具体实施方式

以下，对本发明的一实施方式进行说明。本发明的内容不限定于以下说明的实施方式。

需要说明的是，本说明书中，关于数值的记载的“A～B”这一术语是指“A以上且B以下”(A<B的情况)或“A以下且B以上”(A>B的情况)。另外，本发明中，优选的方式的组合为更优选的方式。

[气体浓度调节剂]

本发明的细菌培养用气体浓度调节剂的特征在于，其包含(a)抗坏血酸类、(b)过渡金属催化剂、(c)活性炭、(d)碱金属碳酸盐或碱土金属氢氧化物和(e)水，前述抗坏血酸类和前述水浸渗于前述活性炭中，前述活性炭的平均孔径为2.0nm以上。气体浓度调节剂优选以用透气性包装材料将组合物包装成包装体的形式使用，所述组合物包含(a)抗坏血酸类、(b)过渡金属催化剂、(c)活性炭、(d)碱金属碳酸盐或碱土金属氢氧化物和(e)水。本发明的气体浓度调节剂可用于细菌培养。

(a)抗坏血酸类

本发明的气体浓度调节剂包含兼具吸氧能力和二氧化碳气体产生能力的抗坏血酸类作为吸氧反应的主剂。

抗坏血酸类是指L-抗坏血酸及其立体异构体及其盐和水合物。作为L-抗坏血酸盐，可列举出L-抗坏血酸钠、L-抗坏血酸钾、L-抗坏血酸钙等。作为L-抗坏血酸的立体异构体，可列举出异抗坏血酸(D-异抗坏血酸)等。作为异抗坏血酸盐，可列举出异抗坏血酸钠、异抗坏血酸钾、异抗坏血酸钙等。抗坏血酸类可以是单独1种，也可以组合使用2种以上。

本发明的气体浓度调节剂中，从吸氧性能的观点出发，抗坏血酸类与水一起浸渗于活性炭中。具体而言，将使抗坏血酸类溶解于水中而得到的抗坏血酸类的水溶液浸渗于作为多孔载体的活性炭中。此时，抗坏血酸类的水溶液的浓度高者能够减少多孔载体的用量，因此抗坏血酸类的浓度优选设为尽可能接近饱和溶解度的浓度。因此作为抗坏血酸类，优选选择在水中的溶解度高的化合物，具体而言，优选L-抗坏血酸钠。使用L-抗坏血酸钠时，将该水溶液的浓度设为40～55质量％是适合的。

在气体浓度调节剂中，利用抗坏血酸类的氧化反应吸收气氛中的氧气来调节其浓度，同时利用产生的二氧化碳来调节气氛中的二氧化碳浓度。需要说明的是，在该氧化反应中，理论上会生成与所消耗的氧分子等摩尔的二氧化碳。由于上述原理，若氧气浓度降低则与其相伴地二氧化碳浓度也增加，但在气体浓度调节剂中配混具有二氧化碳吸收能力的化合物、例如碱土金属氢氧化物时，也能够抑制二氧化碳的增加。相反，若将具有二氧化碳产生能力的化合物配混于气体浓度调节剂中，则也能产生比氧气减少量更多的二氧化碳。如此在本发明的气体浓度调节剂中，通过适宜选择构成气体浓度调节剂的组合物的配混成分和/或配混量，调整氧化反应的进行程度、所产生的二氧化碳量，从而能够在特定气氛下调节至期望的氧气浓度和二氧化碳浓度。通过调节至期望的氧气浓度和二氧化碳浓度，从而能够调节适于厌氧性细菌、微好氧性细菌或好氧性细菌的各种菌的培养环境。

(b)过渡金属催化剂

本发明的气体浓度调节剂包含促进抗坏血酸类的氧化反应进行的过渡金属催化剂。

过渡金属催化剂是具有过渡金属的盐、氧化物等金属化合物的催化剂。作为过渡金属，铁、锰、锌、铜、钴是适合的。作为过渡金属的盐，包含过渡金属的卤化物和无机酸盐，例如是过渡金属的氯化物、硫酸盐。作为代表例，可列举出氯化亚铁、氯化铁、硫酸亚铁、硫酸铁、氯化锰、硫酸锌、硫酸铜、氯化铜、硫酸钴的无水盐或含水盐等，其中优选在水中的溶解性良好、配混性良好的硫酸亚铁七水合物。

从促进抗坏血酸类的氧化反应进行的观点出发，气体浓度调节剂中的过渡金属催化剂的含量相对于抗坏血酸类100质量份优选5～25质量份，更优选10～20质量份。

(c)活性炭

本发明的气体浓度调节剂包含活性炭。活性炭具有作为浸渗抗坏血酸类的水溶液的载体的功能，且由于其比表面积大而与空气的接触面积大，具有促进氧化反应进行的功能。

作为活性炭，例如可以使用以锯末、煤、椰子壳等作为原料并利用水蒸气活化、使用了氯化锌等的药物活化等各种制法而制造的活性炭。另外，对于活性炭，为了将抗坏血酸类的水溶液等负载于活性炭并以颗粒状填充于小袋中而使用，优选粒状活性炭。从吸氧性能的观点和在包装体中的填充性(流动性)的观点出发，粒状活性炭的粒径优选为0.1～2mm、更优选为0.5～1mm。

本发明中，活性炭的平均孔径为2.0nm以上。通过使活性炭的平均孔径为2.0nm以上，从而本发明的细菌培养用气体浓度调节剂的抗坏血酸类的氧化反应在反应初期(自反应开始1小时后)的二氧化碳产生量大、在短时间内能够制作高浓度二氧化碳气氛和低浓度氧气气氛的气体环境。从抗坏血酸类的氧化反应在反应初期(自反应开始1小时后)的二氧化碳产生量的观点出发，活性炭的平均孔径优选为2.2nm以上、更优选为2.5nm以上。活性炭的平均孔径的上限可以是5.5nm以下，可以是5.0nm以下，可以是4.5nm以下，也可以是4.0nm以下。需要说明的是，本发明中的活性炭的平均孔径可以利用后述的实施例中记载的方法进行测定。

另外，本发明中，从抗坏血酸类的氧化反应在反应初期(自反应开始1小时后)的二氧化碳产生量的观点出发，活性炭的总孔容优选为0.60cm³/g以上、更优选为0.65cm³/g以上、进一步优选为0.68cm³/g以上。活性炭的总孔容的上限可以是2.0cm³/g以下，可以是1.8cm³/g以下，可以是1.5cm³/g以下，也可以是1.0cm³/g以下。需要说明的是，本发明中的活性炭的总孔容可以利用后述的实施例中记载的方法进行测定。

从吸氧性能的观点和在包装体中的填充性的观点出发，气体浓度调节剂中的活性炭的含量相对于抗坏血酸类100质量份优选50～400质量份，更优选75～300质量份。

(d)碱金属碳酸盐或碱土金属氢氧化物

为了调节二氧化碳浓度，本发明的气体浓度调节剂包含碱金属碳酸盐或碱土金属氢氧化物。出于使抗坏血酸类的氧化反应迅速地进行、并将反应场控制在碱性区域的目的而使用碱金属碳酸盐。另一方面，碱土金属氢氧化物可用作二氧化碳气体吸收剂。需要说明的是，组合使用碱金属碳酸盐和碱土金属氢氧化物时，难以进行二氧化碳浓度的调节，因此不优选组合使用两者。

作为碱金属碳酸盐，可适宜地使用碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠水合物等水溶性的碱金属碳酸盐，其中特别优选碳酸钠。

作为碱土金属氢氧化物，可适宜地使用特别是氢氧化钙、氢氧化镁或它们的混合物。当希望在短时间内吸收大量二氧化碳时，可适宜地使用氢氧化钙等在水中的溶解性高且二氧化碳吸收速度快的碱土金属氢氧化物。进而，二氧化碳的产生量并非是恒定的而是时时刻刻变化的。例如，在更迅速地形成氧气浓度0％、二氧化碳浓度5％的气体气氛时，为了一次性吸收气氛中的全部氧气，在抗坏血酸类的氧化反应的反应刚开始后一次性产生大量二氧化碳，然后二氧化碳的产生量迅速减少。在这种情况下，优选将二氧化碳吸收速度快的氢氧化钙和二氧化碳吸收速度慢的氢氧化镁混合。

另外，碱土金属氢氧化物优选为粉体，其平均粒径优选为1～100μm、更优选为2～50μm。

从调节二氧化碳浓度的观点出发，气体浓度调节剂中的碱金属碳酸盐或碱土金属氢氧化物的含量相对于抗坏血酸类100质量份优选10～200质量份，更优选15～150质量份，进一步优选20～100质量份。

(e)水

本发明的气体浓度调节剂包含抗坏血酸类的氧化反应进行所需的水。

对于水，从气体浓度调节剂可以以具有流动性的固体物的形式获得的观点出发，优选采用浸渗于活性炭中的形态。在本发明的气体浓度调节剂中，从吸氧性能的观点出发，水与抗坏血酸类一起浸渗于活性炭中。具体而言，将抗坏血酸类溶解于水中而得到的抗坏血酸类的水溶液浸渗于作为多孔载体的活性炭中。另外，水中可以溶解除抗坏血酸类以外的可溶性成分，也可以分散不溶性成分。

从使抗坏血酸类的氧化反应进行的观点出发，气体浓度调节剂中的水的含量相对于抗坏血酸类100质量份优选100～200质量份，更优选110～180质量份，进一步优选120～180质量份。

(f)其它成分

本发明的气体浓度调节剂在不损害本发明的效果的范围内，可以根据需要包含除上述(a)～(e)成分以外的成分。

(f1)热塑性树脂

为了抑制伴随吸氧反应(抗坏血酸类的氧化反应)进行的过度的放热，本发明的气体浓度调节剂可以包含热塑性树脂。热塑性树脂的种类没有特别限制，例如可以使用聚乙烯、聚丙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、弹性体或它们的混合物，从软化点的调节容易、臭气的影响少这样的观点出发，可适宜使用特别是分子量10000以下的低分子量聚乙烯、聚丙烯或它们的混合物。

从与其它成分的混合性的观点出发，热塑性树脂优选粒径为1～500μm的粒状体，更优选10～300μm的粒状体。另外，从更有效地抑制放热的观点出发，热塑性树脂的软化点优选90～125℃。

从使抗坏血酸类的氧化反应进行的观点出发，气体浓度调节剂中的热塑性树脂的含量相对于抗坏血酸类100质量份优选35～300质量份，更优选60～200质量份。

(f2)除醛剂

为了主要去除伴随抗坏血酸类的氧化反应的进行而副产的醛，本发明的气体浓度调节剂还可以包含除醛剂。作为具有除醛能力的化合物，胺类等各种化合物是公知的，但优选配混除醛能力充分、也未观察到产生刺激性臭味、且以少量发挥高效果的亚乙基脲、脲、精氨酸、赖氨酸盐酸盐或聚烯丙胺，更优选以更少量具有高效果的亚乙基脲。

本说明书中所谓的醛是指在其分子内具有1个以上甲酰基的化合物、即醛类。本发明中，典型地是指在吸氧或细菌培养过程中作为副产成分产生的醛。作为该醛，只要不对细菌培养产生不良影响，则包括在化学领域中被分类为醛类的任意的醛。具体而言，例如包括甲醛、乙醛等。

从有效且廉价地去除醛的观点出发，气体浓度调节剂中的除醛剂的含量相对于抗坏血酸类100质量份优选0.5～25质量份，更优选1.0～10质量份，进一步优选1.0～5.0质量份。

本发明的气体浓度调节剂的制造方法没有特别限制，例如可列举出如下方法：将过渡金属催化剂、碱金属碳酸盐或碱土金属氢氧化物等溶解于抗坏血酸类的水溶液中，将该溶液混合并浸渗于活性炭中。

[气体浓度调节剂包装体]

对于气体浓度调节剂，通过将包含上述各成分的组合物用全部或一部分使用了透气性包装材料的包装材料进行包装，从而也能够制成气体浓度调节剂包装体。

(包装材料)

作为包装材料，可列举出：将2张透气性包装材料贴合而制成袋状的包装材料；将1张透气性包装材料和1张非透气性包装材料贴合而制成袋状的包装材料；将1张透气性包装材料弯折，除弯折部外使缘部彼此密封而制成袋状的包装材料。

此处，透气性包装材料和非透气性包装材料为四边形时，包装材料可列举出：将2张透气性包装材料重叠，将4边热封而制成袋状者；将1张透气性包装材料和1张非透气性包装材料重叠，将4边热封而制成袋状者；将1张透气性包装材料弯折，除弯折部外将3边热封而制成袋状者。另外，包装材料也可以是将透气性包装材料制成筒状并对该筒状体的两端部和主体部分进行热封而制成袋状者。

(透气性包装材料)

作为透气性包装材料，可选择透过氧气和二氧化碳的包装材料。其中，可适宜地使用基于Gurley式试验机法的透气抵抗度为600秒以下、更优选为90秒以下的透气性包装材料。此处，透气抵抗度是指利用JIS P8117(1998)的方法测得的值。更具体而言，是指使用株式会社东洋精机制作所制的Gurley式透气度测定仪，100mL的空气透过透气性包装材料所需的时间。

作为上述透气性包装材料，除了纸、无纺布之外，可使用对塑料薄膜赋予了透气性的透气性包装材料。作为塑料薄膜，例如可以使用将聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚酰胺、聚丙烯、聚碳酸酯等薄膜与作为热封层的聚乙烯、离聚物、聚丁二烯、乙烯丙烯酸共聚物、乙烯甲基丙烯酸共聚物或乙烯乙酸乙烯酯共聚物等薄膜层叠粘接而成的层叠薄膜等。另外，这些层叠物也可以用作透气性包装材料。

作为赋予透气性的方法，除了基于冷针、热针的穿孔加工之外，可以采用各种方法。通过穿孔加工来赋予透气性时，透气性可以根据所穿孔的孔的直径、数量、材质等进行自由调整。

另外，层叠薄膜的厚度优选为50～300μm，特别优选为60～250μm。此时，与厚度不在上述范围内的情况相比，能够制成保持强度且热封性、包装适应性优异的包装材料。

为了长期维持上述气体浓度调节剂包装体的功能，优选：在使用前收纳于阻气性的容器、袋中，在使用时从阻气性的容器、袋中取出而使用。另外，在将气体浓度调节剂包装体用于菌培养的用途时，优选对该包装体预先实施使用了γ射线等的杀菌。

[细菌的培养方法]

本发明的细菌的培养方法是在气体浓度调节剂的存在下培养细菌的方法。具体而言，可以通过如下方式实施：将气体浓度调节剂(优选为气体浓度调节剂包装体)与收纳有细菌和培养基的培养容器一起设置于阻气性密闭容器内后，进行密封，将该密闭容器静置在适于细菌培养的温度下，从而实施。此时，出于测定在阻气性密闭容器内产生的醛的产生量、调节该容器内的湿度等目的，也可以在该密闭容器内设置收纳有蒸馏水的开放型的容器。作为开放型的容器，除了培养容器之外，可以示例出烧杯、烧瓶等，优选为与收纳有细菌和培养基的培养容器相同种类的容器。

对于密闭容器内的氧气浓度，在培养微好氧性细菌的情况下优选6～14容量％，在培养厌氧性细菌的情况下优选1容量％以下。

对于密闭容器内的二氧化碳浓度，在培养微好氧性细菌的情况下优选1～10容量％，更优选2～10容量％，进一步优选2～9容量％。在培养厌氧性细菌的情况下优选10容量％以上，更优选12容量％以上，进一步优选14容量％以上。

适合的氧气和二氧化碳浓度因细菌而不同，但重要的是在短时间内达到期望的浓度。培养微好氧性细菌时，抗坏血酸类的氧化反应在反应初期(自反应开始1小时后)的氧气浓度优选2～18容量％，更优选3～17容量％，进一步优选4～16容量％。抗坏血酸类的氧化反应在反应初期(自反应开始1小时后)的二氧化碳浓度优选1～10容量％，更优选2～10容量％，进一步优选2～9容量％。另外，培养厌氧性细菌时，抗坏血酸类的氧化反应在反应初期(自反应开始1小时后)的氧气浓度优选2容量％以下，更优选1容量％以下。抗坏血酸类的氧化反应在反应初期(自反应开始1小时后)的二氧化碳浓度优选10容量％以上，更优选12容量％以上，进一步优选14容量％以上。

另外，培养温度优选为20～45℃，特别优选为25～40℃。

本发明的细菌的培养方法中，培养实施前的阻气性容器内的气氛无需进行特别控制，例如也可以是空气。在阻气性容器内填充空气，在使用能产生与所吸收的氧气等容量的二氧化碳的气体浓度调节剂来实施本发明的培养方法时，若将二氧化碳浓度设为2～10容量％，则氧气浓度为11～19容量％左右，若将二氧化碳浓度设为3～8容量％，则氧气浓度为13～18容量％左右。但是，在使用了本发明的气体浓度调节剂的培养方法中，氧气浓度没有特别限定。另外，作为菌培养条件适合的是，培养基中所溶解的醛浓度优选为2mg/L以下，更优选为1.5mg/L以下，进一步优选为1.0mg/L以下。

本发明的培养方法中使用的细菌没有特别限制。本发明的细菌的培养方法也能够用于厌氧性细菌、微好氧性细菌和好氧性细菌的任意细菌的培养。对于本发明的培养方法中使用的培养基也没有特别限制，由于可以直接使用通常使用的培养基，因此可以自由选择适于所培养的菌的培养基。另外，培养容器只要确保与容器外的透气性就没有特别限制，容积、形状、材质等均可以采用适于培养的任意者。可适宜使用具有盖子部的培养容器，但此时也必须确保与容器外的透气性。

细菌培养方法中使用的阻气性密闭容器是阻碍其内外气体的流通来长期维持通过投入的气体浓度调节剂而形成的氧气、二氧化碳浓度者。经常使用由玻璃、金属、聚碳酸酯等塑料等构成的容器，但也可以使用阻气性薄膜及其层叠物。

根据本发明的培养方法，能够在不使用气罐和气体调节器的情况下进行在适合的气体气氛下的细菌的显微镜观察、运输。

实施例

以下，使用实施例和比较例对本实施方式详细地说明，但本实施方式只要发挥本发明的作用效果就可以进行适宜变更。需要说明的是，实施例和比较例中的“份”没有特别声明时是指质量份。

将实施例和比较例中使用的活性炭示于表1。利用下述方法进行测定了活性炭的平均孔径和总孔容。

(活性炭的平均孔径和总孔容)

在活性炭的平均孔径和总孔容的测定中，使用Microtrac BEL公司制的“BELSORP-max”，将约0.1g试样在预处理条件下进行130℃、真空脱气，测定了液氮(77K)中的氮吸附等温线。使用随附的软件，利用BET多点法，求出总孔容和平均孔径。

[表1]

表1

实施例1

将6g硫酸亚铁·七水合物溶解于100g的L-抗坏血酸钠水溶液(浓度45质量％)中，将水溶液浸渗于60g活性炭(C1)中后，添加混合低分子量聚乙烯70g和碳酸钠·十水合物20g而得到气体浓度调节剂(1)。

另外，在用有孔聚乙烯薄膜层压的日本纸的纵90mm×横55mm透气性小袋中，填充5g气体浓度调节剂(1)而得到气体浓度调节剂包装体(1)。

实施例2～4

实施例1中，将活性炭(C1)分别变更为活性炭(C2)～(C4)，除此以外与实施例1同样地得到气体浓度调节剂(2)～(4)和气体浓度调节剂包装体(2)～(4)。

比较例1

实施例1中，将活性炭(C1)变更为活性炭(C5)，除此以外与实施例1同样地得到气体浓度调节剂(5)和气体浓度调节剂包装体(5)。

[评价]

对于实施例和比较例中得到的气体浓度调节剂包装体(1)～(5)，利用下述方法测定了氧气浓度和二氧化碳气体浓度。将结果示于表2。

(氧气浓度和二氧化碳气体浓度)

在用聚偏氯乙烯涂布的尼龙薄膜的袋(400×220mm)中密封气体浓度调节剂包装体、2个醛测定用培养皿(直径60mm、加入蒸馏水5mL)、空气2.5L，将其在35℃的恒温槽中保温，测定了袋内气体成分的经时变化。使用氧气/二氧化碳气体分析计“CheckMate 3”(MOCON Europe公司制)，同时测定了氧气和二氧化碳气体浓度的经时变化。

[表2]

表2

由表2可知的那样，使用了平均孔径低于2.0nm的活性炭(C5)的比较例1中，抗坏血酸类的氧化反应在自反应开始1～2小时后的二氧化碳浓度低，反应初期的二氧化碳产生量少。相对于此，使用了平均孔径为2.0nm以上活性炭的实施例中，抗坏血酸类的氧化反应在自反应开始1小时后的二氧化碳发生浓度高，在短时间内能够制作高浓度二氧化碳气氛和低浓度氧气气氛的气体环境。