质的酶转化]中,Himmel,M.E.,Baker,J.O.和Overend,R.P.编辑,ACS Symposium Series[美国化学学会讨论会系列]566,American ChemicalSociety[美国化学学会],华盛顿特区,第15章；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.和Tsao,G.T.,1999,Ethanol production from renewable resources[由可再生资源生产乙醇],于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology[生物化学工程/生物技术的进展]中,Scheper,T.编辑,Springer-Verlag[施普林格出版公司],柏林,海德堡,德国,65:207-241；Olsson和Hahn-Hagerdal,1996,Enz.Microb.Tech.[酶与微生物技术]18:312-331；以及Vallander和Eriksson,1990,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.[生物化学工程/生物技术的进展]42:63-95)。
含纤维素材料的糖化和发酵
分开的或同时的糖化(即水解)和发酵包括但不限于：分开的水解和发酵(SHF)；同时的糖化和发酵(SSF)；同时的糖化和共发酵(SSCF)；杂合的水解和发酵(HHF)；分开的水解和共发酵(SHCF)；杂合的水解和共发酵(HHCF)。
SHF使用分开的处理步骤，以首先将该含纤维素材料酶促水解为可发酵糖(例如，葡萄糖、纤维二糖、以及戊糖单体)，并且然后将可发酵糖发酵为乙醇。在SSF中，该含纤维素材料的酶水解和糖发酵成乙醇被组合在一个步骤中(Philippidis，G.P.,1996,Cellulosebioconversion technology[纤维素生物转化技术],于Handbook on Bioethanol:Production and Utilization[生物乙醇手册：生产和利用],Wyman,C.E.编辑,[泰勒-弗朗西斯出版集团],华盛顿特区,179-212)。SSCF涉及多种糖的共发酵(Sheehan和Himmel,1999,Biotechnol.Prog.[生物技术进展]15:817-827)。HHF涉及分开的水解步骤并且另外涉及同时的糖化和水解步骤，其可在同一反应器中进行。HHF过程中的步骤可以在不同的温度下进行，即高温酶糖化，随后在发酵生物耐受的更低温度下进行SSF。本文应理解的是，本领域中已知的包含预处理、酶水解(糖化)、发酵、或其组合的任何方法，可以用于实施本文所述的方法。
常规装置可包括补料分批搅拌反应器、分批搅拌反应器、具有超滤作用的连续流搅拌反应器、和/或连续活塞流柱式反应器(de Castilhos Corazza等人,2003,ActaScientiarum.Technology[科学技术学报]25:33-38；Gusakov和Sinitsyn,1985,Enz.Microb.Technol.[酶学与微生物学技术]7:346-352)、研磨反应器(Ryu和Lee,1983,Biotechnol.Bioeng.[生物技术和生物工程]25:53-65)。另外的反应器类型包括：用于水解和/或发酵的流化床、升流式(upflow blanket)反应器、固定化反应器、以及挤出机型反应器。
在糖化步骤(即，水解步骤)中，该含纤维素材料和/或含淀粉材料(例如预处理的)被水解，来分解纤维素、半纤维素和/或淀粉为可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、***糖、甘露糖、半乳糖、和/或可溶性低聚糖。水解由例如纤维素分解酶组合物酶促进行。这些组合物的酶可以同时或顺序添加。
酶水解可以在易于由本领域技术人员确定的条件下，在适合的含水环境中进行。在一方面，水解在适于一种或多种酶的活性的条件，即对于这种或这些酶来说最佳条件下进行。水解能以分批补料或连续的过程进行，其中将该含纤维素材料和/或含淀粉材料逐渐补入，例如，含有酶的水解溶液中。
糖化通常在搅拌釜反应器或发酵罐中，在受控的pH、温度、和混合条件下进行。适合的处理时间、温度以及pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可以持续长达200小时，但是典型地进行优选约12至约120小时，例如约16至约72小时或约24至约48小时。温度优选约25℃至约70℃，例如约30℃至约65℃，约40℃至约60℃，或约50℃至55℃的范围。pH优选约3至约8，例如约3.5至约7，约4至约6，或约pH 4.5至约pH 5.5的范围。干固体含量在约5wt.％至约50wt.％，例如约10wt.％至约40wt.％，或约20wt.％至约30wt.％的范围内。
可以使用纤维素分解酶组合物进行糖化。这样的酶组合物在以下的“纤维素分解酶组合物”部分中进行了描述。这些纤维素分解酶组合物可包含有用于降解该含纤维素材料的任何蛋白质。在一方面，该纤维素分解酶组合物包含或进一步包含选自下组的一种或多种(例如，若干种)蛋白质，该组由以下组成：纤维素酶、AA9(GH61)多肽、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、木质素分解酶、氧化还原酶、果胶酶、蛋白酶、以及膨胀素。
在另一个实施例中，该纤维素酶优选是选自下组的一种或多种(例如，若干种)酶，该组由以下组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。
在另一个实施例中，该半纤维素酶优选是选自下组的一种或多种(例如，若干种)酶，该组由以下组成：乙酰基甘露聚糖酯酶、乙酰基木聚糖酯酶、***聚糖酶、***呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。在另一个实施例中，该氧化还原酶是选自下组的一种或多种(例如，若干种)酶，该组由以下组成：过氧化氢酶、漆酶、以及过氧化物酶。
在本发明的方法中使用的酶或酶组合物可以是以任何适于使用的形式存在的，例如像发酵液配制品或细胞组合物、具有或不具有细胞碎片的细胞裂解物、半纯化或纯化的酶制剂、或作为酶的来源的宿主细胞。该酶组合物可以是干粉或颗粒、无粉尘的颗粒、液体、稳定化液体或稳定化受保护的酶。可以根据已建立的方法例如通过添加稳定剂(如糖、糖醇或其他多元醇)、和/或乳酸或另一种有机酸，对液体酶制剂进行稳定化。
在一个实施例中，纤维素分解酶组合物或半纤维素分解酶组合物对于该含纤维素材料的有效量是约0.5mg至约50mg，例如，约0.5mg至约40mg、约0.5mg至约25mg、约0.75mg至约20mg、约0.75mg至约15mg、约0.5mg至约10mg、或约2.5mg至约10mg/g的该含纤维素材料。
在一个实施例中，以这样一种化合物对纤维素的葡糖基单元的以下摩尔比添加该化合物：约10-6至约10，例如约10-6至约7.5、约10-6至约5、约10-6至约2.5、约10-6至约1、约10-5至约1、约10-5至约10-1、约10-4至约10-1、约10-3至约10-1、或约10-3至约10-2。在另一方面，这样一种化合物的有效量是约0.1μM至约1M，例如约0.5μM至约0.75M、约0.75μM至约0.5M、约1μM至约0.25M、约1μM至约0.1M、约5μM至约50mM、约10μM至约25mM、约50μM至约25mM、约10μM至约10mM、约5μM至约5mM、或约0.1mM至约1mM。
术语“液体(liquor)”意指在如WO 2012/021401中所述的条件下，由处理浆料中的木质纤维素和/或半纤维素材料、或其单糖(例如，木糖、***糖、甘露糖等)所产生的溶液相(水相、有机相或其组合)、及其可溶性内容物。可以通过对木质纤维素或半纤维素材料(或原料)加热和/或加压进行处理，任选地是在催化剂例如酸的存在下、任选地是在有机溶剂的存在下、和任选地与材料的物理破坏相结合，然后将溶液与残余固形物分离，来产生用于加强AA9多肽(GH61多肽)纤维素分解的液体。在由纤维素分解酶制剂对纤维素底物的水解期间，从液体与AA9多肽的组合中可得到纤维素分解增强的程度是由此类条件确定的。可以使用本领域的标准方法，如过滤、沉淀或离心，而将液体与经过处理的材料进行分离。
在一个实施例中，对于纤维素来说的液体的有效量是约10-6至约10g/g的纤维素，例如约10-6至约7.5g、约10-6至约5g、约10-6至约2.5g、约10-6至约1g、约10-5至约1g、约10-5至约10-1g、约10-4至约10-1g、约10-3至约10-1g、或约10-3至约10-2g/g的纤维素。
在发酵步骤中，例如作为预处理和酶水解步骤的结果由该含纤维素材料释放的糖，由发酵生物(如本文所述的酵母)发酵为乙醇。水解(糖化)和发酵可以是分开的或同时的。
在实施本文所述的方法的发酵步骤中可以使用任何适合的经水解的含纤维素材料。这类原料包括但不限于碳水化合物(例如，木质纤维素、木聚糖、纤维素、淀粉等)。该材料通常是基于经济学，即，每当量糖势的成本，以及对酶致转变的难降解性而进行选择。
使用含纤维素材料通过发酵生物生产乙醇是由糖(单糖)的代谢产生的。经水解的含纤维素材料的糖组成和发酵生物利用不同糖的能力对工艺产率具有直接影响。在申请人在本文的披露之前，本领域已知的菌株有效地利用葡萄糖但不(或非常有限地)代谢戊糖(像木糖，其为通常在水解材料中发现的单糖)。
发酵培养基的组成和发酵条件取决于发酵生物，并且可以由本领域技术人员容易地确定。通常，发酵在已知适于产生发酵产物的条件下进行。在一些实施例中，发酵过程在有氧或微需氧条件下(即，氧气浓度小于空气中的氧气浓度)或厌氧条件下进行。在一些实施例中，发酵在厌氧条件下(即，没有可检测的氧气)或小于约5、约2.5或约1mmol/L/h的氧气中进行。在没有氧的情况下，糖酵解中产生的NADH不能通过氧化磷酸化氧化。在厌氧条件下，宿主细胞可利用丙酮酸或其衍生物作为电子和氢受体以产生NAD+。
发酵过程通常在对重组真菌细胞最佳的温度下进行。例如，在一些实施例中，发酵过程在约25℃至约42℃的范围内的温度下进行。通常，该方法在低于约38℃，低于约35℃，低于约33℃，或低于约38℃，但至少约20℃、22℃或25℃的温度下进行。
发酵刺激剂可以用在本文所描述的方法中，以进一步改善发酵，并且特别是改善发酵生物的性能，例如速率增加和产物产率(例如乙醇产率)。“发酵刺激剂”是指用于发酵生物(特别是酵母)生长的刺激剂。用于生长的优选发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸、烟酸、内消旋肌醇、硫胺素、吡哆醇、对氨基苯酸、叶酸、核黄素、以及维生素A、B、C、D和E。例如，参见Alfenore等人,Improving ethanolproduction and viability of Saccharomyces cerevisia by a vitamin feedingstrategy during fed-batch process[通过在进料分批方法期间的维生素进料策略改善乙醇产生和酿酒酵母的存活力],Springer-Verlag[施普林格出版社](2002)，将其通过引用特此并入。矿物质的实例包括可以供应包含P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn、和Cu营养素的矿物质和矿物盐。
纤维素分解酶和组合物
在糖化过程中可以存在和/或添加纤维素分解酶或纤维素分解酶组合物。纤维素分解酶组合物是包含水解含纤维素材料的一种或多种(例如，若干种)酶的酶制剂。此类酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、和/或其组合。
在一些实施例中，该发酵生物包含编码可水解含纤维素材料的酶(例如，内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶或其组合)的一种或多种(例如，若干种)异源多核苷酸。考虑本文描述或参照的任何酶(可水解含纤维素材料)用于在发酵生物中表达。
该纤维素分解酶可以是适合宿主细胞和/或本文所述的方法的任何纤维素分解酶(例如，内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶)，如天然存在的纤维素分解酶或其保留纤维素分解酶活性的变体。
在一些实施例中，当在相同条件下培养时，与不具有编码纤维素分解酶的异源多核苷酸的宿主细胞相比，包含编码该纤维素分解酶的异源多核苷酸的发酵生物具有增加的纤维素分解酶(例如，增加的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、和/或β-葡糖苷酶)活性水平。在一些实施例中，当在相同条件下培养时，与不具有编码纤维素分解酶的异源多核苷酸的发酵生物相比，该发酵生物具有增加至少5％，例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％或至少500％的纤维素分解酶活性水平。
可以与本文所述的宿主细胞和/或方法一起使用的示例性纤维素分解酶包括细菌、酵母或丝状真菌纤维素分解酶，例如，获得自本文描述或参照的任何微生物，如上文在与蛋白酶有关的部分下描述的。
该纤维素分解酶可以是任何来源的。在一个实施例中，该纤维素分解酶衍生自木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株；腐质霉属的菌株，如特异腐质霉的菌株，和/或金孢子菌属的菌株，如卢克诺文思金孢子菌的菌株。在一个优选的实施例中，该纤维素分解酶衍生自里氏木霉的菌株。
该纤维素分解酶组合物可进一步包含以下多肽(如酶)中的一种或多种：具有纤维素分解增强活性的AA9多肽(GH61多肽)、β-葡糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶、CBH I、CBHII、或其两种、三种、四种、五种、或六种的混合物。
另外的一种或多种多肽(例如，AA9多肽)和/或一种或多种酶(例如，β-葡糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶、CBH I和/或CBH II)对于该纤维素分解酶组合物生产生物(例如，里氏木霉)可以是外源的。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的AA9多肽和β-葡糖苷酶。
在另一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的AA9多肽、β-葡糖苷酶、以及CBH I。
在另一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的AA9多肽、β-葡糖苷酶、CBH I以及CBH II。
其他酶(如内切葡聚糖酶)，还可以包含在该纤维素分解酶组合物中。
如以上提到的，该纤维素分解酶组合物可以包含多种不同的多肽，包括酶。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包含具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌AA9(GH61A)多肽(例如，WO 2005/074656)，以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(例如，披露于WO2008/057637中的一种，特别是如SEQ ID NO:59和60中所示)。
在另一个实施例中，该纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包含具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌AA9(GH61A)多肽(例如，WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2)，以及烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO2005/047499的SEQ ID NO:2)。
在另一个实施例中，该纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包含具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌(Penicillium emersonii)AA9(GH61A)多肽，特别是披露于WO 2011/041397中的一种，以及烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO 2005/047499的SEQ ID NO:2)。
在另一个实施例中，该纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包含具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌AA9(GH61A)多肽，特别是披露于WO 2011/041397中的一种，以及烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO2005/047499的SEQ ID NO:2)，或披露于WO 2012/044915(通过引用特此并入)的变体，特别是包含一个或多个(例如所有)的以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包含具有纤维素分解增强活性的AA9(GH61A)多肽，特别是衍生自埃默森青霉菌菌株的一种(例如，WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2)，烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2)变体，该变体具有一个或多个(特别是所有)的以下取代：F100D、S283G、N456E、F512Y且披露于WO 2012/044915中；烟曲霉Cel7A CBH1，例如在WO2011/057140中披露为SEQ ID NO:6的一种和烟曲霉CBH II，例如在WO 2011/057140中披露为SEQ ID NO:18的一种。
在一个优选的实施例中，该纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包含半纤维素酶或半纤维素分解酶组合物，如烟曲霉木聚糖酶和烟曲霉β-木糖苷酶。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物还包含木聚糖酶(例如，衍生自曲霉属的菌株，特别是棘孢曲霉或烟曲霉；或篮状菌属的菌株，特别是雷塞氏篮状菌)和/或β-木糖苷酶(例如，衍生自曲霉属，特别是烟曲霉，或篮状菌属的菌株，特别是埃默森篮状菌)。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包含具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌AA9(GH61A)多肽(例如，WO 2005/074656)，米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(例如，披露于WO 2008/057637中的一种，特别是如SEQ ID NO:59和60),以及棘孢曲霉木聚糖酶(例如，在WO 94/21785中的Xyl II)。
在另一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包含里氏木霉纤维素分解制剂，该里氏木霉纤维素分解制剂进一步包含具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(例如，WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2)、烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO 2005/047499的SEQ ID NO:2)、以及棘孢曲霉木聚糖酶(披露于WO 94/21785中的Xyl II)。
在另一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包含里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包含具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌AA9(GH61A)多肽(例如，WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2)、烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO2005/047499的SEQ ID NO:2)、以及棘孢曲霉木聚糖酶(例如，披露于WO 94/21785中的XylII)。
在另一个实施例中，该纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包含具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌AA9(GH61A)多肽(特别是披露于WO 2011/041397中的一种)、烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO2005/047499的SEQ ID NO:2)、以及烟曲霉木聚糖酶(例如，WO 2006/078256中的Xyl III)。
在另一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包含里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包含具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌AA9(GH61A)多肽，特别是披露于WO 2011/041397中的一种、烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO 2005/047499的SEQ ID NO:2)、烟曲霉木聚糖酶(例如，WO 2006/078256中的Xyl III)、以及来自烟曲霉的CBH I，特别是在WO 2011/057140中披露为SEQ ID NO:2的Cel7A CBH1。
在另一个实施例中，该纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包含具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌AA9(GH61A)多肽，特别是披露于WO 2011/041397中的一种、烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO 2005/047499的SEQ ID NO:2)、烟曲霉木聚糖酶(例如，WO 2006/078256中的Xyl III)、来自烟曲霉的CBH I，特别是在WO 2011/057140中披露为SEQ ID NO:2的Cel7A CBH1，以及衍生自烟曲霉的CBH II，特别是在WO 2013/028928中披露为SEQ ID NO:4的一种。
在另一个实施例中，该纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包含具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌AA9(GH61A)多肽(特别是披露于WO 2011/041397中的一种)、烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO2005/047499的SEQ ID NO:2)或其变体，该变体具有一个或多个(特别是所有)的以下取代：F100D、S283G、N456E、F512Y；烟曲霉木聚糖酶(例如，WO 2006/078256中的Xyl III)、来自烟曲霉的CBH I(特别是在WO 2011/057140中披露为SEQ ID NO:2的Cel7A CBH I)，以及衍生自烟曲霉的CBH II(特别是在WO 2013/028928中披露的一种)。
在另一个实施例中，该纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物包含CBH I(GENSEQP登录号AZY49536(WO 2012/103293)；CBHII(GENSEQP登录号AZY49446(WO 2012/103288)；β-葡糖苷酶变体(GENSEQP登录号AZU67153(WO 2012/44915))，特别是具有一个或多个(特别是所有)的以下取代：F100D、S283G、N456E、F512Y；以及AA9(GH61多肽)(GENSEQP登录号BAL61510(WO 2013/028912))。
在另一个实施例中，该纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物包含CBH I(GENSEQP登录号AZY49536(WO 2012/103293))；CBH II(GENSEQP登录号AZY49446(WO 2012/103288)；GH10木聚糖酶(GENSEQP登录号BAK46118(WO 2013/019827))；以及β-木糖苷酶(GENSEQP登录号AZI04896(WO 2011/057140))。
在另一个实施例中，该纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物包含CBH I(GENSEQP登录号AZY49536(WO 2012/103293))；CBH II(GENSEQP登录号AZY49446(WO 2012/103288))；以及AA9(GH61多肽；GENSEQP登录号BAL61510(WO 2013/028912))。
在另一个实施例中，该纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物包含CBH I(GENSEQP登录号AZY49536(WO 2012/103293))；CBH II(GENSEQP登录号AZY49446(WO 2012/103288))，AA9(GH61多肽；GENSEQP登录号BAL61510(WO 2013/028912))，以及过氧化氢酶(GENSEQP登录号BAC11005(WO 2012/130120))。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物包含CBH I(GENSEQP登录号AZY49446(WO 2012/103288)；CBHII(GENSEQP登录号AZY49446(WO 2012/103288))，β-葡糖苷酶变体(GENSEQP登录号AZU67153(WO 2012/44915))，具有一个或多个(特别是所有)的以下取代：F100D、S283G、N456E、F512Y；AA9(GH61多肽；GENSEQP登录号BAL61510(WO 2013/028912))，GH10木聚糖酶(GENSEQP登录号BAK46118(WO 2013/019827))，以及β-木糖苷酶(GENSEQP登录号AZI04896(WO 2011/057140))。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物是里氏木霉纤维素分解酶制剂，该里氏木霉纤维素分解酶制剂包含EG I(Swissprot登录号P07981)、EG II(EMBL登录号M19373)、CBHI(见上文)；CBH II(见上文)；具有以下取代的β-葡糖苷酶变体(见上文)：F100D、S283G、N456E、F512Y；AA9(GH61多肽；见上文)，GH10木聚糖酶(见上文)；以及β-木糖苷酶(见上文)。
也考虑披露于WO 2013/028928中的所有的纤维素分解酶组合物并且通过引用特此并入。
该纤维素分解酶组合物包含或可以进一步包含选自下组的一种或多种(若干种)蛋白质，该组由以下组成：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的AA9(即GH61)多肽、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀素。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物是商业纤维素分解酶组合物。适合用于本发明的方法的商业纤维素分解酶组合物的实例包括：
另外的酶及其组合物可在WO 2011/153516和WO 2016/045569(将其内容并入本文)中找到。
编码适合的纤维素分解酶的另外的多核苷酸可以获得自任何属的微生物，包括在UniProtKB数据库(www.uniprot.org)内可容易获得的那些。
纤维素分解酶编码序列也可用于设计核酸探针以鉴定和克隆编码来自不同属或种的菌株的纤维素分解酶的DNA，如上文所述的。
还可以从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得编码纤维素分解酶的多核苷酸，如上文所述的。
用于分离或克隆编码纤维素分解酶的多核苷酸的技术在上文中描述。
在一个实施例中，该纤维素分解酶具有与本文描述或参照的任何纤维素分解酶(例如，任何内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、或β-葡糖苷酶)至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的成熟多肽序列。在一方面，该纤维素分解酶具有如下成熟多肽序列，该序列与本文描述或参照的任何纤维素分解酶相差不超过十个氨基酸，例如相差不超过五个氨基酸、相差不超过四个氨基酸、相差不超过三个氨基酸、相差不超过两个氨基酸、或相差一个氨基酸。在一个实施例中，该纤维素分解酶具有如下成熟多肽序列，该序列包含以下或由其组成：本文描述或参照的任何纤维素分解酶的氨基酸序列、等位基因变体、或其具有纤维素分解酶活性的片段。在一个实施例中，该纤维素分解酶具有一个或多个(例如，两个、若干个)氨基酸的氨基酸取代、缺失和/或***。在一些实施例中，氨基酸取代、缺失和/或***的总数不超过10，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2或1。
在一些实施例中，该纤维素分解酶在相同条件下具有本文描述或参照的任何纤维素分解酶(例如，任何内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、或β-葡糖苷酶)的纤维素分解酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
在一个实施例中，该纤维素分解酶编码序列在至少低严格条件下，例如中严格条件下、中-高严格条件下、高严格条件下、或非常高严格条件下与来自本文描述或参照的任何纤维素分解酶(例如，任何内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、或β-葡糖苷酶)的编码序列的全长互补链杂交。在一个实施例中，该纤维素分解酶编码序列与本文描述或参照的任何纤维素分解酶的编码序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
在一个实施例中，编码该纤维素分解酶的多核苷酸包含文描述或参照的任何纤维素分解酶(例如，任何内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、或β-葡糖苷酶)的编码序列。在一个实施例中，编码该纤维素分解酶的多核苷酸包含来自本文描述或参照的任何纤维素分解酶的编码序列的子序列，其中该子序列编码具有纤维素分解酶活性的多肽。在一个实施例中，子序列中的核苷酸残基的数目是参照编码序列的数目的至少75％，例如至少80％、85％、90％或95％。
该纤维素分解酶还可以包括融合多肽或可切割的融合多肽，如上文所述的。
木糖代谢
在一方面，该发酵生物(例如，酵母细胞)进一步包含编码木糖异构酶(XI)的异源多核苷酸。该木糖异构酶可以是适合宿主细胞和本文所述的方法的任何木糖异构酶，如天然存在的木糖异构酶或其保留木糖异构酶活性的变体。在一个实施例中，该木糖异构酶存在于宿主细胞的胞液中。
在一些实施例中，当在相同条件下培养时，与不具有编码木糖异构酶的异源多核苷酸的宿主细胞相比，包含编码该木糖异构酶的异源多核苷酸的发酵生物具有增加的木糖异构酶活性水平。在一些实施例中，当在相同条件下培养时，与不具有编码木糖异构酶的异源多核苷酸的宿主细胞相比，发酵生物具有增加至少5％，例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％或至少500％的木糖异构酶活性水平。
可以与本文所述的重组宿主细胞和使用方法一起使用的示例性木糖异构酶包括但不限于，来自真菌瘤胃壶菌属菌种(WO 2003/062430)或其他来源(Madhavan等人,2009,Appl Microbiol Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]82(6),1067-1078)的XI，已在酿酒酵母宿主细胞中表达。适用于酵母中表达的另外的其他XI已在US2012/0184020(来自黄化瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)的XI)、WO 2011/078262(来自黄胸散白蚁(Reticulitermes speratus)和达尔文澳白蚁(Mastotermes darwiniensis)的若干种XI)、以及WO 2012/009272(含有来自软弱贫养菌(Abiotrophia defectiva)的XI的构建体和真菌细胞)中描述。US 8,586,336描述了表达通过牛瘤胃液获得的XI(在本文显示为SEQ IDNO:74)的酿酒酵母宿主细胞。
编码适合的木糖异构酶的另外的多核苷酸可以获得自任何属的微生物，包括在UniProtKB数据库(www.uniprot.org)内可容易获得的那些。在一个实施例中，该木糖异构酶是细菌、酵母或丝状真菌木糖异构酶，例如，获得自本文描述或参照的任何微生物，如上文所述的。
木糖异构酶编码序列也可用于设计核酸探针以鉴定和克隆编码来自不同属或种的菌株的木糖异构酶的DNA，如上文所述的。
还可以从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得编码木糖异构酶的多核苷酸，如上文所述的。
用于分离或克隆编码木糖异构酶的多核苷酸的技术在上文中描述。
在一个实施例中，该木糖异构酶具有与本文描述或参照的任何木糖异构酶(例如，SEQ ID NO:74的木糖异构酶)具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的成熟多肽序列。在一方面，该木糖异构酶具有如下成熟多肽序列，该序列与本文描述或参照的任何木糖异构酶(例如，SEQ ID NO:74的木糖异构酶)相差不超过十个氨基酸，例如相差不超过五个氨基酸、相差不超过四个氨基酸、相差不超过三个氨基酸、相差不超过两个氨基酸、或相差一个氨基酸。在一个实施例中，该木糖异构酶具有如下成熟多肽序列，该序列包含以下或由其组成：本文描述或参照的任何木糖异构酶(例如，SEQ ID NO:74的木糖异构酶)的氨基酸序列、等位基因变体、或其具有木糖异构酶活性的片段。在一个实施例中，该木糖异构酶具有一个或多个(例如，两个、若干个)氨基酸的氨基酸取代、缺失和/或***。在一些实施例中，氨基酸取代、缺失和/或***的总数不超过10，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2或1。
在一些实施例中，该木糖异构酶在相同条件下具有本文描述或参照的任何木糖异构酶(例如，SEQ ID NO:74的木糖异构酶)的木糖异构酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
在一个实施例中，该木糖异构酶编码序列在至少低严格条件下，例如中严格条件下、中-高严格条件下、高严格条件下、或非常高严格条件下与来自本文描述或参照的任何木糖异构酶(例如，SEQ ID NO:74的木糖异构酶)的编码序列的全长互补链杂交。在一个实施例中，该木糖异构酶编码序列与来自本文描述或参照的任何木糖异构酶(例如，SEQ IDNO:74的木糖异构酶)的编码序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
在一个实施例中，编码该木糖异构酶的异源多核苷酸包含本文描述或参照的任何木糖异构酶(例如，SEQ ID NO:74的木糖异构酶)的编码序列。在一个实施例中，编码该木糖异构酶的异源多核苷酸包含来自本文描述或参照的任何木糖异构酶的编码序列的子序列，其中该子序列编码具有木糖异构酶活性的多肽。在一个实施例中，子序列中的核苷酸残基的数目是参照编码序列的数目的至少75％，例如至少80％、85％、90％或95％。
这些木糖异构酶还可以包括融合多肽或可切割的融合多肽，如上文所述的。
在一方面，该发酵生物(例如，酵母细胞)进一步包含编码木酮糖激酶(XK)的异源多核苷酸。如本文所用的，木酮糖激酶提供了将D-木酮糖转化为木酮糖5-磷酸的酶活性。该木酮糖激酶可以是适合宿主细胞和本文所述的方法的任何木酮糖激酶，如天然存在的木酮糖激酶或其保留木酮糖激酶活性的变体。在一个实施例中，该木酮糖激酶存在于宿主细胞的胞液中。
在一些实施例中，当在相同条件下培养时，与不具有编码木酮糖激酶的异源多核苷酸的宿主细胞相比，包含编码该木酮糖激酶的异源多核苷酸的发酵生物具有增加的木酮糖激酶活性水平。在一些实施例中，当在相同条件下培养时，与不具有编码木酮糖激酶的异源多核苷酸的宿主细胞相比，宿主细胞具有增加至少5％，例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％或至少500％的木糖异构酶活性水平。
可以与本文所述的发酵生物和使用方法一起使用的示例性木酮糖激酶包括但不限于，SEQ ID NO:75的酿酒酵母木酮糖激酶。编码适合的木酮糖激酶的另外的多核苷酸可以获得自任何属的微生物，包括在UniProtKB数据库(www.uniprot.org)内可容易获得的那些。在一个实施例中，该木酮糖激酶是细菌、酵母或丝状真菌木酮糖激酶，例如，获得自本文描述或参照的任何微生物，如上文所述的。
木酮糖激酶编码序列也可用于设计核酸探针以鉴定和克隆编码来自不同属或种的菌株的木酮糖激酶的DNA，如上文所述的。
还可以从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得编码木酮糖激酶的多核苷酸，如上文所述的。
用于分离或克隆编码木酮糖激酶的多核苷酸的技术在上文中描述。
在一个实施例中，该木酮糖激酶具有与本文描述或参照的任何木酮糖激酶(例如，SEQ ID NO:75的酿酒酵母木酮糖激酶)至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的成熟多肽序列。在一个实施例中，该木酮糖激酶具有如下成熟多肽序列，该序列与本文描述或参照的任何木酮糖激酶(例如，SEQID NO:75的酿酒酵母木酮糖激酶)相差不超过十个氨基酸，例如相差不超过五个氨基酸、相差不超过四个氨基酸相差不超过三个氨基酸相差不超过两个氨基酸、或相差一个氨基酸。在一个实施例中，该木酮糖激酶具有如下成熟多肽序列，该序列包含以下或由其组成：本文描述或参照的任何木酮糖激酶(例如，SEQ ID NO:75的酿酒酵母木酮糖激酶)的氨基酸序列、等位基因变体、或其具有木酮糖激酶活性的片段。在一个实施例中，该木酮糖激酶具有一个或多个(例如，两个、若干个)氨基酸的氨基酸取代、缺失和/或***。在一些实施例中，氨基酸取代、缺失和/或***的总数不超过10，例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2或1。
在一些实施例中，该木酮糖激酶在相同条件下具有本文描述或参照的任何木酮糖激酶(例如，SEQ ID NO:75的酿酒酵母木酮糖激酶)的木酮糖激酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
在一个实施例中，该木酮糖激酶编码序列在至少低严格条件下，例如中严格条件下、中-高严格条件下、高严格条件下、或非常高严格条件下与来自本文描述或参照的任何木酮糖激酶(例如，SEQ ID NO:75的酿酒酵母木酮糖激酶)的编码序列的全长互补链杂交。在一个实施例中，该木酮糖激酶编码序列与来自本文描述或参照的任何木酮糖激酶(例如，SEQ ID NO:75的酿酒酵母木酮糖激酶)的编码序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
在一个实施例中，编码该木酮糖激酶的异源多核苷酸包含本文描述或参照的任何木酮糖激酶(例如，SEQ ID NO:75的酿酒酵母木酮糖激酶)的编码序列。在一个实施例中，编码该木酮糖激酶的异源多核苷酸包含来自本文描述或参照的任何木酮糖激酶的编码序列的子序列，其中该子序列编码具有木酮糖激酶活性的多肽。在一个实施例中，子序列中的核苷酸残基的数目是参照编码序列的数目的至少75％，例如至少80％、85％、90％或95％。
这些木酮糖激酶还可以包括融合多肽或可切割的融合多肽，如上文所述的。
在一方面，该发酵生物(例如，酵母细胞)进一步包含编码核酮糖5磷酸3-差向异构酶(RPE1)的异源多核苷酸。如本文所用的，核酮糖5磷酸3-差向异构酶提供了将L-核酮糖5-磷酸转化为L-木酮糖5-磷酸的酶活性(EC 5.1.3.22)。该RPE1可以是适合宿主细胞和本文所述的方法的任何RPE1，如天然存在的RPE1或其保留RPE1活性的变体。在一个实施例中，该RPE1存在于宿主细胞的胞液中。
在一个实施例中，该重组细胞包含编码核酮糖5磷酸3-差向异构酶(RPE1)的异源多核苷酸，其中该RPE1是酿酒酵母RPE1，或者是与酿酒酵母RPE1具有至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的RPE1。
在一方面，该发酵生物(例如，酵母细胞)进一步包含编码核酮糖5磷酸异构酶(RKI1)的异源多核苷酸。如本文所用的，核酮糖5磷酸异构酶提供了将核糖-5-磷酸转化为核酮糖-5-磷酸的酶活性。该RKI1可以是适合宿主细胞和本文所述的方法的任何RKI1，如天然存在的RKI1或其保留RKI1活性的变体。在一个实施例中，该RKI1存在于宿主细胞的胞液中。
在一个实施例中，该发酵生物包含编码核酮糖5磷酸异构酶(RKI1)的异源多核苷酸，其中该RKI1是酿酒酵母RKI1，或者是具有与酿酒酵母RKI1至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的成熟多肽序列的RKI1。
在一方面，该发酵生物(例如，酵母细胞)进一步包含编码转酮酶(TKL1)的异源多核苷酸。该TKL1可以是适合宿主细胞和本文所述的方法的任何TKL1，如天然存在的TKL1或其保留TKL1活性的变体。在一个实施例中，该TKL1存在于宿主细胞的胞液中。
在一个实施例中，该发酵生物包含编码转酮酶(TKL1)的异源多核苷酸，其中该TKL1是酿酒酵母TKL1，或者是具有与酿酒酵母TKL1至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的成熟多肽序列的TKL1。
在一方面，该发酵生物(例如，酵母细胞)进一步包含编码转醛酶(TAL1)的异源多核苷酸。该TAL1可以是适合宿主细胞和本文所述的方法的任何TAL1，如天然存在的TAL1或其保留TAL1活性的变体。在一个实施例中，该TAL1存在于宿主细胞的胞液中。
在一个实施例中，该发酵生物包含编码转醛酶(TAL1)的异源多核苷酸，其中该TAL1是酿酒酵母TAL1，或者是具有与酿酒酵母TAL1至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的成熟多肽序列的TAL1。
发酵产物
发酵产物可以是由发酵得到的任何物质。该发酵产物可以是，不限于：醇(例如，***糖醇、正丁醇、异丁醇、乙醇、甘油、甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇[丙二醇]、丁二醇、丙三醇、山梨醇和木糖醇)；烷烃(例如，戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、以及十二烷)、环烷烃(例如，环戊烷、环己烷、环庚烷、以及环辛烷)、烯烃(例如，戊烯、己烯、庚烯、以及辛烯)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、以及苏氨酸)；气体(例如，甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)、以及一氧化碳(CO))；异戊二烯；酮(例如，丙酮)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；和聚酮化合物。
在一方面，该发酵产物是醇。术语“醇”涵盖含有一个或多个羟基部分的物质。该醇可以是但不限于：正丁醇、异丁醇、乙醇、甲醇、***糖醇、丁二醇、乙二醇、甘油、丙三醇、1,3-丙二醇、山梨醇、木糖醇。参见，例如Gong等人,1999,Ethanol production fromrenewable resources[由可再生资源生产乙醇]，于Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology[生化工程/生物技术进展]中,Scheper,T.编辑,Springer-Verlag[施普林格出版社],柏林,海德堡,德国,65:207-241；Silveira和Jonas,2002,Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]59:400-408；Nigam和Singh,1995,Process Biochemistry[加工生物化学]30(2):117-124；Ezeji等人,2003,WorldJournal of Microbiology and Biotechnology[微生物学和生物技术世界杂志]19(6):595-603。在一个实施例中，该发酵产物是乙醇。
在另一方面，该发酵产物是烷烃。该烷烃可以是非支链或支链烷烃。该烷烃可以是但不限于：戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、或十二烷。
在另一方面，该发酵产物是环烷烃。该环烷烃可以是但不限于：环戊烷、环己烷、环庚烷或环辛烷。
在另一方面，该发酵产物是烯烃。该烯烃可以是非支链或支链烯烃。该烯烃可以是但不限于：戊烯、己烯、庚烯或辛烯。
在另一方面，该发酵产物是氨基酸。该有机酸可以是但不限于：天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、或苏氨酸。参见，例如Richard和Margaritis,2004,Biotechnologyand Bioengineering[生物技术和生物工程]87(4):501-515。
在另一方面，该发酵产物是气体。该气体可以是但不限于：甲烷、H2、CO2、或CO。参见，例如Kataoka等人,1997,Water Science and Technology[水科学与技术]36(6-7):41-47；以及Gunaseelan,1997,Biomass and Bioenergy[生物质与生物能源]13(1-2):83-114。
在另一方面，该发酵产物是异戊二烯。
在另一方面，该发酵产物是酮。术语“酮”涵盖含有一个或多个酮部分的物质。该酮可以是但不限于：丙酮。
在另一方面，该发酵产物是有机酸。该有机酸可以是但不限于：乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸、或木糖酸。参见，例如Chen和Lee,1997,Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]63-65:435-448。
在另一方面，该发酵产物是聚酮化合物。
回收
可以使用本领域已知的任何方法，任选地从发酵培养基中回收发酵产物(例如，乙醇)，该方法包括但不限于：层析法、电泳程序、差别溶解度、蒸馏或萃取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的纤维素材料中分离和纯化醇。可以获得纯度高达约96vol.％的乙醇，其能用作例如燃料乙醇、饮用乙醇(即，可饮用的中性含酒精饮料)，或工业乙醇。
在这些方法的一些方面，回收后的发酵产物是基本上纯的。关于本文的这些方法，“基本上纯的”意指回收的制剂包含不超过15％的杂质，其中杂质意指除发酵产物(例如，乙醇)以外的化合物。在一种变体中，提供了基本上纯的制剂，其中该制剂包含不超过25％的杂质、或不超过20％的杂质、或不超过10％的杂质、或不超过5％的杂质、或不超过3％的杂质、或不超过1％的杂质、或不超过0.5％的杂质。
可以使用本领域已知的方法实施适合的测定来测试乙醇和污染物的产生以及糖消耗。例如，可以通过方法(如HPLC(高效液相层析法)、GC-MS(气相层析-质谱法)和LC-MS(液相层析-质谱法))或使用本领域熟知的常规程序的其他适合的分析方法对乙醇产物以及其他有机化合物进行分析。还可以用培养上清液测试发酵液中的乙醇的释放。可以使用例如针对葡萄糖和醇类的折光率检测器、以及针对有机酸的UV检测器通过HPLC(Lin等人,Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程]90:775-779(2005))、或使用本领域熟知的其他适合的测定和检测方法量化在发酵培养基中的副产物和残余的糖(例如，葡萄糖或木糖)。
可在以下编号的段落中进一步描述本发明：
段落[1].一种从含淀粉材料或含纤维素材料生产发酵产物的方法，所述方法包括：
(a)糖化所述含淀粉材料或含纤维素材料；和
(b)用发酵生物发酵步骤(a)的经糖化的材料；
其中所述发酵生物包含编码蛋白酶的异源多核苷酸。
段落[2].一种从含淀粉材料生产发酵产物的方法，所述方法包括：(a)用α-淀粉酶液化所述含淀粉材料；(b)糖化来自步骤(a)的液化醪；和(c)用发酵生物发酵步骤(b)的经糖化的材料；其中步骤(a)的液化和/或步骤(b)的糖化在外源添加的蛋白酶存在下进行；并且其中所述发酵生物包含编码蛋白酶的异源多核苷酸。
段落[3].如段落[1]或[2]中任一段所述的方法，其中在同时糖化和发酵(SSF)中同时进行发酵和糖化。
段落[4].如段落[1]或[2]中任一段所述的方法，其中顺序进行发酵和糖化(SHF)。
段落[5].如段落[1]-[4]中任一段所述的方法，所述方法包括从所述发酵中回收所述发酵产物。
段落[6].如段落[5]所述的方法，其中从所述发酵中回收所述发酵产物包括蒸馏。
段落[7].如段落[1]-[6]中任一段所述的方法，其中所述发酵产物是乙醇。
段落[8].如段落[1]-[7]中任一段所述的方法，其中发酵在减氮条件下进行(例如，少于1000ppm补充尿素或氢氧化铵，如少于750ppm、少于500ppm、少于400ppm、少于300ppm、少于250ppm、少于200ppm、少于150ppm、少于100ppm、少于75ppm、少于50ppm、少于25ppm、或少于10ppm补充氮)。
段落[9].如段落[1]-[8]中任一段所述的方法，其中所述蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。
段落[10].如段落[1]-[9]中任一段所述的方法，其中所述蛋白酶是属于家族53的丝氨酸蛋白酶。
段落[11].如段落[10]所述的方法，其中所述S53蛋白酶衍生自以下属的菌株：亚灰树花菌属、栓菌属、叉丝孔菌属、多孔菌属、革褶菌属、灵芝属、香菇属或芽孢杆菌属，更具体地大型亚灰树花菌、变色栓菌、污叉丝孔菌、漏斗多孔菌、桦革褶菌、灵芝、洁丽香菇、或芽孢杆菌属物种19138。
段落[12].如段落[1]-[11]中任一段所述的方法，其中所述异源多核苷酸编码蛋白酶，所述蛋白酶具有与SEQ ID NO:9-73中任一个(例如SEQ ID NO:9、14、16、21、22、33、41、45、61、62、66、67和69中任一个；如SEQ NO:9、14、16和69中任一个)的氨基酸序列至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的成熟多肽序列。
段落[13].如段落[1]-[12]中任一段所述的方法，其中所述异源多核苷酸编码蛋白酶，所述蛋白酶具有与SEQ ID NO:9-73中任一个(例如SEQ ID NO:9、14、16、21、22、33、41、45、61、62、66、67和69中任一个；如SEQ NO:9、14、16和69中任一个)的氨基酸序列相差不超过十个氨基酸，例如相差不超过五个氨基酸、相差不超过四个氨基酸、相差不超过三个氨基酸、相差不超过两个氨基酸、或相差一个氨基酸的成熟多肽序列。
段落[14].如段落[1]-[13]中任一段所述的方法，其中所述异源多核苷酸编码蛋白酶，所述蛋白酶具有包含SEQ ID NO:9-73中任一个(例如SEQ ID NO:9、14、16、21、22、33、41、45、61、62、66、67和69中任一个；如SEQ NO:9、14、16和69中任一个)的氨基酸序列或由其组成的成熟多肽序列。
段落[15].如段落[1]-[14]中任一段所述的方法，其中糖化步骤发生在含淀粉材料上，并且其中所述含淀粉材料是糊化的或未糊化的淀粉。
段落[16].如段落[1]-[15]中任一段所述的方法，其中所述发酵生物包含编码葡糖淀粉酶的异源多核苷酸。
段落[17].如段落[16]所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶是密孔菌葡糖淀粉酶(例如，本文所述的血红密孔菌葡糖淀粉酶)、粘褶菌葡糖淀粉酶(例如，本文所述的篱边粘褶菌或密粘褶菌葡糖淀粉酶)、或者酵母菌葡糖淀粉酶(例如，本文所述的扣囊复膜酵母菌葡糖淀粉酶，如SEQ ID NO:102或103)。
段落[18].如段落[1]-[17]中任一段所述的方法，其中所述方法包括在糖化之前，通过使所述含淀粉材料与α-淀粉酶接触来液化所述材料。
段落[19].如段落[1]-[18]中任一段所述的方法，其中所述发酵生物包含编码α-淀粉酶的异源多核苷酸。
段落[20].如段落[19]所述的方法，其中所述α-淀粉酶是芽孢杆菌α-淀粉酶(例如，本文所述的嗜热脂肪芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、或地衣芽孢杆菌α-淀粉酶)，或者德巴利酵母α-淀粉酶(例如，本文所述的西方德巴利酵母α-淀粉酶)。
段落[21].如段落[1]-[20]中任一段所述的方法，其中糖化步骤发生在含纤维素材料上，并且其中所述含纤维素材料进行了预处理。
段落[22].如段落[21]所述的方法，其中所述预处理是稀酸预处理。
段落[23].如段落[1]-[20]中任一段所述的方法，其中糖化发生在含纤维素材料上，并且其中所述酶组合物包含一种或多种选自以下的酶：纤维素酶、AA9多肽、半纤维素酶、CIP、酯酶、棒曲霉素、木质素分解酶、氧化还原酶、果胶酶、蛋白酶、以及膨胀素。
段落[24].如段落[23]所述的方法，其中所述纤维素酶是选自以下的一种或多种酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。
段落[25].如段落[23]或[24]中任一段所述的方法，其中所述半纤维素酶是选自以下的一种或多种酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、***呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。
段落[26].如段落[1]-[25]中任一段所述的方法，其中所述发酵生物是酵母属、红酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、红冬孢酵母属、假丝酵母属、耶氏酵母属、油脂酵母属、隐球菌属或德克拉酵母属菌种细胞。
段落[27].如段落[26]所述的方法，其中所述发酵生物是酿酒酵母细胞。
段落[28].一种重组酵母细胞，所述重组酵母细胞包含编码蛋白酶的异源多核苷酸。
段落[29].如段落[28]所述的重组酵母，其中所述细胞是酵母属、红酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、红冬孢酵母属、假丝酵母属、耶氏酵母属、油脂酵母属、隐球菌属或德克拉酵母属菌种细胞。
段落[30].如段落[29]所述的重组酵母，其中所述细胞是酿酒酵母细胞。
段落[31].如段落[28]-[30]中任一段所述的重组酵母，其中所述蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。
段落[32].如段落[31]所述的重组酵母，其中所述蛋白酶是属于家族53的丝氨酸蛋白酶。
段落[33].如段落[32]所述的重组酵母，其中所述S53蛋白酶衍生自以下属的菌株：亚灰树花菌属、栓菌属、叉丝孔菌属、多孔菌属、革褶菌属、灵芝属、香菇属或芽孢杆菌属，更具体地大型亚灰树花菌、变色栓菌、污叉丝孔菌、漏斗多孔菌、桦革褶菌、灵芝、洁丽香菇、或芽孢杆菌属物种19138。
段落[34].如段落[28]-[33]中任一段所述的重组酵母，其中所述异源多核苷酸编码蛋白酶，所述蛋白酶具有与SEQ ID NO:9-73中任一个(例如SEQ ID NO:9、14、16、21、22、33、41、45、61、62、66、67和69中任一个；如SEQ NO:9、14、16和69中任一个)的氨基酸序列至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的成熟多肽序列。
段落[35].如段落[28]-[34]中任一段所述的重组酵母，其中所述异源多核苷酸编码蛋白酶，所述蛋白酶具有与SEQ ID NO:9-73中任一个(例如SEQ ID NO:9、14、16、21、22、33、41、45、61、62、66、67和69中任一个；如SEQ NO:9、14、16和69中任一个)的氨基酸序列相差不超过十个氨基酸，例如相差不超过五个氨基酸、相差不超过四个氨基酸、相差不超过三个氨基酸、相差不超过两个氨基酸、或相差一个氨基酸的成熟多肽序列。
段落[36].如段落[28]-[35]中任一段所述的重组酵母，其中所述异源多核苷酸编码蛋白酶，所述蛋白酶具有包含SEQ ID NO:9-73中任一个(例如SEQ ID NO:9、14、16、21、22、33、41、45、61、62、66、67和69中任一个；如SEQ NO:9、14、16和69中任一个)的氨基酸序列或由其组成的成熟多肽序列。
段落[37].如段落[28]-[36]中任一段所述的重组酵母，其中所述发酵生物包含编码葡糖淀粉酶的异源多核苷酸。
段落[38].如段落[37]所述的重组酵母，其中所述葡糖淀粉酶是密孔菌葡糖淀粉酶(例如，本文所述的血红密孔菌葡糖淀粉酶)、粘褶菌葡糖淀粉酶(例如，本文所述的篱边粘褶菌或密粘褶菌葡糖淀粉酶)、或者酵母菌葡糖淀粉酶(例如，本文所述的扣囊复膜酵母菌葡糖淀粉酶，如SEQ ID NO:102或103)。
段落[39].如段落[28]-[38]中任一段所述的重组酵母，其中所述发酵生物包含编码α-淀粉酶的异源多核苷酸。
段落[40].如段落[39]所述的重组酵母，其中所述α-淀粉酶是芽孢杆菌α-淀粉酶(例如，本文所述的嗜热脂肪芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、或地衣芽孢杆菌α-淀粉酶)，或者德巴利酵母α-淀粉酶(例如，本文所述的西方德巴利酵母α-淀粉酶)。
本文描述和要求保护的本发明不限于本文披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。任何等同方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域的技术人员会从前述说明变得显而易见。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。所有参考文献针对描述通过引用具体结合。
提供以下实例以说明本发明的某些方面，但不旨在以任何方式限制所要求保护的本发明的范围。
实例
材料和方法
用作缓冲液和底物的化学品是至少试剂级的商业产品。
ETHANOL REDTM(“ER”)：可从美国富酶泰斯公司/乐斯福公司(Fermentis/Lesaffre)获得的酿酒酵母。
用于酶活性测定的酵母培养上清液的制备
将酵母菌株在含有6％葡萄糖的标准YPD培养基(2％w/v D-葡萄糖、1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.3％KH2PO4)中培养过夜。使培养的酵母培养基在5000rpm下经受离心，持续10分钟以收获上清液。如下所述，将该培养上清液用于酶活性测定。也可以使用其他培养基(如基本YNB培养基)或经澄清和过滤的工业液化玉米醪来培养酵母。
葡糖淀粉酶活性测定
使用麦芽糖作为底物测量葡糖淀粉酶活性。麦芽糖的酶水解将释放葡萄糖作为反应产物，可以使用可商购的测定试剂盒(如AUTOKIT GLUCOSE C2(美国弗吉尼亚州里士满的和光诊断公司(Wako Diagnostics,Richmond,VA,USA))对其进行检测。测定试剂盒中提供的试剂将与葡萄糖发生特异性反应，导致颜色形成。在分光光度计或酶标仪上测量的颜色强度与葡糖淀粉酶活性成正比。反应条件和彩色显影分别描述在表2和表3中。
用于标准葡糖淀粉酶测定的葡糖淀粉酶单位(AGU)被定义为在标准条件下每分钟水解一微摩尔麦芽糖的酶的量。
表2.葡糖淀粉酶反应条件
适当量的酵母上清液
10-200μl
底物
麦芽糖10mM
缓冲液
乙酸盐0.1M
pH
5.0±0.05
孵育温度
32℃
反应时间
5-20min
葡糖淀粉酶测定范围
0.001-0.036AGU/ml
表3.彩色显影
反应混合物
10μl
AUTOKIT GLUCOSE C2显影剂
200μl
孵育温度
室温或37℃
反应时间
10-25min
波长
505nm
蛋白酶活性测定
AZCL-酪蛋白测定
边搅拌边将蓝色底物AZCL-酪蛋白的0.2％溶液悬浮于pH 9的Borax/NaH2PO4缓冲液中。边搅拌边将该溶液分散在微量滴定板(每孔100微升)上，添加30微升酶样品并且将这些板在艾本德热混器(Eppendorf Thermomixer)中在45℃和600rpm下孵育30分钟。使用变性的酶样品(100℃煮沸20min)用作空白对照。孵育之后通过将微量滴定板转移到冰上来终止该反应并且通过在4℃以3000rpm离心5分钟将着色的溶液与固体分离。将60微升的上清液转移到微量滴定板并且使用伯乐酶标仪(BioRad Microplate Reader)测量在595nm处的吸光度。
pNA测定
将50微升含蛋白酶样品添加到微量滴定板并且通过添加100微升1mM pNA底物(5mg溶解于100微升DMSO中并进一步用pH 9.0的Borax/NaH2PO4缓冲液稀释至10mL)开始该测定。监测OD405在室温的增加作为蛋白酶活性的量度。
使用基于荧光的底物(1)进行蛋白酶活性测定
可以使用可从EnzChek蛋白酶测定试剂盒商购的基于荧光的底物来测量蛋白酶活性，该EnzChek蛋白酶测定试剂盒含有酪蛋白衍生物，这些酪蛋白衍生物被pH不敏感的红色荧光TR-X(FITC)染料高度标记。蛋白酶催化的水解释放高度荧光的
表4.工作底物的制备
表5.反应条件和荧光检测
使用基于荧光的底物(2)进行蛋白酶活性测定
使用来自可商购的EnzChek试剂盒(分子探针公司(Molecular Probes))的荧光底物来检测蛋白酶活性。该试剂盒检测通过酪蛋白衍生物的酶水解释放的荧光切割产物的量。在分光光度计或酶标仪上测量的荧光与酶活性成正比。反应条件描述在表6中。
表6.蛋白酶反应条件
酵母上清液的量
80μl
底物的量
80μl
底物
BODIPY酪蛋白，10μg/ml
缓冲液
乙酸钠，0.1M，0.01％Triton 100
pH
5.0±0.05
孵育温度
37℃，覆盖的
反应时间
16小时
波长
485ex/530em(荧光测定的)
检测蛋白酶活性的玉米素-琼脂板的制备
在搅拌板上将0.63g的可商购玉米素(西格玛公司)溶解在25ml的75％乙醇中，然后将20ml的玉米素溶液转移到2％琼脂溶液中，该琼脂溶液含有pH 4.5的20mM乙酸盐缓冲液。使该混合物经受微波，持续1-2分钟，直到琼脂融化成溶液并充分混合。将温玉米素-琼脂溶液倒入板中，使其冷却固化。在玉米素-琼脂板上打小孔，并在每个孔中添加适当量或体积的纯化的蛋白酶或酵母培养上清液，并在32℃下孵育24-48小时。
用于小管发酵的酵母培养物(1)的制备
将酵母菌株在含有6％总葡萄糖的YPD培养基(2％w/v D-葡萄糖，1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.3％KH2PO4)中于32℃在150rpm下孵育过夜，在32℃下共持续18小时。在约18小时收获细胞，将培养物以3500rpm旋转10分钟，并弃去上清液。将细胞悬浮于约15ml自来水中，并使用YC-100Nucleocounter一式两份确定总酵母浓度。向工业上获得的液化玉米醪(其中使用Liquozyme SCDS进行液化)补充3ppm的lactrol和0或600ppm的尿素。通过小规模发酵进行同时糖化和发酵(SSF)。将大约5g液化的玉米醪添加至15ml锥形管中。向每个小瓶中投加0.3AGU/g-DS的外源葡糖淀粉酶产品(Spirizyme Excel)，随后添加酵母菌株。投料10^7个酵母细胞/g的玉米醪。实际Spirizyme Excel和酵母剂量是基于每个小瓶中的玉米浆料的精确重量。将小瓶在32℃下孵育。发酵24和54小时后，对一式三份的每种菌株进行分析。在每个时间点，通过添加50μL的40％H2SO4来终止发酵，随后离心，并且通过0.45微米过滤器过滤。使用HPLC确定乙醇、低聚糖、葡萄糖和有机酸的浓度。
表7小管发酵反应条件
底物
Liquozyme SCDS玉米醪
酵母投料
10^7个细胞/g玉米醪
外源葡糖淀粉酶产品剂量
0.3AGU/g-DS
pH
5.0
孵育温度
32℃
反应时间
24或54小时
用于小管发酵的酵母培养物(2)的制备
将酵母菌株在YPD培养基(6％w/v D-葡萄糖，1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.3％KH2PO4)中于32℃在150rpm下孵育过夜，在32℃下共持续18小时。在约18小时收获细胞，将培养物以3500rpm旋转10分钟，并弃去上清液。将细胞悬浮于约15ml自来水中，并使用YC-100Nucleocounter一式两份确定总酵母浓度。向工业上获得的液化玉米醪(其中使用Avantec Amp进行液化)补充3ppm的lactrol和0或250ppm的外源尿素。通过小规模发酵进行同时糖化和发酵(SSF)。将大约5g液化的玉米醪添加至15ml锥形管中。向每个小瓶中投加0.42AGU/g-DS的外源葡糖淀粉酶产品(Spirizyme Excel)，随后添加在两个不同启动子强度的控制下表达葡糖淀粉酶和蛋白酶的酵母。投料10^7个酵母细胞/g的玉米醪。实际Spirizyme Excel和酵母剂量是基于每个小瓶中的玉米浆料的精确重量。将小瓶在32℃下孵育。发酵52小时后，对单独的或一式三份的每种菌株进行分析。在每个时间点，通过添加50mL的40％H2SO4来终止发酵，随后离心，并且通过0.45微米过滤器过滤。使用HPLC确定乙醇、低聚糖、葡萄糖和有机酸的浓度。反应条件描述并总结在表8中。
表8.小管发酵反应条件
用于Ankom瓶发酵的酵母培养物的制备
将酵母菌株在YPD培养基(6％w/v D-葡萄糖，1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.3％KH2PO4)中于32℃在150rpm下孵育过夜，在32℃下共持续18小时。在约18小时收获细胞，将培养物以3500rpm旋转10分钟，并弃去上清液。将细胞悬浮于约15ml自来水中，并使用YC-100Nucleocounter一式两份确定总酵母浓度。向工业上获得的液化玉米醪(其中使用Avantec Amp进行液化)补充3ppm的lactrol和0或250ppm的外源尿素。通过小规模发酵进行同时糖化和发酵(SSF)。将大约50g液化的玉米醪添加至250ml Ankom瓶中。向每个瓶中投加0.42AGU/g-DS的外源葡糖淀粉酶产品(Spirizyme Excel)，随后添加在两个不同启动子强度的控制下表达葡糖淀粉酶和蛋白酶的酵母。投料10^7个酵母细胞/g的玉米醪。实际Spirizyme Excel和酵母剂量是基于每个瓶中的玉米浆料的精确重量。将瓶在32℃下孵育。发酵52小时后，对单独的或一式三份的每种菌株进行分析。在每个时间点，将5g样品收集到15mL锥形管中，并通过添加50μL的40％H2SO4来终止发酵，随后离心，并且通过0.45微米过滤器过滤。通过HPLC量化乙醇、低聚糖、葡萄糖和有机酸的浓度。反应条件描述并总结在表8中。
用于微量滴定板的酵母培养物的制备
使用工业玉米醪(Liquozyme SC)通过小规模发酵进行同时糖化和发酵(SSF)。将酵母菌株在含有2％葡萄糖的YPD培养基中，在30℃和300rpm下培养过夜，持续24小时。向玉米醪中投加0.30AGU/g-DS的外源葡糖淀粉酶产品(Spirizyme Excel)。将每孔大约0.6mg的玉米醪分配到96孔微量滴定板中，随后添加来自过夜培养物的大约10^8个酵母细胞/g的玉米醪。将这些板在32℃下无振荡地孵育。通过添加100μL的8％H2SO4终止发酵，随后以3000rpm离心10min。
表9.微量滴定板发酵反应条件
实例1：表达异源葡糖淀粉酶的酵母菌株的构建
针对篱边粘褶菌葡糖淀粉酶(GsAMG)的表达盒靶向XII-5整合位点，如Mikkelsen等人(Metabolic Engineering[代谢工程化]第14卷(2012)第104-111页)所述的。将采用***标记方法的两个质粒用于每个整合事件，每个质粒含有一个表达盒和大约三分之二的显性选择标记。左侧质粒包含与所希望的整合位点同源的5'侧翼DNA、驱动GsAMG密码子优化(以用于在酿酒酵母中表达)的表达的酿酒酵母TEF2启动子、酿酒酵母ADH3终止子、loxP位点、以及在棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)TEF1启动子的控制下5’三分之二的显性选择标记。右侧质粒包含具有棉桃阿舒氏囊霉TEF1终止子的3’三分之二的显性选择标记、loxP位点、相对于由酿酒酵母HXT7启动子(其驱动GsAMG密码子优化(以用于在酿酒酵母中表达)的表达)和酿酒酵母PMA1终止子组成的显性选择标记在相反方向上的表达盒、以及与所希望的整合位点同源的3'侧翼DNA。用限制酶将含有靶向XII-5的GsAMG表达盒的左侧和右侧质粒对线性化，并使用乙酸锂转化法将其转化为酿酒酵母菌株MBG4931(参见，Gietz和Woods,2006,Methods in Molecular Biology[分子生物学方法],第313卷,第107-120页)。由于MBG4931是二倍体酵母，因此首先使用卡那霉素抗性作为显性选择标记来整合所希望的整合构建体，随后进行PCR筛选以确认所希望的整合事件。然后使用具有诺尔丝菌素抗性标记的表达盒对再次转化确认的杂合转化体。PCR筛选用于确认产生菌株MeJi703的XII-5整合位点的纯合修饰。
MeJi703中存在的抗生素标记的侧翼为loxP位点。用包含编码CRE重组酶的基因的质粒pFYD80转化MeJi703，该CRE重组酶是一种位点特异性酶，可促进相邻loxP位点之间的重组(Güldener等人,2002)。质粒pFYD80被维持为非整合的、自由复制的分子。此方法可以特异性切除两种选择性标记。用质粒pFYD80转化MeJi703，并在含有博莱霉素的板上选择转化体。博莱霉素抗性在pFYD80中编码。随后，筛选已失去诺尔丝菌素和卡那霉素抗性的转化体。使敏感菌株在YPD液体中生长，直到获得pFYD80质粒的丢失。菌株MeJi705被选择并显示出由于质粒pFYD80的丢失而对博莱霉素是敏感的。
所得的菌株MeJi705(还参见，WO 2017/087330以获取另外的描述，将其内容通过引用并入本文)衍生自酿酒酵母菌株MBG4931，并且表达来自XII-5整合位点的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶(SEQ ID NO:8)的两个纯合拷贝，一个拷贝在TEF2启动子(SEQ ID NO:2)的控制下，另一个拷贝在HXT7启动子(SEQ ID NO:3)的控制下。
如针对MEJI705所述的制备菌株GsAMGinER1，只不过用于转化的宿主菌株是乙醇红。菌株GsAMGinER1衍生自酿酒酵母菌株乙醇红，并且表达来自XII-5整合位点的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶(SEQ ID NO:8)的两个纯合拷贝，一个拷贝在TEF2启动子(SEQ ID NO:2)的控制下，另一个拷贝在HXT7启动子(SEQ ID NO:3)的控制下。
实例2：表达异源蛋白酶的酵母菌株的构建
该实例描述了在酿酒酵母TDH3、TEF2、HXT7、PGK1、ADH1或RPL18B启动子(分别是SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6)的控制下，含有异源蛋白酶或肽酶的酵母细胞的构建。设计含有启动子或基因的两个片段的DNA(左右片段)，以允许这2个DNA片段之间的同源重组并进入酵母乙醇红的X-3位点。所得的菌株将具有包含一个启动子的片段(左片段)和包含一个基因的片段(右片段)，将二者整合到X-3位点处的酿酒酵母基因组中。
含有启动子的片段(左片段)的构建
通过赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)合成含有与X-3位点具有60bp同源性，酿酒酵母启动子(TDH3、TEF2、HXT7、PGK1、ADH1或RPL18B)，以及酿酒酵母MFα1信号序列的合成DNA质粒。对于以上列出的每个启动子，将6个质粒分别表示为16ABN4WP、16ABN4XP、16ABN4YP、16ABN4ZP、16ABN42P和16ABN43P。为了产生线性DNA以转化为酵母，从16ABN4WP、16ABN4XP、16ABN4YP、16ABN4ZP、16ABN42P和16ABN43P PCR扩增含有左盒的DNA。各50皮摩尔的正向和反向引物用于PCR反应，该反应含有50ng质粒DNA(DNA作为模板)，各0.1mM dATP、dGTP、dCTP、dTTP，1X Phusion HF缓冲液(赛默飞世尔科技公司)，以及2个单位的Phusion热启动DNA聚合酶，最终体积为50μL。在T100TM热循环仪(伯乐实验室有限公司)中进行PCR，其被编程为：1个循环，在98℃持续3分钟；随后32个循环，每个循环在98℃持续10秒、58℃持续20秒、以及72℃持续1分钟；以及最终延长，在72℃持续5分钟。热循环后，用PCR净化试剂盒(凯杰公司(Qiagen))对PCR反应产物进行净化。
含有蛋白酶/肽酶的片段(右片段)的构建
通过赛默飞世尔科技公司合成含有酿酒酵母MFα1信号编码序列(编码SEQ ID NO:7的信号序列)、密码子优化的蛋白酶基因、PRM9终止子、以及与X-3位点具有60bp同源性的合成DNA质粒。所得的10个质粒如表10中所示的表示。为了产生线性DNA以转化为酵母，合并1μg的10个质粒中的每一个，并用总体积为200μl的18μl Fast Digest SfiI限制酶(赛默公司)进行消化，在50℃下孵育1小时。用QIAquick PCR纯化试剂盒(凯杰公司)对消化物进行净化。
表10.质粒名称和相关酶
整合左侧和右侧片段以产生具有异源蛋白酶或肽酶的酵母菌株
用上述左右整合片段转化酵母GsAMGinER。左片段的DNA由6个左片段的集合组成，这些左片段含有50ng的每个片段(共300ng)。右侧片段由10个右片段的集合组成，这些右片段含有30ng的每个右片段(共300ng)。为了帮助左片段和右片段在基因组X-3位点处的同源重组，还在转化中使用含有Cas9和对X-3特异的指导RNA的质粒。按照酵母电穿孔方案，将这3种组分转化到酿酒酵母菌株GsAMGinER1中。在YPD+CloNAT上选择转化体以选择含有CRISPR/Cas9质粒pMcTs442的转化体。使用Q-pix Colony Picking System(分子仪器公司(Molecular Devices))挑选转化体，以接种1孔含有YPD+CloNAT培养基的96孔板。使板生长2天，然后添加甘油至20％的终浓度，并将这些板储存在-80℃下直至需要。
实例3：表达蛋白酶的酵母菌株的活性测定
如上文所述，构建由启动子TEF2驱动的表达来自大型亚灰树花菌的蛋白酶基因的酵母菌株。如“材料和方法”中所述，在YPD培养基中培养该菌株，并且使用基于荧光的底物(2)收集上清液以进行蛋白酶活性测定。
测定结果示于表11中。“GA:蛋白酶酵母”显示蛋白酶表达成比例增加了在485ex/530em处测量的荧光切割产物。这表明酿酒酵母菌株可以成功地分泌活性蛋白酶。
表11.
实例4：表达蛋白酶的酵母菌株的活性测定
如上文所述，构建由不同启动子(表12)驱动的表达来自污叉丝孔菌或大型亚灰树花菌的蛋白酶基因的酵母菌株。如“材料和方法”中所述，在YPB培养基中培养该菌株，并且收获上清液以进行葡糖淀粉酶和蛋白酶活性测定。
表12.
使用BODIPY-TRX酪蛋白底物对来自污叉丝孔菌和大型亚灰树花菌的纯化的蛋白酶的测定显示了，蛋白酶剂量的增加成比例地增加了荧光强度检测(参见图1)。
酵母培养上清液的测定显示了，所有酵母菌株均分泌葡糖淀粉酶活性，尽管有些菌株的活性较低(参见图2)。使用BODIPY-TRX酪蛋白作为底物，在含有来自污叉丝孔菌或大型亚灰树花菌的蛋白酶基因的酵母菌株中检测到蛋白酶活性(参见图3)。酵母菌株中蛋白酶的不同活性谱表明，启动子可能影响酶表达，从而影响酵母的分泌。
实例5：使用玉米素-琼脂板检测表达蛋白酶的酵母菌株中的蛋白酶活性
玉米素是玉米蛋白中主要成分的一部分。特定蛋白酶将不溶性玉米素蛋白水解为更可溶的寡肽和/或氨基酸，可以被视为琼脂板上的透明区。
如图4所示，纯化的蛋白酶或酵母培养上清液水解琼脂上的玉米素蛋白，以产生明显的透明区，该纯化的蛋白酶或酵母培养上清液含有来自污叉丝孔菌或大型亚灰树花菌(见上文)的分泌的蛋白酶活性。该透明区的直径指示蛋白酶存在的浓度。对于表达蛋白酶的酵母菌株，玉米素琼脂板上的透明区直径很好地对应使用BODIPY-TRX酪蛋白确定的活性。
实例6：表达蛋白酶的酵母菌株的发酵测定
如“材料和方法”中所述，将来自表12的酵母菌株(见上文)在6％YPD培养基中培养，并将玉米醪发酵以10^7个细胞/g玉米醪投料，并且以0.3AGU/g-DS投加外源葡糖淀粉酶产品。
表12中表达来自污叉丝孔菌或大型亚灰树花菌的蛋白酶的酵母(含有0ppm外源尿素)的玉米醪发酵实验显示了，相对于对照菌株1，发酵24小时后，由于蛋白酶基因的表达，残余葡萄糖的百分比降低(参见图5)。
表12中表达来自污叉丝孔菌或大型亚灰树花菌的蛋白酶的酵母(含有0ppm外源尿素)的玉米醪发酵实验显示了，相对于对照菌株1，发酵24小时后，由于蛋白酶基因的表达，甘油/乙醇比率的百分比降低(参见图6)。
表12中表达来自污叉丝孔菌或大型亚灰树花菌的蛋白酶的酵母(含有0ppm外源尿素)的玉米醪发酵实验显示了，相对于对照菌株1，发酵54小时后，由于蛋白酶基因的表达，残余葡萄糖的百分比降低(参见图7)。
表12中表达来自污叉丝孔菌或大型亚灰树花菌的蛋白酶的酵母(含有0ppm外源尿素)的玉米醪发酵实验显示了，相对于对照菌株1，发酵54小时后，由于蛋白酶基因的表达，乙醇产率百分比的增加(参见图8)。
表12中表达来自污叉丝孔菌或大型亚灰树花菌的蛋白酶的酵母(含有0ppm外源尿素)的玉米醪发酵实验显示了，相对于对照菌株1，发酵54小时后，由于蛋白酶基因的表达，甘油/乙醇比率的百分比降低(参见图9)。
实例7：同时糖化和发酵(SSF)期间表达蛋白酶的酵母菌株的尿素剂量应答
将酵母菌株在含有6％葡萄糖的YPD培养基(2％w/v D-葡萄糖，1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.3％KH2PO4)中伴随振荡于32℃下培养18小时。通过以3500rpm离心10分钟来收获细胞，并弃去上清液。将细胞悬浮于适当体积的自来水中，并使用YC-100Nucleocounter一式两份确定总酵母浓度。使用工业液化的玉米醪通过小规模发酵进行同时糖化和发酵(SSF)，其中用α-淀粉酶产物(Liquozyme SCDS)进行液化。将大约25g的液化玉米醪添加到50ml管中，该管补充有3ppm的lactrol和范围分别从0、50、100、200、400和600ppm的不同尿素浓度。向每个管中投加0.4AGU/gDS的外源葡糖淀粉酶产品(SpirizymeExcel)，随后添加以1X 107个细胞/g的玉米醪投料的酵母悬浮液。使用以下两种酵母菌株：1)共表达葡糖淀粉酶和大型亚灰树花菌蛋白酶的酵母(具有TEF2启动子)；和2)仅表达葡糖淀粉酶的酵母(作为对照)。实际Spirizyme Excel和酵母剂量是基于每个管中的玉米浆料的精确重量。将每种处理以三个重复在32℃下孵育以用于SSF。发酵51小时后，吸取2mL的发酵玉米醪，并通过添加
将0和400ppm尿素的样品处理用于玉米油提取和定量。使用Buchi Multivapor蒸发系统蒸馏乙醇。将在一式三份管中的每种处理***到在75℃预热的单位水浴中，并且伴随振荡在真空抽吸下蒸馏大约80分钟。在蒸馏后对管进行称重并且在蒸馏过程中的重量损失用DI水进行替代。在水添加后再次对管进行称重。按0.125mL己烷/1g起始材料的剂量，将己烷添加至每一样品。将每个管覆盖在封口膜(Dura-seal)中以防止样品漏泄，并且充分混合。将管以3,000x g离心10分钟，并且在离心之后，使用正位移移液管去除油/己烷层(上清液)，转移至预称重的5mL掀盖式管，并且再称重。使用鲁道夫研究分析密度计测量样品密度。然后使用标准曲线等式计算上清液的密度，以发现上清液中油％。从该值衍生出起始材料中油的总％。
如表13和图10所示，与缺乏异源蛋白酶表达的酵母(GA酵母)相比，表达异源蛋白酶的酵母(GA:蛋白酶酵母)在宽范围的尿素浓度(0至600ppm)上显示出统计学上更高的乙醇产率。特别地，当添加少于200ppm的外源尿素时，与缺乏异源蛋白酶表达的酵母相比，由表达异源蛋白酶的酵母产生的乙醇滴度明显更高。这些结果表明，分泌的蛋白酶仍保留功能，并且允许酵母利用从玉米蛋白上的蛋白酶反应释放的另外的氨基氮(肽和氨基酸)，从而在SSF期间需要更少的补充尿素以获得高乙醇产率。
表13.
如表14所示，与缺乏异源蛋白酶表达的酵母相比，从表达异源蛋白酶的酵母获得更高的玉米油产率。二者均含有或不含有补充尿素。
表14.
实例8：同时糖化和发酵(SSF)期间，具有表达蛋白酶的酵母的液化蛋白酶的作用 增强
使用Labomat BFA-24(北卡罗来纳州康科德市马西斯公司(Mathis,Concord,NC))在金属罐中进行液化。在罐中添加308g工业生产的磨碎的玉米至270g工业生产的逆流和320g自来水中并充分混合。目标干固体为约32％DS。将pH调节至pH 5.0并使用水分天平(Mettler-Toledo)测量干固体。将
如图11和表15所示，与不存在液化蛋白酶的情况相比，添加蛋白酶的玉米浆料液化显示出明显更高的乙醇产率。尽管共表达葡糖淀粉酶和蛋白酶的酵母能够在SSF期间从表达的蛋白酶的作用中产生氨基氮，但是液化蛋白酶在液化过程中会产生更多的另外的氨基氮(肽和氨基酸)，这可以使氮源立即进入酵母早期发酵。结果还显示，液化蛋白酶在液化中的存在会减少发酵中酵母的尿素补充量。
表15.
实例9：表达异源蛋白酶的酵母菌株的构建
该实例描述了在酿酒酵母TDH3或RPL18B启动子的控制下，含有异源蛋白酶的酵母细胞的构建。设计含有启动子、基因和终止子的三个片段的DNA，以允许这三个DNA片段之间的同源重组并进入酵母yMHCT484(表达篱边粘褶菌葡糖淀粉酶的并且以与本文所述技术类似的方式构建的酿酒酵母)的X-3位点。每个所得的菌株具有包含一个启动子的片段(左片段)、包含一个基因的片段(中片段)、以及一个PRM9终止子片段(右片段)，将三者整合到X-3位点处的酿酒酵母基因组中。
含有启动子的片段(左片段)的构建
通过赛默飞世尔科技公司合成含有与X-3位点具有300bp同源性、酿酒酵母启动子TEF2或RPL18B、以及酿酒酵母MF1α信号序列的合成线性未克隆DNA。对于以上列出的每个启动子，将两个线性DNA分别表示为17ABCKYP和17ABCKZP。为了产生另外的线性DNA以转化为酵母，从17ABCKYP和17ABCKZP PCR扩增含有左盒的DNA。
含有终止子的片段(右片段)的构建
通过赛默飞世尔科技公司合成含有酿酒酵母PRM9终止子和与X-3位点具有300bp同源性的合成线性未克隆DNA，并且将其表示为17ABCLAP。
表16.蛋白酶DNA产品名称和相关酶
整合左侧、中侧和右侧片段以产生具有异源蛋白酶的酵母菌株
用上述左、中和右整合片段转化酵母yMHCT484。在每个转化池中，使用固定的左片段和右片段。中片段由5-23个中片段的集合组成，这些中片段含有蛋白酶基因且具有100ng的每个片段。为了帮助左片段、中片段和右片段在基因组X-3位点处的同源重组，还在转化中使用含有Cas9和对X-3(pMcTs442)特异的指导RNA的质粒。将这四种组分转化到酿酒酵母菌株yMHCT484中。在YPD+cloNAT上选择转化体以选择含有CRISPR/Cas9质粒pMcTs442的转化体。使用Q-pix Colony Picking System(分子仪器公司)挑选转化体，以接种1孔含有YPD+cloNAT培养基的96孔板。使板生长2天，然后添加甘油至20％的终浓度，并将这些板储存在-80℃下直至需要。通过使用基因座特异性引物的PCR和随后的测序来验证特异性蛋白酶构建体的整合。此实例中产生的菌株示于表17中。
表17.表达蛋白酶的酿酒酵母菌株(所有菌株还含有正确的(PRM9终止子)片段17ABCLAP，未在表中显示)。
实例10：表达蛋白酶的酵母菌株的同时糖化和发酵(SSF)筛选
使用工业玉米醪(Liquozyme SC)通过小规模发酵进行同时糖化和发酵(SSF)。将酵母菌株在含有2％葡萄糖的YPD培养基中，在30℃和300rpm下培养过夜，持续24小时。向玉米醪中投加0.30AGU/g-DS的外源葡糖淀粉酶产品(Spirizyme Excel)。将每孔大约0.6mg的玉米醪分配到96孔微量滴定板中，随后添加来自过夜培养物的大约10^8个酵母细胞/g的玉米醪。将这些板在32℃下无振荡地孵育。发酵48小时后，对一式三份的每种菌株进行分析。通过添加100μL的8％H2SO4终止发酵，随后以3000rpm离心10min。
如表18所示，与缺乏异源蛋白酶表达的酵母相比，从表达异源蛋白酶的酵母中测量出更高的切割产物。“释放的切割产物”一栏显示了使用基于荧光的底物(2)(见上文)进行的基于YPD的蛋白酶活性测定的结果。
表18.菌株ID和蛋白酶活性数据。
实例11：表达蛋白酶-葡糖淀粉酶的菌株中的葡糖淀粉酶表达
如“材料和方法”中所述，在YPD培养基中培养酵母菌株，并且收获上清液以进行葡糖淀粉酶活性测定。随着添加到水解麦芽糖或葡萄糖中的纯化的葡糖淀粉酶的量增加，在505nm处的吸光度增加。产生纯化的葡糖淀粉酶标准曲线，并将其用于估计酵母上清液中的葡糖淀粉酶活性。结果示于表19中。
表19.表达葡糖淀粉酶和蛋白酶基因的酵母菌株、光密度测量值和酶分泌值的描述。
实例12：表达蛋白酶的酵母菌株的乙醇发酵产率
如上文所述，制备了表19(以上)的菌株用于小管发酵，其发酵反应条件略有变化，如下表20所示：
表20.小管发酵反应条件
底物
Liquizyme LpH玉米醪
酵母投料
10^7个细胞/g玉米醪
外源葡糖淀粉酶产品剂量
0.42AGU/g-DS
pH
5.0
孵育温度
32℃
反应时间
54小时
发酵结果示于图12和13中。在这些实验中，与无效尿素对照菌株B1相比，40种菌株(没有外源尿素)产生的乙醇更多。出人意料地，与添加1000ppm外源尿素的对照相比，九种菌株(没有外源尿素)表现出明显增强的发酵性能。
实例13：表达蛋白酶的酵母菌株的甘油减少并且动力学改善
如上文所述(用于小管发酵的酵母培养物(2)的制备)，制备了表达来自家族S10的外切蛋白酶的若干种菌株用于小管发酵，并且测试了不需要的甘油副产物的产生。发酵52小时后，在32℃且没有外源尿素的情况下，投加0.42AGU/g-DS的外源Spirizyme Excel进行针对甘油(％w/v)的单向方差分析。所用的底物是使用Avantec Amp作为液化产物制备的玉米醪。如表21所示，与阳性对照菌株yMHCT484相比，在没有尿素的情况下表达蛋白酶的选择菌株产生的甘油令人惊讶地少。对照菌株yMHCT484显示，在投加0或250ppm外源尿素的情况下甘油产量无明显变化。
另外，基于来自Ankom瓶发酵(见上文)的累积压力研究的动力学曲线作为发酵的前12小时内的时间的函数显示出，表达外切蛋白酶的五种菌株的动力学更快(表21)。
表21.发酵52小时后，在没有外源尿素投加的情况下，观察到外切蛋白酶、所用的启动子和甘油减少。
实例14：表达蛋白酶的酵母菌株的乙醇发酵产率
如上文所述(用于小管发酵的酵母培养物(2)的制备)，制备了表达内切蛋白酶的若干种菌株用于小管发酵，其发酵反应条件略有变化，如下表21所示：
表21.小管发酵反应条件
底物
Liquozyme LpH玉米醪
酵母投料
10^7个细胞/g玉米醪
外源葡糖淀粉酶产品剂量
0.30AGU/g-DS
外源尿素剂量
150或1000ppm
pH
5.0
孵育温度
32℃
反应时间
54小时
如表22所示，与投加1000ppm外源尿素的阳性对照菌株相比，在150ppm外源尿素的存在下表达内切蛋白酶的菌株能够产生乙醇(％w/v)的显著增加和甘油的降低。基于每个经评估的菌株的残余葡萄糖<0.1％，将发酵进行到干燥。
表22.发酵54小时后，在将150ppm尿素用于候选菌株且与用于阳性对照菌株的1000ppm尿素相比的情况下，观察到内切蛋白酶、使用的启动子、乙醇产率和甘油减少。
序列表
<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）
Hogsett, David
Harris, Paul Vincent
Tassone, Monica
<120> 用于乙醇生产的改善的酵母
<130> 14480-WO-PCT
<150> US 62/514,636
<151> 2017-06-02
<160> 109
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 621
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 1
cagttcgagt ttatcattat caatactgcc atttcaaaga atacgtaaat aattaatagt 60
agtgattttc ctaactttat ttagtcaaaa aattagcctt ttaattctgc tgtaacccgt 120
acatgcccaa aatagggggc gggttacaca gaatatataa catcgtaggt gtctgggtga 180
acagtttatt cctggcatcc actaaatata atggagcccg ctttttaagc tggcatccag 240
aaaaaaaaag aatcccagca ccaaaatatt gttttcttca ccaaccatca gttcataggt 300
ccattctctt agcgcaacta cagagaacag gggcacaaac aggcaaaaaa cgggcacaac 360
ctcaatggag tgatgcaacc tgcctggagt aaatgatgac acaaggcaat tgacccacgc 420
atgtatctat ctcattttct tacaccttct attaccttct gctctctctg atttggaaaa 480
agctgaaaaa aaaggttgaa accagttccc tgaaattatt cccctacttg actaataagt 540
atataaagac ggtaggtatt gattgtaatt ctgtaaatct atttcttaaa cttcttaaat 600
tctactttta tagttagtct t 621
<210> 2
<211> 644
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 2
agctacctat attccaccat aatatcaatc atgcggttgc tggtgtattt accaataatg 60
tttaatgtat atatattagg ggccgtatac ttacatatag tagatgtcaa gcgtaggcgc 120
ttcccctgcc ggctgtgacg gcgccataac caaggtatct atagaccgcc aatcagcaaa 180
ctacctccgt acattcatgt tgcacccaca catgtacaca cccagaccgc aacaaattac 240
ccataaggtt gtttgtgacg gcgtcgtaca agagaacgtg ggaacttttt aggctcacca 300
aaaaagaaag gaaaaatacg agttgctgac agaagcctca agaaaaaaaa aattcttctt 360
cgactatgct ggaggcagag atgatcgagc cggtagttaa ctatatatag ctaaattggt 420
tccatcacct tcttttctgg tgtcgctcct tctagtgcta tttctggctt ttcctatttt 480
ttttttttcc atttttcttt ctctctttct aatatataaa ttctcttgca ttttctattt 540
ttctctctat ctattctact tgtttattcc cttcaaggtt tttttttaag gagtacttgt 600
ttttagaata tacggtcaac gaactataat taagctagaa caaa 644
<210> 3
<211> 457
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 3
ctccagaaag gcaacgcaaa attttttttc cagggaataa actttctatg acccactact 60
tctcgtagga acaatttcgg gcccctgcgt gttcttctga ggttcatctt ttacatttgc 120
ttctgctgga taattttcag aggcaacaag gaaaaattag atggcaaaaa gtcgtctttc 180
aaggaaaaat ccccaccatc cttcgagatc ccctgtaact tattggcaac tgaaagaatg 240
aaaaggagga aaatacaaaa tatactagaa ctgaaaaaaa aaagtataaa tagagacgat 300
atatgccaat acttcacaat gttcgaatcc attcttcatt tgcagctatt gtaaaataat 360
aaaacatcaa gaacaaacaa gctcaacttg tcttttctaa gaacaaagaa taaacacaaa 420
aacaaaaagt ttttttaatt ttaatcgcta gaacaaa 457
<210> 4
<211> 700
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 4
gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc 240
tcgacttcct gtcatcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag 300
cgacggctca caggttttgt aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt 360
agtaccacat gctatgatgc ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg 420
ttactctctc tctttcaaac agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca 480
cacactcttt tcttctaacc aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac 540
atttacatat atataaactt gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt 600
tctaattcgt agtttttcaa gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc 660
aaggaagtaa ttatctactt tttacaacaa atataaaaca 700
<210> 5
<211> 705
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 5
atccttttgt tgtttccggg tgtacaatat ggacttcctc ttttctggca accaaaccca 60
tacatcggga ttcctataat accttcgttg gtctccctaa catgtaggtg gcggagggga 120
gatatacaat agaacagata ccagacaaga cataatgggc taaacaagac tacaccaatt 180
acactgcctc attgatggtg gtacataacg aactaatact gtagccctag acttgatagc 240
catcatcata tcgaagtttc actacccttt ttccatttgc catctattga agtaataata 300
ggcgcatgca acttcttttc tttttttttc ttttctctct cccccgttgt tgtctcacca 360
tatccgcaat gacaaaaaaa tgatggaaga cactaaagga aaaaattaac gacaaagaca 420
gcaccaacag atgtcgttgt tccagagctg atgaggggta tctcgaagca cacgaaactt 480
tttccttcct tcattcacgc acactactct ctaatgagca acggtatacg gccttccttc 540
cagttacttg aatttgaaat aaaaaaaagt ttgctgtctt gctatcaagt ataaatagac 600
ctgcaattat taatcttttg tttcctcgtc attgttctcg ttccctttct tccttgtttc 660
tttttctgca caatatttca agctatacca agcatacaat caact 705
<210> 6
<211> 700
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 6
aagaggatgt ccaatatttt ttttaaggaa taaggatact tcaagactag attcccccct 60
gcattcccat cagaaccgta aaccttggcg ctttccttgg gaagtattca agaagtgcct 120
tgtccggttt ctgtggctca caaaccagcg cgcccgatat ggctttcttt tcacttatga 180
atgtaccagt acgggacaat tagaacgctc ctgtaacaat ctctttgcaa atgtggggtt 240
acattctaac catgtcacac tgctgacgaa attcaaagta aaaaaaaatg ggaccacgtc 300
ttgagaacga tagattttct ttattttaca ttgaacagtc gttgtctcag cgcgctttat 360
gttttcattc atacttcata ttataaaata acaaaagaag aatttcatat tcacgcccaa 420
gaaatcaggc tgctttccaa atgcaattga cacttcatta gccatcacac aaaactcttt 480
cttgctggag cttcttttaa aaaagacctc agtacaccaa acacgttacc cgacctcgtt 540
attttacgac aactatgata aaattctgaa gaaaaaataa aaaaattttc atacttcttg 600
cttttattta aaccattgaa tgatttcttt tgaacaaaac tacctgtttc accaaaggaa 660
atagaaagaa aaaatcaatt agaagaaaac aaaaaacaaa 700
<210> 7
<211> 19
<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<400> 7
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Thr Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1 5 10 15
Ala Leu Ala
<210> 8
<211> 556
<212> PRT
<213> 篱边粘褶菌
<400> 8
Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Ser Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys Ala
1 5 10 15
Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly Ala
20 25 30
Ser Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asp Pro Asp Tyr
35 40 45
Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu Ile
50 55 60
Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Gly Thr Ser Ser Leu Arg Thr Leu
65 70 75 80
Ile Asp Asp Phe Val Thr Ala Glu Ala Asn Leu Gln Gln Val Ser Asn
85 90 95
Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn
100 105 110
Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp
115 120 125
Gly Pro Ala Leu Arg Ser Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp Leu
130 135 140
Leu Ser Asn Gly Asn Thr Ser Tyr Val Thr Ser Asn Leu Trp Pro Ile
145 150 155 160
Ile Gln Asn Asp Leu Gly Tyr Val Val Ser Tyr Trp Asn Gln Ser Thr
165 170 175
Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala
180 185 190
Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Ala Ile
195 200 205
Gly Gln Thr Ser Gln Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Asp Asn Leu
210 215 220
Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Ser Gly Gly Tyr Ile Thr
225 230 235 240
Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu Leu
245 250 255
Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Ala Thr
260 265 270
Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr Val
275 280 285
Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser Asn
290 295 300
Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly Gly
305 310 315 320
Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr Asp
325 330 335
Ala Leu Asn Val Trp Glu Ser Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Ser Thr
340 345 350
Ser Leu Ala Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Gly Val Thr Ala Gly Thr
355 360 365
Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Leu Thr Ser Ala Ile Lys
370 375 380
Ser Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Val Asn Ala Lys Tyr Thr Pro Ser
385 390 395 400
Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Lys Ser Asp Gly Ser Pro Leu
405 410 415
Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala Phe
420 425 430
Glu Ala Arg Asn Asn Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Ala Gly Leu
435 440 445
Thr Val Pro Ser Ser Cys Ser Gly Asn Ser Gly Gly Pro Thr Val Ala
450 455 460
Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Glu Thr Val Trp Gly Glu Asn Ile Tyr
465 470 475 480
Leu Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Glu Asn Trp Ser Ala Asp Asn Ala
485 490 495
Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile Thr Val Asn
500 505 510
Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Glu Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Asn Asn
515 520 525
Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile Thr Thr Pro
530 535 540
Ala Ser Gly Ser Thr Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg
545 550 555
<210> 9
<211> 374
<212> PRT
<213> 黑曲霉
<400> 9
Ala Pro Ala Pro Thr Arg Lys Gly Phe Thr Ile Asn Gln Ile Ala Arg
1 5 10 15
Pro Ala Asn Lys Thr Arg Thr Ile Asn Leu Pro Gly Met Tyr Ala Arg
20 25 30
Ser Leu Ala Lys Phe Gly Gly Thr Val Pro Gln Ser Val Lys Glu Ala
35 40 45
Ala Ser Lys Gly Ser Ala Val Thr Thr Pro Gln Asn Asn Asp Glu Glu
50 55 60
Tyr Leu Thr Pro Val Thr Val Gly Lys Ser Thr Leu His Leu Asp Phe
65 70 75 80
Asp Thr Gly Ser Ala Asp Leu Trp Val Phe Ser Asp Glu Leu Pro Ser
85 90 95
Ser Glu Gln Thr Gly His Asp Leu Tyr Thr Pro Ser Ser Ser Ala Thr
100 105 110
Lys Leu Ser Gly Tyr Thr Trp Asp Ile Ser Tyr Gly Asp Gly Ser Ser
115 120 125
Ala Ser Gly Asp Val Tyr Arg Asp Thr Val Thr Val Gly Gly Val Thr
130 135 140
Thr Asn Lys Gln Ala Val Glu Ala Ala Ser Lys Ile Ser Ser Glu Phe
145 150 155 160
Val Gln Asn Thr Ala Asn Asp Gly Leu Leu Gly Leu Ala Phe Ser Ser
165 170 175
Ile Asn Thr Val Gln Pro Lys Ala Gln Thr Thr Phe Phe Asp Thr Val
180 185 190
Lys Ser Gln Leu Asp Ser Pro Leu Phe Ala Val Gln Leu Lys His Asp
195 200 205
Ala Pro Gly Val Tyr Asp Phe Gly Tyr Ile Asp Asp Ser Lys Tyr Thr
210 215 220
Gly Ser Ile Thr Tyr Thr Asp Ala Asp Ser Ser Gln Gly Tyr Trp Gly
225 230 235 240
Phe Ser Thr Asp Gly Tyr Ser Ile Gly Asp Gly Ser Ser Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Phe Ser Ala Ile Ala Asp Thr Gly Thr Thr Leu Ile Leu Leu Asp
260 265 270
Asp Glu Ile Val Ser Ala Tyr Tyr Glu Gln Val Ser Gly Ala Gln Glu
275 280 285
Ser Glu Glu Ala Gly Gly Tyr Val Phe Ser Cys Ser Thr Asn Pro Pro
290 295 300
Asp Phe Thr Val Val Ile Gly Asp Tyr Lys Ala Val Val Pro Gly Lys
305 310 315 320
Tyr Ile Asn Tyr Ala Pro Ile Ser Thr Gly Ser Ser Thr Cys Phe Gly
325 330 335
Gly Ile Gln Ser Asn Ser Gly Leu Gly Leu Ser Ile Leu Gly Asp Val
340 345 350
Phe Leu Lys Ser Gln Tyr Val Val Phe Asn Ser Glu Gly Pro Lys Leu
355 360 365
Gly Phe Ala Ala Gln Ala
370
<210> 10
<211> 590
<212> PRT
<213> 里氏木霉
<400> 10
Ser Val His Leu Leu Glu Ser Leu Glu Lys Leu Pro His Gly Trp Lys
1 5 10 15
Ala Ala Glu Thr Pro Ser Pro Ser Ser Gln Ile Val Leu Gln Val Ala
20 25 30
Leu Thr Gln Gln Asn Ile Asp Gln Leu Glu Ser Arg Leu Ala Ala Val
35 40 45
Ser Thr Pro Thr Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Tyr Leu Asp Val Asp Glu
50 55 60
Ile Asn Ser Ile Phe Ala Pro Ser Asp Ala Ser Ser Ser Ala Val Glu
65 70 75 80
Ser Trp Leu Gln Ser His Gly Val Thr Ser Tyr Thr Lys Gln Gly Ser
85 90 95
Ser Ile Trp Phe Gln Thr Asn Ile Ser Thr Ala Asn Ala Met Leu Ser
100 105 110
Thr Asn Phe His Thr Tyr Ser Asp Leu Thr Gly Ala Lys Lys Val Arg
115 120 125
Thr Leu Lys Tyr Ser Ile Pro Glu Ser Leu Ile Gly His Val Asp Leu
130 135 140
Ile Ser Pro Thr Thr Tyr Phe Gly Thr Thr Lys Ala Met Arg Lys Leu
145 150 155 160
Lys Ser Ser Gly Val Ser Pro Ala Ala Asp Ala Leu Ala Ala Arg Gln
165 170 175
Glu Pro Ser Ser Cys Lys Gly Thr Leu Val Phe Glu Gly Glu Thr Phe
180 185 190
Asn Val Phe Gln Pro Asp Cys Leu Arg Thr Glu Tyr Ser Val Asp Gly
195 200 205
Tyr Thr Pro Ser Val Lys Ser Gly Ser Arg Ile Gly Phe Gly Ser Phe
210 215 220
Leu Asn Glu Ser Ala Ser Phe Ala Asp Gln Ala Leu Phe Glu Lys His
225 230 235 240
Phe Asn Ile Pro Ser Gln Asn Phe Ser Val Val Leu Ile Asn Gly Gly
245 250 255
Thr Asp Leu Pro Gln Pro Pro Ser Asp Ala Asn Asp Gly Glu Ala Asn
260 265 270
Leu Asp Ala Gln Thr Ile Leu Thr Ile Ala His Pro Leu Pro Ile Thr
275 280 285
Glu Phe Ile Thr Ala Gly Ser Pro Pro Tyr Phe Pro Asp Pro Val Glu
290 295 300
Pro Ala Gly Thr Pro Asn Glu Asn Glu Pro Tyr Leu Gln Tyr Tyr Glu
305 310 315 320
Phe Leu Leu Ser Lys Ser Asn Ala Glu Ile Pro Gln Val Ile Thr Asn
325 330 335
Ser Tyr Gly Asp Glu Glu Gln Thr Val Pro Arg Ser Tyr Ala Val Arg
340 345 350
Val Cys Asn Leu Ile Gly Leu Leu Gly Leu Arg Gly Ile Ser Val Leu
355 360 365
His Ser Ser Gly Asp Glu Gly Val Gly Ala Ser Cys Val Ala Thr Asn
370 375 380
Ser Thr Thr Pro Gln Phe Asn Pro Ile Phe Pro Ala Thr Cys Pro Tyr
385 390 395 400
Val Thr Ser Val Gly Gly Thr Val Ser Phe Asn Pro Glu Val Ala Trp
405 410 415
Ala Gly Ser Ser Gly Gly Phe Ser Tyr Tyr Phe Ser Arg Pro Trp Tyr
420 425 430
Gln Gln Glu Ala Val Gly Thr Tyr Leu Glu Lys Tyr Val Ser Ala Glu
435 440 445
Thr Lys Lys Tyr Tyr Gly Pro Tyr Val Asp Phe Ser Gly Arg Gly Phe
450 455 460
Pro Asp Val Ala Ala His Ser Val Ser Pro Asp Tyr Pro Val Phe Gln
465 470 475 480
Gly Gly Glu Leu Thr Pro Ser Gly Gly Thr Ser Ala Ala Ser Pro Val
485 490 495
Val Ala Ala Ile Val Ala Leu Leu Asn Asp Ala Arg Leu Arg Glu Gly
500 505 510
Lys Pro Thr Leu Gly Phe Leu Asn Pro Leu Ile Tyr Leu His Ala Ser
515 520 525
Lys Gly Phe Thr Asp Ile Thr Ser Gly Gln Ser Glu Gly Cys Asn Gly
530 535 540
Asn Asn Thr Gln Thr Gly Ser Pro Leu Pro Gly Ala Gly Phe Ile Ala
545 550 555 560
Gly Ala His Trp Asn Ala Thr Lys Gly Trp Asp Pro Thr Thr Gly Phe
565 570 575
Gly Val Pro Asn Leu Lys Lys Leu Leu Ala Leu Val Arg Phe
580 585 590
<210> 11
<211> 511
<212> PRT
<213> 橙色嗜热子囊菌
<400> 11
Val Pro Val Glu Val Ala Gly Ser Ala Gln Gly Leu Asp Val Thr Leu
1 5 10 15
Ser Gln Val Gly Asn Thr Arg Ile Lys Ala Val Val Lys Asn Thr Gly
20 25 30
Ser Glu Asp Val Thr Phe Val His Leu Asn Phe Phe Lys Asp Ala Ala
35 40 45
Pro Val Gln Lys Val Ser Leu Phe Arg Asn Ala Thr Glu Val Gln Phe
50 55 60
Gln Gly Ile Lys Gln Arg Leu Ile Thr Glu Gly Leu Ser Asp Asp Ala
65 70 75 80
Leu Thr Thr Leu Ala Pro Gly Ala Thr Ile Glu Asp Glu Phe Asp Ile
85 90 95
Ala Ser Thr Ser Asp Leu Ser Glu Gly Gly Thr Ile Thr Ile Asn Ser
100 105 110
Asn Gly Leu Val Pro Ile Thr Thr Asp Asn Lys Val Thr Gly Tyr Ile
115 120 125
Pro Phe Thr Ser Asn Glu Leu Ser Ile Asp Val Asp Ala Ala Glu Ala
130 135 140
Ala Ser Val Thr Gln Ala Val Lys Ile Leu Glu Arg Arg Thr Arg Ile
145 150 155 160
Ser Ser Cys Ser Gly Ser Arg Gln Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg
165 170 175
Asn Ala Ala Ser Leu Ala Asn Lys Ala Ala Asp Ala Ala Gln Ser Gly
180 185 190
Ser Ala Ser Lys Phe Ser Glu Tyr Phe Lys Thr Thr Ser Ser Ser Thr
195 200 205
Arg Gln Thr Val Ala Ala Arg Leu Arg Ala Val Ala Arg Glu Ala Ser
210 215 220
Ser Ser Ser Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Tyr Cys Leu Asp Pro Phe Gly
225 230 235 240
Tyr Cys Ser Gly Asn Val Leu Ala Tyr Thr Leu Pro Ser Tyr Asn Ile
245 250 255
Ile Ala Asn Cys Pro Ile Phe Tyr Thr Tyr Leu Pro Pro Leu Thr Ser
260 265 270
Thr Cys His Ala Gln Asp Gln Ala Thr Thr Val Leu His Glu Phe Thr
275 280 285
His Ala Pro Gly Val Tyr Ser Pro Gly Thr Leu Asp Leu Ala Tyr Gly
290 295 300
Tyr Gln Ala Ala Met Gly Leu Ser Ser Ser Gln Ala Val Met Asn Ala
305 310 315 320
Asp Thr Tyr Ala Leu Tyr Ala Asn Ala Ile Tyr Leu Gly Cys Thr Arg
325 330 335
Ile Ser Ser Cys Ser Gly Ser Arg Gln Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu
340 345 350
Arg Asn Ala Ala Ser Leu Ala Asn Ala Ala Ala Asp Ala Ala Gln Ser
355 360 365
Gly Ser Ala Ser Lys Phe Ser Glu Tyr Phe Lys Thr Thr Ser Ser Ser
370 375 380
Thr Arg Gln Thr Val Ala Ala Arg Leu Arg Ala Val Ala Arg Glu Ala
385 390 395 400
Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Tyr Cys Asp Asp Pro Tyr
405 410 415
Gly Tyr Cys Ser Ser Asn Val Leu Ala Tyr Thr Leu Pro Ser Tyr Asn
420 425 430
Ile Ile Ala Asn Cys Asp Ile Phe Tyr Thr Tyr Leu Pro Ala Leu Thr
435 440 445
Ser Thr Cys His Ala Gln Asp Gln Ala Thr Thr Ala Leu His Glu Phe
450 455 460
Thr His Ala Pro Gly Val Tyr Ser Pro Gly Thr Asp Asp Leu Ala Tyr
465 470 475 480
Gly Tyr Gln Ala Ala Met Gly Leu Ser Ser Ser Gln Ala Val Met Asn
485 490 495
Ala Asp Thr Tyr Ala Leu Tyr Ala Asn Ala Ile Tyr Leu Gly Cys
500 505 510
<210> 12
<211> 550
<212> PRT
<213> 污叉丝孔菌
<400> 12
Lys Pro Thr Ala Arg Asn Leu Lys Leu His Glu Ser Arg Pro Ser Ala
1 5 10 15
Pro Asn Gly Phe Ser Leu Val Gly Ser Ala Asp Ser Asn Arg Thr Leu
20 25 30
Lys Leu Arg Leu Ala Leu Ala Glu Ser Asn Phe Ser Glu Leu Glu Arg
35 40 45
Lys Leu Tyr Asp Val Ser Thr Pro Lys Ser Ala Asn Tyr Gly Lys His
50 55 60
Leu Ser Lys Ala Glu Val Gln Gln Leu Val Ala Pro Gly Gln Asp Ser
65 70 75 80
Ile Asp Ala Val Asn Ala Trp Leu Lys Glu Asn Asp Ile Thr Ala Lys
85 90 95
Thr Ile Ser Ser Thr Gly Glu Trp Ile Ser Phe Glu Val Pro Val Ser
100 105 110
Lys Ala Asn Asp Leu Phe Asp Ala Asp Phe Ser Val Phe Lys His Asp
115 120 125
Asp Thr Gly Val Glu Ala Ile Arg Thr Leu Ser Tyr Ser Ile Pro Ala
130 135 140
Glu Leu Gln Gly His Leu Asp Leu Val His Pro Thr Val Thr Phe Pro
145 150 155 160
Asn Pro Tyr Ser His Leu Pro Val Phe Gln Ser Pro Val Lys Lys Thr
165 170 175
Ala Glu Ile Gln Asn Phe Thr Ala Gly Ala Ile Pro Ser Ser Cys Ser
180 185 190
Ser Thr Ile Thr Pro Ala Cys Leu Gln Ala Ile Tyr Asn Ile Pro Thr
195 200 205
Thr Ala Ala Thr Glu Ser Ser Asn Gln Leu Gly Val Thr Gly Phe Ile
210 215 220
Asp Gln Tyr Ala Asn Lys Lys Asp Leu Lys Thr Phe Leu Lys Lys Tyr
225 230 235 240
Arg Thr Asp Ile Ser Ser Ser Thr Thr Phe Thr Leu Gln Thr Leu Asp
245 250 255
Gly Gly Ser Asn Ser Gln Thr Gly Ser Lys Ala Gly Val Glu Ala Asn
260 265 270
Leu Asp Ile Gln Tyr Thr Val Gly Val Ala Thr Gly Val Pro Thr Thr
275 280 285
Phe Ile Ser Val Gly Asp Asp Phe Gln Asp Gly Asp Leu Glu Gly Phe
290 295 300
Leu Asp Val Ile Asn Ala Leu Leu Asp Glu Asp Ala Pro Pro Ser Val
305 310 315 320
Leu Thr Thr Ser Tyr Gly Gln Asp Glu Ser Thr Ile Ser Arg Ala Leu
325 330 335
Ala Val Lys Leu Cys Asn Ala Tyr Ala Gln Leu Gly Ala Arg Gly Val
340 345 350
Ser Ile Leu Phe Ala Ser Gly Asp Gly Gly Val Ser Gly Ser Gln Ser
355 360 365
Ala Ser Cys Ser Lys Phe Val Pro Thr Phe Pro Ser Gly Cys Pro Tyr
370 375 380
Met Thr Ser Val Gly Ala Thr Gln Gly Val Asn Pro Glu Thr Ala Ala
385 390 395 400
Asp Phe Ser Ser Gly Gly Phe Ser Asn Tyr Trp Gly Val Pro Asp Tyr
405 410 415
Gln Ser Asp Ala Val Ser Thr Tyr Leu Ser Ala Leu Gly Lys Thr Asn
420 425 430
Ser Gly Lys Tyr Asn Ala Ser Gly Arg Gly Phe Pro Asp Val Ser Thr
435 440 445
Gln Gly Val Ser Phe Glu Val Val Val Asp Gly Ser Val Glu Ala Val
450 455 460
Asp Gly Thr Ser Cys Ala Ser Pro Thr Phe Ala Ser Ile Ile Ser Leu
465 470 475 480
Val Asn Asp Lys Leu Val Ala Ala Gly Lys Ser Pro Leu Gly Phe Leu
485 490 495
Asn Pro Phe Leu Tyr Ser Asp Gly Val Ala Ala Leu Asn Asp Ile Thr
500 505 510
Ser Gly Ser Asn Pro Gly Cys Asn Thr Asn Gly Phe Pro Ala Lys Lys
515 520 525
Gly Trp Asp Pro Val Thr Gly Leu Gly Thr Pro Asp Phe Lys Lys Leu
530 535 540
Leu Thr Ala Val Gly Leu
545 550
<210> 13
<211> 353
<212> PRT
<213> 葱绿拟诺卡氏菌
<400> 13
Ala Thr Gly Ala Leu Pro Gln Ser Pro Thr Pro Glu Ala Asp Ala Val
1 5 10 15
Ser Met Gln Glu Ala Leu Gln Arg Asp Leu Asp Leu Thr Ser Ala Glu
20 25 30
Ala Glu Glu Leu Leu Ala Ala Gln Asp Thr Ala Phe Glu Val Asp Glu
35 40 45
Ala Ala Ala Glu Ala Ala Gly Asp Ala Tyr Gly Gly Ser Val Phe Asp
50 55 60
Thr Glu Ser Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Ala Ala Ala Val
65 70 75 80
Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Gly Thr Glu Leu Val Ser Tyr Gly
85 90 95
Ile Asp Gly Leu Asp Glu Ile Val Gln Glu Leu Asn Ala Ala Asp Ala
100 105 110
Val Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Val Ala Gly Asp Thr Val
115 120 125
Val Leu Glu Val Leu Glu Gly Ser Gly Ala Asp Val Ser Gly Leu Leu
130 135 140
Ala Asp Ala Gly Val Asp Ala Ser Ala Val Glu Val Thr Thr Ser Asp
145 150 155 160
Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met
165 170 175
Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln
180 185 190
Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly Thr Gln Val
195 200 205
Thr Ile Gly Asn Gly Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val Phe Pro Gly
210 215 220
Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn
225 230 235 240
Leu Val Ser Arg Tyr Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly His
245 250 255
Asn Gln Ala Pro Ile Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr
260 265 270
Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser Val Ser Tyr
275 280 285
Pro Glu Gly Thr Val Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu
290 295 300
Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln Gly
305 310 315 320
Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe
325 330 335
Tyr Gln Glu Val Thr Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu Arg
340 345 350
Thr
<210> 14
<211> 456
<212> PRT
<213> 简青霉
<400> 14
Ala Pro Ala Ser Thr Ala Lys Asp Ser Val Ser Ser Val Val Lys Asn
1 5 10 15
Gly Val Lys Tyr Thr Val Phe Glu His Ala Ala Thr Gly Ala Lys Met
20 25 30
Glu Phe Val Lys Asn Ser Gly Ile Cys Glu Thr Thr Pro Gly Val Asn
35 40 45
Gln Tyr Ser Gly Tyr Leu Ser Val Gly Ser Asn Met Asn Met Trp Phe
50 55 60
Trp Phe Phe Glu Ala Arg Asn Asn Pro Gln Gln Ala Pro Leu Ala Ala
65 70 75 80
Trp Phe Asn Gly Gly Pro Gly Cys Ser Ser Met Ile Gly Leu Phe Gln
85 90 95
Glu Asn Gly Pro Cys His Phe Val Asn Gly Asp Ser Thr Pro Ser Leu
100 105 110
Asn Glu Tyr Ser Trp Asn Asn Tyr Ala Asn Met Leu Tyr Val Asp Gln
115 120 125
Pro Ile Gly Val Gly Phe Ser Tyr Gly Thr Asp Asp Val Thr Ser Thr
130 135 140
Val Thr Ala Ala Pro Tyr Val Trp Lys Leu Leu Gln Ala Phe Tyr Ala
145 150 155 160
Gln Phe Pro Glu Tyr Glu Ser Arg Asp Phe Ala Ile Phe Thr Glu Ser
165 170 175
Tyr Gly Gly His Tyr Gly Pro Glu Phe Ala Ser Tyr Ile Gln Glu Gln
180 185 190
Asn Ser Ala Ile Lys Thr Gly Ser Ile Ser Gly Glu Asn Ile Asn Leu
195 200 205
Val Ala Leu Gly Val Asn Asn Gly Trp Ile Asp Ser Thr Ile Gln Glu
210 215 220
Lys Ala Tyr Ile Asp Phe Ser Tyr Asn Asn Ser Tyr Gln Gln Leu Ile
225 230 235 240
Asp Asp Ser Gln Arg Thr Ser Leu Leu Ser Ala Tyr Asn Ser Gln Cys
245 250 255
Leu Pro Ala Ile Gln Lys Cys Thr Lys Ser Gly Ser Asn Ser Asp Cys
260 265 270
Gln Asn Ala Asp Ser Val Cys Tyr Asn Lys Ile Glu Gly Pro Ile Ser
275 280 285
Ser Ser Gly Asp Trp Asp Val Tyr Asp Ile Arg Glu Pro Ser Asn Asp
290 295 300
Pro Tyr Pro Pro Ser Thr Tyr Ser Thr Tyr Leu Ser Asn Ala Asp Val
305 310 315 320
Val Lys Ala Ile Gly Ala Gln Ser Ser Tyr Gln Glu Cys Pro Asn Gly
325 330 335
Pro Tyr Asn Lys Phe Ala Ser Thr Gly Asp Asn Pro Arg Ser Phe Leu
340 345 350
Ser Thr Leu Ser Ser Val Val Lys Ser Gly Ile Asn Val Leu Val Trp
355 360 365
Ala Gly Asp Ala Asp Trp Ile Cys Asn Trp Leu Gly Asn Tyr Glu Val
370 375 380
Ala Asn Ala Val Asp Phe Ser Gly His Thr Glu Phe Ser Ala Lys Asp
385 390 395 400
Leu Ala Pro Tyr Thr Val Asn Gly Thr Glu Lys Gly Met Phe Lys Asn
405 410 415
Val Ala Asn Phe Ser Phe Leu Lys Val Tyr Gly Ala Gly His Glu Val
420 425 430
Pro Tyr Tyr Gln Pro Asp Thr Ala Leu Gln Val Phe Glu Gln Val Leu
435 440 445
Gln Asn Lys Pro Ile Phe Ser Thr
450 455
<210> 15
<211> 502
<212> PRT
<213> 黑曲霉
<400> 15
Leu Gln Asn Pro His Arg Arg Ala Val Pro Pro Pro Leu Ser His Arg
1 5 10 15
Ser Val Ala Ser Arg Ser Val Pro Val Glu Arg Arg Thr Thr Asp Phe
20 25 30
Glu Tyr Leu Thr Asn Lys Thr Ala Arg Phe Leu Val Asn Gly Thr Ser
35 40 45
Ile Pro Glu Val Asp Phe Asp Val Gly Glu Ser Tyr Ala Gly Leu Leu
50 55 60
Pro Asn Thr Pro Thr Gly Asn Ser Ser Leu Phe Phe Trp Phe Phe Pro
65 70 75 80
Ser Gln Asn Pro Glu Ala Ser Asp Glu Ile Thr Ile Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Gly Pro Gly Cys Ser Ser Leu Asp Gly Leu Leu Gln Glu Asn Gly Pro
100 105 110
Phe Leu Trp Gln Pro Gly Thr Tyr Lys Pro Val Pro Asn Pro Tyr Ser
115 120 125
Trp Thr Asn Leu Thr Asn Val Val Tyr Ile Asp Gln Pro Ala Gly Thr
130 135 140
Gly Phe Ser Pro Gly Pro Ser Thr Val Asn Asn Glu Glu Asp Val Ala
145 150 155 160
Ala Gln Phe Asn Ser Trp Phe Lys His Phe Val Asp Thr Phe Asp Leu
165 170 175
His Gly Arg Lys Val Tyr Ile Thr Gly Glu Ser Tyr Ala Gly Met Tyr
180 185 190
Val Pro Tyr Ile Ala Asp Ala Met Leu Asn Glu Glu Asp Thr Thr Tyr
195 200 205
Phe Asn Leu Lys Gly Ile Gln Ile Asn Asp Pro Ser Ile Asn Ser Asp
210 215 220
Ser Val Met Met Tyr Ser Pro Ala Val Arg His Leu Asn His Tyr Asn
225 230 235 240
Asn Ile Phe Gln Leu Asn Ser Thr Phe Leu Ser Tyr Ile Asn Ala Lys
245 250 255
Ala Asp Lys Cys Gly Tyr Asn Ala Phe Leu Asp Lys Ala Ile Thr Tyr
260 265 270
Pro Pro Pro Ser Pro Phe Pro Thr Ala Pro Glu Ile Thr Glu Asp Cys
275 280 285
Gln Val Trp Asp Glu Val Val Met Ala Ala Tyr Asp Ile Asn Pro Cys
290 295 300
Phe Asn Tyr Tyr His Leu Ile Asp Phe Cys Pro Tyr Leu Trp Asp Val
305 310 315 320
Leu Gly Phe Pro Ser Leu Ala Ser Gly Pro Asn Asn Tyr Phe Asn Arg
325 330 335
Ser Asp Val Gln Lys Ile Leu His Val Pro Pro Thr Asp Tyr Ser Val
340 345 350
Cys Ser Glu Thr Val Ile Phe Ala Asn Gly Asp Gly Ser Asp Pro Ser
355 360 365
Ser Trp Gly Pro Leu Pro Ser Val Ile Glu Arg Thr Asn Asn Thr Ile
370 375 380
Ile Gly His Gly Trp Leu Asp Tyr Leu Leu Phe Leu Asn Gly Ser Leu
385 390 395 400
Ala Thr Ile Gln Asn Met Thr Trp Asn Gly Lys Gln Gly Phe Gln Arg
405 410 415
Pro Pro Val Glu Pro Leu Phe Val Pro Tyr His Tyr Gly Leu Ala Glu
420 425 430
Leu Tyr Trp Gly Asp Glu Pro Asp Pro Tyr Asn Leu Asp Ala Gly Ala
435 440 445
Gly Tyr Leu Gly Thr Ala His Thr Glu Arg Gly Leu Thr Phe Ser Ser
450 455 460
Val Tyr Leu Ser Gly His Glu Ile Pro Gln Tyr Val Pro Gly Ala Ala
465 470 475 480
Tyr Arg Gln Leu Glu Phe Leu Leu Gly Arg Ile Ser Ser Leu Ser Ala
485 490 495
Lys Gly Asn Tyr Thr Ser
500
<210> 16
<211> 547
<212> PRT
<213> 大型亚灰树花菌
<400> 16
Thr Pro Thr Gly Arg Asn Leu Lys Leu His Glu Ala Arg Glu Asp Leu
1 5 10 15
Pro Ala Gly Phe Ser Leu Arg Gly Ala Ala Ser Pro Asp Thr Thr Leu
20 25 30
Lys Leu Arg Ile Ala Leu Val Gln Asn Asn Phe Ala Glu Leu Glu Asp
35 40 45
Lys Leu Tyr Asp Val Ser Thr Pro Ser Ser Ala Asn Tyr Gly Asn His
50 55 60
Leu Ser Lys Glu Glu Val Glu Gln Tyr Ile Ala Pro Ala Pro Glu Ser
65 70 75 80
Val Lys Ala Val Asn Ala Trp Leu Thr Glu Asn Gly Leu Asp Ala His
85 90 95
Thr Ile Ser Pro Ala Gly Asp Trp Leu Ala Phe Glu Val Pro Val Ser
100 105 110
Lys Ala Asn Glu Leu Phe Asp Ala Asp Phe Ser Val Phe Thr His Asp
115 120 125
Glu Ser Gly Leu Glu Ala Ile Arg Thr Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Ala
130 135 140
Glu Leu Gln Gly His Leu Asp Leu Val His Pro Thr Val Thr Phe Pro
145 150 155 160
Asn Pro Asn Ala His Leu Pro Val Val Arg Ser Thr Gln Pro Ile Arg
165 170 175
Asn Leu Thr Gly Arg Ala Ile Pro Ala Ser Cys Ala Ser Thr Ile Thr
180 185 190
Pro Ala Cys Leu Gln Ala Ile Tyr Gly Ile Pro Thr Thr Lys Ala Thr
195 200 205
Gln Ser Ser Asn Lys Leu Ala Val Ser Gly Phe Ile Asp Gln Phe Ala
210 215 220
Asn Lys Ala Asp Leu Lys Ser Phe Leu Ala Gln Phe Arg Lys Asp Ile
225 230 235 240
Ser Ser Ser Thr Thr Phe Ser Leu Gln Thr Leu Asp Gly Gly Glu Asn
245 250 255
Asp Gln Ser Pro Ser Glu Ala Gly Ile Glu Ala Asn Leu Asp Ile Gln
260 265 270
Tyr Thr Val Gly Leu Ala Thr Gly Val Pro Thr Thr Phe Ile Ser Val
275 280 285
Gly Asp Asp Phe Gln Asp Gly Asn Leu Glu Gly Phe Leu Asp Ile Ile
290 295 300
Asn Phe Leu Leu Gly Glu Ser Asn Pro Pro Gln Val Leu Thr Thr Ser
305 310 315 320
Tyr Gly Gln Asn Glu Asn Thr Ile Ser Ala Lys Leu Ala Asn Gln Leu
325 330 335
Cys Asn Ala Tyr Ala Gln Leu Gly Ala Arg Gly Thr Ser Ile Leu Phe
340 345 350
Ala Ser Gly Asp Gly Gly Val Ser Gly Ser Gln Ser Ala His Cys Ser
355 360 365
Asn Phe Val Pro Thr Phe Pro Ser Gly Cys Pro Phe Met Thr Ser Val
370 375 380
Gly Ala Thr Gln Gly Val Ser Pro Glu Thr Ala Ala Ala Phe Ser Ser
385 390 395 400
Gly Gly Phe Ser Asn Val Phe Gly Ile Pro Ser Tyr Gln Ala Ser Ala
405 410 415
Val Ser Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Gly Ser Thr Asn Ser Gly Lys Phe
420 425 430
Asn Arg Ser Gly Arg Gly Phe Pro Asp Val Ser Thr Gln Gly Val Asp
435 440 445
Phe Gln Ile Val Ser Gly Gly Gln Thr Ile Gly Val Asp Gly Thr Ser
450 455 460
Cys Ala Ser Pro Thr Phe Ala Ser Val Ile Ser Leu Val Asn Asp Arg
465 470 475 480
Leu Ile Ala Ala Gly Lys Ser Pro Leu Gly Phe Leu Asn Pro Phe Leu
485 490 495
Tyr Ser Ser Ala Gly Lys Ala Ala Leu Asn Asp Val Thr Ser Gly Ser
500 505 510
Asn Pro Gly Cys Ser Thr Asn Gly Phe Pro Ala Lys Ala Gly Trp Asp
515 520 525
Pro Val Thr Gly Leu Gly Thr Pro Asn Phe Ala Lys Leu Leu Thr Ala
530 535 540
Val Gly Leu
545
<210> 17
<211> 541
<212> PRT
<213> 轮枝菌属物种
<400> 17
Ala Pro Ala Pro His Gly Pro Leu Val Lys Phe Gly Glu Ile Thr Lys
1 5 10 15
Leu Pro Ser Lys Trp Ile Ala Thr Gly Ala Ala Asp Ser Asp Ala Val
20 25 30
Ile Lys Ala Gln Ile Gly Ile Lys Gln Asn Asn Ile Lys Gly Leu Gln
35 40 45
Asp Lys Leu Ala Asp Ile Ala Asp Pro Asn Ser Pro Asn Tyr Gly Gln
50 55 60
Trp Leu Ser Lys Glu Glu Val Asp Lys Tyr Ser Ala Pro Ala Ala Ala
65 70 75 80
Asp Val Ala Ala Val Lys Ala Trp Leu Ala Ser Ser Gly Ile Thr Asp
85 90 95
Val Thr Met Pro Thr Asn Asp Trp Ile Glu Phe Ser Val Pro Val Ser
100 105 110
Lys Met Glu Ser Leu Leu Gly Ser Lys Tyr Glu Trp Phe Val His Leu
115 120 125
Glu Thr Gly Glu Lys Val Pro Arg Thr Lys Gln Phe Ser Val Pro Gln
130 135 140
Asn Leu His Asp Leu Ile Asp Val Val Thr Pro Thr Thr Val Leu Tyr
145 150 155 160
His Asn Met Gly Pro His Ala His Ala Ser Pro Gln Ala Ala Asp Ala
165 170 175
Ser Gly Leu Thr Ser Pro Ala Ser Ile Lys Ser Ala Tyr Asn Val Asp
180 185 190
Tyr Lys Gly Thr Gly Asn Thr Leu Val Gly Thr Thr Gly Phe Leu Gly
195 200 205
Val Gly Ala Ser His Gln Asp Tyr Ala Asn Phe Ala Arg Gln Phe Ser
210 215 220
Pro Gly Leu Thr Asp Phe Lys Asp Val Ser Ile Asn Gly Gly Ser Asn
225 230 235 240
Ser Gly Asp Gly Ser Ala Leu Glu Gly Asn Leu Asp Thr Gln Tyr Cys
245 250 255
Gly Ala Leu Ala Ala Pro Asn Pro Ser Glu Tyr Leu Ala His Ala Pro
260 265 270
Glu Gly Ser Asp Gly Ser Ser Phe Asn Asp Ala Met Leu Ala Phe Gly
275 280 285
Asn Tyr Leu Asn Ala Asn Ser Asn Pro Pro Ser Ala Val Ser Thr Ser
290 295 300
Tyr Gly Gly Glu Glu Asp Gly Thr Asp Pro Asn Tyr Met Asp Arg Ile
305 310 315 320
Cys Asn Glu Phe Met Lys Ala Gly Ser Arg Gly Val Ser Ile Phe Phe
325 330 335
Ser Ser Gly Asp Asn Gly Val Gly Gly Asn Gly Glu Ser Ser Cys Tyr
340 345 350
Asn Gly Tyr Tyr Pro Leu Trp Pro Ala Ser Cys Pro Tyr Val Thr Thr
355 360 365
Val Gly Gly Thr Glu Phe Asp Gly Ser Gly Arg Glu Val Val Ala Asn
370 375 380
Phe Glu Gln Tyr Asn Lys Asn Val Lys Ser Pro Gly Gly Gly Phe Ser
385 390 395 400
Asn His Phe Pro Ala Pro Ser Tyr Asn Lys Asn Val Thr Thr Ala Tyr
405 410 415
Ala Asn Ser Leu Ser Ala Ala Gln Lys Gln Arg Leu Asn Pro Asn Gly
420 425 430
Arg Gly Phe Pro Asp Ile Ala Leu Val Ser Val Lys Tyr Gln Val Asn
435 440 445
Val Asn Gly Gln Ile Ser Gln Val Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ser Pro
450 455 460
Ser Met Ala Gly Leu Val Gly Leu Leu Asn Asp Tyr Arg Lys Thr Gln
465 470 475 480
Gly Lys Pro Asn Leu Gly Phe Ile Asn Pro Leu Leu Tyr Ser Asp Lys
485 490 495
Val Lys Pro Ala Leu Arg Asp Val Thr Ser Gly Ala Asn Lys Gly Cys
500 505 510
Asp Ser Ser Gly Leu Pro Ala Lys Thr Gly Trp Asp Ala Ala Ser Gly
515 520 525
Leu Gly Ser Phe Asp Phe Ala Lys Leu Arg Thr Leu Val
530 535 540
<210> 18
<211> 633
<212> PRT
<213> 解蛋白篮状菌
<400> 18
Val Pro Ala Pro Ser Lys Arg His Val Val His Glu Arg Arg Asp Ala
1 5 10 15
Leu Pro His Ser Trp Ser Glu Pro Arg Arg Val Asp Gly Arg Thr Gln
20 25 30
Leu Pro Val Arg Ile Gly Leu Thr Gln Ser Asn Ile Asp Glu Ser His
35 40 45
Asp Met Leu Met Asp Ile Ala Ser Pro Ser Ser Pro Asn Tyr Arg Lys
50 55 60
Tyr Met Thr Val His Glu Val Asn Glu Leu Phe Ala Pro Ala Gly Glu
65 70 75 80
Ala Val Ser Ala Val Arg Asp Trp Leu Glu Ser Ala Gly Ile Ala Ala
85 90 95
Glu Arg Val Thr Gln Ser Ala Asn Lys Gln Trp Leu Gln Phe Asp Gly
100 105 110
Asp Ala Ala Glu Val Glu Ser Leu Leu Gly Ala Glu Tyr Tyr Ile Tyr
115 120 125
Thr His Asp Thr Asn Gly Arg Ser His Met Gly Cys Glu Lys Tyr His
130 135 140
Val Pro Glu His Ile Ser His His Ile Asp Tyr Ile Ile Pro Gly Val
145 150 155 160
Lys Ser Leu Glu Val Arg Glu Pro Gln Pro Ala Glu Leu Glu Lys Arg
165 170 175
Thr Phe Gly Phe Arg Lys Pro Gln Pro Pro Leu Phe Lys Ala Leu Pro
180 185 190
Glu Ser Leu Glu Thr Ile Ile Asn Ser Ile Leu Gly Gly Leu Leu Asp
195 200 205
Leu Cys Ser Thr Val Ile Thr Pro Ser Cys Ile Lys Thr Leu Tyr Asn
210 215 220
Ile Thr Glu Gly Thr Thr Ala Thr Lys Gly Asn Glu Leu Gly Ile Phe
225 230 235 240
Glu Asp Leu Gly Asp Tyr Tyr Ser Gln Thr Asp Leu Asp Leu Phe Phe
245 250 255
Thr Leu Phe Tyr Ser Gln Ile Pro Ala Gly Thr Gly Pro Thr Leu Lys
260 265 270
Gly Ile Asp Gly Ala Gln Ala Pro Thr Gln Thr Leu Thr Gln Ala Gly
275 280 285
Pro Glu Ser Asp Leu Asp Phe Gln Val Ser Tyr Pro Ile Ile Trp Pro
290 295 300
Gln Asn Ser Ile Leu Phe Gln Thr Asp Asp Ala Asn Tyr Glu Ala Asn
305 310 315 320
Tyr Thr Phe Asn Gly Phe Leu Asn Asn Phe Leu Asp Ala Ile Asp Gly
325 330 335
Ser Tyr Cys Thr Tyr Ser Ala Phe Gly Ile Asp Gly Asn Thr Ala Asp
340 345 350
Asp Pro Pro Tyr Pro Asp Pro Ala Ser Asn Gly Tyr Lys Gly Ser Leu
355 360 365
Gln Cys Gly Val Tyr Glu Pro Thr Asn Val Ile Ser Ile Ser Tyr Gly
370 375 380
Gly Asp Glu Ala Gly Leu Ser Val Asn Tyr Gln Lys Arg Gln Cys Asn
385 390 395 400
Glu Tyr Lys Lys Leu Gly Leu Gln Gly Val Ser Val Val Val Ser Ser
405 410 415
Gly Asp Ser Gly Val Ala Gly Ala Asp Gly Cys Leu Gly Gly Gly Lys
420 425 430
Ile Phe Asn Pro Asp Phe Pro Ala Gly Cys Pro Tyr Ile Thr Thr Val
435 440 445
Gly Ala Thr Tyr Leu Pro Ser Gly Ala Ser Ser Thr Ser Asp Ser Glu
450 455 460
Val Ala Val Ser Arg Phe Pro Ser Gly Gly Gly Phe Ser Asn Ile Tyr
465 470 475 480
Ser Gln Pro Ser Tyr Gln Ser Asp Ala Val Asn Thr Tyr Leu Thr Gln
485 490 495
His Thr Pro Pro Tyr Pro Ala Tyr Glu Thr Ser Asp Asn Ser Ser Val
500 505 510
Gly Ala Asn Gly Gly Ile Tyr Asn Lys Ala Gly Arg Gly Tyr Pro Asp
515 520 525
Val Ala Ala Val Gly Asp Asn Ile Val Ile Phe Asn Ala Gly Ala Pro
530 535 540
Thr Leu Ile Gly Gly Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ile Phe Ala Ser Ile
545 550 555 560
Leu Thr Arg Ile Asn Glu Val Leu Leu Ala Lys Lys Gly Thr Thr Val
565 570 575
Gly Phe Val Asn Pro Thr Leu Tyr Ala Asn Pro Asp Ala Phe His Asp
580 585 590
Ile Thr Ser Gly Asp Asn Pro Gly Cys Ser Thr Asn Gly Phe Ser Thr
595 600 605
Ala Pro Gly Trp Asp Pro Val Thr Gly Leu Gly Thr Pro Asn Tyr Pro
610 615 620
Ala Leu Leu Lys Val Phe Leu Gly Glu
625 630
<210> 19
<211> 371
<212> PRT
<213> 拉努马法纳青霉
<400> 19
Val Pro Thr Gly Gly Lys Lys Ser Phe Thr Val Asn Gln Val Ala Val
1 5 10 15
Ser Ala Thr Lys Thr Gln Asn Phe Ala Asn Asn Tyr Ala Arg Ala Leu
20 25 30
Ala Lys Tyr Gly Ala Lys Val Pro Thr His Val Gln Ala Ala Ala Gln
35 40 45
Gln Ser Gly Ser Ala Thr Thr Thr Pro Glu Ser Asp Asp Glu Glu Tyr
50 55 60
Leu Thr Pro Val Asn Val Gly Gly Thr Thr Leu Asn Leu Asp Phe Asp
65 70 75 80
Thr Gly Ser Ala Asp Leu Trp Val Phe Ser Ser Glu Leu Pro Ala Ser
85 90 95
Glu Gln Thr Gly His Ser Leu Tyr Lys Pro Asn Asn Gly Thr Lys Leu
100 105 110
Ser Gly Tyr Thr Trp Ser Ile Ser Tyr Gly Asp Gly Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Gly Asp Val Tyr Arg Asp Thr Val Ser Val Gly Gly Val Lys Ala Thr
130 135 140
Gly Gln Ala Val Glu Ala Ala Ser Thr Ile Ser Gln Gln Phe Thr Gln
145 150 155 160
Asp Gln Asn Asn Asp Gly Leu Leu Gly Leu Ala Phe Ser Ser Ile Asn
165 170 175
Thr Val Lys Pro Lys Ser Gln Thr Thr Phe Phe Asp Thr Val Lys Ser
180 185 190
Thr Leu Ala Ser Pro Leu Phe Ala Val Ser Leu Lys His Asn Ala Pro
195 200 205
Gly Ser Tyr Asp Phe Gly Phe Ile Asp Lys Ser Lys Tyr Thr Gly Ser
210 215 220
Leu Thr Tyr Thr Asp Val Asp Ser Ser Gln Gly Phe Trp Gly Phe Thr
225 230 235 240
Ala Asp Ser Tyr Lys Ile Gly Ser Thr Thr Gly Ser Ser Ile Lys Gly
245 250 255
Ile Ala Asp Thr Gly Thr Thr Leu Leu Leu Leu Asp Asp Glu Val Val
260 265 270
Ser Ala Tyr Tyr Lys Gln Val Ser Gly Ala Ala Ser Asp Ser Ser Ala
275 280 285
Gly Gly Tyr Thr Phe Asp Cys Ser Ser Thr Leu Pro Asp Phe Thr Val
290 295 300
Ser Ile Ser Gly Tyr Asp Ala Val Val Pro Gly Ser Leu Ile Asn Tyr
305 310 315 320
Thr Pro Val Ser Gln Gly Ser Ser Lys Cys Leu Gly Gly Ile Gln Ser
325 330 335
Asn Ser Gly Leu Gly Phe Ser Ile Phe Gly Asp Ile Phe Leu Lys Ser
340 345 350
Gln Tyr Val Val Phe Asp Ser Asn Gly Pro Arg Leu Gly Phe Ala Ala
355 360 365
Gln Ser Ser
370
<210> 20
<211> 578
<212> PRT
<213> 米曲霉
<400> 20
Glu Ala Phe Glu Lys Leu Ser Ala Val Pro Lys Gly Trp His Tyr Ser
1 5 10 15
Ser Thr Pro Lys Gly Asn Thr Glu Val Cys Leu Lys Ile Ala Leu Ala
20 25 30
Gln Lys Asp Ala Ala Gly Phe Glu Lys Thr Val Leu Glu Met Ser Asp
35 40 45
Pro Asp His Pro Ser Tyr Gly Gln His Phe Thr Thr His Asp Glu Met
50 55 60
Lys Arg Met Leu Leu Pro Arg Asp Asp Thr Val Asp Ala Val Arg Gln
65 70 75 80
Trp Leu Glu Asn Gly Gly Val Thr Asp Phe Thr Gln Asp Ala Asp Trp
85 90 95
Ile Asn Phe Cys Thr Thr Val Asp Thr Ala Asn Lys Leu Leu Asn Ala
100 105 110
Gln Phe Lys Trp Tyr Val Ser Asp Val Lys His Ile Arg Arg Leu Arg
115 120 125
Thr Leu Gln Tyr Asp Val Pro Glu Ser Val Thr Pro His Ile Asn Thr
130 135 140
Ile Gln Pro Thr Thr Arg Phe Gly Lys Ile Ser Pro Lys Lys Ala Val
145 150 155 160
Thr His Ser Lys Pro Ser Gln Leu Asp Val Thr Ala Leu Ala Ala Ala
165 170 175
Val Val Ala Lys Asn Ile Ser His Cys Asp Ser Ile Ile Thr Pro Thr
180 185 190
Cys Leu Lys Glu Leu Tyr Asn Ile Gly Asp Tyr Gln Ala Asp Ala Asn
195 200 205
Ser Gly Ser Lys Ile Ala Phe Ala Ser Tyr Leu Glu Glu Tyr Ala Arg
210 215 220
Tyr Ala Asp Leu Glu Asn Phe Glu Asn Tyr Leu Ala Pro Trp Ala Lys
225 230 235 240
Gly Gln Asn Phe Ser Val Thr Thr Phe Asn Gly Gly Leu Asn Asp Gln
245 250 255
Asn Ser Ser Ser Asp Ser Gly Glu Ala Asn Leu Asp Leu Gln Tyr Ile
260 265 270
Leu Gly Val Ser Ala Pro Leu Pro Val Thr Glu Phe Ser Thr Gly Gly
275 280 285
Arg Gly Pro Leu Val Pro Asp Leu Thr Gln Pro Asp Pro Asn Ser Asn
290 295 300
Ser Asn Glu Pro Tyr Leu Glu Phe Phe Gln Asn Val Leu Lys Leu Asp
305 310 315 320
Gln Lys Asp Leu Pro Gln Val Ile Ser Thr Ser Tyr Gly Glu Asn Glu
325 330 335
Gln Glu Ile Pro Glu Lys Tyr Ala Arg Thr Val Cys Asn Leu Ile Ala
340 345 350
Gln Leu Gly Ser Arg Gly Val Ser Val Leu Phe Ser Ser Gly Asp Ser
355 360 365
Gly Val Gly Glu Gly Cys Met Thr Asn Asp Gly Thr Asn Arg Thr His
370 375 380
Phe Pro Pro Gln Phe Pro Ala Ala Cys Pro Trp Val Thr Ser Val Gly
385 390 395 400
Ala Thr Phe Lys Thr Thr Pro Glu Arg Gly Thr Tyr Phe Ser Ser Gly
405 410 415
Gly Phe Ser Asp Tyr Trp Pro Arg Pro Glu Trp Gln Asp Glu Ala Val
420 425 430
Ser Ser Tyr Leu Glu Thr Ile Gly Asp Thr Phe Lys Gly Leu Tyr Asn
435 440 445
Ser Ser Gly Arg Ala Phe Pro Asp Val Ala Ala Gln Gly Met Asn Phe
450 455 460
Ala Val Tyr Asp Lys Gly Thr Leu Gly Glu Phe Asp Gly Thr Ser Ala
465 470 475 480
Ser Ala Pro Ala Phe Ser Ala Val Ile Ala Leu Leu Asn Asp Ala Arg
485 490 495
Leu Arg Ala Gly Lys Pro Thr Leu Gly Phe Leu Asn Pro Trp Leu Tyr
500 505 510
Lys Thr Gly Arg Gln Gly Leu Gln Asp Ile Thr Leu Gly Ala Ser Ile
515 520 525
Gly Cys Thr Gly Arg Ala Arg Phe Gly Gly Ala Pro Asp Gly Gly Pro
530 535 540
Val Val Pro Tyr Ala Ser Trp Asn Ala Thr Gln Gly Trp Asp Pro Val
545 550 555 560
Thr Gly Leu Gly Thr Pro Asp Phe Ala Glu Leu Lys Lys Leu Ala Leu
565 570 575
Gly Asn
<210> 21
<211> 456
<212> PRT
<213> 利亚尼篮状菌
<400> 21
Ala Pro Ala Ser Thr Thr Lys Asp Asn Val Ser Ser Val Val Lys Asn
1 5 10 15
Gly Val Thr Tyr Thr Val Phe Glu His Ala Ala Thr Gly Ala Lys Met
20 25 30
Glu Phe Val Lys Asn Ser Gly Ile Cys Glu Thr Thr Pro Gly Val Asn
35 40 45
Gln Tyr Ser Gly Tyr Leu Ser Val Gly Asn Asn Met Asn Met Trp Phe
50 55 60
Trp Phe Phe Glu Ala Arg Asn Asn Pro Gln Thr Ala Pro Leu Ala Ala
65 70 75 80
Trp Phe Asn Gly Gly Pro Gly Cys Ser Ser Met Ile Gly Leu Phe Gln
85 90 95
Glu Asn Gly Pro Cys His Phe Val Asn Gly Ala Ser Thr Pro Ser Leu
100 105 110
Asn Glu Tyr Ser Trp Asn Asn Tyr Ala Asn Met Leu Tyr Val Asp Gln
115 120 125
Pro Ile Gly Val Gly Phe Ser Tyr Gly Thr Asp Asp Val Thr Ser Thr
130 135 140
Val Thr Ala Ala Pro Tyr Val Trp Lys Leu Leu Gln Ala Phe Tyr Ala
145 150 155 160
Gln Phe Pro Glu Tyr Gln Ser Arg Asp Phe Ala Ile Phe Thr Glu Ser
165 170 175
Tyr Gly Gly His Tyr Gly Pro Glu Phe Ala Ala Tyr Ile Gln Glu Gln
180 185 190
Asn Ser Gly Ile Ala Ala Gly Ser Val Ser Gly Glu Asn Ile Asn Leu
195 200 205
Ile Ala Leu Gly Val Asn Asn Gly Trp Ile Asp Pro Ala Ile Gln Glu
210 215 220
Lys Ala Tyr Ile Asp Phe Ser Tyr Asn Asn Ser Tyr Gln Gln Leu Ile
225 230 235 240
Asp Asp Ser Gln Arg Thr Asn Leu Leu Ser Asp Tyr Asn Asp Gln Cys
245 250 255
Leu Pro Ala Ile Gln Gln Cys Ala Gln Thr Gly Arg Asn Ser Asp Cys
260 265 270
Gln Asn Ala Asp Asn Val Cys Tyr Asp Thr Ile Glu Gly Pro Ile Ser
275 280 285
Ser Ser Gly Asn Trp Asp Val Tyr Asp Ile Arg Glu Pro Ser Asn Asp
290 295 300
Pro Tyr Pro Pro Ser Thr Tyr Ser Ser Tyr Leu Ser Asn Ser Arg Val
305 310 315 320
Val Lys Ala Ile Gly Ala Gln Thr Ser Tyr Gln Glu Cys Pro Asn Gly
325 330 335
Pro Tyr Asn Lys Phe Ala Ser Thr Gly Asp Asn Pro Arg Ser Phe Leu
340 345 350
Ser Thr Leu Ser Ser Val Val Gln Ser Gly Ile His Val Leu Val Trp
355 360 365
Ala Gly Asp Ala Asp Trp Ile Cys Asn Trp Leu Gly Asn Tyr Arg Val
370 375 380
Ala Asn Ala Val Asp Phe Pro Gly His Ala Glu Phe Ser Ala Lys Ala
385 390 395 400
Leu Ala Pro Tyr Thr Val Asn Gly Thr Glu Lys Gly Met Phe Lys Asn
405 410 415
Val Asp Asn Phe Ser Phe Leu Lys Val Tyr Gly Ala Gly His Glu Val
420 425 430
Pro Tyr Tyr Gln Pro Ala Thr Ala Leu Gln Val Phe Glu Gln Ile Leu
435 440 445
Gln Asn Lys Ser Ile Thr Ser Thr
450 455
<210> 22
<211> 589
<212> PRT
<213> 嗜热嗜热子囊菌
<400> 22
Glu Val Phe Glu Arg Leu Arg Ala Val Pro Glu Gly Trp Arg Phe Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Ser Asp Asp Gln Pro Ile Arg Leu Gln Ile Ala Leu Gln
20 25 30
Gln His Asp Val Glu Gly Phe Glu Arg Ala Val Leu Asp Met Ser Thr
35 40 45
Pro Ser Ser Pro Asn Tyr Gly Lys His Phe Gln Ser His Asp Glu Met
50 55 60
Lys Arg Met Leu Leu Pro Ser Asp Asp Ala Val Asp Ala Val Leu Asp
65 70 75 80
Trp Leu Gln Ser Ala Gly Ile Thr Asp Ile Glu Glu Asp Ala Asp Trp
85 90 95
Ile Asn Phe Arg Thr Thr Val Gly Val Ala Asn Glu Leu Leu Asp Thr
100 105 110
Gln Phe Gln Trp Phe Val Ser Glu Thr Ser Ser His Val Arg Arg Leu
115 120 125
Arg Ala Leu Glu Tyr Ser Ile Pro Glu Ser Val Thr Pro His Ile His
130 135 140
Met Val Gln Pro Thr Thr Arg Phe Gly Gln Ile Gly Arg His His Thr
145 150 155 160
Thr Ser Arg Glu Lys Pro Ile Val Ser Gly Ala Asp Ile His Ala Ser
165 170 175
Ile Ala Gly Ala Asn Asn Gln Thr Thr Gly Thr Asp Cys Asn Thr Glu
180 185 190
Ile Thr Pro Lys Cys Leu Gln Asp Leu Tyr Lys Phe Gly Gly Tyr Lys
195 200 205
Ala Ser Ala Asn Ser Gly Ser Lys Val Gly Phe Cys Ser Tyr Leu Glu
210 215 220
Glu Tyr Ala Arg Tyr Asp Asp Leu Ala Leu Phe Glu Glu Ala Leu Ala
225 230 235 240
Pro Tyr Ala Ala Gly Gln Asn Phe Ser Val Ile Thr Tyr Asn Gly Gly
245 250 255
Leu Asn Asp Gln His Ser Ser Ser Asp Ser Gly Glu Ala Asn Leu Asp
260 265 270
Leu Gln Tyr Ile Val Gly Val Ser Ala Pro Leu Pro Val Thr Glu Phe
275 280 285
Ser Thr Gly Gly Arg Gly Glu Leu Val Pro Asp Leu Asp Gln Pro Asn
290 295 300
Pro Ala Asp Asn Ser Asn Glu Pro Tyr Leu Asp Phe Leu Gln Asn Val
305 310 315 320
Leu Lys Leu Asp Gln Lys Asp Leu Pro Gln Val Ile Ser Thr Ser Tyr
325 330 335
Gly Glu Asn Glu Gln Ser Val Pro Glu Lys Tyr Ala Arg Ser Val Cys
340 345 350
Asn Leu Phe Met Gln Leu Gly Ser Arg Gly Val Ser Val Ile Phe Ser
355 360 365
Ser Gly Asp Ser Gly Val Gly Ser Ala Cys Leu Thr Asn Asp Gly Lys
370 375 380
Asn Gln Thr Arg Phe Met Pro Gln Phe Pro Ala Ser Cys Pro Trp Val
385 390 395 400
Thr Ser Val Gly Ser Thr Gln His Ile Ala Pro Glu Glu Ala Thr Tyr
405 410 415
Phe Ser Ser Gly Gly Phe Ser Asp Leu Trp Pro Met Pro Asp Tyr Gln
420 425 430
Lys Ser Ala Val Gly Glu Tyr Leu Asp Arg Leu Gly Ser Lys Trp Ala
435 440 445
Gly Leu Tyr Asn Pro Gln Gly Arg Gly Phe Pro Asp Val Ala Ala Gln
450 455 460
Gly Val Asn Phe Asn Val Tyr Asp Lys Gly Ser Leu Lys Arg Phe Asp
465 470 475 480
Gly Thr Ser Cys Ser Ala Pro Thr Phe Ala Gly Val Ile Ala Leu Leu
485 490 495
Asn Asp Ala Arg Leu Arg Ala Arg Gln Pro Pro Met Gly Phe Leu Asn
500 505 510
Pro Trp Leu Tyr Gly Ala Gly Lys Gly Gly Leu Asn Asp Ile Val Asn
515 520 525
Gly Gly Ser Thr Gly Cys Asp Gly Asn Ala Arg Phe Gly Gly Ala Pro
530 535 540
Asn Gly Ser Pro Val Val Pro Phe Ala Ser Trp Asn Ala Thr Gln Gly
545 550 555 560
Trp Asp Pro Val Ser Gly Leu Gly Thr Pro Asp Phe Ser Arg Leu Leu
565 570 575
Lys Leu Ala Val Pro Ser Arg Val Gly Gly Arg Leu Ala
580 585
<210> 23
<211> 413
<212> PRT
<213> 强烈火球菌
<400> 23
Ala Glu Leu Glu Gly Leu Asp Glu Ser Ala Ala Gln Val Met Ala Thr
1 5 10 15
Tyr Val Trp Asn Leu Gly Tyr Asp Gly Ser Gly Ile Thr Ile Gly Ile
20 25 30
Ile Asp Thr Gly Ile Asp Ala Ser His Pro Asp Leu Gln Gly Lys Val
35 40 45
Ile Gly Trp Val Asp Phe Val Asn Gly Arg Ser Tyr Pro Tyr Asp Asp
50 55 60
His Gly His Gly Thr His Val Ala Ser Ile Ala Ala Gly Thr Gly Ala
65 70 75 80
Ala Ser Asn Gly Lys Tyr Lys Gly Met Ala Pro Gly Ala Lys Leu Ala
85 90 95
Gly Ile Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser Gly Ser Ile Ser Thr Ile
100 105 110
Ile Lys Gly Val Glu Trp Ala Val Asp Asn Lys Asp Lys Tyr Gly Ile
115 120 125
Lys Val Ile Asn Leu Ser Leu Gly Ser Ser Gln Ser Ser Asp Gly Thr
130 135 140
Asp Ala Leu Ser Gln Ala Val Asn Ala Ala Trp Asp Ala Gly Leu Val
145 150 155 160
Val Val Val Ala Ala Gly Asn Ser Gly Pro Asn Lys Tyr Thr Ile Gly
165 170 175
Ser Pro Ala Ala Ala Ser Lys Val Ile Thr Val Gly Ala Val Asp Lys
180 185 190
Tyr Asp Val Ile Thr Ser Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Ala Asp Gly
195 200 205
Arg Leu Lys Pro Glu Val Val Ala Pro Gly Asn Trp Ile Ile Ala Ala
210 215 220
Arg Ala Ser Gly Thr Ser Met Gly Gln Pro Ile Asn Asp Tyr Tyr Thr
225 230 235 240
Ala Ala Pro Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ile Ala
245 250 255
Ala Leu Leu Leu Gln Ala His Pro Ser Trp Thr Pro Asp Lys Val Lys
260 265 270
Thr Ala Leu Ile Glu Thr Ala Asp Ile Val Lys Pro Asp Glu Ile Ala
275 280 285
Asp Ile Ala Tyr Gly Ala Gly Arg Val Asn Ala Tyr Lys Ala Ile Asn
290 295 300
Tyr Asp Asn Tyr Ala Lys Leu Val Phe Thr Gly Tyr Val Ala Asn Lys
305 310 315 320
Gly Ser Gln Thr His Gln Phe Val Ile Ser Gly Ala Ser Phe Val Thr
325 330 335
Ala Thr Leu Tyr Trp Asp Asn Ala Asn Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Leu
340 345 350
Tyr Asp Pro Asn Gly Asn Gln Val Asp Tyr Ser Tyr Thr Ala Tyr Tyr
355 360 365
Asp Phe Glu Lys Val Gly Tyr Tyr Asn Pro Thr Asp Gly Thr Trp Thr
370 375 380
Ile Lys Val Val Ser Tyr Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Gln Val Asp Val
385 390 395 400
Val Ser Asp Gly Ser Leu Ser Gln Pro Gly Ser Ser Pro
405 410
<210> 24
<211> 387
<212> PRT
<213> 里氏木霉
<400> 24
Leu Pro Thr Glu Gly Gln Lys Thr Ala Ser Val Glu Val Gln Tyr Asn
1 5 10 15
Lys Asn Tyr Val Pro His Gly Pro Thr Ala Leu Phe Lys Ala Lys Arg
20 25 30
Lys Tyr Gly Ala Pro Ile Ser Asp Asn Leu Lys Ser Leu Val Ala Ala
35 40 45
Arg Gln Ala Lys Gln Ala Leu Ala Lys Arg Gln Thr Gly Ser Ala Pro
50 55 60
Asn His Pro Ser Asp Ser Ala Asp Ser Glu Tyr Ile Thr Ser Val Ser
65 70 75 80
Ile Gly Thr Pro Ala Gln Val Leu Pro Leu Asp Phe Asp Thr Gly Ser
85 90 95
Ser Asp Leu Trp Val Phe Ser Ser Glu Thr Pro Lys Ser Ser Ala Thr
100 105 110
Gly His Ala Ile Tyr Thr Pro Ser Lys Ser Ser Thr Ser Lys Lys Val
115 120 125
Ser Gly Ala Ser Trp Ser Ile Ser Tyr Gly Asp Gly Ser Ser Ser Ser
130 135 140
Gly Asp Val Tyr Thr Asp Lys Val Thr Ile Gly Gly Phe Ser Val Asn
145 150 155 160
Thr Gln Gly Val Glu Ser Ala Thr Arg Val Ser Thr Glu Phe Val Gln
165 170 175
Asp Thr Val Ile Ser Gly Leu Val Gly Leu Ala Phe Asp Ser Gly Asn
180 185 190
Gln Val Arg Pro His Pro Gln Lys Thr Trp Phe Ser Asn Ala Ala Ser
195 200 205
Ser Leu Ala Glu Pro Leu Phe Thr Ala Asp Leu Arg His Gly Gln Asn
210 215 220
Gly Ser Tyr Asn Phe Gly Tyr Ile Asp Thr Ser Val Ala Lys Gly Pro
225 230 235 240
Val Ala Tyr Thr Pro Val Asp Asn Ser Gln Gly Phe Trp Glu Phe Thr
245 250 255
Ala Ser Gly Tyr Ser Val Gly Gly Gly Lys Leu Asn Arg Asn Ser Ile
260 265 270
Asp Gly Ile Ala Asp Thr Gly Thr Thr Leu Leu Leu Leu Asp Asp Asn
275 280 285
Val Val Asp Ala Tyr Tyr Ala Asn Val Gln Ser Ala Gln Tyr Asp Asn
290 295 300
Gln Gln Glu Gly Val Val Phe Asp Cys Asp Glu Asp Leu Pro Ser Phe
305 310 315 320
Ser Phe Gly Val Gly Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro Gly Asp Leu Leu
325 330 335
Asn Leu Thr Pro Leu Glu Glu Gly Ser Ser Thr Cys Phe Gly Gly Leu
340 345 350
Gln Ser Ser Ser Gly Ile Gly Ile Asn Ile Phe Gly Asp Val Ala Leu
355 360 365
Lys Ala Ala Leu Val Val Phe Asp Leu Gly Asn Glu Arg Leu Gly Trp
370 375 380
Ala Gln Lys
385
<210> 25
<211> 408
<212> PRT
<213> 米黑根毛霉
<400> 25
Arg Pro Val Ser Lys Gln Ser Glu Ser Lys Asp Lys Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Pro Leu Thr Ser Val Ser Arg Lys Phe Ser Gln Thr Lys Phe Gly Gln
20 25 30
Gln Gln Leu Ala Glu Lys Leu Ala Gly Leu Lys Pro Phe Ser Glu Ala
35 40 45
Ala Ala Asp Gly Ser Val Asp Thr Pro Gly Tyr Tyr Asp Phe Asp Leu
50 55 60
Glu Glu Tyr Ala Ile Pro Val Ser Ile Gly Thr Pro Gly Gln Asp Phe
65 70 75 80
Leu Leu Leu Phe Asp Thr Gly Ser Ser Asp Thr Trp Val Pro His Lys
85 90 95
Gly Cys Thr Lys Ser Glu Gly Cys Val Gly Ser Arg Phe Phe Asp Pro
100 105 110
Ser Ala Ser Ser Thr Phe Lys Ala Thr Asn Tyr Asn Leu Asn Ile Thr
115 120 125
Tyr Gly Thr Gly Gly Ala Asn Gly Leu Tyr Phe Glu Asp Ser Ile Ala
130 135 140
Ile Gly Asp Ile Thr Val Thr Lys Gln Ile Leu Ala Tyr Val Asp Asn
145 150 155 160
Val Arg Gly Pro Thr Ala Glu Gln Ser Pro Asn Ala Asp Ile Phe Leu
165 170 175
Asp Gly Leu Phe Gly Ala Ala Tyr Pro Asp Asn Thr Ala Met Glu Ala
180 185 190
Glu Tyr Gly Ser Thr Tyr Asn Thr Val His Val Asn Leu Tyr Lys Gln
195 200 205
Gly Leu Ile Ser Ser Pro Leu Phe Ser Val Tyr Met Asn Thr Asn Ser
210 215 220
Gly Thr Gly Glu Val Val Phe Gly Gly Val Asn Asn Thr Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Asp Ile Ala Tyr Thr Asp Val Met Ser Arg Tyr Gly Gly Tyr Tyr
245 250 255
Phe Trp Asp Ala Pro Val Thr Gly Ile Thr Val Asp Gly Ser Ala Ala
260 265 270
Val Arg Phe Ser Arg Pro Gln Ala Phe Thr Ile Asp Thr Gly Thr Asn
275 280 285
Phe Phe Ile Met Pro Ser Ser Ala Ala Ser Lys Ile Val Lys Ala Ala
290 295 300
Leu Pro Asp Ala Thr Glu Thr Gln Gln Gly Trp Val Val Pro Cys Ala
305 310 315 320
Ser Tyr Gln Asn Ser Lys Ser Thr Ile Ser Ile Val Met Gln Lys Ser
325 330 335
Gly Ser Ser Ser Asp Thr Ile Glu Ile Ser Val Pro Val Ser Lys Met
340 345 350
Leu Leu Pro Val Asp Gln Ser Asn Glu Thr Cys Met Phe Ile Ile Leu
355 360 365
Pro Asp Gly Gly Asn Gln Tyr Ile Val Gly Asn Leu Phe Leu Arg Phe
370 375 380
Phe Val Asn Val Tyr Asp Phe Gly Asn Asn Arg Ile Gly Phe Ala Pro
385 390 395 400
Leu Ala Ser Ala Tyr Glu Asn Glu
405
<210> 26
<211> 548
<212> PRT
<213> 桦革褶菌
<400> 26
Lys Pro Met Gly Arg Asn Leu Lys Val His Glu Ala Arg Glu Glu Ile
1 5 10 15
Pro Asp Gly Phe Ser Leu Gln Gly Ser Ala Ala Pro Asp Thr Thr Leu
20 25 30
Lys Leu Arg Ile Ala Leu Val Gln Ser Asn Phe Ala Glu Leu Glu Gln
35 40 45
Lys Leu Tyr Asp Val Ser Thr Pro Ser Ser Pro Asn Tyr Gly Ala His
50 55 60
Leu Ser Lys Glu Glu Val Glu Gln Leu Val Ala Pro Ser Ala Asp Ser
65 70 75 80
Val Asp Ala Val Asn Ala Trp Leu Lys Glu Asn Asp Leu Ser Ala Gln
85 90 95
Thr Ile Ser Pro Ala Gly Asp Trp Leu Ala Phe Glu Val Pro Val Ser
100 105 110
Lys Ala Asn Glu Leu Phe Asp Ala Asp Phe Ser Val Phe Thr His Asp
115 120 125
Gln Thr Gly Leu Glu Ala Ile Arg Thr Met Ser Tyr Ser Ile Pro Ala
130 135 140
Glu Leu Gln Gly His Leu Asp Leu Val His Pro Thr Val Thr Phe Pro
145 150 155 160
Asn Pro Tyr Ser His Leu Pro Val Val Arg Ser Pro Ile Lys Ala Ser
165 170 175
Gln Asn Leu Thr Ser Arg Ala Thr Ile Pro Ala Ser Cys Ala Ser Thr
180 185 190
Ile Thr Pro Ala Cys Leu Gln Asp Ile Tyr Gly Ile Pro Thr Thr Lys
195 200 205
Ala Thr Gln Ser Ser Asn Lys Leu Ala Val Ser Gly Phe Ile Asp Gln
210 215 220
Phe Ala Asn Ser Ala Asp Leu Ala Thr Phe Leu Lys Lys Phe Arg Thr
225 230 235 240
Asp Ile Ser Ser Thr Thr Thr Phe Ala Leu Gln Thr Leu Asp Gly Gly
245 250 255
Ser Asn Ser Gln Ser Gly Ser Gln Ala Gly Val Glu Ala Asn Leu Asp
260 265 270
Ile Gln Tyr Thr Val Gly Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Thr Phe Ile
275 280 285
Ser Val Gly Asp Asn Phe Gln Asp Gly Asp Leu Glu Gly Phe Leu Asp
290 295 300
Ile Ile Asn Phe Leu Leu Ala Glu Ser Ala Pro Pro Gln Val Leu Thr
305 310 315 320
Thr Ser Tyr Gly Gln Asn Glu Asn Thr Ile Ser Val Lys Leu Ala Asn
325 330 335
Gln Leu Cys Asn Ala Tyr Ala Gln Leu Gly Ala Arg Gly Thr Ser Ile
340 345 350
Leu Phe Ala Ser Gly Asp Gly Gly Val Ser Gly Ser Gln Ser Ser Ser
355 360 365
Cys Ser Lys Phe Val Pro Thr Phe Pro Ser Gly Cys Pro Phe Met Thr
370 375 380
Ser Val Gly Ala Thr Gln Gly Val Asn Pro Glu Thr Ala Ala Asp Phe
385 390 395 400
Ser Ser Gly Gly Phe Ser Asn Tyr Phe Gly Ile Pro Ser Tyr Gln Ala
405 410 415
Thr Ala Val Lys Thr Tyr Leu Thr Ala Leu Gly Thr Thr Asn Ser Gly
420 425 430
Lys Phe Asn Thr Ser Gly Arg Ala Phe Pro Asp Val Ser Thr Gln Gly
435 440 445
Val Asp Phe Glu Ile Val Val Asp Gly Arg Thr Glu Gly Val Asp Gly
450 455 460
Thr Ser Cys Ala Ser Pro Thr Phe Ala Ala Ile Ile Ser Leu Val Asn
465 470 475 480
Asp Lys Leu Ile Ala Ala Gly Lys Ser Pro Leu Gly Phe Leu Asn Pro
485 490 495
Phe Leu Tyr Ser Thr Gly Ala Ser Ala Phe Thr Asp Ile Thr Ser Gly
500 505 510
Ser Asn Pro Gly Cys Asn Thr Lys Gly Phe Pro Ala Lys Ala Gly Trp
515 520 525
Asp Pro Val Thr Gly Leu Gly Thr Pro Asn Phe Ala Lys Leu Leu Ala
530 535 540
Ala Ala Gly Val
545
<210> 27
<211> 547
<212> PRT
<213> 洁丽香菇
<400> 27
Gly Pro Ala Pro Arg Asn Leu Val Leu His Glu Ser Arg Asp Gly Val
1 5 10 15
Pro Glu Gly Phe Val Lys Ser Ser Thr Ala Ser Pro Asp Thr Thr Leu
20 25 30
Lys Leu Arg Ile Ala Leu Val Gln Gly Asp Met Ala Ser Leu Glu Lys
35 40 45
Ala Leu Tyr Asp Val Ser Val Pro Ser Ser Pro Leu Tyr Gly Gln His
50 55 60
Leu Ser Lys Gln Glu Val Glu Glu Tyr Val Lys Pro Thr Gln Glu Ser
65 70 75 80
Val Asp Ala Val Asn Gln Trp Leu Ser Ser Glu Gly Ile Thr Ala Asn
85 90 95
Thr Ile Ser Pro Ala Gly Asp Trp Leu Gln Phe Ser Val Pro Val Ser
100 105 110
Lys Ala Asn Glu Met Phe Asp Ala Asp Phe Ser Val Phe Thr His Thr
115 120 125
Glu Ser Gly Gln Gln Ala Ile Arg Thr Leu Ser Tyr Ser Ile Pro Lys
130 135 140
Glu Leu Val Gly His Leu Asp Leu Val His Pro Thr Ile Thr Phe Pro
145 150 155 160
Asn Pro Tyr Ser His Leu Pro Val Val Ser Ser Pro Ala Pro Arg Asn
165 170 175
Leu Thr Ile Asp Ala Ser Val Pro Ser Ser Cys Gly Ser Thr Ile Thr
180 185 190
Pro Thr Cys Leu Gln Asp Leu Tyr Gly Ile Pro Thr Thr Ala Ala Thr
195 200 205
Gln Ser Ser Asn Lys Leu Ala Val Ser Gly Phe Ile Asp Gln Tyr Ala
210 215 220
Asn Lys Ala Asp Leu Lys Ser Phe Leu Thr Thr Tyr Arg Lys Asp Ile
225 230 235 240
Ser Ser Ser Thr Thr Phe Thr Leu Glu Thr Ile Asp Gly Gly Glu Asn
245 250 255
Pro Gln Asp Gly Ser Asp Ala Gly Val Glu Ala Asn Leu Asp Thr Gln
260 265 270
Tyr Thr Val Gly Leu Ala Thr Gly Val Pro Thr Tyr Phe Ile Ser Val
275 280 285
Gly Asp Asp Tyr Gln Asp Gly Asp Leu Glu Gly Phe Leu Asp Ile Val
290 295 300
Asn Tyr Leu Leu Ser Met Asp Gln Pro Gln Gln Val Leu Thr Thr Ser
305 310 315 320
Tyr Gly Gln Asn Glu Asn Thr Met Ser Arg Ser Leu Ala Asn Asn Leu
325 330 335
Cys Asn Ala Tyr Met Gln Leu Gly Ala Arg Gly Thr Ser Ile Leu Phe
340 345 350
Ala Ser Gly Asp Gly Gly Val Ser Gly Ser Gln Ser Gly Ser Cys Gly
355 360 365
Ser Lys Phe Val Pro Thr Phe Pro Ser Gly Cys Pro Tyr Leu Thr Ser
370 375 380
Val Gly Ala Thr Thr Gly Ile Asn Pro Glu Val Ala Ala Ser Phe Ser
385 390 395 400
Ser Gly Gly Phe Ser Asn Tyr Trp Gly Val Pro Ser Tyr Gln Gln Ser
405 410 415
Val Val Ser Ser Tyr Ile Ser Gly Leu Gly Ser Thr Asn Lys Gly Lys
420 425 430
Tyr Asn Ser Ser Gly Arg Gly Phe Pro Asp Val Ser Ala Gln Gly Glu
435 440 445
Asn Val Glu Ile Val Val Asp Gly Ser Thr Glu Gly Val Asp Gly Thr
450 455 460
Ser Cys Ser Ser Pro Ile Phe Ala Ser Ile Val Ser Leu Leu Asn Asp
465 470 475 480
Glu Leu Ile Ala Ala Gly Lys Ser Pro Leu Gly Phe Leu Asn Pro Phe
485 490 495
Leu Tyr Ser Asp Gly Ala Ser Ala Phe Asn Asp Ile Thr Ser Gly Asp
500 505 510
Asn Pro Gly Cys Asn Thr Asn Gly Phe Ser Ala Lys Ser Gly Trp Asp
515 520 525
Pro Val Thr Gly Leu Gly Thr Pro Asn Tyr Ala Lys Leu Arg Thr Ala
530 535 540
Val Gly Phe
545
<210> 28
<211> 399
<212> PRT
<213> 高温球菌属物种
<400> 28
Val Ser Ala Glu Lys Val Arg Val Ile Ile Thr Ile Asp Lys Asp Phe
1 5 10 15
Asn Glu Asn Ser Val Phe Ala Leu Gly Gly Asn Val Val Ala Arg Gly
20 25 30
Lys Val Phe Pro Ile Val Ile Ala Glu Leu Ser Pro Arg Ala Val Glu
35 40 45
Arg Leu Lys Asn Ala Lys Gly Val Val Arg Val Glu Tyr Asp Ala Glu
50 55 60
Val Gln Val Leu Lys Gly Lys Ser Pro Gly Ala Gly Lys Pro Lys Pro
65 70 75 80
Ser Gln Pro Ala Gln Thr Ile Pro Trp Gly Ile Glu Arg Ile Lys Ala
85 90 95
Pro Asp Val Trp Ser Ile Thr Asp Gly Ser Ser Ser Gly Val Ile Glu
100 105 110
Val Ala Ile Leu Asp Thr Gly Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Leu Ala
115 120 125
Ala Asn Leu Ala Trp Gly Val Ser Val Leu Arg Gly Lys Val Ser Thr
130 135 140
Lys Pro Lys Asp Tyr Lys Asp Gln Asn Gly His Gly Thr His Val Ala
145 150 155 160
Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Asp Ile Gly Val Val Gly Val Ala
165 170 175
Pro Ala Val Glu Ile Tyr Ala Val Arg Val Leu Asp Ala Ser Gly Arg
180 185 190
Gly Ser Tyr Ser Asp Ile Ile Leu Gly Ile Glu Gln Ala Leu Leu Gly
195 200 205
Pro Asp Gly Val Leu Asp Ser Asp Gly Asp Gly Ile Ile Val Gly Asp
210 215 220
Pro Asp Asp Asp Ala Ala Glu Val Ile Ser Met Ser Leu Gly Gly Leu
225 230 235 240
Ser Asp Val Gln Ala Phe His Asp Ala Ile Ile Glu Ala Tyr Asn Tyr
245 250 255
Gly Val Val Ile Val Ala Ala Ser Gly Asn Glu Gly Ala Ser Ser Pro
260 265 270
Ser Tyr Pro Ala Ala Tyr Pro Glu Val Ile Ala Val Gly Ala Thr Asp
275 280 285
Val Asn Asp Gln Val Pro Trp Trp Ser Asn Arg Gly Val Glu Val Ser
290 295 300
Ala Pro Gly Val Asp Val Leu Ser Thr Tyr Pro Asp Asp Ser Tyr Glu
305 310 315 320
Thr Leu Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ser Gly Val Val
325 330 335
Ala Leu Ile Gln Ala Ala Tyr Tyr Asn Lys Tyr Gly Ser Val Leu Pro
340 345 350
Val Gly Thr Phe Asp Asp Asn Thr Met Ser Thr Val Arg Gly Ile Leu
355 360 365
His Ile Thr Ala Asp Asp Leu Gly Ser Ser Gly Trp Asp Ala Asp Tyr
370 375 380
Gly Tyr Gly Ile Val Arg Ala Asp Leu Ala Val Gln Ala Val Asn
385 390 395
<210> 29
<211> 396
<212> PRT
<213> 高温球菌属物种
<400> 29
Glu Lys Val Arg Val Ile Ile Thr Ile Asp Lys Asp Phe Asn Glu Asn
1 5 10 15
Ser Val Phe Ala Leu Gly Gly Asn Val Val Ala Arg Gly Lys Val Phe
20 25 30
Pro Ile Val Ile Ala Glu Leu Ser Pro Arg Ala Val Glu Arg Leu Lys
35 40 45
Asn Ala Lys Gly Val Val Arg Val Glu Tyr Asp Ala Glu Val Gln Val
50 55 60
Leu Lys Gly Lys Ser Pro Gly Ala Gly Lys Pro Lys Pro Ser Gln Pro
65 70 75 80
Ala Gln Thr Ile Pro Trp Gly Ile Glu Arg Ile Lys Ala Pro Asp Val
85 90 95
Trp Ser Ile Thr Asp Gly Ser Ser Ser Gly Val Ile Glu Val Ala Ile
100 105 110
Leu Asp Thr Gly Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Leu Ala Ala Asn Leu
115 120 125
Ala Trp Gly Val Ser Val Leu Arg Gly Lys Val Ser Thr Lys Pro Lys
130 135 140
Asp Tyr Lys Asp Gln Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val
145 150 155 160
Ala Ala Leu Asn Asn Asp Ile Gly Val Val Gly Val Ala Pro Ala Val
165 170 175
Glu Ile Tyr Ala Val Arg Val Leu Asp Ala Ser Gly Arg Gly Ser Tyr
180 185 190
Ser Asp Ile Ile Leu Gly Ile Glu Gln Ala Leu Leu Gly Pro Asp Gly
195 200 205
Val Leu Asp Ser Asp Gly Asp Gly Ile Ile Val Gly Asp Pro Asp Asp
210 215 220
Asp Ala Ala Glu Val Ile Ser Met Ser Leu Gly Gly Leu Ser Asp Val
225 230 235 240
Gln Ala Phe His Asp Ala Ile Ile Glu Ala Tyr Asn Tyr Gly Val Val
245 250 255
Ile Val Ala Ala Ser Gly Asn Glu Gly Ala Ser Ser Pro Ser Tyr Pro
260 265 270
Ala Ala Tyr Pro Glu Val Ile Ala Val Gly Ala Thr Asp Val Asn Asp
275 280 285
Gln Val Pro Trp Trp Ser Asn Arg Gly Val Glu Val Ser Ala Pro Gly
290 295 300
Val Asp Val Leu Ser Thr Tyr Pro Asp Asp Ser Tyr Glu Thr Leu Ser
305 310 315 320
Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ser Gly Val Val Ala Leu Ile
325 330 335
Gln Ala Ala Tyr Tyr Asn Lys Tyr Gly Ser Val Leu Pro Val Gly Thr
340 345 350
Phe Asp Asp Asn Thr Met Ser Thr Val Arg Gly Ile Leu His Ile Thr
355 360 365
Ala Asp Asp Leu Gly Ser Ser Gly Trp Asp Ala Asp Tyr Gly Tyr Gly
370 375 380
Ile Val Arg Ala Asp Leu Ala Val Gln Ala Val Asn
385 390 395
<210> 30
<211> 572
<212> PRT
<213> 疏棉状嗜热丝孢菌
<400> 30
Ala Pro Phe Gln Val Val Glu Arg Leu Ser Ala Pro Pro Asp Gly Trp
1 5 10 15
Ile Lys Lys Glu Lys Ala Ala Pro Ser Ala Gln Ile Gln Phe Arg Leu
20 25 30
Gly Leu Pro Gln Gln Asn Ser Glu Gln Leu Glu Gln Leu Ala Leu Asn
35 40 45
Ile Ala Thr Pro Gly His Glu Leu Tyr Arg Lys His Leu Lys Arg Asp
50 55 60
Glu Ile Lys Ala Leu Val Arg Pro Leu Ala Ser Val Ser Glu Lys Val
65 70 75 80
Leu Ala Trp Leu Arg Asp Glu Gly Val Pro Glu Asp Arg Ile His Asp
85 90 95
Asp Gly Ala Trp Ile Lys Phe Thr Val Pro Val Ser Thr Ala Glu Lys
100 105 110
Leu Leu Asn Thr Glu Phe Phe Val Phe His Asn Glu Arg Thr Gly Ala
115 120 125
Glu Gln Ile Arg Thr Leu Glu Tyr Ser Val Pro Gln Asp Ile His Ser
130 135 140
Leu Val Lys Phe Ile Gln Pro Thr Thr His Phe Ser Ser Leu Gly Pro
145 150 155 160
Gln Val Arg Arg Val Val Pro Leu Asp Val Leu Pro Lys Leu Arg Ile
165 170 175
Thr Leu Glu Asp Cys Asn Lys Lys Ile Thr Pro Asp Cys Leu Lys Gln
180 185 190
Leu Tyr Lys Ile Gly Asp Tyr Val Ala Pro Glu Asp Pro Arg Asn Arg
195 200 205
Ile Gly Ile Ser Gly Tyr Leu Glu Gln Phe Ala Arg Tyr Ala Asp Phe
210 215 220
Glu Glu Phe Leu Glu Ser Tyr Ala Pro Asp Arg Thr Asp Ala Asn Phe
225 230 235 240
Thr Val Val Ser Ile Asn Gly Gly Arg Asn Asp Gln Asn Ser Thr Leu
245 250 255
Asp Ser Thr Glu Ala Ser Leu Asp Ile Asp Tyr Ala Val Thr Leu Ser
260 265 270
Tyr Lys Thr Gln Ala Val Tyr Tyr Thr Thr Ala Gly Arg Gly Pro Leu
275 280 285
Val Pro Asp Glu Ser Gln Pro Asp Pro Asn Glu Val Ser Asn Glu Pro
290 295 300
Tyr Met Glu Gln Leu Gln Phe Leu Leu Asp Leu Pro Asp Glu Glu Leu
305 310 315 320
Pro Thr Val Leu Thr Thr Ser Tyr Gly Glu Asn Glu Gln Ser Leu Pro
325 330 335
Gly Ser Tyr Ala Asp Glu Thr Cys Asn Met Phe Arg Leu Leu Gly Met
340 345 350
Arg Gly Val Ser Val Ile Phe Ser Ser Gly Asp Trp Gly Thr Gly Ile
355 360 365
Val Cys Lys Ala Asn Asp Gly Ser Glu Arg Ile Lys Phe Asp Pro Val
370 375 380
Tyr Pro Ala Ser Cys Pro Tyr Val Thr Ser Val Gly Gly Thr Thr Gly
385 390 395 400
Val Asn Pro Glu Arg Ala Val Glu Phe Ser Ser Gly Gly Phe Ser Asp
405 410 415
Arg Phe Pro Arg Pro Lys Tyr Gln Asp Glu Ala Val Arg Ser Tyr Leu
420 425 430
Thr Lys Leu Gly Asp His Trp Lys Gly Leu Tyr Asn Glu Ser Gly Arg
435 440 445
Ala Phe Pro Asp Val Ala Ala Gln Ala Asp Asn Phe Val Val Arg Asp
450 455 460
Gln Gly Gln Trp Val Ser Val Gly Gly Thr Ser Ala Ser Ala Pro Val
465 470 475 480
Phe Ala Ala Ile Ile Ala Asn Val Asn Ala Glu Leu Leu Lys Ala Gly
485 490 495
Lys Pro Pro Leu Gly Phe Leu Asn Pro Trp Leu Tyr Gly Leu Lys Gly
500 505 510
Arg Gly Phe Thr Asp Val Val His Gly Gly Ser Thr Gly Cys Pro Gly
515 520 525
Thr Val Pro Trp Thr Gly Leu Pro Ala Gly His Val Pro Tyr Ala Ser
530 535 540
Trp Asn Ala Thr Glu Gly Trp Asp Pro Val Thr Gly Leu Gly Thr Pro
545 550 555 560
Leu Tyr Asp Glu Leu Val Lys Ala Ala Leu Gly Lys
565 570
<210> 31
<211> 397
<212> PRT
<213> 减硫高温球菌
<400> 31
Glu Lys Pro Glu Leu Val Arg Val Ile Val His Val Asp Arg Gly His
1 5 10 15
Phe Asn Thr Ala Asp Val Ala Thr Ile Gly Gly His Val Val Tyr Gln
20 25 30
Phe Lys Leu Ile Asp Ala Val Val Val Glu Val Pro Ser Thr Ala Val
35 40 45
Gly Arg Leu Lys Lys Leu Pro Gly Val Lys Met Val Glu Phe Asp His
50 55 60
Lys Ala Arg Ile Leu Ala Gly Pro Pro Ser Trp Leu Gly Gly Gly Gln
65 70 75 80
Pro Ser Gln Gln Ile Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Arg Ala Pro Asp
85 90 95
Val Trp Gly Ile Thr Asp Gly Ser Gly Gly Val Ile Glu Val Ala Val
100 105 110
Leu Asp Thr Gly Val Asp Tyr Asp His Pro Asp Leu Ala Gly Asn Ile
115 120 125
Ala Trp Cys Val Ser Thr Leu Arg Gly Arg Val Thr Thr Asn Pro Ala
130 135 140
Gln Cys Lys Asp Gln Asn Gly His Gly Thr His Val Ile Gly Thr Ile
145 150 155 160
Ala Ala Leu Asn Asn Asp Ile Gly Val Val Gly Val Ala Pro Gly Val
165 170 175
Glu Ile Tyr Ser Ile Arg Val Leu Asp Ala Ser Gly Ser Gly Ser Tyr
180 185 190
Ser Asp Ile Ala Ile Gly Ile Glu Gln Ala Leu Leu Gly Pro Asp Gly
195 200 205
Ile Leu Asp Lys Asp Gly Asp Gly Ile Ile Val Gly Asp Pro Asp Asp
210 215 220
Asp Ala Ala Glu Val Ile Ser Met Ser Leu Gly Gly Pro Thr Asp Asp
225 230 235 240
Gln Tyr Leu His Asp Met Ile Ile Thr Ala Tyr Asn Tyr Gly Val Val
245 250 255
Ile Val Ala Ala Ser Gly Asn Glu Gly Ala Ser Ser Pro Ser Tyr Pro
260 265 270
Ala Ala Tyr Pro Glu Val Ile Ala Val Gly Ala Ser Asp Val Asn Asp
275 280 285
Gln Ile Ala Ser Trp Ser Asn Arg Gln Pro Glu Val Ser Ala Pro Gly
290 295 300
Val Asp Ile Leu Ser Thr Tyr Pro Asp Asp Thr Tyr Glu Thr Leu Ser
305 310 315 320
Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ser Gly Val Val Ala Leu Ile
325 330 335
Gln Ala Ala Tyr Tyr Asn Lys Tyr Gly Lys Val Leu Pro Val Gly Thr
340 345 350
Phe Asp Asp Met Gly Thr Asn Thr Val Arg Gly Ile Leu His Val Thr
355 360 365
Ala Asp Asp Leu Gly Asp Ala Gly Trp Asp Ile Tyr Tyr Gly Tyr Gly
370 375 380
Ile Val Arg Ala Asp Leu Ala Val Gln Ala Ala Ile Gly
385 390 395
<210> 32
<211> 549
<212> PRT
<213> 漏斗多孔菌
<400> 32
Lys Pro Met Ala Arg Ser Met Lys Leu His Glu Ser Arg Glu Gly Ile
1 5 10 15
Pro Glu Gly Phe Ser Leu Arg Gly Ala Ala Gln Pro Glu Gln Thr Ile
20 25 30
Lys Leu Arg Leu Ala Leu Val Gln Ser Asn Phe Ala Glu Leu Glu Arg
35 40 45
Lys Leu Met Asp Val Ser Thr Pro Ser Ser Ala Asn Tyr Gly Lys His
50 55 60
Leu Ser Lys Ala Glu Val Gln Gln Leu Val Ala Pro Thr Gln Asp Ser
65 70 75 80
Val Asp Ala Val Lys Ser Trp Leu Lys Glu Asn Asp Ile Ser Ala Lys
85 90 95
Thr Ile Ser Ala Thr Gly Asp Trp Leu Ser Phe Glu Val Pro Val Ser
100 105 110
Lys Ala Asn Glu Leu Phe Asp Ala Asp Phe Ser Ile Tyr Thr His Asp
115 120 125
Glu Thr Gly Thr Glu Ala Val Arg Thr Leu Ser Tyr Ser Ile Pro Ala
130 135 140
Glu Leu Gln Gly His Leu Asp Leu Val His Pro Thr Val Thr Phe Pro
145 150 155 160
Asn Pro Arg Gly Leu Pro Pro Val Phe Thr Ala Pro Ile Lys Ala Glu
165 170 175
Ala Gln Asn Leu Thr Ser Arg Ala Thr Ile Pro Ser Ser Cys Ala Arg
180 185 190
Thr Ile Thr Pro Ala Cys Leu Gln Ala Ile Tyr Asn Ile Pro Ser Thr
195 200 205
Pro Ala Thr Glu Ser Ser Asn Lys Leu Ala Val Thr Gly Phe Ile Glu
210 215 220
Gln Phe Ala Asn Lys Ala Asp Leu Lys Thr Phe Leu Thr Arg Phe Arg
225 230 235 240
Thr Asp Ile Ser Ser Ser Thr Ser Phe Thr Leu Gln Thr Leu Asp Gly
245 250 255
Gly Ser Asn Pro Gln Ser Ser Ser Glu Ala Gly Val Glu Ala Asn Leu
260 265 270
Asp Ile Gln Tyr Thr Val Gly Val Ala Thr Gly Val Pro Thr Val Phe
275 280 285
Ile Ser Val Gly Glu Asp Phe Gln Asp Gly Asp Leu Glu Gly Phe Leu
290 295 300
Asp Val Val Asn Ser Leu Leu Asp Glu Asp Thr Pro Pro Phe Val Met
305 310 315 320
Thr Thr Ser Tyr Gly Gln Asn Glu Asn Thr Ile Ser Arg Asn Leu Ala
325 330 335
Asn Asn Leu Cys Asn Ala Tyr Ala Gln Leu Gly Ala Arg Gly Val Ser
340 345 350
Ile Leu Phe Ala Ser Gly Asp Gly Gly Val Ala Gly Ser Gln Ser Ala
355 360 365
Ser Cys Ser Lys Phe Val Pro Thr Phe Pro Ser Gly Cys Pro Phe Met
370 375 380
Thr Ser Val Gly Ala Thr Gln Gly Phe Ser Pro Glu Thr Ala Ala Asp
385 390 395 400
Phe Ser Ser Gly Gly Phe Ser Asn Tyr Phe Ala Ile Pro Asp Tyr Gln
405 410 415
Thr Ser Ala Val Ser Gly Tyr Ile Lys Ala Leu Gly Asn Thr Asn Ser
420 425 430
Gly Lys Tyr Asn Ala Thr Gly Arg Gly Phe Pro Asp Ile Ala Thr Gln
435 440 445
Gly Val Asn Phe Glu Val Val Val Gly Gly Gln Ser Gly Thr Val Glu
450 455 460
Gly Thr Ser Cys Ser Ser Pro Thr Leu Ala Ser Ile Ile Ser Leu Leu
465 470 475 480
Asn Asp Arg Leu Ile Ala Ala Gly Lys Ser Pro Leu Gly Phe Leu Asn
485 490 495
Pro Phe Leu Tyr Ser Thr Gly Thr Ser Ala Leu Asn Asp Ile Thr Ser
500 505 510
Gly Ser Asn Pro Gly Cys Asn Thr Asn Gly Phe Pro Ala Lys Ala Gly
515 520 525
Trp Asp Pro Val Thr Gly Leu Gly Thr Pro Asp Phe Asn Lys Leu Leu
530 535 540
Ser Ala Val Gly Leu
545
<210> 33
<211> 548
<212> PRT
<213> 灵芝
<400> 33
Lys Ser Thr Thr Arg Asn Leu Lys Leu His Glu Thr Arg Gln Gly Ala
1 5 10 15
Pro Ser Gly Phe Ser His Thr Gly Ser Ala Asp Pro Asn Gln Thr Leu
20 25 30
Lys Leu Arg Leu Ala Leu Val Gln Gly Asn Thr Ala Glu Leu Glu Arg
35 40 45
Lys Leu Tyr Asp Val Ser Thr Pro Ser Ser Ala Asn Tyr Gly Lys His
50 55 60
Leu Ser Lys Glu Glu Val Arg Gln Leu Val Ala Pro Ala Gln Gly Ser
65 70 75 80
Val Asp Ala Val Asn Ala Trp Leu Arg Glu Asn Gly Ile Thr Ala Lys
85 90 95
Ser Thr Ser Ala Ala Gly Asp Trp Leu Ser Phe Glu Val Pro Val Ser
100 105 110
Lys Ala Asn Glu Leu Phe Asp Ala Asp Phe Ser Val Phe Lys His Asp
115 120 125
Asp Thr Gly Val Lys Ala Val Arg Thr Leu Ser Tyr Ser Ile Pro Ala
130 135 140
Glu Leu Gln Gly His Leu Asp Leu Val His Pro Thr Val Thr Phe Pro
145 150 155 160
Asn Pro Asn Gly His Met Pro Val Phe Gln Ala Pro Val Lys Asp Thr
165 170 175
Asp Ala Val Gln Asn Phe Ser Ala Arg Ala Val Pro Ser Ser Cys Ser
180 185 190
Asn Thr Ile Thr Pro Ala Cys Leu Gln Ala Leu Tyr Asn Ile Pro Ser
195 200 205
Asp Ala Ala Thr Gln Ser Ser Asn Lys Leu Ala Val Thr Gly Phe Ile
210 215 220
Glu Gln Tyr Ala Asn Gln Val Asp Leu Ala Val Phe Leu Lys Gln Tyr
225 230 235 240
Arg Ala Asp Ile Ser Ser Asn Thr Thr Phe Ala Leu Gln Thr Leu Asp
245 250 255
Gly Gly Ser Asn Ser Gln Thr Asn Val Pro Gly Val Glu Ala Asn Leu
260 265 270
Asp Ile Gln Tyr Thr Val Gly Ile Ala Thr Gly Val Pro Thr Val Phe
275 280 285
Ile Ser Val Gly Asp Gln Tyr Gln Asp Gly Asp Leu Glu Gly Phe Leu
290 295 300
Asp Val Ile Asn Phe Leu Leu Asp Glu Asp Thr Pro Pro Tyr Val Val
305 310 315 320
Thr Thr Ser Tyr Gly Gln Asp Glu His Thr Ile Ser Arg Lys Leu Ala
325 330 335
Gln Asn Leu Cys Asn Ala Tyr Ala Gln Leu Gly Ala Arg Gly Val Ser
340 345 350
Ile Leu Phe Ala Ser Gly Asp Gly Gly Val Ala Gly Ser Arg Ser Asn
355 360 365
Ser Cys Ser Lys Phe Val Pro Thr Phe Pro Ser Gly Cys Pro Tyr Met
370 375 380
Thr Ser Val Gly Ala Thr Gln Gly Val Pro Glu Thr Ala Ala Asp Phe
385 390 395 400
Ser Ser Gly Gly Phe Ser Asn Tyr Phe Gly Thr Pro Asp Tyr Gln Ala
405 410 415
Ser Ala Val Lys Ser Tyr Leu Ser Thr Leu Gly Ser Thr Asn Arg Gly
420 425 430
Lys Phe Asn Ala Ser Gly Arg Gly Phe Pro Asp Val Ala Thr Gln Gly
435 440 445
Val Asn Phe Glu Val Ile Val Asp Gly Glu Val Glu Gly Val Ser Gly
450 455 460
Thr Ser Ala Ala Ser Pro Met Phe Ala Ala Ile Val Ala Leu Leu Asn
465 470 475 480
Asp Lys Leu Ile Ala Ala Gly Lys Ser Pro Leu Gly Phe Leu Asn Pro
485 490 495
Phe Leu Tyr Ser Lys Gly Val Glu Ala Leu Asn Asp Ile Thr Thr Gly
500 505 510
Ser Asn Pro Gly Cys Gly Thr Ile Gly Phe Pro Ala Lys Glu Gly Trp
515 520 525
Asp Pro Val Thr Gly Leu Gly Thr Pro Asp Phe Gln Lys Leu Ala Ser
530 535 540
Ala Ala Gly Leu
545
<210> 34
<211> 548
<212> PRT
<213> 灵芝
<400> 34
Lys Thr Ala Thr Arg Asn Leu Lys Leu His Glu Thr Ser Gln Gly Ala
1 5 10 15
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20 25 30
Lys Leu Arg Leu Ala Leu Val Gln Gly Asn Val Ala Glu Leu Glu Arg
35 40 45
Arg Leu Tyr Asp Val Ser Thr Pro Ser Ser Pro Asn Tyr Gly Lys His
50 55 60
Leu Ser Lys Ser Glu Val Gln Gln Leu Val Ala Pro Ala Gln Asp Ser
65 70 75 80
Ile Asp Ala Ile Asn Ala Trp Leu Lys Glu Asn Gly Ile Ser Ala Lys
85 90 95
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100 105 110
Lys Ala Asn Glu Leu Phe Asp Ala Asp Phe Ser Val Tyr Lys His His
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Asn Pro Lys Gly His Pro Pro Val Phe Gln Ala Pro Ala Met Ile Thr
165 170 175
Asn Asp Val Gln Asn Phe Ser Ala Gly Ala Val Pro Ser Ser Cys Ser
180 185 190
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210 215 220
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Arg Ala Asp Met Ser Ser Asn Thr Thr Phe Thr Leu Gln Thr Leu Asp
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Ile Ser Val Gly Asp Gln Tyr Gln Asp Gly Asn Leu Glu Gly Phe Leu
290 295 300
Asp Val Val Asn Phe Leu Leu Asp Glu Asp Thr Pro Pro Tyr Val Met
305 310 315 320
Thr Thr Ser Tyr Gly Gln Asp Glu His Thr Met Ser Arg Lys Leu Ala
325 330 335
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340 345 350
Ile Leu Phe Ala Ser Gly Asp Gly Gly Val Ala Gly Ser Arg Ser Ser
355 360 365
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370 375 380
Thr Ser Val Gly Ala Thr Gln Gly Val Pro Glu Thr Ala Ala Asp Phe
385 390 395 400
Ser Ser Gly Gly Phe Ser Asn Tyr Phe Gly Ile Pro Asp Tyr Gln Ala
405 410 415
Ser Ala Val Ser Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Gly His Thr Asn Lys Gly
420 425 430
Lys Tyr Asn Ala Ser Gly Arg Gly Phe Pro Asp Val Ser Thr Gln Gly
435 440 445
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450 455 460
Thr Ser Ala Ala Ser Pro Thr Phe Ala Ala Val Val Ala Leu Leu Asn
465 470 475 480
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485 490 495
Phe Leu Tyr Ser Lys Gly Val Ser Ala Leu Asn Asp Ile Thr Ser Gly
500 505 510
Ser Asn Pro Gly Cys Arg Thr Asn Gly Phe Pro Ala Lys Glu Gly Trp
515 520 525
Asp Pro Val Thr Gly Leu Gly Thr Pro Asp Phe Gln Lys Leu Ala Ser
530 535 540
Ala Ala Gly Leu
545
<210> 35
<211> 541
<212> PRT
<213> 灵芝
<400> 35
Lys Pro Thr Ala Arg Asn Leu Arg Leu His Glu Thr Arg Gln Gly Ala
1 5 10 15
Pro Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Ser Ala Asp Pro Asn Gln Thr Val
20 25 30
Arg Leu Arg Leu Ala Leu Val Gln Gly Asn Thr Gly Glu Leu Glu Arg
35 40 45
Lys Leu Tyr Asp Val Ser Thr Pro Ser Ser Ala Asn Tyr Gly Lys His
50 55 60
Leu Ser Lys Ala Glu Val Gln Gln Leu Val Ala Pro Ala Gln Gly Ser
65 70 75 80
Ile Asp Ala Val Asn Ala Trp Leu Lys Glu Asn Asp Ile Thr Ala Lys
85 90 95
Thr Ile Ser Ala Thr Gly Asp Trp Leu Ser Phe Glu Val Pro Val Asn
100 105 110
Lys Ala Asn Glu Leu Phe Asp Ala Asp Phe Ser Val Phe Lys His Asp
115 120 125
Asp Thr Gly Met Glu Ala Val Arg Thr Leu Ser Tyr Ser Ile Pro Ala
130 135 140
Glu Leu Gln Gly His Leu Asp Leu Val His Pro Thr Val Thr Phe Pro
145 150 155 160
Asn Pro Lys Gly Asn Leu Pro Leu Phe Gln Thr Pro Ile Lys Ser Lys
165 170 175
Arg Asp Val Pro Ala Asp Cys Ser Asn Asn Ile Thr Pro Ala Cys Leu
180 185 190
Gln Ala Leu Tyr Asn Ile Pro Ser Asp Ala Ala Thr Gln Ser Ser Asn
195 200 205
Thr Leu Ala Val Thr Gly Tyr Ile Glu Gln Tyr Ala Asn Gln Gln Asp
210 215 220
Leu Thr Ser Phe Leu Gly Gln Phe Arg Pro Asp Ile Ser Ser Asn Thr
225 230 235 240
Thr Phe Ala Leu Gln Thr Ile Asp Gly Gly Ser Asn Ser Gln Asn Gly
245 250 255
Ser Asp Ala Gly Gly Glu Ala Asn Leu Asp Ile Gln Tyr Thr Val Gly
260 265 270
Leu Ala Thr Gly Val Pro Thr Val Phe Ile Ser Val Gly Glu Gln Tyr
275 280 285
Gln Asp Gly Asp Leu Gly Gly Leu Leu Asp Val Ile Asn Phe Val Leu
290 295 300
Ala Glu Asp Ala Pro Pro Asn Val Ile Thr Thr Ser Tyr Gly Gln Asn
305 310 315 320
Glu Asn Thr Ile Ser Leu Lys Leu Ala Gln Asn Leu Cys Asn Ala Tyr
325 330 335
Ala Gln Leu Gly Ala Arg Gly Val Ser Ile Leu Phe Ala Ser Gly Asp
340 345 350
Gly Gly Val Ala Gly Ser Gln Ser Asp Asn Cys Thr Gln Phe Val Pro
355 360 365
Thr Phe Pro Ser Gly Cys Pro Tyr Met Thr Ser Val Gly Ala Thr Gln
370 375 380
Gly Val Pro Glu Thr Ala Ala Asp Phe Ser Thr Gly Gly Phe Ser Asn
385 390 395 400
Leu Phe Ser Val Pro Asp Tyr Gln Ala Ala Ala Val Gln Ser Tyr Leu
405 410 415
Ser Ala Leu Gly Gly Thr Tyr Gln Gly Leu Phe Asn Ala Ser Gly Arg
420 425 430
Ala Phe Pro Asp Val Ser Thr Gln Gly Val Asn Phe Glu Thr Val Val
435 440 445
Asp Gly Ser Val Ser Gly Ala Ser Gly Thr Ser Ala Ala Ser Pro Thr
450 455 460
Phe Ala Ala Ile Val Ala Leu Leu Asn Asp Arg Leu Val Ala Ala Gly
465 470 475 480
Lys Ser Pro Leu Gly Phe Leu Asn Pro Phe Leu Tyr Ser Thr Gly Ala
485 490 495
Ser Ala Leu Asn Asp Ile Ala Thr Gly Ser Asn Pro Gly Cys Gly Thr
500 505 510
Asn Gly Phe Ser Ala Gln Lys Gly Trp Asp Pro Val Thr Gly Leu Gly
515 520 525
Thr Pro Asp Phe Gln Lys Leu Ala Ala Ala Ala Gly Leu
530 535 540
<210> 36
<211> 547
<212> PRT
<213> 栓菌属物种
<400> 36
Thr Pro Thr Gly Arg Asn Leu Lys Leu His Glu Ala Arg Glu Asp Ile
1 5 10 15
Pro Thr Gly Tyr Ser Leu Arg Gly Ala Ala Ser Pro Asp Thr Thr Leu
20 25 30
Lys Leu Arg Leu Ala Leu Val Gln Asn Asn Phe Ala Glu Leu Glu Asp
35 40 45
Lys Leu Tyr Asp Val Ser Thr Pro Ser Ser Ala Asn Tyr Gly Asn His
50 55 60
Leu Ser Lys Glu Glu Val Glu Gln Tyr Ile Ala Pro Ala Pro Glu Ser
65 70 75 80
Val Lys Ala Val Asn Ala Trp Leu Thr Glu Asn Gly Leu Asp Ala His
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Thr Ile Ser Pro Ala Gly Asp Trp Leu Ala Phe Glu Val Pro Val Ser
100 105 110
Lys Ala Asn Glu Leu Phe Asp Ala Asp Phe Ser Val Phe Thr His Asp
115 120 125
Glu Ser Gly Leu Glu Ala Ile Arg Thr Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Ala
130 135 140
Glu Leu Gln Gly His Leu Asp Leu Val His Pro Thr Val Thr Phe Pro
145 150 155 160
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165 170 175
Asn Leu Thr Gly Arg Ala Ile Pro Ala Ser Cys Ala Ser Thr Ile Thr
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Pro Ala Cys Leu Gln Ala Ile Tyr Gly Ile Pro Thr Thr Lys Ala Thr
195 200 205
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Asn Ser Ala Asp Leu Lys Ser Phe Leu Ser Thr Phe Arg Lys Asp Ile
225 230 235 240
Ser Ser Ser Thr Thr Phe Ala Leu Gln Thr Leu Asp Gly Gly Gln Asn
245 250 255
Asn Gln Ser Pro Ser Gln Ala Gly Ile Glu Ala Asn Leu Asp Ile Gln
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Tyr Thr Val Gly Leu Ala Thr Gly Val Pro Val Thr Phe Ile Ser Val
275 280 285
Gly Asp Asn Phe Gln Asp Gly Asp Leu Glu Gly Phe Leu Asp Ile Ile
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Asn Phe Leu Leu Ser Glu Ser Asn Pro Pro Gln Val Leu Thr Thr Ser
305 310 315 320
Tyr Gly Gln Asn Glu Asn Thr Ile Ser Ala Lys Leu Ala Asn Gln Leu
325 330 335
Cys Asn Ala Tyr Ala Gln Leu Gly Ala Arg Gly Thr Ser Ile Leu Phe
340 345 350
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355 360 365
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385 390 395 400
Gly Gly Phe Ser Asn Val Phe Gly Ile Pro Ser Tyr Gln Thr Ser Ala
405 410 415
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420 425 430
Asn Arg Ser Gly Arg Gly Phe Pro Asp Val Ala Thr Gln Gly Val Asn
435 440 445
Phe Gln Ile Val Ser Gly Gly Asp Thr Gly Gly Val Asp Gly Thr Ser
450 455 460
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465 470 475 480
Leu Ile Ala Ala Gly Lys Ser Pro Leu Gly Phe Leu Asn Pro Phe Leu
485 490 495
Tyr Ser Ala Ala Gly Lys Ala Ala Leu Asn Asp Val Thr Ser Gly Ser
500 505 510
Asn Pro Gly Cys Asn Thr Asn Gly Phe Pro Ala Lys Ala Gly Trp Asp
515 520 525
Pro Val Thr Gly Leu Gly Thr Pro Asn Phe Ala Lys Leu Leu Thr Ala
530 535 540
Val Gly Leu
545
<210> 37
<211> 553
<212> PRT
<213> 林氏灰孔菌
<400> 37
Lys Pro Thr Ala Arg Asn Leu Leu Val His Glu Ser Leu Asp Gly Val
1 5 10 15
Pro Thr Gly Phe Gln Leu Val Gly Pro Ala Ser Pro Asp Thr Val Leu
20 25 30
Ser Met Arg Ile Ala Leu Val Gln Ser Asp Pro Ala Gly Leu Glu Ala
35 40 45
Ala Leu Tyr Asp Val Ser Thr Pro Ser Ser Ala Ser Tyr Gly Asn His
50 55 60
Leu Ser Lys Ala Glu Val Glu Lys Phe Val Ser Pro Thr Ser Glu Ser
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Lys Ala Glu Asp Leu Phe Gly Thr Gln Phe Ser Val Phe Thr His Glu
115 120 125
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130 135 140
Glu Leu Gln Gly His Leu Asp Leu Val Phe Pro Thr Ile Asn Phe Pro
145 150 155 160
Asp Pro Asn Ala Asn Leu Pro Val Phe Arg His Ala Ser Lys Lys Arg
165 170 175
Glu Val Thr Thr Leu Asn Ala Asn Leu Thr Ser Asp Ala Val Pro Ser
180 185 190
Ser Cys Ala Asp Thr Ile Thr Pro Ala Cys Leu Gln Ala Leu Tyr Gly
195 200 205
Ile Pro Thr Thr Pro Ala Thr Ser Ser Thr Asn Gln Leu Gly Val Ser
210 215 220
Gly Phe Ile Asp Gln Phe Ala Asn Gln Ala Asp Leu Lys Thr Phe Leu
225 230 235 240
Gln Asn Phe Arg Thr Asp Ile Ser Ser Ser Thr Thr Phe Ser Leu Glu
245 250 255
Thr Leu Asp Gly Gly Ser Asn Ser Gln Asn Arg Gly Asp Ala Gly Val
260 265 270
Glu Ala Asn Leu Asp Thr Gln Tyr Thr Val Gly Leu Ala Thr Asp Val
275 280 285
Pro Thr Val Phe Ile Ser Val Gly Glu Asp Asn Gln Asp Gly Ser Leu
290 295 300
Gly Gly Phe Leu Asp Ile Ile Asn Phe Leu Leu Asp Gln Asp Ser Pro
305 310 315 320
Pro Gln Val Leu Thr Thr Ser Tyr Gly Gln Asn Glu Asn Thr Val Ser
325 330 335
Arg Ala Val Ala Asn Asn Leu Cys Asn Ala Tyr Ala Gln Leu Gly Ala
340 345 350
Arg Gly Thr Ser Ile Leu Phe Ala Ser Gly Asp Gly Gly Val Ser Gly
355 360 365
Ser Gln Ser Ala Ser Cys Arg Thr Phe Val Pro Thr Phe Pro Ser Gly
370 375 380
Cys Pro Phe Met Thr Ser Val Gly Ala Thr Thr Gly Ile Asn Pro Glu
385 390 395 400
Thr Ala Ala Thr Phe Ser Ala Gly Gly Phe Ser Asn Tyr Phe Gly Thr
405 410 415
Pro Ser Tyr Gln Ala Ser Ala Val Ser Ser Tyr Leu Ala Ala Leu Gly
420 425 430
Ser Thr Asn Ser Gly Lys Phe Asn Thr Ser Gly Arg Gly Tyr Pro Asp
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Ile Ser Leu Val Asn Asp Arg Leu Ile Ala Ala Gly Lys Pro Pro Leu
485 490 495
Gly Phe Leu Asn Pro Phe Leu Tyr Ser Thr Gly Ala Ser Ala Phe Thr
500 505 510
Asp Ile Thr Thr Gly Asp Asn Pro Gly Cys Asn Thr Asn Gly Phe Pro
515 520 525
Ala Lys Ser Gly Trp Asp Pro Val Thr Gly Leu Gly Thr Pro Asn Phe
530 535 540
Ser Lys Leu Leu Thr Ala Val Gly Leu
545 550
<210> 38
<211> 559
<212> PRT
<213> 变色栓菌
<400> 38
Ala Val Ala Ser Thr Leu Gln Leu His Glu Ala Arg Lys Gly Ile Pro
1 5 10 15
Ala Gly Phe Ser Leu His Gly Ala Ala Ser Pro Asp Thr Val Leu Asn
20 25 30
Leu Arg Met Ala Leu Val Gln Ser Asn Phe Ala Gly Leu Glu Glu Arg
35 40 45
Leu Tyr Asp Val Ser Thr Pro Ser Ser Ala Asn Tyr Gly Lys His Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Thr Ala Val Lys Ala Trp Leu Ala Ala Asn Gly Leu Ser Gly Thr Ser
85 90 95
Ile Ser Pro Ala Gly Asp Trp Ile Ala Ala Lys Val Pro Val Ser Lys
100 105 110
Ala Asn Lys Leu Leu Gly Ala Gln Phe Ser Val Phe Asn Asn Asp Ala
115 120 125
Thr Gly Arg Gln Ile Ile Arg Thr Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Ala Glu
130 135 140
Leu Lys Gly His Leu Asp Leu Val His Pro Thr Ile Thr Phe Ala Asp
145 150 155 160
Ile Lys Pro Leu Val Pro Val Val Ser Ala Arg Arg Glu Ser Arg Val
165 170 175
Leu Val Asp Ser Asp Leu Val Ala Asn Thr Ile Pro Ala Ser Cys Asn
180 185 190
Ala Ala Ile Thr Pro Ala Cys Leu Gln Asp Leu Tyr Gly Ile Pro Ser
195 200 205
Thr Pro Ala Thr Gln Ser Ser Asn Gln Leu Gly Val Ser Gly Phe Ile
210 215 220
Asp Gln Phe Ala Asn Gln Ala Asp Leu Ala Thr Phe Leu Thr Glu Phe
225 230 235 240
Arg Pro Asp Val Ser Asn Ser Thr Thr Phe Thr Leu Gln Thr Leu Asp
245 250 255
Gly Gly Gln Asn Pro Gln Asp Pro Ser Asp Ala Gly Val Glu Ala Asn
260 265 270
Leu Asp Thr Gln Tyr Thr Val Gly Val Ala Thr Asn Val Pro Thr Thr
275 280 285
Phe Phe Ser Val Gly Asp Asp Thr Lys Asp Gly Ile Phe Gly Phe Leu
290 295 300
Asp Leu Ile Ser Phe Leu Leu Ala Ala Ala Ala Pro Pro Gln Val Leu
305 310 315 320
Thr Thr Ser Tyr Gly Ala Asp Glu Gly Gly Leu Ser Ala Asn Leu Val
325 330 335
Arg Asn Leu Cys Gln Ala Tyr Ala Gln Leu Gly Ala Arg Gly Thr Ser
340 345 350
Ile Leu Phe Ser Ser Gly Asp Gly Gly Val Ser Gly Ser Gln Ala Glu
355 360 365
Gly Cys Val Asp Phe Val Pro Thr Phe Pro Ser Gly Cys Pro Phe Leu
370 375 380
Thr Ser Val Gly Ala Thr Gln Leu Thr Thr Ala Ser Gly Leu Thr Val
385 390 395 400
Glu Thr Ala Ala Gly Phe Ser Ser Gly Gly Phe Ser Asn Tyr Phe Pro
405 410 415
Thr Pro Pro Tyr Gln Gln Ala Val Val Asp Ala Tyr Ile Lys Lys Thr
420 425 430
Leu Val Asn Gly Thr Val Asn Glu Gly Leu Phe Asn Ala Ser Gly Arg
435 440 445
Ala Phe Pro Asp Val Ser Ala Val Gly Val Asp Tyr Leu Ile Val Val
450 455 460
Gly Gly Gly Thr Asp Ile Val Ser Gly Thr Ser Ala Ser Ser Pro Leu
465 470 475 480
Phe Ala Ser Val Ile Ala Leu Ile Asn Asp Arg Arg Leu Ala Ala Gly
485 490 495
Lys Pro Pro Leu Gly Phe Leu Asn Pro Phe Leu Tyr Ser Gln Ala Gly
500 505 510
Ala Ser Ala Leu Asn Asp Val Thr Val Gly Ser Asn Pro Gly Cys Ala
515 520 525
Ser Pro Gly Phe Pro Ala Ala Gln Gly Trp Asp Pro Val Thr Gly Leu
530 535 540
Gly Thr Pro Asn Phe Ala Lys Leu Leu Ala Ala Ala Leu Ala Leu
545 550 555
<210> 39
<211> 541
<212> PRT
<213> 蝙蝠蛾拟青霉
<400> 39
Ala Pro Ala Pro His Gly Pro Leu Val Lys Phe Gly Glu Ile Arg Lys
1 5 10 15
Leu Pro Ser Lys Trp Val Ala Thr Gly Ala Ala Asp Ala Asn Ala Val
20 25 30
Ile Lys Gly Gln Ile Gly Ile Lys Gln Asn Asn Ile Gln Gly Leu Gln
35 40 45
Ala Lys Leu Ala Asp Ile Ala Asp Pro Asn Ser Pro Asn Tyr Gly Gln
50 55 60
Trp Leu Ser Lys Glu Glu Val Asp Lys Tyr Ser Ala Pro Ala Ala Ala
65 70 75 80
Asp Val Ala Ala Val Lys Ala Trp Leu Ala Ser Ser Gly Ile Thr Asp
85 90 95
Val Thr Met Pro Thr Asn Asp Trp Ile Glu Phe Ser Val Pro Val Ser
100 105 110
Lys Met Glu Ser Leu Leu Gly Ser Lys Tyr Glu Trp Phe Val His Leu
115 120 125
Glu Thr Gly Glu Lys Val Pro Arg Thr Lys Glu Phe Ser Val Pro Gln
130 135 140
Asn Leu His Asp Leu Ile Asp Val Val Thr Pro Thr Thr Val Leu Tyr
145 150 155 160
His Asn Ile Asn Pro His Thr His Ser Ser Pro Gln Ala Ala Gly Ala
165 170 175
Ala Gly Leu Thr Ser Pro Ala Ser Ile Lys Ser Ala Tyr Asn Val Asp
180 185 190
Tyr Lys Gly Thr Gly Asn Thr Leu Val Gly Thr Thr Gly Phe Leu Gly
195 200 205
Val Gly Ala Ser His Thr Asp Tyr Ala Asn Phe Gly Gln Gln Phe Ser
210 215 220
Pro Gly Leu Lys Asp Phe Gln Asp Val Ser Val Asn Gly Gly Ser Asn
225 230 235 240
Ser Gly Asp Gly Ser Ala Leu Glu Gly Asn Leu Asp Thr Gln Tyr Cys
245 250 255
Gly Ala Leu Ala Ala Pro Asn Pro Ser Glu Tyr Leu Ala His Ala Pro
260 265 270
Glu Gly Ser Asp Asn Asn Ser Phe Asn Asp Ala Met Leu Ala Phe Gly
275 280 285
Asn Tyr Leu Asn Ser Ala Arg Asn Pro Pro Ser Ala Val Ser Thr Ser
290 295 300
Tyr Gly Gly Glu Glu Asp Gly Val Asp Ala Ser Tyr Leu Asp Arg Ile
305 310 315 320
Cys Asn Glu Phe Met Lys Ala Gly Ser Arg Gly Val Ser Ile Phe Phe
325 330 335
Ser Ser Gly Asp Asn Gly Val Gly Gly Asn Gly Glu Ser Ser Cys Gln
340 345 350
Asn Gly Tyr Tyr Pro Leu Trp Pro Ala Thr Cys Pro Tyr Val Thr Thr
355 360 365
Val Gly Gly Thr Glu Phe Asp Asn Ser Gly Arg Glu Val Val Ala Asn
370 375 380
Phe Glu Gln Tyr Asn Lys Asn Ile Lys Ser Pro Gly Gly Gly Tyr Ser
385 390 395 400
Asn His Phe Ala Ala Pro Ser Tyr Asn Lys Ala Val Thr Thr Ser Tyr
405 410 415
Ala Asn Gly Leu Ala Ala Pro Gln Lys Gln Arg Leu Asn Pro Asn Gly
420 425 430
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435 440 445
Val Asn Asn Gln Ile Ser Gln Val Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ser Pro
450 455 460
Ser Ile Ala Gly Leu Val Gly Leu Leu Asn Asp Tyr Arg Lys Thr Gln
465 470 475 480
Gly Lys Pro Asn Leu Gly Phe Ile Asn Pro Leu Leu Tyr Ser Asp Lys
485 490 495
Val Lys Pro Ala Leu Arg Asp Val Thr Ser Gly Ser Asn Lys Gly Cys
500 505 510
Asp Ser Val Gly Leu Pro Ala Lys Thr Gly Trp Asp Ala Ala Ser Gly
515 520 525
Leu Gly Ser Phe Asp Phe Gly Lys Leu Arg Thr Leu Val
530 535 540
<210> 40
<211> 541
<212> PRT
<213> 细脚棒束孢
<400> 40
Ala Pro Ala Pro His Gly Pro Leu Val Lys Phe Gly Glu Leu Lys Lys
1 5 10 15
Leu Pro Ser Gln Trp Val Ala Thr Gly Ala Ala Asn Gly Asp Ala Val
20 25 30
Ile Lys Ala Gln Ile Gly Ile Lys Gln Asn Asn Ile Lys Gly Leu Gln
35 40 45
Asp Lys Leu Ala Glu Ile Ser Asp Pro Asn Ser Pro Ser Tyr Gly Gln
50 55 60
Trp Leu Ser Lys Glu Glu Val Ala Lys Tyr Thr Ala Pro Ala Asp Ala
65 70 75 80
Asp Val Ala Ala Val Lys Ala Trp Leu Ser Ser Ala Gly Ile Thr Glu
85 90 95
Val Thr Met Pro Thr Asn Asp Trp Leu Glu Phe Ser Val Pro Val Ser
100 105 110
Lys Met Glu Ser Leu Leu Gly Ser Lys Tyr Glu Trp Phe Val His Leu
115 120 125
Glu Thr Gly Glu Lys Ala Pro Arg Thr Lys Glu Phe Ser Val Pro Gln
130 135 140
Asn Leu His Gly Ile Ile Asp Val Val Thr Pro Thr Thr Val Leu Tyr
145 150 155 160
His Asn Ile Asn Pro Asn Ser His Gly Asn Glu Leu Ser Ala Ser Ala
165 170 175
Ser Gly Leu Thr Ser Pro Ala Ser Ile Lys Ser Ala Tyr Asn Val Asp
180 185 190
Tyr Lys Gly Thr Gly Asn Thr Leu Val Ala Thr Thr Gly Phe Leu Gly
195 200 205
Val Gly Ala Ser His Asn Asp Tyr Leu Ala Phe Gly His Gln Phe Ser
210 215 220
Pro Gly Leu Lys Asp Phe Gln Asp Val Ser Val Asn Gly Gly Ser Asn
225 230 235 240
Ser Gly Asp Gly Ser Ala Leu Glu Gly Asn Leu Asp Thr Gln Tyr Cys
245 250 255
Gly Ala Leu Ala Ser Pro Asn Pro Ser Gln Tyr Leu Ala Asn Ser Pro
260 265 270
Glu Gly Ser Asp Asn Asn Ser Phe Asn Asp Ala Met Thr Ala Phe Gly
275 280 285
Asn Tyr Leu Asn Ser Ala Ser Asn Pro Pro Ser Ala Val Ser Thr Ser
290 295 300
Tyr Gly Gly Glu Glu Asp Gly Val Asp Ala Gly Tyr Leu Asp Arg Ile
305 310 315 320
Cys Asn Glu Phe Met Lys Ala Gly Ser Arg Gly Ile Ser Val Phe Phe
325 330 335
Ser Ser Gly Asp Asn Gly Val Gly Gly Asn Gly Glu Pro Ser Cys Gln
340 345 350
Asn Gly Tyr Tyr Pro Leu Trp Pro Ala Thr Cys Pro Tyr Val Thr Thr
355 360 365
Val Gly Gly Thr Glu Phe Asp Asp Ser Gly Arg Glu Val Val Ala Asn
370 375 380
Phe Glu Gln Tyr Asn Lys Asn Val Lys Ser Pro Gly Gly Gly Tyr Ser
385 390 395 400
Asn His Phe Pro Ala Pro Asp Tyr Asn Lys Asn Val Thr Thr Ala Tyr
405 410 415
Ala Asn Ser Leu Ser Ala Ala Gln Gln Gln Arg Leu Asn Pro Asn Gly
420 425 430
Arg Gly Phe Pro Asp Ile Ser Leu Val Ser Val Lys Tyr Gln Val Ser
435 440 445
Leu Asn Gly Gln Thr Lys Gln Val Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ser Pro
450 455 460
Ser Val Ala Gly Leu Val Gly Leu Leu Asn Asp Tyr Arg Lys Thr Gln
465 470 475 480
Gly Lys Ser Asn Leu Gly Phe Leu Asn Pro Leu Leu Tyr Ser Gly Lys
485 490 495
Val Asn Ala Ala Leu Arg Asp Val Thr Ser Gly Ser Asn Lys Gly Cys
500 505 510
Asp Ser Val Gly Leu Pro Ala Lys Ser Gly Trp Asp Ala Ala Ser Gly
515 520 525
Leu Gly Ser Phe Asp Phe Ala Lys Leu Arg Ser Leu Ile
530 535 540
<210> 41
<211> 578
<212> PRT
<213> 溜曲霉
<400> 41
Glu Ala Phe Glu Lys Leu Ser Ala Val Pro Lys Gly Trp His Tyr Ser
1 5 10 15
Ser Thr Pro Glu Gly Ser Thr Ser Val Cys Leu Lys Ile Ala Leu Ala
20 25 30
Gln Lys Asp Ala Ala Gly Phe Glu Lys Arg Val Tyr Glu Met Ser Asp
35 40 45
Pro Asp His Pro Asn Tyr Gly Gln His Phe Thr Thr His Glu Glu Met
50 55 60
Lys Arg Met Leu Leu Pro Arg Asp Asp Thr Val Asp Ala Val Arg Gln
65 70 75 80
Trp Leu Glu Asn Gly Gly Val Thr Asp Val Arg Gln Asp Ser Asp Trp
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Ile Asn Phe Cys Thr Thr Val Asp Thr Ala Asn Lys Leu Leu Asn Ala
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Gln Phe Lys Trp Tyr Val Ser Asp Val Lys His Ile Arg Arg Leu Arg
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Thr His Ser Lys Pro Ser Gln Leu Asp Val Thr Ala Leu Ala Ala Ala
165 170 175
Val Val Ala Lys Asn Ile Ser His Cys Asp Ser Ile Ile Thr Pro Thr
180 185 190
Cys Leu Lys Glu Leu Tyr Asn Ile Gly Asp Tyr Gln Ala Asp Ala Asn
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Gly Gln Asn Phe Ser Val Ile Thr Tyr Asn Gly Gly Leu Asn Asp Gln
245 250 255
Asn Ser Ser Ser Asp Ser Gly Glu Ala Asn Leu Asp Leu Gln Tyr Ile
260 265 270
Leu Gly Val Ser Ala Pro Leu Pro Val Thr Glu Phe Ser Thr Gly Gly
275 280 285
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Ser Asn Glu Pro Tyr Leu Glu Phe Phe Gln Asn Val Leu Lys Leu Asp
305 310 315 320
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325 330 335
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355 360 365
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370 375 380
Phe Pro Pro Gln Phe Pro Ala Ala Cys Pro Trp Val Thr Ser Val Gly
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Ser Ala Pro Ala Phe Ser Ala Ile Ile Ala Leu Leu Asn Asp Ala Arg
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Gly Cys Thr Gly Arg Ala Arg Phe Gly Gly Ala Pro Asp Gly Gly Pro
530 535 540
Val Val Pro Phe Ala Ser Trp Asn Ala Thr Gln Gly Trp Asp Pro Val
545 550 555 560
Thr Gly Leu Gly Thr Pro Asp Phe Ala Glu Leu Lys Lys Leu Ala Leu
565 570 575
Ala Asn
<210> 42
<211> 587
<212> PRT
<213> 巴西曲霉
<400> 42
Glu Ile Phe Glu Lys Leu Ser Gly Val Pro Asn Gly Trp Arg Tyr Ala
1 5 10 15
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50 55 60
Lys Arg Met Leu Leu Pro Ser Asp Thr Ala Val Asp Ser Val Arg Asp
65 70 75 80
Trp Leu Glu Ser Ala Gly Val His Asn Ile Gln Val Asp Ala Asp Trp
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Ile Lys Phe His Thr Thr Val Thr Lys Ala Asn Ala Leu Leu Asp Ala
100 105 110
Asp Phe Lys Trp Tyr Val Ser Glu Ala Arg His Ile Arg Arg Leu Arg
115 120 125
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130 135 140
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Tyr Ala Asp Leu Glu Lys Phe Glu Gln His Leu Ala Pro Asn Ala Ile
225 230 235 240
Gly Gln Asn Phe Thr Val Val Gln Phe Asn Gly Gly Leu Asn Asp Gln
245 250 255
Leu Ser Thr Lys Asp Ser Gly Glu Ala Asn Leu Asp Leu Gln Tyr Ile
260 265 270
Leu Gly Val Ser Ala Pro Leu Pro Val Thr Glu Tyr Ser Thr Gly Gly
275 280 285
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Asn Ser Asp Leu Pro Gln Val Ile Ser Thr Ser Tyr Gly Glu Asp Glu
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Tyr Ala Val Tyr Asp Lys Gly Ile Leu Gly Gln Phe Asp Gly Thr Ser
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Tyr Gly Ala Gly Ser Lys Leu Gly Gly Leu Asn Asp Ile Val Thr Gly
515 520 525
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<212> PRT
<213> 饭冢曲霉
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Trp Leu Leu Ala Ala Asp Val Thr Asp Tyr Glu Val Asp Ala Asp Trp
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Ile Asn Leu His Thr Thr Val Gln Gln Ala Asn Glu Leu Leu Asp Thr
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225 230 235 240
Pro Tyr Ala Lys Gly Glu Asn Phe Ser Val Ile Leu Tyr Asn Gly Gly
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Gly Leu Tyr Asn Ala Ser Gly Arg Ala Phe Pro Asp Val Ser Ala Gln
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Gly Gln Asn Tyr Ala Ile Phe Asp Lys Gly Arg Leu Gly Lys Met Asp
465 470 475 480
Gly Thr Ser Cys Ser Ala Pro Ala Phe Ala Gly Ile Val Ser Leu Leu
485 490 495
Asn Asp Ala Arg Leu Arg Ala Asn Arg Pro Val Leu Gly Phe Leu Asn
500 505 510
Pro Trp Leu Tyr Gly Thr Ala Arg Glu Gly Leu Asn Asp Ile Val His
515 520 525
Gly Gly Ser Lys Gly Cys Asp Gly Arg Asp Arg Phe Gly Gly Lys Pro
530 535 540
Asn Gly Ser Pro Val Val Pro Tyr Ala Ser Trp Asn Ala Thr Pro Gly
545 550 555 560
Trp Asp Pro Val Ser Gly Leu Gly Thr Pro Asn Phe Ala Thr Leu Val
565 570 575
Gln Val Ala Leu His Asp
580
<210> 44
<211> 456
<212> PRT
<213> 青霉属物种
<400> 44
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Asn Glu Tyr Ser Trp Asn Asn Tyr Ala Asn Met Leu Tyr Val Asp Gln
115 120 125
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130 135 140
Val Thr Ala Ala Pro Tyr Val Trp Lys Leu Leu Gln Ala Phe Tyr Ala
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Gln Phe Pro Glu Tyr Glu Ser Arg Asp Phe Ala Ile Phe Thr Glu Ser
165 170 175
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Asn Ala Ala Ile Lys Ala Gly Ser Val Ser Gly Glu Asn Ile Asn Leu
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Lys Ala Tyr Ile Asp Phe Ser Tyr Asn Asn Ser Tyr Lys Gln Leu Ile
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245 250 255
Leu Pro Ala Ile Gln Lys Cys Thr Ser Ser Gly Ser Asn Ser Asp Cys
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Lys Asn Ala Asp Ser Val Cys Tyr Asn Gln Ile Glu Gly Pro Ile Ser
275 280 285
Ser Ser Gly Asp Trp Asp Val Tyr Asp Ile Arg Glu Pro Ser Asn Asp
290 295 300
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325 330 335
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435 440 445
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<210> 45
<211> 456
<212> PRT
<213> 齿状曲霉
<400> 45
Ser Thr Ala Ser Ala Ala Lys Asp Ser Val Ser Ser Ile Val Lys Asn
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275 280 285
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<210> 46
<211> 456
<212> PRT
<213> 半内果菌属物种
<400> 46
Ala Pro Ala Ser Thr Ala Lys Asp Thr Leu Ser Ser Ile Val Lys Asn
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Gly Val Thr Tyr Asn Val Phe Glu His Ala Asp Ser Gly Ala Lys Ile
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Trp Phe Asn Gly Gly Pro Gly Cys Ser Ser Met Ile Gly Leu Phe Gln
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Asn Glu Tyr Ser Trp Asn Asn Tyr Ala Asn Met Leu Tyr Val Asp Gln
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Pro Ile Gly Val Gly Phe Ser Tyr Gly Thr Asp Asp Val Asp Ser Thr
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Val Thr Ala Ala Pro Tyr Val Trp Lys Leu Leu Gln Ala Phe Tyr Ala
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Gln Phe Pro Glu Tyr Glu Ser Arg Asp Phe Ala Ile Phe Thr Glu Ser
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Tyr Gly Gly His Tyr Gly Pro Glu Phe Ala His Tyr Ile Gln Gln Gln
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Asn Ala Ala Ile Lys Ser Gly Ser Val Lys Gly Glu Asn Ile Asn Leu
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Ile Gly Leu Gly Val Asn Asn Gly Trp Ile Asp Ser Ala Ile Gln Glu
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Lys Ala Tyr Ile Asp Phe Ser Tyr Asn Asn Ser Tyr Lys Gln Leu Ile
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Asp Phe Ser Gln Arg Thr Ser Leu Met Arg Ala Tyr Lys Asn Gln Cys
245 250 255
Leu Pro Ala Ile Gln Lys Cys Tyr Gln Thr Gly Thr Asn Ala Asp Cys
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Thr Asp Ala Ser Ser Val Cys Tyr Asn Asn Ile Glu Gly Pro Ile Ser
275 280 285
Ser Ser Gly Asp Trp Asp Val Tyr Asp Ile Arg Glu Pro Ser Asn Asp
290 295 300
Pro Tyr Pro Pro Lys Thr Tyr Ser Ser Tyr Leu Ser Asp Pro Lys Val
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Val Lys Ala Ile Gly Ala Arg Thr Asn Tyr Lys Glu Cys Pro Asn Gly
325 330 335
Pro Tyr Asn Lys Phe Ser Thr Thr Gly Asp Asn Pro Arg Ser Phe Leu
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Ser Thr Leu Ser Asp Val Val Lys Ser Gly Ile Asn Val Ile Leu Trp
355 360 365
Ala Gly Asp Ala Asp Trp Ile Cys Asn Trp Leu Gly Gly Tyr Gly Val
370 375 380
Ala Asn Ala Val Asp Tyr Pro Gly His Ala Gln Phe Arg Ala Lys Ala
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Leu Ala Pro Tyr Thr Val Asn Gly Thr Glu Lys Gly Gln Phe Lys Thr
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Val Asp Asn Phe Gln Phe Leu Lys Val Tyr Gly Ala Gly His Glu Val
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Pro Tyr Tyr Gln Pro Glu Thr Ala Leu Gln Val Phe Glu Gln Ile Leu
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Gln Lys Lys Pro Ile His Ser Thr
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<210> 47
<211> 456
<212> PRT
<213> 微紫青霉
<400> 47
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Val Thr Ala Ala Pro Tyr Val Trp Lys Leu Leu Gln Ala Phe Tyr Ala
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Gln Phe Pro Glu Tyr Glu Ser Arg Asp Phe Ala Ile Phe Thr Glu Ser
165 170 175
Tyr Gly Gly His Tyr Gly Pro Glu Phe Ala Ser Tyr Ile Glu Gln Gln
180 185 190
Asn Ala Ala Ile Lys Ala Gly Ser Val Thr Gly Gln Asn Val Asn Ile
195 200 205
Val Ala Leu Gly Val Asn Asn Gly Trp Ile Asp Ala Thr Ile Gln Glu
210 215 220
Lys Ala Tyr Ile Asp Phe Ser Tyr Asn Asn Ser Tyr Gln Gln Ile Ile
225 230 235 240
Asp Ser Ser Thr Arg Asp Ser Leu Leu Asp Ala Tyr Asn Asn Gln Cys
245 250 255
Leu Pro Ala Leu Gln Gln Cys Ala Gln Ser Gly Ser Asn Ser Asp Cys
260 265 270
Thr Asn Ala Asp Ser Val Cys Tyr Gln Asn Ile Glu Gly Pro Ile Ser
275 280 285
Ser Ser Gly Asp Phe Asp Val Tyr Asp Ile Arg Glu Pro Ser Asn Asp
290 295 300
Pro Tyr Pro Pro Lys Thr Tyr Ser Thr Tyr Leu Ser Asp Pro Thr Val
305 310 315 320
Val Lys Ala Ile Gly Ala Arg Thr Asn Tyr Gln Glu Cys Pro Asn Gly
325 330 335
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340 345 350
Ser Thr Leu Ser Ser Val Val Gln Ser Gly Ile Asn Val Leu Val Trp
355 360 365
Ala Gly Asp Ala Asp Trp Ile Cys Asn Trp Leu Gly Asn Tyr Ala Val
370 375 380
Ala Asn Ala Val Asp Phe Pro Gly Asn Ala Gln Phe Ser Ala Met Asp
385 390 395 400
Leu Ala Pro Tyr Thr Val Asn Gly Val Glu Lys Gly Gln Phe Lys Thr
405 410 415
Val Asp Asn Phe Ser Phe Leu Lys Val Tyr Gly Ala Gly His Glu Val
420 425 430
Pro Tyr Tyr Gln Pro Asp Thr Ala Leu Gln Val Phe Lys Gln Ile Leu
435 440 445
Gln Lys Lys Pro Ile Ser Ser Thr
450 455
<210> 48
<211> 456
<212> PRT
<213> 瓦斯科尼青霉
<400> 48
Ala Pro Ala Ser Thr Ala Lys Asp Ser Val Ser Ser Val Val Lys Asn
1 5 10 15
Gly Val Lys Tyr Thr Val Phe Glu His Ala Ala Thr Gly Ala Lys Met
20 25 30
Glu Phe Val Lys Asn Ser Gly Ile Cys Glu Thr Thr Pro Gly Val Asn
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Gln Tyr Ser Gly Tyr Leu Ser Val Gly Ser Asn Met Asn Met Trp Phe
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Pro Ile Gly Val Gly Phe Ser Tyr Gly Thr Asp Asp Val Thr Ser Thr
130 135 140
Val Thr Ala Ala Pro Tyr Val Trp Lys Leu Leu Gln Ala Phe Tyr Ala
145 150 155 160
Gln Phe Pro Glu Tyr Glu Ser Arg Asp Phe Ala Ile Phe Thr Glu Ser
165 170 175
Tyr Gly Gly His Tyr Gly Pro Glu Phe Ala Ser Tyr Ile Gln Glu Gln
180 185 190
Asn Ala Ala Ile Thr Ala Gly Ser Val Ser Gly Gln Lys Ile Asn Leu
195 200 205
Ile Ala Leu Gly Val Asn Asn Gly Trp Ile Asp Ser Thr Ile Gln Glu
210 215 220
Lys Ala Tyr Ile Asp Phe Ser Tyr Asn Asn Ser Tyr Gln Gln Leu Ile
225 230 235 240
Asp Asp Ser Gln Arg Thr Ser Leu Leu Ser Ala Tyr Asn Lys Gln Cys
245 250 255
Leu Pro Ala Ile Gln Lys Cys Thr Gln Thr Gly Ser Asn Ser Ala Cys
260 265 270
Gln Asn Ala Ala Asn Val Cys Tyr Asn Asn Ile Glu Gly Pro Ile Ser
275 280 285
Ser Ser Gly Asp Trp Asp Val Tyr Asp Ile Arg Glu Pro Ser Asn Asp
290 295 300
Pro Tyr Pro Pro Ser Thr Tyr Ser Thr Tyr Leu Ala Asn Ser Asp Val
305 310 315 320
Val Lys Ala Ile Gly Ala Gln Ser Ser Tyr Gln Glu Cys Pro Asn Gly
325 330 335
Pro Tyr Asn Lys Phe Ala Ser Thr Gly Asp Asn Pro Arg Ser Phe Leu
340 345 350
Ser Thr Leu Ser Ser Val Val Lys Ser Gly Ile Asn Val Leu Val Trp
355 360 365
Ala Gly Asp Ala Asp Trp Ile Cys Asn Trp Leu Gly Asn Tyr Glu Val
370 375 380
Ala Asn Ala Val Asp Phe Ser Gly His Ala Glu Phe Ser Ala Lys Asp
385 390 395 400
Leu Ala Pro Tyr Thr Val Asn Gly Ala Glu Lys Gly Met Phe Lys Asn
405 410 415
Val Asp Asn Phe Ser Phe Leu Lys Val Tyr Gly Ala Gly His Glu Val
420 425 430
Pro Tyr Tyr Gln Pro Glu Thr Ala Leu Gln Val Phe Glu Gln Ile Leu
435 440 445
Gln Lys Lys Pro Ile Ser Ser Thr
450 455
<210> 49
<211> 454
<212> PRT
<213> 副榛色半内果菌
<400> 49
Ala Pro Ser Leu Arg Asp Lys Arg Ser Phe Val Glu Arg Asp Gly Val
1 5 10 15
Thr Tyr Thr Val Phe Glu His Ala Ala Thr Gly Ala Lys Met Glu Phe
20 25 30
Val Gln Asn Ser Gly Ile Cys Glu Thr Thr Pro Gly Val Asn Gln Tyr
35 40 45
Ser Gly Tyr Leu Ser Val Gly Asp Asn Met Asn Met Trp Phe Trp Phe
50 55 60
Phe Glu Ala Arg Asn Asn Pro Thr Ala Ala Pro Leu Ala Ala Trp Phe
65 70 75 80
Asn Gly Gly Pro Gly Cys Ser Ser Met Ile Gly Leu Phe Gln Glu Asn
85 90 95
Gly Pro Cys His Phe Val Asn Gly Glu Ser Thr Pro Ser Leu Asn Glu
100 105 110
Tyr Ser Phe Asn Asn Tyr Ala Asn Val Leu Tyr Val Asp Gln Pro Ile
115 120 125
Gly Thr Gly Phe Ser Tyr Gly Thr Asp Asp Val Thr Ser Thr Val Thr
130 135 140
Ala Ala Pro Tyr Val Trp Lys Leu Leu Gln Ala Phe Tyr Ala Gln Phe
145 150 155 160
Pro Glu Tyr Glu Ser Arg Asp Phe Gly Ile Phe Thr Glu Ser Tyr Gly
165 170 175
Gly His Tyr Gly Pro Glu Phe Ala Ser Tyr Ile Gln Glu Gln Asn Ala
180 185 190
Ala Ile Lys Ala Gly Ser Val Ser Gly Asp Asn Ile Asn Leu Val Ala
195 200 205
Leu Gly Ile Asn Asn Gly Trp Phe Asp Ala Gly Ile Gln Glu Lys Ala
210 215 220
Tyr Ile Asp Phe Ser Tyr Asn Asn Ser Tyr Arg Gln Ile Ile Ser Ser
225 230 235 240
Ser Gln Arg Ser Ser Tyr Leu Asp Ala Tyr Asn His Asp Cys Leu Pro
245 250 255
Ala Ile Glu Ser Cys Ala Ser Ser Gly Thr Asn Ser Ala Cys Lys Asn
260 265 270
Ala Glu Ser Val Cys Tyr Asn Gly Ile Glu Gly Pro Ile Ser Ser Ala
275 280 285
Ala Asp Phe Asp Val Tyr Asp Val Arg Gln Pro Ser Asn Asp Pro Tyr
290 295 300
Pro Pro Ala Thr Tyr Ser Thr Tyr Leu Gln Ser Ala Ser Val Arg Lys
305 310 315 320
Ala Ile Gly Ala Arg Thr Lys Tyr Gln Glu Cys Pro Asn Gly Pro Tyr
325 330 335
Asn Lys Phe Glu Thr Thr Gly Asp Asn Ser Arg Ser Phe Leu Ser Thr
340 345 350
Leu Ser Asp Val Val Asn Thr Gly Ile Thr Val Leu Val Trp Ala Gly
355 360 365
Asp Ala Asp Trp Ile Cys Asn Trp Val Gly Gly His Ala Val Ala Asp
370 375 380
Ala Val Thr Phe Ala Arg Gln Lys Thr Phe Gln Ala Lys Pro Leu Glu
385 390 395 400
Pro Tyr Thr Val Asn Gly Thr Glu Lys Gly Arg Phe Lys Thr Val Asp
405 410 415
Asn Phe Thr Phe Leu Arg Val Tyr Glu Ala Gly His Glu Val Pro Tyr
420 425 430
Tyr Gln Pro Glu Thr Ala Leu Gln Val Phe Val Gln Thr Met Gln Lys
435 440 445
Lys Ala Ile Phe Ser Thr
450
<210> 50
<211> 453
<212> PRT
<213> 多变篮状菌
<400> 50
Ala Ala Val Pro Gln Asp Lys Arg Ser Ile Val Lys Arg Asp Gly Val
1 5 10 15
Thr Tyr Asn Val Phe Glu His Ala Ala Thr Gly Ala Lys Met Glu Phe
20 25 30
Val Lys Asn Ser Gly Ile Cys Glu Thr Thr Pro Gly Val Asn Gln Tyr
35 40 45
Ser Gly Tyr Leu Ser Val Gly Asp Asn Met Asn Met Trp Phe Trp Phe
50 55 60
Phe Glu Ser Arg Asn Asn Ala Ser Gly Ala Pro Leu Ala Ala Trp Phe
65 70 75 80
Asn Gly Gly Pro Gly Cys Ser Ser Met Ile Gly Leu Phe Gln Glu Asn
85 90 95
Gly Pro Cys His Phe Val Asn Gly Glu Lys Lys Pro Ser Leu Asn Lys
100 105 110
Tyr Ser Phe Asn Glu Tyr Ala Asn Val Leu Tyr Val Asp Gln Pro Ile
115 120 125
Gly Val Gly Phe Ser Tyr Gly Thr Asp Asp Val Thr Ser Thr Glu Ser
130 135 140
Ala Ala Pro Tyr Val Trp Lys Leu Leu Gln Ala Phe Tyr Ala Gln Phe
145 150 155 160
Pro Gln Tyr Glu Ser Arg Asp Phe Gly Ile Phe Thr Glu Ser Tyr Gly
165 170 175
Gly His Tyr Gly Pro Glu Phe Ala His Tyr Leu Gln Gln Gln Asn Glu
180 185 190
Gly Val Lys Asn Gly Ser Val Asp Gly Glu Asn Ile Asn Leu Val Ala
195 200 205
Leu Gly Ile Asn Asn Gly Trp Phe Asp Thr Gln Leu Gln Glu Gly Ala
210 215 220
Tyr Ile Asp Tyr Ala Tyr Ser Asn Asn Tyr Lys Lys Ile Ile Asp Ser
225 230 235 240
Ser Gln Arg Ser Ser Leu Glu Asp Ser Leu Lys Ser Asp Cys Leu Pro
245 250 255
Ala Val Lys Gln Cys Leu Ser Ser Gly Ser Asp Ser Asp Cys Glu Asn
260 265 270
Ala Ser Asp Thr Cys Gly Gln Ile Glu Ser Ser Ile Gln Gln Ala Ala
275 280 285
Asp Phe Asp Val Tyr Asp Val Arg Glu Pro Ser Asn Asp Pro Tyr Pro
290 295 300
Pro Ser Thr Tyr Ser Asp Tyr Leu Ala Asp Ser Ser Val Val Lys Ala
305 310 315 320
Ile Gly Ala Lys Ser Thr Tyr Lys Glu Cys Pro Asn Gly Pro Tyr Tyr
325 330 335
Lys Phe Ser Ser Thr Gly Asp Asn Thr Arg Ser Phe Leu Ser Glu Leu
340 345 350
Ser Ser Val Val Gln Ser Gly Ile Gln Val Leu Val Trp Ala Gly Asp
355 360 365
Ala Asp Trp Ile Cys Asn Tyr Met Gly Val Gln Arg Val Ala Asp Ala
370 375 380
Val Glu Phe Asp Gly Ser Ser Gln Phe Ser Asn Ala Thr Leu Lys Pro
385 390 395 400
Tyr Thr Val Asn Gly Thr Lys Lys Gly Glu Tyr Lys Asn Val Asp Asn
405 410 415
Phe Ser Tyr Leu Arg Val Tyr Gly Ala Gly His Glu Val Pro Tyr Tyr
420 425 430
Gln Pro Ala Val Ala Leu Gln Val Phe Lys Gln Thr Met Gln Gln Gln
435 440 445
Ala Ile Lys Ser Thr
450
<210> 51
<211> 456
<212> PRT
<213> 沙地青霉
<400> 51
Ala Pro Ala Thr His Leu Gln Asp Lys Arg Ser Ile Val Glu Arg Asp
1 5 10 15
Gly Val Asn Tyr Thr Val Phe Glu His Ala Ala Thr Gly Ala Lys Leu
20 25 30
Glu Phe Val Thr Asn Ser Gly Ile Cys Glu Thr Thr Ser Gly Val Asn
35 40 45
Gln Tyr Ser Gly Tyr Leu Ser Val Gly Thr Asn Met Asn Met Trp Phe
50 55 60
Trp Phe Phe Glu Ser Arg Asn Ser Pro Ser Thr Ala Pro Leu Ala Ala
65 70 75 80
Trp Phe Asn Gly Gly Pro Gly Cys Ser Ser Met Ile Gly Leu Phe Gln
85 90 95
Glu Asn Gly Pro Cys Gln Phe Tyr Asp Gly Ala Ser Thr Pro Ser Leu
100 105 110
Asn Pro Tyr Ser Phe Asn Glu Tyr Ala Asn Met Ile Tyr Ile Asp Gln
115 120 125
Pro Ile Gly Val Gly Phe Ser Tyr Gly Thr Asp Asp Val Thr Ser Thr
130 135 140
Val Thr Ala Ala Pro Tyr Val Trp Lys Leu Ile Gln Ala Phe Tyr Ala
145 150 155 160
Ser Phe Pro Ala Tyr Glu Ser Arg Glu Phe Gly Leu Phe Thr Glu Ser
165 170 175
Tyr Gly Gly His Tyr Gly Pro Glu Phe Ala Tyr Tyr Ile Gln Gln Gln
180 185 190
Asn Ala Ala Ile Ala Ser Gly Thr Val Thr Gly Asp Thr Ile Asp Ile
195 200 205
Val Ala Leu Gly Ile Asn Asn Gly Trp Ile Asp Ser Ala Leu Gln Glu
210 215 220
Lys Ala Tyr Ile Glu Tyr Ser Tyr Asn Asn Ser Tyr Lys Gln Ile Ile
225 230 235 240
Thr Ser Ser Gln Arg Thr Ser Tyr Leu Ser Thr Tyr Thr Asn Asp Cys
245 250 255
Leu Pro Ala Ile Asn Lys Cys Thr Thr Gly Gly Ser Asn Ser Ala Cys
260 265 270
Ser Asn Ala Ala Asp Val Cys Tyr Asn Asp Ile Glu Ser Pro Ile Met
275 280 285
Ser Asp Ala Asp Phe Asp Val Tyr Asp Ile Arg Gln Pro Ser Asn Asp
290 295 300
Ala Tyr Pro Pro Glu Thr Tyr Val Thr Tyr Leu Gln Thr Ser Ser Val
305 310 315 320
Val Lys Ala Ile Gly Ala Ser Ser Thr Tyr Gln Glu Cys Pro Asp Ala
325 330 335
Pro Tyr Asn Lys Phe Ala Thr Thr Gly Asp Asn Asp Arg Ser Phe Leu
340 345 350
Ala Thr Leu Ser Thr Val Val Gln Ser Gly Ile Thr Val Leu Leu Trp
355 360 365
Ala Gly Asp Ala Asp Trp Ile Cys Asn Trp Val Gly Asn Gln Tyr Val
370 375 380
Ala Asp Ala Val Thr Trp Ser Gly Gln Ser Ser Phe Ala Ala Gln Thr
385 390 395 400
Leu Thr Pro Tyr Thr Val Asn Gly Ser Glu Val Gly Thr Phe Lys Thr
405 410 415
Leu Asp Asn Leu Ser Phe Leu Arg Val Tyr Glu Ala Gly His Glu Val
420 425 430
Pro Tyr Tyr Gln Pro Ala Thr Ala Leu Gln Ala Phe Ile Gln Thr Met
435 440 445
Gln Lys Lys Ala Leu Ser Ser Thr
450 455
<210> 52
<211> 354
<212> PRT
<213> 群山拟诺卡氏菌
<400> 52
Ala Pro Ala Pro Gln Asn Pro Thr Glu Pro Ala Glu Ala Thr Thr Met
1 5 10 15
Ala Glu Ala Leu Glu Arg Asp Leu Gly Leu Asn Glu Ala Glu Ala Thr
20 25 30
Asp Leu Ile Asp Ala Gln Glu Ser Ala Leu Asp Val Asp Ala Glu Ala
35 40 45
Thr Glu Ala Ala Gly Glu His Tyr Gly Gly Ser Leu Phe Asp Thr Glu
50 55 60
Thr His Asp Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Ser Ala Ala Val Pro Gly
65 70 75 80
Val Glu Ala Ala Gly Ala Glu Ala Ala Val Val Glu His Gly Val Glu
85 90 95
Gly Leu Asp Asp Leu Ile Ser Asp Leu Asp Ser Ala Gly Ala Gln Glu
100 105 110
Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Glu Val Glu Asn Asp Thr Val Val Ile
115 120 125
Glu Thr Leu Glu Gly Ala Asp Ala Asp Val Asp Ala Leu Leu Ser Ser
130 135 140
Ala Gly Val Asp Pro Ala Asp Val Arg Val Glu Thr Thr Asp Glu Ala
145 150 155 160
Pro Glu Val Tyr Ala Asn Ile Val Gly Gly Asp Ala Tyr Thr Ile Gly
165 170 175
Gly Ser Ser Arg Cys Ser Val Gly Phe Pro Ala Ser Asp Ser Tyr Gly
180 185 190
Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Thr Gly Ser Ser
195 200 205
Val Ser Ile Gly Asn Gly Ser Gly Val Phe Ser Gln Ser Val Phe Pro
210 215 220
Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Ser Leu Thr
225 230 235 240
Asn Leu Val Asn Arg Tyr Asn Ser Gly Ser Asp Val Ala Val Ser Gly
245 250 255
Ser Thr Gln Ala Pro Ile Gly Ser Gln Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr
260 265 270
Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Thr Val Ser
275 280 285
Tyr Pro Gln Gly Thr Val Arg Asp Leu Thr Arg Thr Ser Val Cys Ala
290 295 300
Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly Ser Gln Ala Gln
305 310 315 320
Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Trp Gly Gly Thr Thr
325 330 335
Tyr Tyr Gln Glu Val Asn Pro Met Leu Asn Ser Trp Asn Leu Asn Leu
340 345 350
Ser Thr
<210> 53
<211> 425
<212> PRT
<213> 微小链霉菌
<400> 53
Gly Thr Ala Pro Ser Pro Ala Ala Pro Thr Ala Ala Glu Ser Leu Arg
1 5 10 15
Ala Asp Ala Ala Pro Pro Ala Leu Leu Arg Ala Met Glu Arg Asp Leu
20 25 30
Gly Leu Gly Arg Glu Gln Ala Glu Arg Arg Leu Gly Asn Glu Ala Glu
35 40 45
Ala Gly Ala Val Ala Gly Arg Leu Arg Ala Asp Leu Gly Gly Asp Phe
50 55 60
Ala Gly Ala Trp Val Arg Gly Ala Glu Ser Gly Thr Leu Thr Val Ala
65 70 75 80
Thr Thr Asp Ala Ala Asp Val Pro Ala Ile Glu Ala Arg Gly Ala Val
85 90 95
Ala Glu Val Val Arg His Ser Leu Ala Asp Leu Gly Ala Ala Lys Ser
100 105 110
Arg Leu Asp Arg Ala Ala Ala His Arg Asp Thr Ala Glu Ala Pro Val
115 120 125
Arg Tyr Val Asp Val Arg Thr Asn Thr Val Thr Val Gln Ala Val Arg
130 135 140
Pro Ser Ala Ala Arg Ala Leu Leu Ala Ala Ala Gly Val Asp Ala Gly
145 150 155 160
Leu Ala Arg Val Glu Thr Ser Ala Glu Arg Pro Arg Pro Leu Tyr Asp
165 170 175
Leu Arg Gly Gly Glu Ala Tyr Tyr Ile Asn Asn Ser Gly Arg Cys Ser
180 185 190
Val Gly Phe Pro Val Thr Lys Gly Thr Gln Gln Gly Phe Ala Thr Ala
195 200 205
Gly His Cys Gly Arg Ala Gly Ala Ser Thr Ser Gly Ala Asn Arg Val
210 215 220
Ala Gln Gly Thr Phe Gln Gly Ser Val Phe Pro Gly Arg Asp Met Ala
225 230 235 240
Trp Val Ala Ala Asn Ser Gln Trp Thr Ala Thr Pro Tyr Val Ser Gly
245 250 255
Ala Gly Gly Gln Asn Val Gln Val Ala Gly Ser Thr Gln Ala Pro Val
260 265 270
Gly Ala Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly
275 280 285
Thr Ile Gln Gln His Asp Thr Ser Val Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Ile
290 295 300
Thr Gly Val Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly
305 310 315 320
Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly
325 330 335
Ser Gly Asn Cys Gly Ser Gly Gly Thr Thr Phe Phe Gln Pro Ile Asn
340 345 350
Pro Leu Leu Gln Asn Tyr Gly Leu Thr Leu Lys Thr Thr Gly Gly Gly
355 360 365
Gly Glu Asp Pro Gly Glu Pro Gly Glu Pro Gly Gly Thr Trp Ala Ala
370 375 380
Gly Thr Val Tyr Arg Pro Gly Asp Thr Val Thr Tyr Gly Gly Ala Thr
385 390 395 400
Tyr Arg Cys Leu Gln Gly His Gln Ala Gln Arg Gly Trp Glu Pro Ala
405 410 415
Asn Val Pro Ala Leu Trp Gln Arg Val
420 425
<210> 54
<211> 350
<212> PRT
<213> 内生糖多孢菌
<400> 54
Leu Thr Ala Thr Ile Ala Asp Pro Ala Gly Pro Pro Val Ser Pro Glu
1 5 10 15
Leu Val Thr Ala Met Gln Arg Asp Leu Gly Leu Thr Ala Asp Gln Ala
20 25 30
Val Ala Arg Leu Gly Gln Glu Ala Val Ala Ala Arg Ala Asp Ser Ala
35 40 45
Leu Arg Asp Ala Leu Ala Gly Ser Tyr Gly Gly Ser Tyr Phe Asp Ala
50 55 60
Asn Leu Gly Lys Leu Val Val Gly Thr Thr Asp Ala Ala Lys Ser Asp
65 70 75 80
Glu Val Arg Ala Ala Gly Ala Glu Pro Arg Gln Val Asp Ala Ser Glu
85 90 95
Arg Gln Leu Asp Gly Ile Val Glu Ala Leu Asn Gly Arg Gly Ala Gln
100 105 110
Val Pro Ala Ala Val Thr Gly Trp Tyr Ala Asp Val Arg Glu Asn Ala
115 120 125
Val Val Val Thr Thr Gln Pro Gly Thr Ala Glu Gln Ala Thr Gly Phe
130 135 140
Val Arg Asp Ala Gln Val Pro Gln Glu Ser Val Arg Val Trp Glu Ser
145 150 155 160
Pro Ala Gln Pro Glu Thr Tyr Ala Asp Val Val Gly Gly Tyr Ala Tyr
165 170 175
Tyr Thr Ala Ser Gly Ala Arg Cys Ser Met Gly Phe Ala Val Gln Gly
180 185 190
Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Ala Pro Gly Glu Ser Thr Thr
195 200 205
Gln Pro Thr Gly Tyr Phe Ala Gly Ser Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr
210 215 220
Ala Phe Val Asn Thr Gly Thr Asp Asp Thr Gly Tyr Pro Leu Val Tyr
225 230 235 240
Asn Tyr Ser Ser Gly Tyr Val Arg Val Ser Gly Ser Ala Glu Ala Pro
245 250 255
Leu Gly Ser Ser Ile Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys
260 265 270
Gly Thr Val Leu Ala Lys Asn Gln Ser Val Arg Tyr Gln Glu Gly Thr
275 280 285
Val Ser Gly Leu Thr Arg Thr Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser
290 295 300
Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly Asn Gln Ala Gln Gly Met Thr Ser Gly
305 310 315 320
Gly Trp Gly Asp Cys Arg Thr Gly Gly Glu Thr Tyr Tyr Gln Pro Val
325 330 335
Arg Glu Ala Leu Ser Ala Tyr Gly Leu Thr Leu Leu Thr Gln
340 345 350
<210> 55
<211> 355
<212> PRT
<213> 藤黄细胞壁
<400> 55
Ala Ser Gly Pro Leu Pro Gln Ser Pro Ser Pro Asp Ser Asp Val Ala
1 5 10 15
Thr Thr Met Ala Glu Ala Leu Glu Arg Asp Leu Asn Leu Thr Ser Thr
20 25 30
Glu Ala Gln Glu Leu Leu Thr Ala Gln Glu Ala Ala Phe Glu Ala Asp
35 40 45
Glu Ala Ala Ala Gln Ala Ala Gly Asp Ala Tyr Gly Gly Ser Val Phe
50 55 60
Asp Thr Glu Thr Leu Asp Leu Thr Val Met Val Thr Asp Ala Ala Ala
65 70 75 80
Val Gln Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Lys Ala Asp Val Val Ser Tyr
85 90 95
Gly Ile Asp Gly Leu Asp Thr Ile Ile Asp Asp Leu Asn Glu Ala Asp
100 105 110
Ala Pro Glu Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Ile Asp Ser Asp Thr
115 120 125
Val Val Leu Glu Val Leu Glu Gly Ser Gly Ala Asp Val Asp Ala Leu
130 135 140
Leu Ala Glu Ala Gly Val Asp Ala Ser Ala Val Lys Val Glu Ser Thr
145 150 155 160
Thr Glu Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr
165 170 175
Tyr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ser
180 185 190
Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly Thr
195 200 205
Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly Arg Gly Val Phe Glu Arg Ser Val Phe
210 215 220
Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu
225 230 235 240
Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Ser Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ser
245 250 255
Gly Ser Ser Val Ala Pro Ile Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser
260 265 270
Thr Thr Gly Trp Arg Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Thr Val
275 280 285
Thr Tyr Pro Gln Gly Thr Ile Tyr Asn Met Thr Arg Thr Ser Ala Cys
290 295 300
Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly Thr Gln Ala
305 310 315 320
Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Trp Gly Gly Thr
325 330 335
Thr Phe Tyr Gln Glu Val Asn Pro Met Leu Asn Ser Trp Asn Leu Arg
340 345 350
Leu Arg Thr
355
<210> 56
<211> 406
<212> PRT
<213> 澳大利亚糖丝菌
<400> 56
Gly Pro Pro Thr Thr His Gln Glu Glu Ser Gly Leu Ile Ala Ala Met
1 5 10 15
Ala Arg Asp Phe Lys Ile Thr Pro Asp Gln Ala Arg Ala Arg Leu Val
20 25 30
Arg Glu Ala Lys Ala Ala Thr Thr Glu Gln Ser Leu Lys Ser Arg Leu
35 40 45
Gly Gly His Tyr Ala Gly Ala Trp Leu Asn Glu Gly Ala Thr Glu Leu
50 55 60
Val Val Ala Val Thr Asp Ala Ala Gln Ala Lys Val Val Glu Asp Ala
65 70 75 80
Gly Ala Thr Pro Lys Val Val Gln Arg Ser Gln Ile Gln Leu Asp Glu
85 90 95
Leu Lys Ala Lys Leu Asp Ala Asn Lys Asn Ala Pro Lys Asp Val Pro
100 105 110
Ala Trp Tyr Val Asp Val Lys Thr Asn Ser Val Val Val Leu Ala Arg
115 120 125
Asn Thr Ala Ser Ala Lys Ala Phe Ala Arg Ala Ser Gly Leu Ser Glu
130 135 140
Ala Asp Val Arg Ile Glu Gln Ser Thr Glu Asp Pro Arg Pro Leu Ile
145 150 155 160
Asp Val Ile Gly Gly Asn Ala Tyr Tyr Met Gly Ser Gly Gly Arg Cys
165 170 175
Ser Val Gly Phe Ser Val Asn Gly Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys
180 185 190
Gly Arg Val Gly Thr Thr Thr Thr Gln Pro Ser Gly Thr Phe Ala Gly
195 200 205
Ser Thr Phe Pro Gly Arg Asp Tyr Ala Trp Val Arg Val Ser Ser Gly
210 215 220
Asn Thr Met Arg Gly Leu Val Asn Arg Tyr Pro Gly Thr Val Pro Val
225 230 235 240
Lys Gly Ser Asn Glu Ser Ser Val Gly Ala Ser Val Cys Arg Ser Gly
245 250 255
Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Gln Lys Asn Thr Ser
260 265 270
Val Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Ile Ser Gly Val Thr Arg Thr Asn Ala
275 280 285
Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Trp Leu Thr Gly Asp Gln
290 295 300
Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Ser Gly Gly
305 310 315 320
Thr Thr Tyr Phe Gln Pro Val Asn Pro Ile Leu Gln Ala Tyr Gly Leu
325 330 335
Gln Leu Val Ile Glu Gly Gly Pro Thr Gly Thr Thr Gly Pro Thr Thr
340 345 350
Thr Ser Ser Asn Pro Gly Gly Thr Thr Trp Gln Pro Gly Val Ala Tyr
355 360 365
Thr Ala Gly Thr Thr Val Thr Tyr Glu Gly Val Gly Tyr Glu Cys Leu
370 375 380
Gln Gly His Thr Ser Gln Ile Gly Trp Glu Pro Ser Ala Val Pro Ala
385 390 395 400
Leu Trp Glu Arg Val Gly
405
<210> 57
<211> 346
<212> PRT
<213> 拜城拟诺卡氏菌
<400> 57
Asp Ala Phe Pro Glu Gly Thr Glu Pro Leu Ala Glu Ala Ile Glu Arg
1 5 10 15
Asp Leu Gly Val Ala Ser Gly Gln Ala Asp Glu Leu Leu Thr Ala Glu
20 25 30
Glu Ser Ala Arg Ser Leu Glu Lys Glu Ala Glu Lys Ala Ala Gly Glu
35 40 45
Ala Phe Ala Gly Ala Val Phe Asp Thr Glu Thr His Glu Leu Thr Val
50 55 60
Ser Val Ala Asp Pro Ser Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala
65 70 75 80
Glu Thr Arg Val Val Glu Ala Ser Gln Asp Glu Leu Asp Ala Ala Met
85 90 95
Ala Asp Leu Asp Ala Ala Ser Glu Asp Gly Val Ser Glu Glu Val Thr
100 105 110
Gly Trp His Val Asp Leu Glu Ser Asn Thr Val Val Val Glu Ala Leu
115 120 125
Glu Gly Ser Glu Asp Ala Ala Glu Asp Leu Ile Ala Asp Ala Gly Leu
130 135 140
Asp Ser Ala Pro Val Val Val Glu Lys Ala Asp Ala Gln Pro Glu Thr
145 150 155 160
Phe Gly Ala Ile Val Gly Gly Asp Ala Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Arg
165 170 175
Cys Ser Ile Gly Phe Ser Val Arg Gly Gly Phe Val Thr Ala Gly His
180 185 190
Cys Gly Ser Thr Gly Thr Ser Val Ser Gly Ser Ala Gly Glu Ser Gly
195 200 205
Arg Val Ala Gly Ser Val Phe Pro Gly Arg Asp Met Gly Tyr Val Arg
210 215 220
Ala Asn Ser Gly Trp Thr Pro Ser Pro Tyr Val Asn Asn Tyr Arg Gly
225 230 235 240
Gly Arg Val Ala Val Arg Gly Ser Asn Glu Ala Ser Val Gly Ala Ser
245 250 255
Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln
260 265 270
Ala Lys Asn Gln Thr Val Asn Tyr Pro Gln Gly Thr Val Arg Gly Leu
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Thr Arg Thr Thr Ala Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Trp
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Leu Ser Gly Asn Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn
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Cys Ser Trp Gly Gly Thr Thr Phe Phe Gln Pro Val Asn Pro Ile Leu
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Ser Gln Trp Gly Leu Ser Leu Thr Thr Thr
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<211> 353
<212> PRT
<213> 链霉菌属物种
<400> 58
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Ala Gly Val Leu Asp Ala Met Glu Arg Asp Leu Gly Leu Ser Glu Gln
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Glu Ala Gly Leu Gln Leu Val Ala Gln Tyr Asp Ala Ser Leu Leu Gly
35 40 45
Glu Thr Leu Ser Ala Asp Leu Asp Ala Tyr Ala Gly Ser Trp Leu Ala
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Asp Gly Thr Asp Leu Val Val Ala Thr Thr Asp Arg Ala Glu Ala Ala
65 70 75 80
Gln Ile Thr Glu Ala Gly Ala Lys Val Glu Ile Val Asp His Thr Leu
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Gly Asp Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val
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Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Thr Ser Gly Gly Thr Thr Tyr His
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Gly
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<213> 斯比提异壁放线菌
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Leu Arg Ala Ser Leu Gly Pro Ala Phe Gly Gly Ala His Phe Asp Gly
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165 170 175
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195 200 205
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260 265 270
Trp Arg Cys Gly Thr Val Gln Ala Lys Asn Gln Thr Val Phe Tyr Ala
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Gln Gly Ala Val Ser Gly Leu Thr Arg Thr Asn Ala Cys Ala Glu Gly
290 295 300
Gly Asp Ser Gly Gly Ser Trp Leu Ser Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val
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Gln Pro Leu Asn Pro Ile Leu Ser Arg Trp Gly Leu Ser Leu Thr Arg
340 345 350
Gly
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<212> PRT
<213> 疣状丝衣霉
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Gly Ala Ile Ala Ser Thr Val Ser Lys Ala Ile Ala Pro Leu Asn Arg
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Arg Thr Asn Ile Ser Ser Cys Ser Gly Ser Glu Gln Ser Thr Leu Thr
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Met Ala Leu Lys Asn Ala Ala Ser Leu Ala His Ala Ala Ala Asp Ala
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Ala Glu Ser Gly Ser Ala Ser Lys Phe Ser Glu Tyr Phe Lys Thr Thr
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Ala Ser Ser Thr Arg Lys Thr Val Ala Ala Arg Leu Arg Ala Val Ala
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Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Ser Ser Thr Ser Leu Ser Ser Ser Gln Ala
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Val Met Asn Ala Asp Ser Tyr Ala Leu Tyr Ala Asn Ala Ile Tyr Val
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Gly Cys
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<212> PRT
<213> 栖土半内果菌
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Val Glu Phe Gln Gly Ile Leu Arg Arg Val Lys Tyr Thr Asp Val Ser
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Thr Asp Ser Val Thr Thr Leu Ala Pro Gly Ala Ser Ile Glu Asp Val
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Val Thr Gly Tyr Ala Arg Tyr Thr Ser Asn Glu Leu His Leu Asp Val
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Asp Gly Pro Ser Ala Ala Thr Val Ser Lys Ala Ile Ala Pro Leu Asp
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Arg Arg Thr Arg Leu Ser Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Ser Ala Leu
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Gln Thr Ala Leu Arg Asn Thr Val Ser Leu Ala Asn Ala Ala Ala Asn
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Ala Ala Arg Ser Gly Ser Ala Ser Lys Phe Ser Glu Tyr Phe Lys Thr
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Thr Ser Ser Ser Val Arg Ser Thr Val Ala Ala Arg Leu Ser Ala Val
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Leu Gly Cys
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<211> 334
<212> PRT
<213> 溜曲霉
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Ser Gln Val Gly Asn Thr Arg Ile Lys Ala Val Val Lys Asn Thr Gly
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Pro Val Gln Lys Val Ser Leu Phe Arg Asn Ala Thr Glu Val Gln Phe
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Leu Thr Thr Leu Ala Pro Gly Ala Thr Ile Glu Asp Glu Phe Asp Ile
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Asn Thr Val Ser Leu Ala Arg Ala Ala Ala Ser Ala Ala Gln Ser Gly
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Ser Ser Ser Arg Phe Gln Glu Tyr Phe Lys Thr Thr Ser Ser Ser Thr
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Ser Thr Ala Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Cys Ser Asp Val Tyr Gly
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Tyr Ser Ala Ala Thr Ala Leu Ser Ala Ser Gln Ala Leu Leu Asn Ala
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Asp Thr Tyr Ala Leu Phe Ala Asn Ala Val Asn Leu Asn Cys
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<211> 334
<212> PRT
<213> 霉白曲霉
<400> 63
Leu Pro Ala Lys Thr Gly Glu Gln Leu Gln Lys Leu Asp Val Ala Leu
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Ser Gln Val Asp Asn Thr Leu Ile Lys Ala Val Val Lys Asn Thr Gly
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Leu Thr Val Leu Ala Pro Gly Glu Ser Ile Glu Asp Glu Phe Asp Ile
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115 120 125
Pro Phe Ser Ser Asn Glu Leu Ser Val Glu Val Asp Ala Ala Gln Ala
130 135 140
Ala Ser Val Ala Ser Ala Val Lys Pro Leu Asp Arg Arg Thr Lys Val
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Ala Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Ser Ala Leu Thr Gln Ala Leu Arg
165 170 175
Asn Thr Val Ser Leu Ala Asn Ala Ala Ala Ser Ala Ala Gln Ser Gly
180 185 190
Ser Ser Thr Arg Phe Gln Glu Tyr Phe Lys Thr Thr Ser Ser Ser Val
195 200 205
Arg Ser Ser Val Ala Ala Arg Phe Arg Ala Val Ala Ser Glu Ala Ser
210 215 220
Ser Thr Ser Ala Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Cys Thr Asp Val Tyr Gly
225 230 235 240
Tyr Cys Ser Ser Asn Val Leu Ala Tyr Thr Leu Pro Ala Tyr Asn Ile
245 250 255
Ile Ala Asn Cys Asp Ile Tyr Tyr Thr Tyr Leu Pro Ala Leu Thr Ser
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Thr Cys His Ala Gln Asp Gln Ala Thr Thr Thr Leu His Glu Phe Thr
275 280 285
His Ala Pro Gly Val Tyr Ser Pro Gly Thr Asp Asp Leu Gly Tyr Gly
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Tyr Asp Ala Ala Thr Ala Leu Ser Ser Ser Gln Ala Leu Asn Asn Ala
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<211> 372
<212> PRT
<213> 菌核青霉
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Ile Pro Thr Gly Gly Lys Lys Ser Ser Phe Ser Val Asp Gln Val Ala
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Ile Pro Ala Thr Lys Thr Lys Asn Phe Ala Asp Thr Tyr Ala Arg Ala
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Ser Leu Ala Tyr Thr Asp Val Asp Asn Ser Gln Gly Phe Trp Glu Phe
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Thr Ala Asp Ser Tyr Lys Val Gly Ser Gln Ser Gly Ser Ser Ile Lys
245 250 255
Gly Ile Ala Asp Thr Gly Thr Thr Leu Leu Leu Leu Asp Asp Glu Val
260 265 270
Val Ser Ala Tyr Tyr Lys Gln Val Ser Gly Ala Ser Asp Ser Gln Ser
275 280 285
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Val Thr Ile Ser Gly Tyr Asp Ala Val Val Pro Gly Ser Leu Ile Asn
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Tyr Ala Pro Val Ser Asp Gly Ser Ser Thr Cys Leu Gly Gly Ile Gln
325 330 335
Ser Asn Ser Gly Ile Gly Phe Ser Ile Phe Gly Asp Ile Phe Leu Lys
340 345 350
Ser Gln Tyr Val Val Phe Asp Ser Asn Gly Pro Arg Leu Gly Phe Ala
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Ala Gln Ser Ser
370
<210> 65
<211> 371
<212> PRT
<213> 拜赖青霉
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Val Pro Thr Gly Gly Lys Lys Ser Phe Ser Ile Asn Gln Val Ala Ile
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Pro Ala Thr Lys Thr Lys Asn Phe Ala Gly Asn Tyr Ala His Ala Ile
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Ala Lys Tyr Gly Gly Asn Val Pro Ser His Val Glu Ala Ala Ala Gln
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Thr Gly Ser Ala Asp Leu Trp Val Phe Ser Ala Glu Leu Pro Ser Ala
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Glu Gln Ser Gly His Ala Leu Tyr Lys Pro Ser Asn Gly Thr Lys Leu
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Ser Gly Ala Ser Trp Ser Ile Ser Tyr Gly Asp Gly Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Gly Asp Val Tyr Lys Asp Thr Val Ser Val Gly Ser Val Lys Ala Thr
130 135 140
Gly Gln Ala Val Glu Ala Ala Ser Lys Ile Ser Ala Gln Phe Thr Lys
145 150 155 160
Asp Lys Asn Asn Asp Gly Leu Leu Gly Leu Ala Phe Ser Ser Ile Asn
165 170 175
Thr Val Lys Pro Lys Ala Gln Thr Thr Phe Phe Asp Thr Val Lys Ser
180 185 190
Ser Leu Ala Ser Pro Leu Phe Ala Val Thr Leu Lys His Asn Ala Pro
195 200 205
Gly Thr Tyr Asp Phe Gly Phe Ile Asp Lys Ser Lys Tyr Thr Gly Ser
210 215 220
Leu Ala Tyr Ala Asp Val Asp Asn Ser Gln Gly Phe Trp Glu Phe Thr
225 230 235 240
Ala Asp Ser Tyr Ser Val Gly Ser Ser Lys Gly Ser Ser Ile Lys Gly
245 250 255
Ile Ala Asp Thr Gly Thr Thr Leu Leu Leu Leu Asp Asp Glu Val Val
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Ser Ala Tyr Tyr Lys Gln Val Gln Gly Ala Gln Gln Asp Ser Ser Ala
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Gly Gly Tyr Thr Phe Asp Cys Ser Ser Lys Leu Pro Asp Phe Thr Val
290 295 300
Thr Ile Ser Gly Tyr Asp Ala Val Val Pro Gly Asp Leu Ile Asn Phe
305 310 315 320
Ala Pro Ala Ser Glu Gly Ser Ser Thr Cys Leu Gly Gly Ile Gln Ser
325 330 335
Asn Ser Gly Ile Gly Phe Ser Ile Phe Gly Asp Ile Phe Leu Lys Ser
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Gln Ser Ser
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<212> PRT
<213> 南极青霉
<400> 66
Ser Pro Leu Val Thr Pro Arg Lys Gly Phe Thr Ile Asn Gln Glu Thr
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Thr Lys Leu Ser Gly Ser Ser Trp Ser Ile Ser Tyr Gly Asp Gly Ser
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Ser Ala Ser Gly Asp Val Tyr Lys Asp Thr Val Thr Val Gly Gly Val
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Ser Val Val Ser Ala Tyr Tyr Lys Lys Val Ser Gly Ser Gln Asn Ser
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Ile Gln Ser Asn Ser Gly Ile Gly Phe Ser Ile Phe Gly Asp Ile Phe
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Leu Lys Ser Gln Tyr Val Val Phe Asp Ser Glu Gly Pro Arg Leu Gly
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Phe Ala Ala Gln Ala
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<210> 67
<211> 370
<212> PRT
<213> 苏门答腊青霉
<400> 67
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Leu Ser Lys Tyr Gly Ala Gly Val Pro Ser His Val Glu Ala Ala Ala
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Ala Ser Gly Asp Val Tyr Thr Asp Thr Val Thr Val Gly Gly Val Thr
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Ala Ser Lys Gln Ala Val Glu Ala Ala Lys Gln Ile Ser Ser Gln Phe
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Gln Gln Asp Thr Asp Asn Asp Gly Leu Leu Gly Leu Ala Phe Ser Ser
165 170 175
Ile Asn Thr Val Ser Pro Thr Pro Gln Lys Thr Phe Phe Asp Asn Val
180 185 190
Lys Ser Ser Leu Ser Gln Pro Leu Phe Ala Val Ala Leu Lys His Asn
195 200 205
Ala Pro Gly Val Tyr Asp Phe Gly Phe Ile Asp Ser Ser Lys His Thr
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Gly Ser Ile Ala Tyr Thr Ser Val Asp Ser Ser Gln Gly Phe Trp Ser
225 230 235 240
Phe Thr Val Asp Gly Tyr Lys Val Gly Ser Lys Ser Gly Ala Gly Phe
245 250 255
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275 280 285
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Asn Ser Gly Ile Gly Phe Ser Ile Phe Gly Asp Ile Phe Leu Lys Ser
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355 360 365
Gln Ala
370
<210> 68
<211> 384
<212> PRT
<213> lixii木霉
<400> 68
Leu Pro Thr Glu Gly Gln Lys Thr Ala Ser Ile Glu Val Thr Tyr Asn
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Lys Asn Tyr Val Ala His Gly Pro Thr Ala Leu Phe Lys Ala Lys Arg
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Lys His Ser Leu Thr Lys Arg Gln Thr Gly Ser Ala Asn Thr Asn Pro
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145 150 155 160
Ile Glu Ser Ala Thr Lys Val Ser Thr Gln Phe Val Gln Asp Thr Val
165 170 175
Ile Ser Gly Leu Val Gly Leu Gly Phe Asp Val Gly Asn Thr Val Lys
180 185 190
Pro Arg Ala Gln Lys Thr Trp Phe Ser Asn Ala Ala Ser Ser Leu Ala
195 200 205
Glu Pro Leu Phe Thr Ala Asp Leu Arg His Gln Glu Thr Gly Ser Tyr
210 215 220
Asn Phe Gly Phe Ile Asp Asn Ser Leu Ala Lys Gly Thr Ile Gly Tyr
225 230 235 240
Thr Pro Ala Asp Gly Ser Glu Gly Tyr Trp Gly Phe Thr Ala Thr Gly
245 250 255
Tyr Ser Val Gly Gly Ala Lys Leu Gly Arg Ser Ser Ile Thr Gly Ile
260 265 270
Ala Asp Thr Gly Thr Thr Leu Leu Leu Leu Pro Asp Asn Val Val Asp
275 280 285
Ala Tyr Tyr Asn Asn Val Glu Ser Ala Gln Tyr Asp Asp Ser Gln Glu
290 295 300
Gly Val Val Phe Asp Cys Ser Glu Asp Leu Pro Ser Phe Ser Phe Gly
305 310 315 320
Val Gly Gly Gln Thr Ile Thr Ile Ser Gly Asp Leu Leu Asn Leu Thr
325 330 335
Pro Ile Glu Glu Gly Ser Ser Thr Cys Phe Gly Gly Leu Gln Ser Ser
340 345 350
Ala Asp Ile Gly Ile Asn Ile Phe Gly Asp Val Ala Leu Lys Ala Ala
355 360 365
Leu Val Val Phe Asp Leu Gly Asn Glu Arg Leu Gly Phe Ala Gln Lys
370 375 380
<210> 69
<211> 384
<212> PRT
<213> 脐孢木霉
<400> 69
Leu Pro Thr Glu Gly Gln Lys Thr Ala Ser Val Glu Val Thr Tyr Asn
1 5 10 15
Gln Asn Tyr Ala Ala His Gly Pro Thr Gln Leu Tyr Lys Ala Lys Arg
20 25 30
Lys Tyr Gly Ala Pro Ile Ser Asp Asn Leu Lys Ala Ile Val Ala Asn
35 40 45
Arg Lys Ala Leu Ile Lys Arg Gln Thr Gly Ser Ala Pro Asn His Pro
50 55 60
Ser Asp Ser Ala Asp Asp Glu Tyr Ile Thr Asn Val Ser Ile Gly Thr
65 70 75 80
Pro Ala Gln Val Leu Pro Leu Asp Phe Asp Thr Gly Ser Ser Asp Leu
85 90 95
Trp Val Phe Ser Ser Glu Thr Pro Lys Ser Ser Ala Ser Gly His Thr
100 105 110
Ile Tyr Thr Pro Ser Lys Ser Ser Thr Ser Lys Lys Leu Ser Gly Ala
115 120 125
Thr Trp Ser Ile Glu Tyr Gly Asp Lys Ser Thr Ser Ser Gly Asp Val
130 135 140
Tyr Thr Asp Lys Val Thr Val Gly Gly Phe Ser Val Ser Thr Gln Ala
145 150 155 160
Val Glu Ser Ala Thr Lys Val Ser Ala Gln Phe Val Gln Asp Thr Ala
165 170 175
Asn Ser Gly Leu Leu Gly Leu Ala Phe Asp Ser Ile Asn Thr Val Ser
180 185 190
Pro Arg Gln Gln Lys Thr Trp Phe Ser Asn Ala Ala Asn Ser Leu Ala
195 200 205
Gln Pro Leu Phe Thr Ala Asn Leu Asn His Gln Ala Thr Gly Ser Tyr
210 215 220
Asn Phe Gly Phe Ile Asp Thr Ser Leu Ala Ser Gly Pro Ile Asn Tyr
225 230 235 240
Val Pro Val Asp Asn Ser Gln Gly Phe Trp Gly Phe Thr Ala Ser Gly
245 250 255
Tyr Ser Val Gly Gly Gly Lys Leu Asn Arg Ser Ser Leu Ser Gly Ile
260 265 270
Ala Asp Thr Gly Thr Thr Leu Leu Leu Leu Pro Asp Ala Val Val Asn
275 280 285
Ala Tyr Tyr Ala Asn Val Glu Ser Ala Glu Tyr Asp Asp Glu Gln Glu
290 295 300
Gly Val Val Phe Asp Cys Ser Glu Asp Leu Pro Thr Phe Ser Phe Gly
305 310 315 320
Val Gly Ser Gly Thr Ile Thr Ile Pro Gly Asp Leu Leu Asn Leu Thr
325 330 335
Pro Ile Asp Ser Ser Gly Gln Thr Cys Tyr Gly Gly Leu Gln Ser Ser
340 345 350
Ser Asp Ile Gly Ile Asn Ile Phe Gly Asp Val Ala Leu Lys Ala Ala
355 360 365
Leu Val Val Phe Asp Leu Gly Asn Glu Arg Leu Gly Trp Ala Gln Lys
370 375 380
<210> 70
<211> 379
<212> PRT
<213> 肉桂紫青霉
<400> 70
Ile Pro Thr Gly Val Pro Asn Arg Lys Gly Phe Thr Val Asn Gln Gln
1 5 10 15
Val Arg Pro Val Thr Asn Gly Thr Lys Ser Lys Thr Leu Asn Leu Pro
20 25 30
Ala Ile Tyr Ala Asn Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Val Ala Val Pro Ala
35 40 45
Asn Ile Lys Ala Ala Ala Glu Ser Gly Thr Ala Thr Thr Thr Pro Glu
50 55 60
Asp Asn Asp Ile Glu Tyr Leu Thr Pro Val Asp Val Gly Gly Thr Thr
65 70 75 80
Leu Asn Leu Asp Phe Asp Thr Gly Ser Ala Asp Leu Trp Val Phe Ser
85 90 95
Ser Glu Leu Pro Ser Ser Glu Ser Ser Gly His Ser Ile Tyr Lys Pro
100 105 110
Ser Gln Ser Gly Lys Lys Leu Asp Gly Tyr Ser Trp Lys Ile Ser Tyr
115 120 125
Gly Asp Ser Ser Ser Ala Ser Gly Asp Val Tyr Thr Asp Thr Val Thr
130 135 140
Val Gly Gly Val Thr Ala Asp Gly Gln Ala Val Glu Ala Ala Lys Lys
145 150 155 160
Ile Ser Gln Gln Phe Val Gln Asp Lys Asn Asn Asp Gly Leu Leu Gly
165 170 175
Leu Ala Phe Ser Ser Ile Asn Thr Val Gln Pro Lys Ala Gln Thr Thr
180 185 190
Phe Phe Asp Thr Val Lys Asp Gln Leu Asp Ser Pro Leu Phe Ala Val
195 200 205
Thr Leu Lys His Asn Ala Pro Gly Ser Tyr Asp Phe Gly Phe Ile Asp
210 215 220
Lys Ser Lys Tyr Thr Gly Ser Leu Thr Tyr Ala Asp Val Asp Lys Ser
225 230 235 240
Asp Gly Phe Trp Ala Phe Thr Ala Asp Gly Tyr Ser Val Gly Ser Gly
245 250 255
Ser Ser Ser Ser Ser Arg Ile Lys Gly Ile Ala Asp Thr Gly Thr Thr
260 265 270
Leu Leu Leu Ile Asp Asp Glu Ile Val Ser Ala Tyr Tyr Lys Gln Val
275 280 285
Asp Gly Ala Gln Glu Ser Tyr Ser Val Gly Gly Tyr Thr Phe Asp Cys
290 295 300
Ser Thr Lys Leu Pro Asp Phe Asn Ile Lys Ile Gly Asp Tyr Thr Ala
305 310 315 320
Val Ile Pro Gly Asp Val Ile Asn Tyr Ala Pro Val Gln Gln Gly Ser
325 330 335
Ser Thr Cys Phe Gly Gly Ile Gln Ser Asn Ser Gly Leu Pro Phe Ser
340 345 350
Ile Phe Gly Asp Ile Phe Leu Lys Ser Gln Tyr Val Val Phe Asp Ala
355 360 365
Asn Gly Pro Arg Leu Gly Phe Ala Ala Gln Ala
370 375
<210> 71
<211> 350
<212> PRT
<213> 地衣芽孢杆菌
<400> 71
Ala Gln Pro Ala Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys
1 5 10 15
Ser Gly Val Lys Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser
20 25 30
Gly Gly Lys Val Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala
35 40 45
Lys Leu Asp Lys Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val
50 55 60
Ala Tyr Val Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Leu Ala Gln Thr Val
65 70 75 80
Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val Gln Ala Gln Gly
85 90 95
Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Gln
100 105 110
Ala Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala
115 120 125
Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala
130 135 140
Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val Leu Gly Val Ala
145 150 155 160
Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Ser Ser Gly Ser
165 170 175
Gly Ser Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn
180 185 190
Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala Ser Gly Ser Thr
195 200 205
Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val Val Val
210 215 220
Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile
225 230 235 240
Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp
245 250 255
Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu
260 265 270
Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Thr
275 280 285
Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly
290 295 300
Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln
305 310 315 320
Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe
325 330 335
Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln
340 345 350
<210> 72
<211> 360
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 72
Phe Ser Asn Met Ser Ala Gln Ala Ala Gly Lys Ser Ser Thr Glu Lys
1 5 10 15
Lys Tyr Ile Val Gly Phe Lys Gln Thr Met Ser Ala Met Ser Ser Ala
20 25 30
Lys Lys Lys Asp Val Ile Ser Glu Lys Gly Gly Lys Val Gln Lys Gln
35 40 45
Phe Lys Tyr Val Asn Ala Ala Ala Ala Thr Leu Asp Glu Lys Ala Val
50 55 60
Lys Glu Leu Lys Lys Asp Pro Ser Val Ala Tyr Val Glu Glu Asp His
65 70 75 80
Ile Ala His Glu Tyr Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Ile Ser Gln Ile
85 90 95
Lys Ala Pro Ala Leu His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys
100 105 110
Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Asn
115 120 125
Val Arg Gly Gly Ala Ser Phe Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Tyr Gln
130 135 140
Asp Gly Ser Ser His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu
145 150 155 160
Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr
165 170 175
Ala Val Lys Val Leu Asp Ser Thr Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile
180 185 190
Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ser Asn Asn Met Asp Val Ile Asn
195 200 205
Met Ser Leu Gly Gly Pro Thr Gly Ser Thr Ala Leu Lys Thr Val Val
210 215 220
Asp Lys Ala Val Ser Ser Gly Ile Val Val Ala Ala Ala Ala Gly Asn
225 230 235 240
Glu Gly Ser Ser Gly Ser Thr Ser Thr Val Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr
245 250 255
Pro Ser Thr Ile Ala Val Gly Ala Val Asn Ser Ser Asn Gln Arg Ala
260 265 270
Ser Phe Ser Ser Ala Gly Ser Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val
275 280 285
Ser Ile Gln Ser Thr Leu Pro Gly Gly Thr Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly
290 295 300
Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu
305 310 315 320
Ser Lys His Pro Thr Trp Thr Asn Ala Gln Val Arg Asp Arg Leu Glu
325 330 335
Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu
340 345 350
Ile Asn Val Gln Ala Ala Ala Gln
355 360
<210> 73
<211> 548
<212> PRT
<213> 变色栓菌相似种
<400> 73
Thr Pro Thr Ala Arg Asn Leu Lys Leu His Glu Ser Arg Glu Glu Ile
1 5 10 15
Pro Ala Gly Phe Ser Leu Ser Gly Ala Ala Ser Pro Asp Thr Thr Leu
20 25 30
Lys Leu Arg Leu Ala Leu Val Gln Ser Asn Phe Ala Glu Leu Glu Asp
35 40 45
Lys Leu Tyr Asp Val Ser Thr Pro Ser Ser Ala Asn Tyr Gly Gln His
50 55 60
Leu Ser Lys Glu Glu Val Glu Gln Leu Val Ala Pro Ser Ala Glu Ser
65 70 75 80
Val Asn Ala Val Asn Ala Trp Leu Thr Glu Asn Gly Leu Thr Ala Gln
85 90 95
Thr Ile Ser Pro Ala Gly Asp Trp Leu Ala Phe Glu Val Pro Val Ser
100 105 110
Lys Ala Asn Glu Leu Phe Asp Ala Asp Phe Ser Val Phe Thr His Asp
115 120 125
Glu Ser Gly Leu Lys Ala Val Arg Thr Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Ala
130 135 140
Glu Leu Gln Gly His Leu Asp Leu Val His Pro Thr Ile Thr Phe Pro
145 150 155 160
Asn Pro Asn Ser His Leu Pro Val Val Arg Ser Pro Val Lys Pro Val
165 170 175
Gln Asn Leu Thr Ser Arg Ala Val Pro Ala Ser Cys Ala Ser Thr Ile
180 185 190
Thr Pro Ala Cys Leu Gln Ala Leu Tyr Gly Ile Pro Thr Thr Lys Ala
195 200 205
Thr Gln Ser Ser Asn Lys Leu Ala Val Ser Gly Phe Ile Asp Gln Phe
210 215 220
Ala Asn Ser Ala Asp Leu Lys Thr Phe Leu Gly Lys Phe Arg Thr Asp
225 230 235 240
Ile Ser Ser Ser Thr Thr Phe Thr Leu Gln Thr Leu Asp Gly Gly Ser
245 250 255
Asn Ser Gln Ser Ser Ser Gln Ala Gly Val Glu Ala Asn Leu Asp Ile
260 265 270
Gln Tyr Thr Val Gly Leu Ala Ser Ala Val Pro Thr Ile Phe Ile Ser
275 280 285
Val Gly Asp Asp Phe Gln Asp Gly Asp Leu Glu Gly Phe Leu Asp Ile
290 295 300
Ile Asn Phe Leu Leu Asn Glu Ser Ala Pro Pro Gln Val Leu Thr Thr
305 310 315 320
Ser Tyr Gly Gln Asn Glu Asn Thr Ile Ser Ala Lys Leu Ala Asn Gln
325 330 335
Leu Cys Asn Ala Tyr Ala Gln Leu Gly Ala Arg Gly Thr Ser Ile Leu
340 345 350
Phe Ala Ser Gly Asp Gly Gly Val Ser Gly Ser Gln Ser Ser Ser Cys
355 360 365
Ser Lys Phe Val Pro Thr Phe Pro Ser Gly Cys Pro Phe Met Thr Ser
370 375 380
Val Gly Ala Thr Gln Gly Ile Asn Pro Glu Thr Ala Ala Asp Phe Ser
385 390 395 400
Ser Gly Gly Phe Ser Asn Val Phe Ala Arg Pro Ser Tyr Gln Ser Thr
405 410 415
Ala Val Ser Ser Tyr Leu Thr Ala Leu Gly Ser Thr Asn Ser Gly Lys
420 425 430
Phe Asn Thr Ser Gly Arg Ala Phe Pro Asp Ile Ala Thr Gln Gly Val
435 440 445
Asp Phe Glu Ile Val Val Ser Gly Arg Thr Glu Gly Val Asp Gly Thr
450 455 460
Ser Cys Ala Ser Pro Thr Leu Ala Ala Ile Ile Ser Leu Leu Asn Asp
465 470 475 480
Arg Leu Ile Ala Ala Gly Lys Ser Pro Leu Gly Phe Leu Asn Pro Phe
485 490 495
Leu Tyr Ser Ala Ala Gly Thr Ala Ala Leu Thr Asp Ile Thr Ser Gly
500 505 510
Ser Asn Pro Gly Cys Asn Thr Asn Gly Phe Pro Ala Lys Ala Gly Trp
515 520 525
Asp Pro Val Thr Gly Leu Gly Thr Pro Asn Phe Ala Lys Leu Leu Thr
530 535 540
Ala Val Gly Leu
545
<210> 74
<211> 439
<212> PRT
<213> 普通牛
<400> 74
Met Ala Lys Glu Tyr Phe Pro Phe Thr Gly Lys Ile Pro Phe Glu Gly
1 5 10 15
Lys Asp Ser Lys Asn Val Met Ala Phe His Tyr Tyr Glu Pro Glu Lys
20 25 30
Val Val Met Gly Lys Lys Met Lys Asp Trp Leu Lys Phe Ala Met Ala
35 40 45
Trp Trp His Thr Leu Gly Gly Ala Ser Ala Asp Gln Phe Gly Gly Gln
50 55 60
Thr Arg Ser Tyr Glu Trp Asp Lys Ala Glu Cys Pro Val Gln Arg Ala
65 70 75 80
Lys Asp Lys Met Asp Ala Gly Phe Glu Ile Met Asp Lys Leu Gly Ile
85 90 95
Glu Tyr Phe Cys Phe His Asp Val Asp Leu Val Glu Glu Ala Pro Thr
100 105 110
Ile Ala Glu Tyr Glu Glu Arg Met Lys Ala Ile Thr Asp Tyr Ala Gln
115 120 125
Glu Lys Met Lys Gln Phe Pro Asn Ile Lys Leu Leu Trp Gly Thr Ala
130 135 140
Asn Val Phe Gly Asn Lys Arg Tyr Ala Asn Gly Ala Ser Thr Asn Pro
145 150 155 160
Asp Phe Asp Val Val Ala Arg Ala Ile Val Gln Ile Lys Asn Ser Ile
165 170 175
Asp Ala Thr Ile Lys Leu Gly Gly Thr Asn Tyr Val Phe Trp Gly Gly
180 185 190
Arg Glu Gly Tyr Met Ser Leu Leu Asn Thr Asp Gln Lys Arg Glu Lys
195 200 205
Glu His Met Ala Thr Met Leu Gly Met Ala Arg Asp Tyr Ala Arg Ala
210 215 220
Lys Gly Phe Lys Gly Thr Phe Leu Ile Glu Pro Lys Pro Met Glu Pro
225 230 235 240
Ser Lys His Gln Tyr Asp Val Asp Thr Glu Thr Val Ile Gly Phe Leu
245 250 255
Lys Ala His Gly Leu Asp Lys Asp Phe Lys Val Asn Ile Glu Val Asn
260 265 270
His Ala Thr Leu Ala Gly His Thr Phe Glu His Glu Leu Ala Cys Ala
275 280 285
Val Asp Ala Gly Met Leu Gly Ser Ile Asp Ala Asn Arg Gly Asp Ala
290 295 300
Gln Asn Gly Trp Asp Thr Asp Gln Phe Pro Ile Asp Asn Phe Glu Leu
305 310 315 320
Thr Gln Ala Met Leu Glu Ile Ile Arg Asn Gly Gly Leu Gly Asn Gly
325 330 335
Gly Thr Asn Phe Asp Ala Lys Ile Arg Arg Asn Ser Thr Asp Leu Glu
340 345 350
Asp Leu Phe Ile Ala His Ile Ser Gly Met Asp Ala Met Ala Arg Ala
355 360 365
Leu Met Asn Ala Ala Asp Ile Leu Glu Asn Ser Glu Leu Pro Ala Met
370 375 380
Lys Lys Ala Arg Tyr Ala Ser Phe Asp Ser Gly Ile Gly Lys Asp Phe
385 390 395 400
Glu Asp Gly Lys Leu Thr Phe Glu Gln Val Tyr Glu Tyr Gly Lys Lys
405 410 415
Val Glu Glu Pro Lys Gln Thr Ser Gly Lys Gln Glu Lys Tyr Glu Thr
420 425 430
Ile Val Ala Leu His Cys Lys
435
<210> 75
<211> 591
<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<400> 75
Met Leu Cys Ser Val Ile Gln Arg Gln Thr Arg Glu Val Ser Asn Thr
1 5 10 15
Met Ser Leu Asp Ser Tyr Tyr Leu Gly Phe Asp Leu Ser Thr Gln Gln
20 25 30
Leu Lys Cys Leu Ala Ile Asn Gln Asp Leu Lys Ile Val His Ser Glu
35 40 45
Thr Val Glu Phe Glu Lys Asp Leu Pro His Tyr His Thr Lys Lys Gly
50 55 60
Val Tyr Ile His Gly Asp Thr Ile Glu Cys Pro Val Ala Met Trp Leu
65 70 75 80
Gly Ala Leu Asp Leu Val Leu Ser Lys Tyr Arg Glu Ala Lys Phe Pro
85 90 95
Leu Asn Lys Val Met Ala Val Ser Gly Ser Cys Gln Gln His Gly Ser
100 105 110
Val Tyr Trp Ser Ser Gln Ala Glu Ser Leu Leu Glu Gln Leu Asn Lys
115 120 125
Lys Pro Glu Lys Asp Leu Leu His Tyr Val Ser Ser Val Ala Phe Ala
130 135 140
Arg Gln Thr Ala Pro Asn Trp Gln Asp His Ser Thr Ala Lys Gln Cys
145 150 155 160
Gln Glu Phe Glu Glu Cys Ile Gly Gly Pro Glu Lys Met Ala Gln Leu
165 170 175
Thr Gly Ser Arg Ala His Phe Arg Phe Thr Gly Pro Gln Ile Leu Lys
180 185 190
Ile Ala Gln Leu Glu Pro Glu Ala Tyr Glu Lys Thr Lys Thr Ile Ser
195 200 205
Leu Val Ser Asn Phe Leu Thr Ser Ile Leu Val Gly His Leu Val Glu
210 215 220
Leu Glu Glu Ala Asp Ala Cys Gly Met Asn Leu Tyr Asp Ile Arg Glu
225 230 235 240
Arg Lys Phe Met Tyr Glu Leu Leu His Leu Ile Asp Ser Ser Ser Lys
245 250 255
Asp Lys Thr Ile Arg Gln Lys Leu Met Arg Ala Pro Met Lys Asn Leu
260 265 270
Ile Ala Gly Thr Ile Cys Lys Tyr Phe Ile Glu Lys Tyr Gly Phe Asn
275 280 285
Thr Asn Cys Lys Val Ser Pro Met Thr Gly Asp Asn Leu Ala Thr Ile
290 295 300
Cys Ser Leu Pro Leu Arg Lys Asn Asp Val Leu Val Ser Leu Gly Thr
305 310 315 320
Ser Thr Thr Val Leu Leu Val Thr Asp Lys Tyr His Pro Ser Pro Asn
325 330 335
Tyr His Leu Phe Ile His Pro Thr Leu Pro Asn His Tyr Met Gly Met
340 345 350
Ile Cys Tyr Cys Asn Gly Ser Leu Ala Arg Glu Arg Ile Arg Asp Glu
355 360 365
Leu Asn Lys Glu Arg Glu Asn Asn Tyr Glu Lys Thr Asn Asp Trp Thr
370 375 380
Leu Phe Asn Gln Ala Val Leu Asp Asp Ser Glu Ser Ser Glu Asn Glu
385 390 395 400
Leu Gly Val Tyr Phe Pro Leu Gly Glu Ile Val Pro Ser Val Lys Ala
405 410 415
Ile Asn Lys Arg Val Ile Phe Asn Pro Lys Thr Gly Met Ile Glu Arg
420 425 430
Glu Val Ala Lys Phe Lys Asp Lys Arg His Asp Ala Lys Asn Ile Val
435 440 445
Glu Ser Gln Ala Leu Ser Cys Arg Val Arg Ile Ser Pro Leu Leu Ser
450 455 460
Asp Ser Asn Ala Ser Ser Gln Gln Arg Leu Asn Glu Asp Thr Ile Val
465 470 475 480
Lys Phe Asp Tyr Asp Glu Ser Pro Leu Arg Asp Tyr Leu Asn Lys Arg
485 490 495
Pro Glu Arg Thr Phe Phe Val Gly Gly Ala Ser Lys Asn Asp Ala Ile
500 505 510
Val Lys Lys Phe Ala Gln Val Ile Gly Ala Thr Lys Gly Asn Phe Arg
515 520 525
Leu Glu Thr Pro Asn Ser Cys Ala Leu Gly Gly Cys Tyr Lys Ala Met
530 535 540
Trp Ser Leu Leu Tyr Asp Ser Asn Lys Ile Ala Val Pro Phe Asp Lys
545 550 555 560
Phe Leu Asn Asp Asn Phe Pro Trp His Val Met Glu Ser Ile Ser Asp
565 570 575
Val Asp Asn Glu Asn Trp Ile Ala Ile Ile Pro Arg Leu Ser Pro
580 585 590
<210> 76
<211> 444
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 76
Glu Thr Ala Asn Lys Ser Asn Glu Leu Thr Ala Pro Ser Ile Lys Ser
1 5 10 15
Gly Thr Ile Leu His Ala Trp Asn Trp Ser Phe Asn Thr Leu Lys His
20 25 30
Asn Met Lys Asp Ile His Asp Ala Gly Tyr Thr Ala Ile Gln Thr Ser
35 40 45
Pro Ile Asn Gln Val Lys Glu Gly Asn Gln Gly Asp Lys Ser Met Ser
50 55 60
Asn Trp Tyr Trp Leu Tyr Gln Pro Thr Ser Tyr Gln Ile Gly Asn Arg
65 70 75 80
Tyr Leu Gly Thr Glu Gln Glu Phe Lys Glu Met Cys Ala Ala Ala Glu
85 90 95
Glu Tyr Gly Ile Lys Val Ile Val Asp Ala Val Ile Asn His Thr Thr
100 105 110
Phe Asp Tyr Ala Ala Ile Ser Asn Glu Val Lys Ser Ile Pro Asn Trp
115 120 125
Thr His Gly Asn Thr Gln Ile Lys Asn Trp Ser Asp Arg Trp Asp Val
130 135 140
Thr Gln Asn Ser Leu Leu Gly Leu Tyr Asp Trp Asn Thr Gln Asn Thr
145 150 155 160
Gln Val Gln Ser Tyr Leu Lys Arg Phe Leu Glu Arg Ala Leu Asn Asp
165 170 175
Gly Ala Asp Gly Phe Arg Phe Asp Ala Ala Lys His Ile Glu Leu Pro
180 185 190
Asp Asp Gly Ser Tyr Gly Ser Gln Phe Trp Pro Asn Ile Thr Asn Thr
195 200 205
Ser Ala Glu Phe Gln Tyr Gly Glu Ile Leu Gln Asp Ser Ala Ser Arg
210 215 220
Asp Ala Ala Tyr Ala Asn Tyr Met Asp Val Thr Ala Ser Asn Tyr Gly
225 230 235 240
His Ser Ile Arg Ser Ala Leu Lys Asn Arg Asn Leu Gly Val Ser Asn
245 250 255
Ile Ser His Tyr Ala Tyr Asp Val Ser Ala Asp Lys Leu Val Thr Trp
260 265 270
Val Glu Ser His Asp Thr Tyr Ala Asn Asp Asp Glu Glu Ser Thr Trp
275 280 285
Met Ser Asp Asp Asp Ile Arg Leu Gly Trp Ala Val Ile Ala Ser Arg
290 295 300
Ser Gly Ser Thr Pro Leu Phe Phe Ser Arg Pro Glu Gly Gly Gly Asn
305 310 315 320
Gly Val Arg Phe Pro Gly Lys Ser Gln Ile Gly Asp Arg Gly Ser Ala
325 330 335
Leu Phe Glu Asp Gln Ser Ile Thr Ala Val Asn Arg Phe His Asn Val
340 345 350
Met Ala Gly Gln Pro Glu Glu Leu Ser Asn Pro Asn Gly Asn Asn Gln
355 360 365
Ile Phe Met Asn Gln Arg Gly Ser His Gly Val Val Leu Ala Asn Ala
370 375 380
Gly Ser Ser Ser Val Ser Ile Asn Thr Pro Thr Lys Leu Pro Asp Gly
385 390 395 400
Arg Tyr Asp Asn Lys Ala Gly Ala Gly Ser Phe Gln Val Asn Asp Gly
405 410 415
Lys Leu Thr Gly Thr Ile Asn Ala Arg Ser Val Ala Val Leu Tyr Pro
420 425 430
Asp Asp Ile Glu Ile Arg Cys Asn Thr Phe Phe Gln
435 440
<210> 77
<211> 476
<212> PRT
<213> 扣囊复膜酵母菌
<400> 77
Gln Pro Val Thr Leu Phe Lys Arg Glu Thr Asn Ala Asp Lys Trp Arg
1 5 10 15
Ser Gln Ser Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Ala Arg Thr Asp
20 25 30
Gly Asp Thr Ser Ala Ser Cys Asn Thr Glu Asp Arg Leu Tyr Cys Gly
35 40 45
Gly Ser Phe Gln Gly Ile Ile Lys Lys Leu Asp Tyr Ile Lys Asp Met
50 55 60
Gly Phe Thr Ala Ile Trp Ile Ser Pro Val Val Glu Asn Ile Pro Asp
65 70 75 80
Asn Thr Ala Tyr Gly Tyr Ala Tyr His Gly Tyr Trp Met Lys Asn Ile
85 90 95
Tyr Lys Ile Asn Glu Asn Phe Gly Thr Ala Asp Asp Leu Lys Ser Leu
100 105 110
Ala Gln Glu Leu His Asp Arg Asp Met Leu Leu Met Val Asp Ile Val
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Ile Asp Gly Leu Arg Ile Asp Ser Ala Lys His Val Asp Gln Gly Phe
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<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 84
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Asp Glu Phe His Ala Ala Met Asn Tyr Pro Phe Thr Glu Pro Met Ile
370 375 380
Glu Tyr Phe Ala Asp Gln Thr Ile Ser Ala Ser Arg Met Ala His Arg
385 390 395 400
Val Asn Ala His Leu Met Asn Gly Met Lys Gln Ala Asn Glu Val Met
405 410 415
Phe Asn Leu Leu Asp Ser His Asp Thr Lys Arg Leu Leu Thr Arg Cys
420 425 430
Arg Asn Asp Glu Lys Lys Ala Arg Ala Leu Leu Ala Phe Met Phe Ala
435 440 445
Gln Thr Gly Ser Pro Cys Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Ile Gly Leu Asp
450 455 460
Gly Glu Asn Asp Pro Leu Cys Arg Lys Cys Met Val Trp Glu Lys Glu
465 470 475 480
Lys Gln Asn Gln Asp Met Leu Gln Phe Met Lys Arg Leu Ile Ala Leu
485 490 495
Arg Lys Gln Glu Asn Thr Leu Leu Thr Glu Gly His Leu Glu Trp Asn
500 505 510
Leu Leu Asp Asp Lys Asn Asp Phe Ile Ser Phe Ser Arg Thr Leu Asp
515 520 525
Glu Lys Ile Leu Ile Tyr Phe Phe Asn Gln Gly Asn Val Val Gln His
530 535 540
Ile Ser Leu Arg Glu Leu Asn Ile Asp Arg Asn Asn Lys Ile Cys Asp
545 550 555 560
Ala Trp Thr Glu Gln Pro Leu His Tyr His Asp Val Ile Ala Val Gln
565 570 575
Pro Gly Glu Phe Leu Ile Leu Ser Ala Ala Ala Pro Val
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<210> 85
<211> 483
<212> PRT
<213> 地衣芽孢杆菌
<400> 85
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1 5 10 15
Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu
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Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly
35 40 45
Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu
50 55 60
Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys
65 70 75 80
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85 90 95
Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr
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Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro
130 135 140
Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe
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Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe
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Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met
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355 360 365
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370 375 380
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405 410 415
Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
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Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr
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<213> 黑曲霉
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<212> PRT
<213> 黑曲霉
<400> 87
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Asp Arg Phe Ala Arg Thr Asp Gly Ser Thr Thr Ala Thr Cys Asn Thr
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<212> PRT
<213> 发酵植物多糖梭菌
<400> 89
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Gly Tyr Asp Val Ile Asn Lys Ile Leu Leu Gln Ala Gly Leu Ser Lys
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Asn Arg Ile Ala Gly Lys Lys Leu Gly Asn Gly Phe Phe Asp Ala Leu
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195 200 205
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Gly Ser Ala Trp Asn His Tyr Pro Glu Glu Asp Leu Trp Gly Leu His
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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Ile Gln Lys Glu Ala Phe Thr Pro Tyr Gln Ala Phe Ser Val Gly Glu
325 330 335
Thr Pro Gly Ile Gly Met Lys Met Gly Lys Leu Leu Thr Asp Asp Ser
340 345 350
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355 360 365
Gly His Ala Arg Phe Asp Gln Tyr Glu Tyr Asp Leu Asn Tyr Tyr Lys
370 375 380
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385 390 395 400
Ser Leu Phe Tyr Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Met Leu Ser Lys Val
405 410 415
Asp His Thr His Thr His Arg Gln Glu Leu Ala Lys Met Leu Ala Met
420 425 430
Ile Gln Met Thr Leu Lys Gly Thr Pro Phe Leu Tyr Gln Gly Gln Glu
435 440 445
Leu Gly Met Ile Asn Lys Asp Phe His Glu Ile Ser Asn Phe Arg Asp
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Ile Ala Leu Arg Arg Lys Thr Pro Ala Leu Ile Tyr Gly Asp Ile Glu
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<212> PRT
<213> 发酵植物多糖梭菌
<400> 90
Ala Thr Asp Thr Ile Thr Ile His Tyr His Arg Asp Asp Gly Asp Tyr
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Glu Lys Trp Asn Leu Trp Leu Trp Ala Glu Gly Lys Asp Gly Ala Ala
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Tyr Tyr Phe Asp Gly Glu Asp Ala Phe Gly Pro Tyr Val Ser Val Ser
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Pro Glu Gly Tyr Glu Lys Glu Val Ser Ile Glu Ser Phe Gln Leu Lys
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Leu Asn Tyr Leu Arg Tyr Asp Glu Glu Tyr Thr Asp Ile Ser Phe Arg
115 120 125
Leu Thr Phe Glu Asp Gly Thr Thr Asp Phe Leu Thr Lys Glu His Met
130 135 140
Arg Ile Glu Asn Gly Ile Leu Lys Ala Glu Lys Glu Val Lys Tyr Gly
145 150 155 160
Lys Lys Ile Thr Leu Asp Val Leu Lys Asn Gly Leu Glu Glu Asp Tyr
165 170 175
Gln Gly Val Ser Phe Ser Thr Ala Lys Ile Asp Glu Glu Ser Lys Leu
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Glu Met Tyr Trp Met Gln Gly Thr Gly Thr Ile Ser Pro Lys Ala Asp
195 200 205
Phe Ile Lys Arg Ser Lys Glu Ile Glu Ser Ala Leu Ile Thr Ser Met
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Lys Glu Ile Thr Val Lys Leu Ser Val Pro Cys Arg Val Asp Asp Ile
225 230 235 240
Lys Gln Asp Gly Phe Lys Leu Ser Pro Lys Leu Ala Val Ser Lys Val
245 250 255
Glu Ala Thr Ser Thr Arg Asp Ser Glu Tyr Lys Thr Ile Lys Glu Gly
260 265 270
Tyr Ala Asp Thr Phe Ile Ile Thr Met Glu Glu Pro Leu Asp Met Ser
275 280 285
Lys Lys Tyr Ala Leu Ser Lys Thr Asp Tyr Gly Ser Arg Asn Leu Thr
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Leu Asp Ser Gly Leu Tyr Thr Ser Glu Glu Phe Glu Ala Ala Tyr Thr
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625 630 635 640
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Lys Arg Asn Val Ser Asn Arg Asp Glu Ser Ile Lys Phe Gly Ile Val
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<210> 91
<211> 554
<212> PRT
<213> 发酵植物多糖梭菌
<400> 91
Met Lys Asn Thr Asn Thr Leu His Pro Trp Trp Glu Ser Ala Ala Ala
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Tyr Gln Ile Tyr Pro Arg Ser Phe Met Asp Ser Asn Gly Asp Gly Val
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100 105 110
His Pro Trp Phe Ile Glu Ser Arg Ser Ser Lys Asp Asn Pro Lys Arg
115 120 125
Asp Trp Tyr Ile Trp Lys Asp Gly Lys Asp Asn Val Glu Pro Asn Asn
130 135 140
Trp Glu Ser Ile Phe Gly Gly Ser Thr Trp Glu Tyr Asp Glu Lys Ser
145 150 155 160
Gly Gln Tyr Phe Leu His Val Phe Gly Lys Thr Met Pro Asp Ile Asn
165 170 175
Trp Glu Asn Thr Gln Val Lys Lys Ala Ile Phe Asp Met Ile Cys Trp
180 185 190
Trp Leu Asp Lys Gly Ile Asp Gly Phe Arg Val Asp Ala Ile Ser His
195 200 205
Ile Lys Lys Pro Asp Phe Asn Asp Met Pro Asn Pro Lys Asn Glu Arg
210 215 220
Tyr Val Ser Ser Phe Asp Lys His Met Asn Gln Ser Gly Ile Leu Asp
225 230 235 240
Leu Leu Asn Glu Leu Lys Glu Asn Ala Phe Ser Lys Tyr Asp Ile Phe
245 250 255
Thr Val Ala Glu Ala Asn Gly Val Arg Ile Glu Glu Ile Glu Glu Trp
260 265 270
Val Ser Ser Glu Lys Gly Ile Phe Asn Ser Leu Phe Gln Phe Asp His
275 280 285
Leu Asn Leu Trp Asn Val Gly Ser Glu Glu Gly Lys Ile Ser Ile Lys
290 295 300
Lys Leu Lys Asn Ala Leu Thr Lys Trp Gln Lys Ala Ala Pro Met Asp
305 310 315 320
Gly Asn Val Ala Leu Val Met Glu Asn His Asp Leu Val Arg Ser Ile
325 330 335
Ser Arg Phe Gly Ser Glu Asp Lys Tyr Trp Lys Glu Ser Ala Lys Cys
340 345 350
Leu Ala Leu Met Tyr Tyr Met Gln Lys Gly Val Pro Phe Ile Tyr Gln
355 360 365
Gly Gln Glu Ile Gly Met Leu Asn Ala Asp Tyr Glu Ser His Leu Asp
370 375 380
Phe Arg Asp Asp Pro Thr Leu Phe Ala Tyr Gln Asp Arg Ile Asn Asn
385 390 395 400
Gly Met Ser Pro Ala Glu Ser Leu Gln Val Leu Lys Lys Ser Ser Arg
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Leu Asn Ala Glu Val Gln Lys Glu Asp Glu Asp Ser Ile Leu Asn Phe
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Tyr Lys Lys Leu Ile Lys Ile Lys Lys Glu Thr Thr Gly Leu Ile Tyr
465 470 475 480
Gly Asp Tyr Lys Leu Leu Met Glu Glu Ser Glu Ser Ile Tyr Ala Tyr
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Glu Glu Leu Ser Glu Leu Gln Ile Asp Leu Asp Ile Thr Lys Gly Glu
515 520 525
Ile Leu Ile Ser Asn Tyr Glu Asp Arg Asn Ser Lys Glu Met Leu Leu
530 535 540
Lys Pro Tyr Glu Cys Arg Leu Tyr Ser Leu
545 550
<210> 92
<211> 538
<212> PRT
<213> 发酵植物多糖梭菌
<400> 92
Met Val Lys Lys Trp Trp His Ser Ser Val Val Tyr Gln Ile Tyr Pro
1 5 10 15
Arg Ser Phe Asn Asp Ser Asn Gly Asp Gly Ile Gly Asp Leu Lys Gly
20 25 30
Ile Ile Glu Lys Leu Asp Tyr Leu Lys Asn Leu Gly Ile Asp Val Ile
35 40 45
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50 55 60
Ile Ser Asp Tyr Glu Asp Ile Met Asp Glu Phe Gly Thr Leu Glu Asp
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Leu Lys Glu Ala Asn Asn Arg Gly Ile Lys Ile Leu
85 90 95
Met Asp Leu Val Ala Asn His Thr Ser Asp Glu His Lys Trp Phe Ile
100 105 110
Glu Ser Arg Lys Ser Lys Asp Asn Ala Tyr Arg Asp Tyr Tyr Ile Trp
115 120 125
Arg Asp Pro Val Asp Gly His Glu Pro Asn Asp Leu Gly Ser Thr Phe
130 135 140
Ser Gly Ser Ala Trp Glu Trp Asp Glu Ala Thr Gly Gln Tyr Tyr Leu
145 150 155 160
His Leu Phe Ser Lys Lys Gln Pro Asp Leu Asn Trp Glu Asn Pro Ile
165 170 175
Val Arg Glu Glu Val Trp Lys Ser Met Asn Phe Trp Ile Asp Lys Gly
180 185 190
Ile Gly Gly Phe Arg Met Asp Val Ile Glu Leu Leu Gly Lys Ile Pro
195 200 205
Asp Glu Lys Ile Ile Ser Asn Gly Pro Met Leu His Glu Tyr Ile Arg
210 215 220
Glu Met Asn Arg Asn Ser Phe Gly Asp Lys Asp Leu Leu Thr Val Gly
225 230 235 240
Glu Cys Trp Gly Ala Thr Pro Glu Ile Ala Lys Met Tyr Ser Asn Pro
245 250 255
Asp Gly Ser Glu Leu Ser Met Val Phe Gln Phe Glu His Ile Gly Leu
260 265 270
Asp Gln Ile Pro Gly Lys Asp Lys Trp Asp Leu Gln Pro Leu Asn Leu
275 280 285
Ile Asp Leu Lys Asn Val Phe His Lys Trp Gln Thr Cys Phe His Asp
290 295 300
Asp Gly Trp Asn Ser Leu Phe Trp Asn Asn His Asp Thr Pro Arg Ile
305 310 315 320
Val Ser Arg Trp Gly Asn Asp Lys Val Tyr Lys Ile Glu Ser Ala Lys
325 330 335
Met Leu Ala Thr Leu Leu His Gly Leu Lys Gly Thr Pro Tyr Ile Tyr
340 345 350
Gln Gly Glu Glu Leu Gly Met Ala Asn Ile Lys Phe Lys Asp Ile Asn
355 360 365
Gln Tyr Lys Asp Ile Glu Thr Leu Asn Met Tyr Lys Asp Arg Leu Asn
370 375 380
Lys Gly Tyr Lys His Glu Asp Ile Met Glu Ser Ile Tyr Ala Lys Gly
385 390 395 400
Arg Asp Asn Ala Arg Thr Pro Met Gln Trp Ser Asp Glu Ile Asp Gly
405 410 415
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420 425 430
Glu Ile Asn Ala Lys Glu Gln Val Ser Asn Pro Asn Ser Ile Tyr Asn
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Tyr Gly Asp Phe Glu Met Leu Leu Pro Glu Asp Lys Asn Ile Phe Ala
465 470 475 480
Tyr Val Arg Thr Leu Lys Asp Ser Lys Ile Val Val Val Cys Asn Phe
485 490 495
Tyr Glu Asn Glu Val Glu Tyr Asn Ile Pro Lys Glu Tyr Glu Glu Lys
500 505 510
Lys Glu Val Leu Ile Ser Asn Tyr Gly Leu Ser Leu Thr Gly Arg Leu
515 520 525
Arg Pro Phe Glu Ala Ile Met Tyr Arg Val
530 535
<210> 93
<211> 555
<212> PRT
<213> 发酵植物多糖梭菌
<400> 93
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His Lys Arg Gly Ile His Leu Ile Ile Asp Phe Val Phe Asn His Thr
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Ser Ala Lys His Pro Trp Phe Leu Glu Ala Val Ser Tyr Leu Glu Ser
165 170 175
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180 185 190
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225 230 235 240
Ile Ala Lys Tyr Trp Leu Asp Leu Gly Val Asp Gly Phe Arg Leu Asp
245 250 255
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260 265 270
Leu Lys Trp Phe Ser Asp Tyr Val Lys Ser Val Lys Glu Asp Ala Asp
275 280 285
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<210> 94
<211> 583
<212> PRT
<213> 发酵植物多糖梭菌
<400> 94
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1 5 10 15
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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275 280 285
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<210> 95
<211> 575
<212> PRT
<213> 热纤维梭菌
<400> 95
Met Lys Leu Glu Ala Ile Tyr His Lys Pro Tyr Ser Glu Phe Ala Phe
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115 120 125
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130 135 140
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Ile Ile Asp Arg Phe Asp His Leu Val Lys Leu Gly Val Asp Val Val
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Val Asp Tyr Tyr Glu Ile Asp Pro Met Phe Gly Ser Lys Glu Glu Leu
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Val Val Glu Lys Gly Glu Lys Ser Lys Tyr Ala Asn Trp Tyr Phe Ile
245 250 255
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260 265 270
Ser Phe Tyr Gly Gly Met Pro Lys Leu Asn Thr Gly Asn Pro Glu Thr
275 280 285
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290 295 300
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Trp Arg Lys Leu Arg Asp Met Leu Lys Asp Leu Asn Lys Asp Val Val
325 330 335
Leu Ile Gly Glu Ile Phe Asp Glu Ala Ser Ser Trp Leu Trp Gly Asp
340 345 350
Gln Phe Asp Ser Val Ile Asn Tyr Pro Leu Lys Ala Met Ile Asn Asp
355 360 365
Leu Phe Ala Tyr Arg Ser Ile Asp Val Glu Thr Phe Arg Asn Arg Ile
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Ser Gly Tyr Ile Met Lys Phe Asn Lys Lys Val Leu Ser Ser Leu Val
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Asn Ile Ile Ser Thr His Asp Thr Pro Arg Phe Leu Thr Leu Cys Asn
405 410 415
Gly Asp Glu Lys Arg Phe Glu Met Ala Val Val Phe Gln Phe Thr Phe
420 425 430
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435 440 445
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Lys Asp Glu Glu Arg Leu Asn Val Asp Lys Lys Arg Ile Asn Ile Cys
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Leu Asn Pro Phe Glu Trp Arg Ile Tyr Lys Ala Cys Gly Glu Leu
565 570 575
<210> 96
<211> 655
<212> PRT
<213> 嗜热裂孢菌
<400> 96
Met Ile Gly Arg Phe Pro Ile Leu Asp Val Ser Pro Val Val Asp Ile
1 5 10 15
Gly Thr Ala Lys Ala Val Val Gly Glu Thr Phe Pro Val Arg Ala Thr
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Val Phe Arg Glu Gly His Glu Ala Leu Gly Ala Gly Val Val Leu Tyr
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50 55 60
Pro Gly Thr Asp Arg Tyr Glu Ala Glu Val Thr Val Thr Ser Glu Gly
65 70 75 80
Leu Trp His Phe Ala Ile Glu Ala Trp Ser Asp Pro Tyr Ala Thr Trp
85 90 95
Cys His Asp Ala Arg Ile Lys Ile Pro Ala Gly Gln Asp Val Glu Leu
100 105 110
Met Leu Glu Glu Gly Ala Arg Leu Leu Glu Arg Ala Ala Arg Arg Val
115 120 125
Pro Arg Arg Pro Ala Leu Ala Glu Ile Ala Ala Ala Met Arg Asp Gly
130 135 140
Ser Arg Ser Ala His Glu Arg Leu Asp Leu Ala Leu Ser Asp Leu Val
145 150 155 160
Arg Asp Glu Leu Ala Glu Arg Pro Leu Arg Glu Leu Val Thr Arg Ser
165 170 175
Gln Arg Phe Pro Val Met Val Ser Arg Arg Arg Ala Leu Phe Gly Ser
180 185 190
Trp Tyr Glu Phe Phe Pro Arg Ser Glu Gly Ala Val Leu Asp Thr Glu
195 200 205
Asp Gly Glu Pro Arg Ser Gly Thr Phe Ala Thr Ala Ala Arg Arg Leu
210 215 220
Pro Ala Ile Ala Asp Met Gly Phe Asp Val Val Tyr Ile Pro Pro Ile
225 230 235 240
His Pro Val Gly Tyr Ser Phe Arg Lys Gly Arg Asn Asn Ser Thr Val
245 250 255
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Gly Gly His Asp Ala Ile His Pro Asp Leu Gly Thr Ile Asp Asp Phe
275 280 285
Asp Ala Phe Val Ala Arg Ala Arg Glu Leu Gly Leu Glu Ile Ala Met
290 295 300
Asp Leu Ala Leu Gln Ala Ser Pro Asp His Pro Trp Val Lys Glu His
305 310 315 320
Pro Glu Trp Phe Thr Val Arg Ala Asp Gly Ser Ile Ala Tyr Ala Glu
325 330 335
Asn Pro Pro Lys Lys Tyr Gln Asp Ile Tyr Pro Ile Asn Phe Asp Lys
340 345 350
Asp Pro Glu Gly Ile Phe Thr Glu Val Arg Arg Ile Val Arg Tyr Trp
355 360 365
Met Ser His Gly Val Arg Ile Phe Arg Val Asp Asn Pro His Thr Lys
370 375 380
Pro Val Ala Phe Trp Glu Arg Leu Leu Ala Asp Ile Ala Ala Thr Asp
385 390 395 400
Pro Asp Val Ile Phe Leu Ser Glu Ala Phe Thr Arg Pro Ala Met Met
405 410 415
His Thr Leu Ala Lys Ile Gly Phe His Gln Ser Tyr Thr Tyr Phe Thr
420 425 430
Trp Arg Asn Thr Lys Gln Glu Leu Glu Glu Tyr Leu Thr Glu Leu Thr
435 440 445
Gly Glu Ala Ala Ala Tyr Met Arg Pro Asn Phe Phe Val Asn Thr Pro
450 455 460
Asp Ile Leu His Ala Tyr Leu Gln His Gly Gly Arg Pro Ala Phe Glu
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Val Arg Ala Ile Leu Ala Ala Thr Leu Ser Pro Thr Trp Gly Met Tyr
485 490 495
Ser Gly Tyr Glu Leu Cys Glu Asn Arg Ala Leu Lys Pro Gly Ser Glu
500 505 510
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Asn Ser Leu Arg Arg Ser His Pro Ala Leu Gln Glu Leu Arg Asn Leu
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Leu Ser Gly His Ser Tyr His Trp Val Glu Ala Asn Tyr Val Arg Leu
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Asp Pro His Val Gln Thr Ala His Ile Phe Thr Val Ala Pro Ala
645 650 655
<210> 97
<211> 572
<212> PRT
<213> 嗜热裂孢菌
<400> 97
Ala Pro Ser Gly Asn Arg Asp Val Ile Val His Leu Phe Gln Trp Arg
1 5 10 15
Trp Lys Ser Ile Ala Asp Glu Cys Arg Thr Thr Leu Gly Pro His Gly
20 25 30
Phe Gly Ala Val Gln Val Ser Pro Pro Gln Glu His Val Val Leu Pro
35 40 45
Ala Glu Asp Tyr Pro Trp Trp Gln Asp Tyr Gln Pro Val Ser Tyr Lys
50 55 60
Leu Asp Gln Thr Arg Arg Gly Ser Arg Ala Asp Phe Ile Asp Met Val
65 70 75 80
Asn Thr Cys Arg Glu Ala Gly Val Lys Ile Tyr Val Asp Ala Val Ile
85 90 95
Asn His Met Thr Gly Thr Gly Ser Ala Gly Ala Gly Pro Gly Ser Ala
100 105 110
Gly Ser Ser Tyr Ser Lys Tyr Asp Tyr Pro Gly Ile Tyr Gln Ser Gln
115 120 125
Asp Phe Asn Asp Cys Arg Arg Asp Ile Thr Asn Trp Asn Asp Lys Trp
130 135 140
Glu Val Gln His Cys Glu Leu Val Gly Leu Ala Asp Leu Lys Thr Ser
145 150 155 160
Ser Pro Tyr Val Gln Asp Arg Ile Ala Ala Tyr Leu Asn Glu Leu Ile
165 170 175
Asp Leu Gly Val Ala Gly Phe Arg Ile Asp Ala Ala Lys His Ile Pro
180 185 190
Glu Gly Asp Leu Gln Ala Ile Leu Ser Arg Leu Lys Asn Val His Pro
195 200 205
Ala Trp Gly Gly Gly Lys Pro Tyr Ile Phe Gln Glu Val Ile Ala Asp
210 215 220
Ser Thr Ile Ser Thr Gly Ser Tyr Thr His Leu Gly Ser Val Thr Glu
225 230 235 240
Phe Gln Tyr His Arg Asp Ile Ser His Ala Phe Ala Asn Gly Asn Ile
245 250 255
Ala His Leu Thr Gly Leu Gly Ser Gly Leu Thr Pro Ser Asp Lys Ala
260 265 270
Val Val Phe Val Val Asn His Asp Thr Gln Arg Tyr Glu Pro Ile Leu
275 280 285
Thr His Thr Asp Gly Ala Arg Tyr Asp Leu Ala Gln Lys Phe Met Leu
290 295 300
Ala His Pro Tyr Gly Thr Pro Lys Val Met Ser Ser Tyr Thr Trp Ser
305 310 315 320
Gly Asp Asp Lys Ala Gly Pro Pro Met His Ser Asp Gly Thr Thr Arg
325 330 335
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340 345 350
Ala Gly Met Val Gly Phe His Asn Ala Val Ala Gly Gln Gly Ile Gly
355 360 365
Ser Ala Val Thr Asp Gly Asn Gly Arg Leu Ala Phe Ala Arg Gly Ser
370 375 380
Ala Gly Tyr Ala Ala Phe Asn Ala Thr Asn Thr Ala Trp Thr Arg Thr
385 390 395 400
Phe Thr Thr Ser Leu Pro Asp Gly Val Tyr Cys Asp Val Ala Asn Gly
405 410 415
Thr Phe Val Asp Gly Val Cys Asp Gly Pro Ser Tyr Gln Val Ser Gly
420 425 430
Gly Lys Phe Thr Ala Thr Val Pro Ala Asn Gly Ala Val Ala Leu His
435 440 445
Val Glu Ala Pro Gly Ser Cys Gly Pro Asp Gly Cys Gly Thr Pro Pro
450 455 460
Gly Gly Gly Asp Asp Cys Thr Thr Val Thr Ala Arg Phe His Ala Thr
465 470 475 480
Val Thr Thr Trp Tyr Gly Gln Glu Val Ala Val Val Gly Ser Ile Pro
485 490 495
Glu Leu Gly Ser Trp Gln Pro Ala Gln Gly Val Arg Leu Arg Thr Asp
500 505 510
Ser Gly Thr Tyr Pro Val Trp Ser Gly Ala Val Asp Leu Pro Ala Gly
515 520 525
Val Gly Phe Glu Tyr Lys Tyr Val Lys Leu Asn Pro Asp Gly Thr Val
530 535 540
Glu Trp Glu Gln Gly Gly Asn Arg Ile Ala Thr Val Asp Asp Ser Gly
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Gly Gly Cys Ser Gln Asn Phe Tyr Asp Ser Trp Arg
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<211> 825
<212> PRT
<213> 嗜热厌氧菌
<400> 98
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1 5 10 15
Leu Ser Gln Met Val His Ser Val Lys Lys Glu Asp Phe Lys Val Phe
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Leu Asn Glu Glu Glu Ile Asp Ile Glu Lys Ile Asp Lys Ile Ile Pro
35 40 45
His Ser Asp Asn Pro Ala Glu Ala Glu Thr Arg Gly Tyr Glu Ile Cys
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Glu Gln Lys Gly Lys Ile Arg Phe Val Leu Lys Glu Gly His Phe Asp
65 70 75 80
Tyr His Arg Lys Pro Tyr Lys Lys Pro Val Phe Val Ile Gly Glu Met
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Thr Ala Phe Thr Asn Met Ile Arg Ile Ile Pro Ser Asn Arg Leu Leu
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Phe Val Lys Thr Ile Glu Lys Gln Gln Asp Ala Ile Ile Tyr Glu Met
325 330 335
His Val Arg Asp Phe Thr Ile Asp Lys Asn Ser Gly Val Asp Glu Lys
340 345 350
Phe Arg Gly Lys Phe Leu Gly Leu Cys Gln Lys Ser Phe Tyr Lys Glu
355 360 365
Lys Phe Ser Thr Gly Leu Leu His Leu Lys Glu Leu Gly Ile Thr His
370 375 380
Ile His Leu Leu Pro Ile Ser Asp Phe Gly Ser Val Asp Asp Lys Asn
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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625 630 635 640
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<212> PRT
<213> 嗜热厌氧菌
<400> 99
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Lys Glu Leu Gly Lys Asp Gly Val Val Ile Gly Ala Lys Phe Lys Phe
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<213> 嗜热厌氧菌
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245 250 255
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Phe Ile Val Ser Ala Met Asp Glu Leu Gly Leu Ser Arg Glu Val Glu
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Ile Asp Arg Ala Glu Lys Leu Phe Glu Trp Ala Lys Ala His Ser Leu
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595 600 605
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610
<210> 101
<211> 529
<212> PRT
<213> 除虫链霉菌
<400> 101
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Gly Ser Ala Asp Asp Leu Ala Glu Leu Val Asp Glu Ala Gly Arg Arg
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Gly Ile Arg Val Leu Leu Asp Leu Val Ala Gly His Thr Ser Asp Glu
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Ile Trp Ala Pro Glu Gly Arg Pro Asp Gly Phe Val Thr Ser Pro Gly
130 135 140
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Arg Ile Trp Thr Glu Leu Arg His Trp Leu Asp Thr Ala His Pro Asp
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Ala Trp Asp Pro Leu Asp Cys Phe Phe Asp Ala Ser Gly Lys Gly Ser
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340 345 350
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Arg Ala Asp Asp Gly Ser Leu Leu His Leu Val Arg Arg Leu Val Ala
435 440 445
Leu Arg Ala Ser Thr Pro Ala Leu Gly Ser Gly Gly Ser Val Glu Val
450 455 460
Leu His Thr Gly Tyr Pro Phe Val Tyr Val Arg Gly Gly Arg Tyr Leu
465 470 475 480
Val Val Val Asn Pro Gln Arg Asn Glu Val Arg Cys Pro Tyr Asp Ala
485 490 495
Thr Arg Glu Ala Arg Ala Leu Glu Ala Ser Gly Val Arg Val Gly Asn
500 505 510
Gly Thr Ile Glu Ala Glu Gly Phe Ser Tyr Gly Val Phe Asp Leu Gly
515 520 525
Arg
<210> 102
<211> 431
<212> PRT
<213> 除虫链霉菌
<400> 102
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Leu Ala Asp Leu Asp Thr Gly Glu Glu Tyr Val Arg Lys Thr Ile Ala
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Gly Tyr Met Asn Thr Leu Leu Gly Tyr Gly Ala Asp Gly Phe Arg Val
165 170 175
Asp Ala Val Lys His Ile Pro Ala Ala Asp Leu Ala Asn Ile Lys Ser
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Ser Ser Val Ala Gly Val Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Arg Asn
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Tyr Glu Trp Ser Asp Ala Asp Ala Gly Pro Pro Gly Gly Gly Thr Val
305 310 315 320
Asn Ala Cys Trp Gln Asp Gly Trp Lys Cys Gln His Ala Trp Pro Glu
325 330 335
Ile Lys Ala Met Val Ala Phe Arg Asn Ala Thr Arg Gly Glu Ser Val
340 345 350
Thr Asn Trp Trp Asp Asn Gly Gly Asp Ala Ile Ala Phe Gly Arg Gly
355 360 365
Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ile Asn His Glu Ser Gly Ser Leu Thr Arg
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Thr Tyr Gln Thr Ser Leu Thr Ala Gly Thr Tyr Cys Asn Val Gln Asn
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420 425 430
<210> 103
<211> 503
<212> PRT
<213> 扣囊复膜酵母菌
<400> 103
Leu Pro Leu Gln Glu Gly Pro Leu Asn Lys Arg Ala Tyr Pro Ser Phe
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Glu Ala Tyr Ser Asn Tyr Lys Val Asp Arg Thr Asp Leu Glu Thr Phe
20 25 30
Leu Asp Lys Gln Lys Asp Val Ser Leu Tyr Tyr Leu Leu Gln Asn Ile
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Ala Tyr Pro Glu Gly Gln Phe Asn Asp Gly Val Pro Gly Thr Val Ile
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65 70 75 80
Asp Ser Ala Ile Thr Phe Leu Thr Val Leu Ser Glu Leu Glu Asp Asn
85 90 95
Asn Phe Asn Thr Thr Leu Ala Lys Ala Val Glu Tyr Tyr Ile Asn Thr
100 105 110
Ser Tyr Asn Leu Gln Arg Thr Ser Asn Pro Ser Gly Ser Phe Asp Asp
115 120 125
Glu Asn His Lys Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Thr Asp Gly Ser
130 135 140
Ala Tyr Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Asn Asp Gly Pro Ala Leu
145 150 155 160
Arg Ala Tyr Ala Ile Ser Arg Tyr Leu Asn Asp Val Asn Ser Leu Asn
165 170 175
Lys Gly Lys Leu Val Leu Thr Asp Ser Gly Asp Ile Asn Phe Ser Ser
180 185 190
Thr Glu Asp Ile Tyr Lys Asn Ile Ile Lys Pro Asp Leu Glu Tyr Val
195 200 205
Ile Gly Tyr Trp Asp Ser Thr Gly Phe Asp Leu Trp Glu Glu Asn Gln
210 215 220
Gly Arg His Phe Phe Thr Ser Leu Val Gln Gln Lys Ala Leu Ala Tyr
225 230 235 240
Ala Val Asp Ile Ala Lys Ser Phe Asp Asp Gly Asp Phe Ala Asn Thr
245 250 255
Leu Ser Ser Thr Ala Ser Thr Leu Glu Ser Tyr Leu Ser Gly Ser Asp
260 265 270
Gly Gly Phe Val Asn Thr Asp Val Asn His Ile Val Glu Asn Pro Asp
275 280 285
Leu Leu Gln Gln Asn Ser Arg Gln Gly Leu Asp Ser Ala Thr Tyr Ile
290 295 300
Gly Pro Leu Leu Thr His Asp Ile Gly Glu Ser Ser Ser Thr Pro Phe
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Ala Ile Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Asn Gly Asp Gly Ser Ser
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Glu Gly Asn Pro Trp Phe Leu Ala Thr Ala Tyr Ala Ala Gln Val Pro
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Tyr Lys Leu Val Tyr Asp Ala Lys Ser Ala Ser Asn Asp Ile Thr Ile
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Asn Lys Ile Asn Tyr Asp Phe Phe Asn Lys Tyr Ile Val Asp Leu Ser
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Thr Ile Asn Ser Gly Tyr Gln Ser Ser Asp Ser Val Thr Ile Lys Ser
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Gly Ser Asp Glu Phe Asn Thr Val Ala Asp Asn Leu Val Thr Phe Gly
435 440 445
Asp Ser Phe Leu Gln Val Ile Leu Asp His Ile Asn Asp Asp Gly Ser
450 455 460
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<213> 扣囊复膜酵母菌
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<212> PRT
<213> 热纤维梭菌
<400> 109
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