Fe3O4纳米粒子提升酿酒酵母发酵性能的用途
阅读说明：本技术 Fe3O4纳米粒子提升酿酒酵母发酵性能的用途 (Fe3O4Application of nano particles in improving fermentation performance of saccharomyces cerevisiae ) 是由 杨粟平 李勇 侯长军 霍丹群 张宿义 杨平 周军 黄锐 于 2021-09-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种Fe-(3)O-(4)纳米粒子提升酿酒酵母发酵性能的用途,属于生物工程领域、食品微生物领域和工业微生物领域。提升酿酒酵母发酵性能的用途主要为提升酿酒酵母对乙醇耐受性的用途和提升酿酒酵母的生长率的用途。所述Fe-(3)O-(4)纳米粒子为：粒径为10-50nm的Small-Fe-(3)O-(4)、粒径为250-450nm的Big-Fe-(3)O-(4)、粒径为50-100nm的组氨酸修饰His-Fe-(3)O-(4)中的任意一种。本发明的Fe-(3)O-(4)纳米粒子提升酿酒酵母发酵性能的用途,可有效解决酿酒酵母对乙醇耐受性较差的问题。(The invention discloses Fe 3 O 4 The application of nano particles in improving the fermentation performance of saccharomyces cerevisiae belongs to the fields of bioengineering, food microorganisms and industrial microorganisms. The application of improving the fermentation performance of the saccharomyces cerevisiae is mainly the application of improving the ethanol tolerance of the saccharomyces cerevisiae and the application of improving the growth rate of the saccharomyces cerevisiae. Said Fe 3 O 4 The nano particles are: Small-Fe with grain diameter of 10-50nm 3 O 4 Big-Fe with particle size of 250-450nm 3 O 4 Histidine modified His-Fe with particle size of 50-100nm 3 O 4 Any one of them. Fe of the invention 3 O 4 The application of the nanoparticles in improving the fermentation performance of the saccharomyces cerevisiae can effectively solve the problem of poor ethanol tolerance of the saccharomyces cerevisiae.)
技术领域
本发明属于生物工程领域、食品微生物领域和工业微生物领域，涉及一种提升酿酒酵母发酵性能的方法。
背景技术
酿酒酵母广泛应用于生产酒精、食品和燃料酒精等工业领域。然而，酵母发酵过程中由于产物乙醇的持续产生，在发酵最后阶段细胞面临高浓度乙醇，导致细胞受到毒性多项功能衰弱，抑制了其对葡萄糖的吸收和分解，胞内糖酵解酶活性降低，以及破坏细胞膜的完整性，减慢生产发酵过程，进而影响酵母菌的发酵效率、可持续性和乙醇产量。
目前，针对增强酵母的乙醇耐受程度和提升乙醇产量方法主要是基因工程，该策略是利用全基因组筛选对乙醇耐受性影响的基因，通过引入或敲除特异性突变基因如影响细胞膜组成和蛋白质折叠的基因等达到增强细胞乙醇耐受性效果。然而乙醇耐受性涉及多个生理过程，每个过程依赖于许多不同的等位基因和突变组合相互作用，导致该技术操作复杂，耗时长。
其次优化发酵工艺，该法是通过优化发酵过程中的各项参数，使酵母菌处在最佳发酵环境进行生产进而实现乙醇产量提升，该法对工厂设备和质控要求严格，对于提升产量的上升空间不大。
以上这些方法，限制了其在工业生产中的应用，因此开发一种方便、经济的新方法用于提升酿酒酵母的发酵性能，增强酵酒酵母菌对乙醇的耐受性，提高乙醇产量是很有必要的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是酿酒酵母对乙醇耐受性较差的问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：Fe3O4纳米粒子提升酿酒酵母发酵性能的用途。
上述Fe3O4纳米粒子为：粒径为10-50nm的Small-Fe3O4、粒径为250-450nm的Big-Fe3O4、粒径为50-100nm的组氨酸修饰His-Fe3O4中任意一种。
上述提升酿酒酵母发酵性能的用途为提升酿酒酵母对乙醇耐受性的用途。
上述提升酿酒酵母发酵性能的用途为提升酿酒酵母的生长率的用途。
当上述Fe3O4纳米粒子为His-Fe3O4和/或Big-Fe3O4时，所述提升酿酒酵母发酵性能的用途为提高体系中的电子转移率、降低氧化还原反应电位的用途。
当上述Fe3O4纳米粒子为His-Fe3O4时，所述提升酿酒酵母发酵性能的用途为提高乙醇乙酸产量的用途。
上述Big-Fe3O4的制备方法为：按氯化铁∶柠檬酸三钠∶乙二醇∶乙酸钠＝13∶4∶440∶24的质量比，将氯化铁和柠檬酸三钠完全溶解在乙二醇中后，再加入乙酸钠剧烈搅拌至混合均匀，然后将混合物转移到高压釜中，在200℃下加热10h，产物用乙醇洗涤干净后烘干得到Big-Fe3O4。
进一步的是，上述剧烈搅拌时间为30-40分钟。
进一步的是，上述高压釜为特氟隆内衬的不锈钢高压釜，烘干温度为55-65℃。
上述His-Fe3O4的制备方法为：按六水氯化铁∶乙二醇:乙酸钠∶组氨酸＝4∶220∶18∶5 的质量比，将六水氯化铁完全溶解于乙二醇中后，再添加乙酸钠和组氨酸剧烈搅拌至混合均匀，然后将混合物超声10-15分钟后转移到聚反应器中，在200℃下加热12h，产物用乙醇洗涤干净后烘干得到His-Fe3O4。
进一步的是，上述剧烈搅拌时间为30-40分钟。
进一步的是，上述反应器为聚四氟乙烯反应器，烘干温度为55-65℃。
上述Fe3O4纳米粒子发酵结束后仍具有磁性可回收能力。
本发明的有益效果是：Fe3O4纳米粒子(Fe3O4 NPs)作为类似过氧化物酶的纳米颗粒，参与过氧化物和活性氧的代谢，可通过控制脂肪酸组成改善膜磷脂的合成或降解。将Fe3O4纳米粒子用于提升酿酒酵母的发酵性能，其可有效提升酿酒酵母对乙醇的耐受性，使酿酒酵母保持较强的生长率，且Fe3O4纳米粒子发酵结束后仍具有磁性可回收能力。
同时，当采用本发明特别制备的His-Fe3O4和Big-Fe3O4提升酿酒酵母的发酵性能时，还能使体系中的电子转移率提高氧化还原反应电位降低，促使酵母在低电位下发生氧化反应，可以加速葡萄糖的氧化分解，加快细胞生长，能使酿酒酵母保持更强生长率和更高的乙醇生产率。
其中，His-Fe3O4由于组氨酸的引入提高了类过氧化酶活性和Fe3O4纳米酶的催化效率，降低了线粒体的应激，因此采用His-Fe3O4提升酿酒酵母的发酵性能时，提高酿酒酵母的乙醇耐受性的效果最好，其不仅改善了乙醇代谢，还能有效提高乙酸产量，具有很大的工业化生产潜力。
附图说明
图1为本发明实施例采用的酿酒酵母扫描电镜图；
图2为本发明实施例采用的Fe3O4 NPs的TEM图像和粒径分布；
图3为本发明实施例1共培养时酿酒酵母光密度曲线；
图4为本发明实施例2孵育6天后的酵母长势图；
图5为本发明实施例3的CV图；
图6为本发明实施例4的乙醇乙酸产量图；
图7为本发明实施例5的磁性回收结果图。
具体实施方式
本发明的技术方案，具体可以按照以下方式实施。
Fe3O4纳米粒子提升酿酒酵母发酵性能的用途。
上述Fe3O4纳米粒子为：粒径为10-50nm的Small-Fe3O4、粒径为250-450nm的Big-Fe3O4、粒径为50-100nm的组氨酸修饰His-Fe3O4中任意一种。
上述提升酿酒酵母发酵性能的用途为提升酿酒酵母对乙醇耐受性的用途和提升酿酒酵母的生长率的用途。
当上述Fe3O4纳米粒子为His-Fe3O4和/或Big-Fe3O4时，所述提升酿酒酵母发酵性能的用途，不仅是提升酿酒酵母对乙醇耐受性和提升酿酒酵母的生长率；其还具有提高体系中的电子转移率、降低氧化还原反应电位的用途。
当上述Fe3O4纳米粒子为His-Fe3O4时，所述提升酿酒酵母发酵性能的用途包括：提升酿酒酵母对乙醇耐受性的用途、提升酿酒酵母的生长率的用途、提高体系中的电子转移率、降低氧化还原反应电位的用途以及提高乙醇乙酸产量的用途。
上述Big-Fe3O4的制备方法为：按氯化铁∶柠檬酸三钠∶乙二醇∶乙酸钠＝13∶4∶440∶24的质量比，将氯化铁和柠檬酸三钠完全溶解在乙二醇中后，再加入乙酸钠剧烈搅拌至混合均匀，然后将混合物转移到高压釜中，在200℃下加热10h，产物用乙醇洗涤干净后烘干得到Big-Fe3O4。其中乙酸钠在整个体系起静电平衡作用和配合还原剂作用，待其他原料混合后再加入固体乙酸钠可以使反应物浓度更加均匀。
为了得到更好的实验结果，因此优选的是，所述剧烈搅拌时间为30-40分钟，高压釜为特氟隆内衬的不锈钢高压釜，烘干温度为55-65℃。
上述His-Fe3O4的制备方法为：按六水氯化铁∶乙二醇:乙酸钠∶组氨酸＝4∶220∶18∶5 的质量比，将六水氯化铁完全溶解于乙二醇中后，再添加乙酸钠和组氨酸剧烈搅拌至混合均匀，然后将混合物超声10-15分钟后转移到聚反应器中，在200℃下加热12h，产物用乙醇洗涤干净后烘干得到His-Fe3O4。His-Fe3O4为组氨酸修饰纳米Fe3O4，因此先形成Fe3O4，然后再添加组氨酸将其连接上四氧化三铁表面。
为了得到更好的实验结果，因此优选的是，所述剧烈搅拌时间为30-40分钟，所述反应器为聚四氟乙烯反应器，烘干温度为55-65℃。
上述Fe3O4纳米粒子发酵结束后仍具有磁性可回收能力。
下面通过实际的例子对本发明的技术方案和效果做进一步的说明。
实施例
(1)分离鉴定酿酒酵母
利用100mLYPD培养基(2g蛋白胨，2g葡萄糖，1g酵母提取液和2g琼脂)从商业酵母粉中分离出酿酒酵母。利用引物NL1(5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3')和NL4(5' –GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3')进行PCR扩增酿酒酵母26S rRNAD1/D2基因区域。获得的扩增序列在GenBankNCBI数据库进行比对确认为酿酒酵母，制备得到的酿酒酵母扫描电镜图如图1所示。
(2)Fe3O4NPs的合成
①Small-Fe3O4：通过市场购买得到。
②Big-Fe3O4：将0.65g氯化铁和0.20g柠檬酸三钠完全溶解在20mL乙二醇中，然后加入 1.20g乙酸钠，剧烈搅拌30分钟。将混合物转移到一个50ml特氟隆内衬的不锈钢高压釜中，在200℃下加热10h，产物用乙醇洗涤三次，60℃烘干备用。
③His-Fe3O4：将0.82g六水氯化铁完全溶解于40mL乙二醇中，随后添加3.6g乙酸钠和 1g组氨酸并剧烈搅拌30分钟，接着超声10分钟，将混合物转移到50mL聚四氟乙烯反应器中，在200℃下加热12h，产物用乙醇洗涤三次，60℃烘干备用。
将上述得到的Small-Fe3O4，Big-Fe3O4，His-Fe3O4各称取0.16g，分别加入16mL蒸馏水中，得到浓度为10mg/mL原液。
图2中ABC分别为本实施例Small-Fe3O4，Big-Fe3O4，His-Fe3O4的TEM图像，DEF分别为Small-Fe3O4，Big-Fe3O4，His-Fe3O4的粒径分布，由图2可知，本发明实施例采用的 Small-Fe3O4平均粒径为18nm，Big-Fe3O4平均粒径为337nm，His-Fe3O4平均粒径为70nm。
(3)实施例1培养实验
将上述制备的Small-Fe3O4，Big-Fe3O4，His-Fe3O4原液各取400μL，分别加入100mLYPD 培养基中(培养基主要成分为：2g蛋白胨，2g葡萄糖，1g酵母提取液，2g琼脂)作为三组实验组，另取100mLYPD培养基不添加Fe3O4 NPs作为对照组(NC)，随后向实验组与对照组中分别加入8％(v/v)的乙醇和接种5％(v/v)的酿酒酵母，培养24h(30℃，120rpm)。
结果检测：在共培养过程中利用紫外可见分光光度计在600nm处检测培养液中酿酒酵母光密度，结果如图3所示，由图3可知，实验组中添加His-Fe3O4组的酵母光密度明显高于 Big-Fe3O4和Small-Fe3O4处理的细胞，三组添加Fe3O4 NPs的实验组光密度均高于没有添加 Fe3O4NPs的对照组。由此可知，采用本发明的方法将Fe3O4 NPs与酿酒酵母共培养，可使酵母保持更强的生长率。
(4)实施例2滴板实验
A.将Small-Fe3O4，Big-Fe3O4，His-Fe3O4原液各取400μL，分别加入100mLYPD固体培养基中(2％琼脂)作为实验组，另取100mLYPD固体培养基不添加Fe3O4 NPs作为对照组(NC)，随后向实验组与对照组中分别加入12％(v/v)的乙醇，备用；
B.将Small-Fe3O4，Big-Fe3O4，His-Fe3O4原液各取400μL，分别加入100mLYPD固体培养基中(2％琼脂)作为实验组，另取100mLYPD固体培养基不添加Fe3O4 NPs作为对照组(NC)，随后向实验组与对照组中分别加入16％(v/v)的乙醇，备用；
C.滴板试验：将酵母浓度分别稀释为100、10-1、10-2、10-3和10-4，分别吸取10μL滴入步骤A和B准备好的固体培养基中，30℃孵育6天。
结果检测：图4为孵育6天后的酵母长势图，由图4可以明显看出在高浓度乙醇条件下，添加Fe3O4 NPs的酵母仍旧能保持较好的长势，而对照组(NC)明显较弱。由此可知，采用本发明的方法可有效提高酿酒酵母对乙醇的耐受性。
(5)实施例3电化学实验
A.将Small-Fe3O4，Big-Fe3O4，His-Fe3O4原液各取400μL，分别加入100mLYPD固体培养基中作为A组实验组，另取100mLYPD固体培养基不添加Fe3O4 NPs作为A组对照组(NC)；
B.将Small-Fe3O4，Big-Fe3O4，His-Fe3O4原液各取400μL，分别加入100mLYPD固体培养基中，然后分别接种1％(v/v)酿酒酵母在YPD培养基中，共培养7h后作为B组实验组，另取100mLYPD固体培养基不添加Fe3O4 NPs接种1％(v/v)酿酒酵母培养7h作为B组对照组(NC)。
结果测试：利用电化学工作站测试三种Fe3O4 NPs对酿酒酵母电化学活性的影响。采用以Ag/AgCl(浸泡在3.0M的KCl中)为参比电极，铂丝为辅助电极，玻璃碳电极(GCE)为工作电极的三电极体系测试相关循环伏安曲线(CV)。扫描电位范围为(-0.6)-1.6V，扫描速率设置为10mV/s，测试结果如图5所示。
从图5可以看出：①A组实验组与对照组均未检测到氧化还原反应，但含His-Fe3O4和 Big-Fe3O4的实验组电流在1.0-1.6V范围内高于其他各组，这说明Fe3O4 NPs不能与培养基发生反应，但可以通过降低培养液的电阻加速体系电子转移速率；②培养7h后，B组实验组在 0.8-1.2V范围内出现氧化峰，含His-Fe3O4和Big-Fe3O4实验组的氧化峰相对于B组对照培养基左移，表明His-Fe3O4和Big-Fe3O4能促使酵母在低电位下发生氧化反应，可以加速葡萄糖的氧化分解，加快细胞生长。
(6)实施例4发酵实验
将Small-Fe3O4，Big-Fe3O4，His-Fe3O4原液各取400μL，分别加入100mLYPD培养基中(40mg/L)作为三组实验组，另取100mLYPD培养基不添加Fe3O4 NPs作为对照组(NC)，随后向实验组与对照组中分别接种1％(v/v)的酿酒酵母，培养48h。
结果测试：将培养后的培养液离心得到900μL上清液，向上清液中加入100μL 2-辛醇内标液(10μg/mL)，进一步过滤得上清液，最后得到的上清液采用岛津TQ8040气相色谱-质谱 (GC-MS)分析，色谱柱为30m×0.25mm×0.25μm Rtx-Wax柱。采用公式：半定量分析方法对乙醇、乙酸进行定量，公式为：其中C为化合物含量(μg/mL)；CI.S为样品中2-辛醇含(μg/mL)；AC为化合物峰面积；AI.S为2-辛醇的峰面积。结果如图6所示，图6中A 为乙醇产量，B为乙酸产量，由图6可知，His-Fe3O4可有效提高乙醇乙酸产量，与对照组NC((8.032g/L)相比，添加His-Fe3O4的试验组中乙醇产量提升约为17.1％，乙酸产量最高。
(7)实施例5磁性回收实验
将Small-Fe3O4，Big-Fe3O4，His-Fe3O4原液各取400μL，分别加入100mLYPD培养基中(40mg/L)中，随后分别接种1％(v/v)的酿酒酵母，培养发酵。
结果测试：将分别含有三种Fe3O4 NPs的培养液待发酵结束后放入20mL试管中，利用普通磁铁放置试管一旁，进行观察，结果如图7所示，从图7可以明显看出Fe3O4 NPs发酵结束后具有磁性可回收性能。
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