通过计算机设计发酵过程中酶制剂补料方式的方法及应用

文档序号：1827186 发布日期：2021-11-12 浏览：22次 >En<

阅读说明：本技术 通过计算机设计发酵过程中酶制剂补料方式的方法及应用 (Method for designing enzyme preparation feeding mode in fermentation process through computer and application ) 是由黄和李秀娟乔杰王明慧盛义杰张立慧魏珺楠于 2021-10-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及可再生能源和生物工程技术,公开了一种通过计算机设计发酵过程中酶制剂补料方式的方法及应用。该方法包括：在发酵过程的目标产物存在的条件下,分别测定各个酶组分的活性,其中目标产物的浓度设置为多个不同的模拟浓度；从蛋白质数据库中获得酶组分的晶体结构,选取目标产物的模型,进行酶组分在目标产物的浓度为模拟浓度时的分子动力学模拟；获取不添加酶制剂时发酵过程中目标产物的浓度值,将活性数据与分子动力学模拟结果相结合,提出各个酶组分的补料时间段和补料量。该方法能够优化发酵产乙醇时纤维素酶的添加策略,提高乙醇产量,降低成本,进而提高整个乙醇工艺的经济效益。(The invention relates to renewable energy and bioengineering technology, and discloses a method for designing an enzyme preparation feeding mode in a fermentation process through a computer and application thereof. The method comprises the following steps: measuring the activity of each enzyme component separately in the presence of a target product of the fermentation process, wherein the concentration of the target product is set to a plurality of different simulated concentrations; obtaining a crystal structure of the enzyme component from a protein database, selecting a model of a target product, and performing molecular dynamics simulation of the enzyme component when the concentration of the target product is a simulated concentration; and (3) obtaining a concentration value of a target product in the fermentation process when no enzyme preparation is added, combining the activity data with a molecular dynamics simulation result, and providing a material supplementing time period and a material supplementing amount of each enzyme component. The method can optimize the adding strategy of the cellulase during ethanol production by fermentation, improve the ethanol yield, reduce the cost and further improve the economic benefit of the whole ethanol process.)

技术领域

本发明涉及可再生能源和生物工程技术，具体涉及一种通过计算机设计发酵过程中酶制剂补料方式的方法及应用。

背景技术

生物乙醇是一种很有前途的液体燃料，可满足不断增长的能源需求和可持续经济，对农村、环境和能源安全产生积极的影响。近几年已开展了大量关于生物乙醇的研究工作，开发出先进的发酵制备技术，以提高整个生物乙醇工艺的经济性和增加盈利能力。然而，该行业仍然迫切需要更高的生物质利用率和乙醇产量。

在生产生物乙醇过程中，水解是将纤维素类生物质（玉米纤维、玉米秸秆、麦秸、柳枝稷等）转化为乙醇的关键步骤，除了化学物质（主要是酸）的水解作用，酶驱动的生物催化是在相对较低的温度下将纤维素水解为葡萄糖的一种最具潜力的替代方法，也是目前工业生产中最普遍应用的方法，可缓解酸水解遇到的困难。当应用纤维素酶、木聚糖酶、多糖单加氧酶和纤维二糖脱氢酶等多种酶时，水解效率提高，乙醇发酵性能更好。但是，纤维素酶的高成本和组分单一被认为是生物乙醇商业化的瓶颈，而在使用多种纤维素酶作为纤维素酶制剂，对生物乙醇生产进行作用时，纤维素酶制剂的配方理性设计同样面临着费时费力的挑战。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的纤维素酶制剂的配方理性设计困难的问题，提供一种通过计算机设计发酵过程中酶制剂补料方式的方法及应用，该方法能够优化发酵产乙醇时纤维素酶的添加策略，提高乙醇产量，降低成本，进而提高整个乙醇工艺的经济效益。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种通过计算机设计发酵过程中酶制剂补料方式的方法，所述酶制剂含有多个酶组分，该方法包括：

（1）在所述发酵过程的目标产物存在的条件下，分别测定各个所述酶组分的活性，其中所述目标产物的浓度设置为多个不同的模拟浓度；

（2）从蛋白质数据库中获得所述酶组分的晶体结构，选取所述目标产物的模型，进行所述酶组分在所述目标产物的浓度为模拟浓度时的分子动力学模拟；

（3）获取不添加所述酶制剂时所述发酵过程中目标产物的浓度值，将步骤（1）得到的活性数据与步骤（2）得到的分子动力学模拟结果相结合，提出各个所述酶组分的补料时间段和补料量。

优选地，步骤（1）中，所述酶组分的活性测定方法包括：在所述目标产物的浓度为梯度增加的条件下，将含有所述酶组分的溶液、含有该酶组分对应的底物的溶液与缓冲液以相同的比例混合得到混合液，将所述混合液进行相同时间的酶解反应，然后测定所述酶解反应的产物的吸光度值。

优选地，所述混合液中目标产物的浓度为0-20体积%，所述酶组分与该酶组分对应的底物的质量比为1：0.04-50；

优选地，所述酶解反应的条件包括：温度为40-60℃，时间为20-120min；所述吸光度值测定的波长为400-600nm。

优选地，所述发酵过程的目标产物为乙醇，所述酶制剂为纤维素酶制剂，多个所述酶组分为外切纤维素酶I、外切纤维素酶II、内切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶；

优选地，所述外切纤维素酶I对应的底物为4-硝基苯基-β-D-纤维二糖苷，所述外切纤维素酶II对应的底物为微晶纤维素，所述内切纤维素酶对应的底物为羧甲基纤维素，所述β-葡萄糖苷酶对应的底物为4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷；

优选地，所述缓冲液为柠檬酸缓冲液。

优选地，步骤（2）中，所述分子动力学模拟的过程包括：从蛋白质数据库中获得所述酶组分的晶体结构，选取所述目标产物的模型，利用Gromacs软件模拟基础溶剂系统和共溶剂系统，进行各个所述酶组分的MD模拟分析，获得各个所述酶组分的能量及结构数据，以及所述共溶剂对所述酶组分的活性部位的作用行为；其中，所述共溶剂含有所述目标产物和基础溶剂，所述共溶剂中目标产物的浓度为所述模拟浓度；

优选地，所述基础溶剂为水，所述共溶剂中目标产物的浓度为0-20体积%。

优选地，步骤（3）中，将所述活性数据与所述分子动力学模拟结果相结合的过程包括：

（a）通过分析所述酶组分的能量及结构数据，以及所述共溶剂对所述酶组分的活性部位的作用行为，得到所述酶组分的空间分布函数、径向分布函数、基础溶剂化壳层与溶剂-氨基酸残基接触频率、目标产物层与溶剂-氨基酸残基接触频率，进而获得所述酶组分在所述共溶剂中的特定指纹谱；

（b）根据所述酶组分的特定指纹谱分别进行该酶组分去溶剂化及活性部位去抑制化的设计，结合不添加所述酶制剂时所述发酵过程中目标产物的浓度值与所述模拟浓度相同的时间点，提出各个所述酶组分的补料时间段和补料量。

本发明第二方面提供一种生物乙醇的制备方法，该制备方法包括：将淀粉质原料经液化处理形成发酵原料，将乙醇发酵菌种接种至所述发酵原料中，并加入糖化酶、氮源进行同步糖化发酵，根据上述的方法获得的发酵过程中酶制剂补料方式，在所述补料时间段加入相应的所述酶组分。

优选地，所述酶制剂为纤维素酶制剂，多个所述酶组分为外切纤维素酶I、外切纤维素酶II、内切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶；

优选地，所述补料时间段分别为0-2h、4-12h、12-16h、20-30h、45-55h。

优选地，所述酶制剂补料方式包括：在所述发酵进行0-2h，向每升发酵液中添加3-7mg的外切纤维素酶I、3-7mg的外切纤维素酶II、3-7mg的内切纤维素酶和3-7mg的β-葡萄糖苷酶；在所述发酵进行4-12h，向每升所述发酵液中添加0.3-1.8mg的外切纤维素酶I、1.8-3.5mg的外切纤维素酶II、0-0.7mg 的内切纤维素酶和0-0.7mg的β-葡萄糖苷酶；在所述发酵进行12-16h，向所述发酵液中添加0.3-1.8mg的外切纤维素酶I和0-7mg的β-葡萄糖苷酶；在所述发酵进行20-30h，向所述发酵液中添加0-0.7mg的外切纤维素酶I、0-7mg的外切纤维素酶II、0-3.5mg的内切纤维素酶和0-0.7mg的β-葡萄糖苷酶；在所述发酵进行45-55h，向所述发酵液中添加0-0.7mg的外切纤维素酶I、0-3.5mg的外切纤维素酶II、0-0.7mg的内切纤维素酶和0-0.7mg的β-葡萄糖苷酶。

优选地，所述乙醇发酵菌株为酿酒酵母，所述乙醇发酵菌株的接种量为0.3-0.5g干细胞重量/kg发酵原料，所述同步糖化发酵的条件包括：温度为25-35℃，转速为120-180rpm，时间为60-96h；

优选地，所述液化处理的过程包括：将所述淀粉质原料与水混合后，与α-淀粉酶混合进行液化；

优选地，所述淀粉质原料与水混合后淀粉质原料的干物浓度为25-30重量%，所述液化处理的条件包括：温度为85-90℃，时间为60-120min；

优选地，所述淀粉质原料选自玉米、高粱和大米中的至少一种，所述氮源选自硫酸铵、尿素和硝酸铵中的至少一种；

优选地，相对于所述淀粉质原料的干重，所述α-淀粉酶的用量为0.010-0.015%，所述糖化酶的用量为0.0320-0.0330%，所述氮源的用量为0.010-0.015%。

通过上述技术方案，本发明的有益效果为：

本发明提供的方法基于计算机的分子动力学模拟，揭示在发酵过程中目标产物的浓度变化对酶制剂中的酶组分产生的稳定性变化的分子机理，并结合发酵过程中目标产物的浓度变化对酶组分的活性影响，提出活性部位抑制引导策略，进行酶组分去溶剂化及活性部位去抑制化的设计，以获得发酵过程中酶制剂的补料方式；在应用于生物乙醇发酵时，该方法不仅省时省力，有效减少发酵过程中纤维素酶的添加量，而且提高乙醇的产量，节省生产成本，提高整个乙醇工艺的经济性。

附图说明

图1是实施例1中纤维素酶的残余活性与不同乙醇浓度的关系图；

图2是实施例1中从MD轨迹中提取的纤维素酶的代表性结构的叠加示意图；

图3是实施例1中在不同乙醇浓度下纤维素酶重原子的时间平均RMSD；

图4是实施例1中在不同乙醇浓度下纤维素酶中>95%的内部氢键数；

图5是实施例1中在不同乙醇浓度下纤维素酶周围的水化层和乙醇层的平均值；其中（a）表示在不同乙醇浓度下纤维素酶周围的水化层的平均值、（b）表示在不同乙醇浓度下纤维素酶周围的乙醇层的平均值；

图6是实施例1中在不同乙醇浓度下纤维素酶活性部位中溶剂分子乙醇和水的平均数量；其中（a）表示在不同乙醇浓度下纤维素酶活性部位中水分子的平均数量、（b）表示在不同乙醇浓度下纤维素酶活性部位中乙醇分子的平均数量。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明第一方面提供一种通过计算机设计发酵过程中酶制剂补料方式的方法，所述酶制剂含有多个酶组分，该方法包括：

（1）在所述发酵过程的目标产物存在的条件下，分别测定各个所述酶组分的活性，其中所述目标产物的浓度设置为多个不同的模拟浓度；

本发明的发明人在研究过程中，意外地发现在发酵产目标产物（例如乙醇）的过程中，未添加酶制剂（例如纤维素酶）时得到不同时间点下对应的目标产物浓度；然后基于这些目标产物浓度的数据进行动力学模拟，模拟酶制剂在不同目标产物浓度下的变化，得到不同目标产物的浓度下，酶制剂的残留活性或水合作用等降低的百分比（可定义为酶活性的减少率），以更准确地提出发酵的不同时间点下，需要补加的酶制剂的量，从而实现在目标产物浓度提高的情况下，尽量恢复酶制剂的酶活，进一步提高目标产物的产量，且酶制剂的用量明显减少，有效降低生产成本。

根据本发明，步骤（1）中，所述酶组分的活性测定方法包括：在所述目标产物的浓度为梯度增加的条件下，将含有所述酶组分的溶液、含有该酶组分对应的底物的溶液与缓冲液以相同的比例混合得到混合液，将所述混合液进行相同时间的酶解反应，然后测定所述酶解反应的产物的吸光度值。即在目标产物存在的条件下，其它条件不变的情况下，考察酶组分的活性随目标产物浓度的升高而产生的变化，这也能够进一步反映出目标产物的浓度升高是否对酶组分的活性产生抑制作用。

根据本发明，目标产物的模拟浓度可以是根据未添加酶制剂时得到不同时间点下对应的目标产物浓度来进行设置。优选地，所述混合液中目标产物的浓度为0-20体积%，例如，所述混合液中目标产物的浓度可以为0体积%、4体积%、8体积%、12体积%、16体积%、20体积%。

根据本发明，所述酶组分与该酶组分对应的底物的用量没有特别的限定，酶组分能够对相应的底物水解反应产生催化作用即可。优选地，所述酶组分与该酶组分对应的底物的质量比为1：0.04-50。为了提高酶组分的酶解催化效果，进一步优选地，含有所述酶组分的溶液通过将酶组分稀释0-5000倍获得，含有该酶组分对应的底物的溶液浓度为0.1-2重量%。

根据本发明，根据不同的酶组分和相应的底物，确定酶解反应的温度、时间、吸光度测定的波长等条件。为了提高酶解反应的效率，优选地，所述酶解反应的条件包括：温度为40-60℃，时间为20-120min；所述吸光度值测定的波长为400-600nm。

根据本发明，优选地，所述发酵过程的目标产物为乙醇，所述酶制剂为纤维素酶制剂，多个所述酶组分为外切纤维素酶I、外切纤维素酶II、内切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶；

进一步优选地，所述外切纤维素酶I对应的底物为4-硝基苯基-β-D-纤维二糖苷（pNPC），所述外切纤维素酶II对应的底物为微晶纤维素，所述内切纤维素酶对应的底物为羧甲基纤维素，所述β-葡萄糖苷酶对应的底物为4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）。

根据本发明，所述缓冲液可以为任意一种酶解反应中可使用的缓冲液。优选地，所述缓冲液为柠檬酸缓冲液，柠檬酸缓冲液的浓度为0.01-0.1M。

示例性地，外切纤维素酶I（CBHI-Tr）活性的测定方法为将稀释0-1000倍的外切纤维素酶I溶液、浓度为5-50mmol/L的4-硝基苯基-β-D-纤维二糖苷溶液、浓度为0.01-0.1M的柠檬酸缓冲液混合，并加入与模拟浓度对应的乙醇，混合后在40-60℃下反应20-60min，加入浓度为0.5-2mol/L的Na₂CO₃和水，测量400-450nm处的吸光度值。

示例性地，外切纤维素酶II（CBHII-Hi）活性的测定方法为将稀释10-1000倍的外切纤维素酶II溶液、浓度为1-3重量%的微晶纤维素溶液、浓度为0.01-0.1M的柠檬酸缓冲液混合，并加入与模拟浓度对应的乙醇，混合后在40-60℃下反应20-60min，加入3，5-二硝基水杨酸（DNS）后沸水反应3-8min，然后加入水，测量500-600nm处的吸光度值。

示例性地，内切纤维素酶（EG-An）活性的测定方法为将稀释10-2000倍的内切纤维素酶溶液、浓度为0.5-1.5重量%的羧甲基纤维素溶液、浓度为0.01-0.1M的柠檬酸缓冲液混合，并加入与模拟浓度对应的乙醇，混合后在40-60℃下反应20-60min，加入3，5-二硝基水杨酸（DNS）后沸水反应3-8min，然后加入水，测量500-600nm处的吸光度值。

示例性地，β-葡萄糖苷酶（BG-Pc）活性的测定方法为将稀释1000-5000倍的外切纤维素酶I溶液、浓度为5-50mmol/L的4-硝基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷溶液、浓度为0.01-0.1M的柠檬酸缓冲液混合，并加入与模拟浓度对应的乙醇，混合后在40-60℃下反应20-60min，加入浓度为0.5-2mol/L的Na₂CO₃和水，测量400-450nm处的吸光度值。

根据本发明，优选地，步骤（2）中，所述分子动力学模拟的过程包括：从蛋白质数据库中获得所述酶组分的晶体结构，选取所述目标产物的模型，利用Gromacs软件模拟基础溶剂系统和共溶剂系统，进行各个所述酶组分的MD模拟分析，获得各个所述酶组分的能量及结构数据，以及所述共溶剂对所述酶组分的活性部位的作用行为；其中，所述共溶剂含有所述目标产物和基础溶剂，所述共溶剂中目标产物的浓度为所述模拟浓度。

优选地，所述基础溶剂为水，所述共溶剂中目标产物的浓度为0-20体积%。

示例性地，目标产物为乙醇时，乙醇模型取自ATB和优化参数后的GROMOS96（54a7）力场，模拟系统在纯水系统（即基础溶剂系统）中填充15892个水分子，在4-16%（v/v）乙醇共溶剂系统中填充146-800个乙醇分子；采用最速下降法进行能量最小化，然后在对纤维素酶进行位置限制的情况下，在NPT系综中进行100ps平衡，以不同的起始原子速度进行了三次独立的计算模拟，每500ps收集一次坐标、能量和速度，用于后期分析。

根据本发明，优选地，步骤（3）中，将所述活性数据与所述分子动力学模拟结果相结合的过程包括：

（a）通过分析所述酶组分的能量及结构数据，以及所述共溶剂对所述酶组分的活性部位的作用行为，得到所述酶组分的空间分布函数、径向分布函数、基础溶剂化壳层与溶剂-氨基酸残基接触频率、目标产物层与溶剂-氨基酸残基接触频率，进而获得所述酶组分在所述共溶剂中的特定指纹谱，以详细研究共溶剂中酶组分周围的完整的溶剂化现象；

根据本发明，在以乙醇为目标产物时，将所述活性数据与所述分子动力学模拟结果相结合的过程可以为：

（a）结合不同纤维素酶在乙醇下的活性和动力学模拟结果，分析了分析空间分布函数(SDF)、径向分布函数(RDF)、水化壳层、乙醇层和溶剂-氨基酸残基接触频率，获得每种纤维素酶在共溶剂中的特定指纹谱，详细研究乙醇共溶剂中纤维素酶周围的完整的溶剂化现象；

（b）根据每种纤维素酶在共溶剂中的特定指纹谱对它们进行特定的设计方法，根据纤维酶表面的溶剂化状态（水化层和乙醇层），选择利用精确的水分子的数目变化作为复配方案的设计源头，分别提出水化层指导策略和活性位点去抑制指导策略以解除纤维素酶在乙醇发酵过程中的活性降低问题。

根据本发明，在发酵过程中需要用到酶制剂时，均可以采用本发明提供的通过计算机理性设计发酵过程中酶制剂补料方式的方法；例如，采用玉米、高粱、小麦、木薯、马铃薯、秸秆等生物质原料发酵生产乙醇的过程。

通过对不同模拟浓度下纤维素酶组分的活性测定看出，在所有纤维素酶-乙醇系统中，乙醇浓度在0-16%（v/v）之间时，乙醇分子的数量逐渐增加，会对纤维素酶发生更为明显的抑制作用，随着乙醇浓度的增加，纤维素酶的活性逐渐降低，这无疑限制了淀粉质原料中的纤维素有效水解生成葡萄糖，从而干扰了酿酒酵母的生长及其生产乙醇的过程。因此，通过上述的方法提出活性部位抑制引导方法来恢复降低的纤维素酶的活性，可以显著优化乙醇/甘油比率以获得更好的乙醇产量，当未添加纤维素酶发酵产生的乙醇浓度与实验中模拟的浓度大致相同时，确定为纤维素酶的进料时间，能够获得更低的纤维素酶消耗量，乙醇产量显著改善，且计算设计的方法需要耗费更少的实验工作。通过玉米发酵生产乙醇的过程验证可知，通过本发明提供的方法获得的纤维素酶制剂的补料方式具有良好的协同效应。

根据本发明，优选地，所述酶制剂为纤维素酶制剂，多个所述酶组分为外切纤维素酶I、外切纤维素酶II、内切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶。

根据本发明，优选地，所述补料时间段分别为0-2h、4-12h、12-16h、20-30h、45-55h。

根据本发明，优选地，所述酶制剂补料方式包括：在所述发酵进行0-2h，向每升发酵液中添加3-7mg的外切纤维素酶I、3-7mg的外切纤维素酶II、3-7mg的内切纤维素酶和3-7mg的β-葡萄糖苷酶；在所述发酵进行4-12h，向每升所述发酵液中添加0.3-1.8mg的外切纤维素酶I、1.8-3.5mg的外切纤维素酶II、0-0.7mg 的内切纤维素酶和0-0.7mg的β-葡萄糖苷酶；在所述发酵进行12-16h，向所述发酵液中添加0.3-1.8mg的外切纤维素酶I和0-7mg的β-葡萄糖苷酶；在所述发酵进行20-30h，向所述发酵液中添加0-0.7mg的外切纤维素酶I、0-7mg的外切纤维素酶II、0-3.5mg的内切纤维素酶和0-0.7mg的β-葡萄糖苷酶；在所述发酵进行45-55h，向所述发酵液中添加0-0.7mg的外切纤维素酶I、0-3.5mg的外切纤维素酶II、0-0.7mg的内切纤维素酶和0-0.7mg的β-葡萄糖苷酶。

根据本发明，优选地，所述乙醇发酵菌株为酿酒酵母，所述乙醇发酵菌株的接种量为0.3-0.5g干细胞重量/kg发酵原料，所述发酵的条件包括：温度为25-35℃，转速为120-180rpm，时间为60-96h；

根据本发明，所述液化处理的过程包括：将所述淀粉质原料与水混合后，先与α-淀粉酶混合进行液化；

根据本发明，优选地，所述淀粉质原料与水混合后淀粉质原料的干物浓度为25-30重量%，所述液化处理的条件包括：温度为85-90℃，时间为60-120min。

根据本发明，优选地，所述淀粉质原料选自玉米、高粱和大米中的至少一种，所述氮源选自硫酸铵、尿素和硝酸铵中的至少一种。其中，玉米、高粱和大米等均可市购得到，优选为采用各自对应的粉剂作为淀粉质原料。

根据本发明，优选地，相对于所述淀粉质原料的干重，所述α-淀粉酶的用量为0.010-0.015%，所述糖化酶的用量为0.0320-0.0330%，所述氮源的用量为0.010-0.015%。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中，玉米粉由中国辽宁铁岭国投生物能源有限公司赠送（葡聚糖含量：82.40%，木聚糖含量：2.50%，淀粉含量：77.65%，纤维素含量：4.79%）；α-淀粉酶购自Genencor生物制品有限公司，糖化酶购自山东隆达生物制品有限公司，外切纤维素酶I（CBHI-Tr）购自Sigma Aldrich公司，外切纤维素酶II（CBHII-Hi）、内切纤维素酶（EG-An）和β-葡萄糖苷酶（BG-Pc）均购自Megazyme公司，CBHI-Tr、CBHII-Hi、EG-An和BG-Pc的蛋白质含量分别为2.97、1.55、0.33和5.05mg/mL；酿酒酵母购自Angel酵母有限公司，其它原料及试剂均为常规的市售品。

以下实施例中，吸光度值通过吸取200μL的上清液至酶标板中，通过酶标仪测得，乙醇浓度通过将样品以10000rcf的速度离心10min，得到上清液，稀释10倍后，立即通过0.22μm过滤器进行无菌过滤，通过高效液相色谱分析测得。

实施例1

（1）外切纤维素酶I（CBHI-Tr）活性的测定：将0.1mL的外切纤维素酶I溶液、0.7mL浓度为10mmol/L的4-硝基苯基-β-D-纤维二糖苷溶液与0.1mL浓度为0.05M的柠檬酸缓冲液混合，并加入乙醇得到混合液，使得混合液中乙醇浓度分别为0体积%、4体积%、8体积%、12体积%、16体积%、20体积%，然后在50℃下反应40min，加入2mL浓度为1mol/L的Na₂CO₃和10mL水，测量400nm处的吸光值，结果见表1；

（2）外切纤维素酶II（CBHII-Hi）活性的测定：将0.1mL稀释200倍的外切纤维素酶II溶液、0.14mL浓度为2重量%的微晶纤维素PH101溶液、0.1mL浓度为0.05M的柠檬酸缓冲液混合，并加入乙醇得到混合液，使得混合液中乙醇浓度分别为0体积%、4体积%、8体积%、12体积%、16体积%、20体积%，然后在50℃下反应40min，加入0.6mL的3，5-二硝基水杨酸（DNS）后沸水反应5min，再加入2mL水，测量550nm处的吸光值，结果见表1；

（3）内切纤维素酶（EG-An）活性的测定：将0.1mL稀释200倍的内切纤维素酶溶液、0.14mL浓度为1重量%的羧甲基纤维素溶液与0.1mL浓度为0.05M的柠檬酸缓冲液混合，并加入乙醇得到混合液，使得混合液中乙醇浓度分别为0体积%、4体积%、8体积%、12体积%、16体积%、20体积%，然后在50℃下反应40min，加入0.6mL 的3，5-二硝基水杨酸（DNS）后沸水反应5min，然后加入2mL水，测量550nm处的吸光值，结果见表1；

（4）β-葡萄糖苷酶（BG-Pc）活性的测定：将0.1mL稀释5000倍的外切纤维素酶I溶液、0.7mL浓度为5mmol/L的4-硝基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷溶液、0.1mL浓度为0.05M的柠檬酸缓冲液混合，并加入乙醇得到混合液，使得混合液中乙醇浓度分别为0体积%、4体积%、8体积%、12体积%、16体积%、20体积%，然后在50℃下反应120min，加入2mL浓度为1mol/L的Na₂CO₃和10mL水，测量400nm处的吸光值，结果见表1；

（5）从蛋白质数据库中获得CBHI-Tr、CBHII-Hi、BG-Pc和EG-An的晶体结构，使用Gromacs v5.1.2进行MD模拟，GROMOS96（54a7）力场用于模拟乙醇溶剂中的纤维素酶，将纤维素酶晶体结构放到一个最小距离为1.2nm的SPCE水的立方箱中；根据实验条件，模拟系统在纯水系统中填充15892个水分子，在4-16%（v/v）乙醇溶剂系统中填充146-800个乙醇分子，为了避免最不利的相互作用，首先采用最速下降法进行能量最小化，然后，在对纤维素酶进行位置限制的情况下，在NPT系统中进行100 ps平衡，以不同的起始原子速度进行了三次独立的MD模拟，每500 ps收集一次坐标、能量和速度，用于MD分析；

（6）结合步骤（1）-步骤（4）中不同纤维素酶在不同乙醇浓度下的活性（见图1）及整体结构性能（见图2、图3和图4）和步骤（5）的MD模拟结果，分析空间分布函数(SDF)、径向分布函数(RDF)、水化壳层、乙醇层和溶剂-氨基酸残基接触频率，详细研究乙醇共溶剂中纤维素酶周围的完整的溶剂化现象，根据每种纤维素酶在共溶剂中的特定指纹谱对它们进行特定的设计方法，结合纤维素酶表面的溶剂化状态（包括水化层和乙醇层，见图5），选择利用精确的水分子的数目变化（见图6）作为复配方案的设计源头，分别提出去溶剂化和活性位点去抑制化的纤维素酶补料方式，即根据实际研究中，首先确定常规条件下每种纤维素酶的添加量（以添加量为玉米干重的0.03重量%为例），考虑到有效蛋白质含量后，需要在0h加入0.16mg每种纤维素酶蛋白，根据上述残留活性数据或模拟结果，计算每个时间点所选因子（例如残留活性、整体水合作用、活性中心水化层程度）的减少百分比，并将后者的减少定义为酶活性减少的量，为了理论上恢复100%的酶活性，在每个时间点补充相应量的酶，最终获得纤维素酶的补料方式具体为：在所述发酵进行0-2h，向每升发酵液中添加3-7mg的外切纤维素酶I、3-7mg的外切纤维素酶II、3-7mg的内切纤维素酶和3-7mg的β-葡萄糖苷酶；在所述发酵进行4-12h，向每升所述发酵液中添加0.3-1.8mg 的外切纤维素酶I、1.8-3.5mg的外切纤维素酶II、0-0.7mg 的内切纤维素酶和0-0.7mg的β-葡萄糖苷酶；在所述发酵进行12-16h，向所述发酵液中添加0.3-1.8mg的外切纤维素酶I和0-7mg的β-葡萄糖苷酶；在所述发酵进行20-30h，向所述发酵液中添加0-0.7mg的外切纤维素酶I、0-7mg的外切纤维素酶II、0-3.5mg的内切纤维素酶和0-0.7mg的β-葡萄糖苷酶；在所述发酵进行45-55h，向所述发酵液中添加0-0.7mg的外切纤维素酶I、0-3.5mg的外切纤维素酶II、0-0.7mg的内切纤维素酶和0-0.7mg的β-葡萄糖苷酶。

表1

实施例2

（1）以添加有葡萄糖的YPD培养基作为酿酒酵母的种子培养基（葡萄糖的浓度为100g/L），在温度为30℃、转速为150rpm的条件下培养24h，得到种子培养液，将种子培养液在4000rpm下离心10min获得种子湿菌体；

（2）将玉米粉与水混合使得玉米干物浓度为30重量%，加入0.012重量%（相对于玉米的干重）的α-淀粉酶，在温度为88℃条件下液化90min后，冷却至60℃得到发酵原料；

（3）取30g步骤（2）得到的发酵原料作为发酵液，将步骤（1）得到的种子湿菌体以0.44g干细胞重量/kg发酵液进行接种，并加入0.0325重量%（相对于玉米的干重）的糖化酶和0.012重量%（相对于玉米的干重）的尿素，然后在pH值为4.0、转速为150rpm、温度为30℃的条件下进行发酵；在发酵进行0h时，向发酵液中添加0.16mg的CBHI-Tr、0.16mg的CBHII-Hi、0.16mg的EG-An和0.16mg的BG-Pc；在发酵进行8h时，向发酵液中添加0.04mg的CBHI-Tr、0.09mg的CBHII-Hi、0.01mg的EG-An和0.01mg的BG-Pc；在发酵进行13h时，向发酵液中添加0.03mg的CBHI-Tr和0.10mg的BG-Pc；在发酵进行22h时，向发酵液中添加0.01mg的CBHI-Tr、0.19mg的CBHII-Hi和0.04mg的EG-An；在发酵进行50h时，向发酵液中添加0.07mg的CBHII-Hi和0.01mg的EG-An，继续发酵至72h结束。

测定步骤（3）得到的发酵液中的乙醇浓度为119.57g/L。

实施例3