阅读说明：本技术 一种含冰川水的制剂、制备方法及其应用 (preparation containing glacier water, and its preparation method and application ) 是由 姜山山 摩根多斯桑托斯 蒋丹丹 李慧 章漳 于 2018-07-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种含冰川水的制剂,其中所述制剂含有冰川水和诃子提取物,所述冰川水最终体积百分比2.0-5.0％,所述诃子提取物终浓度为5-10μg/mL。本发明还公开了所述的含冰川水的制剂的制备方法；以及所述的含冰川水的制剂的应用,所述应用为在改善人体皮肤表皮内稳态及屏障功能上的应用。本发明的含冰川水的制剂天然、安全,具有激发表皮细胞的增殖与分化、表皮更快的再生与修复能力,以及促进屏障功能修复的效果,在改善人体皮肤表皮内稳态及皮肤屏障功能上有很高的应用价值。(The invention discloses preparations containing glacier water, wherein the preparations contain glacier water and myrobalan extract, the final volume percentage of the glacier water is 2.0-5.0%, and the final concentration of the myrobalan extract is 5-10 mug/mL.)

一种含冰川水的制剂、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及皮肤生物领域，具体涉及一种含冰川水的制剂、制备方法及其应用，尤其是其在改善人体皮肤表皮内稳态及屏障功能上的应用。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，主要承担着保护身体、排汗、感觉冷热和压力的功能。皮肤覆盖全身，阻挡住外来侵入，亦保住水份，保暖、阻隔、感觉之用；它使体内各种组织和器官免受物理性、机械性、化学性和病原微生物性的侵袭。人和高等动物的皮肤由表皮、真皮、皮下组织三层组成。随着年龄的增长，皮肤会出现松弛、干燥粗糙、弹性下降、皱纹增多等老化现象，皮肤衰老主要分为自然衰老和光老化两种形式。

遗传程序性内在老化会导致表皮层和真皮层变薄。组织学上，最突出的改变之一是真表皮连接处(DEJ)的结构和功能面临挑战，导致两层之间营养物质的传输减少。生命过程中，真皮层厚度主要受胶原蛋白、弹性蛋白和透明质酸含量降低的影响；表皮层中，增殖下降以及衰老角质细胞的出现导致表皮细胞更新速度逐渐降低。表皮更新，对于年轻人来说需要28天，而对于老年人需要40-60天，从而影响了皮肤的屏障功能、保湿和修复。

诃子原产于印度、缅甸等地，在我国云南、广东、广西、西藏等地均有分布，是常用的藏药，在中医中本药为非常用药。其蒙古名为必匝雅、阿如拉、老兴布等。在藏药学经典著作《晶珠本草》里，诃子被称为额木茵汗，即“藏药之王”。其为使君子科植物诃子(Terminalia chebula Retz.)或绒毛诃子(Terminadia chebula Retz.var.tomentellaKurt.)的干燥成熟果实，含鞣质，主要成分为诃子酸(chebulinic acid)、诃黎勒酸(chebulagic acid)、1， 3，6-三没食子酰葡萄糖(1,3,6-trigalloyl-β-glucose)。另含原诃子酸(terchebin)、鞣花酸(ellagic acid)、诃子素(chebulin)等。其味苦、酸、涩，性平，药理作用为涩肠敛肺，降火利咽，在临床上主要用于治疗久泻久痢，脱肛便血，肺虚咳嗽，久咳音哑等。目前在皮肤上尚未得到广泛应用。

矿物泉水已在外用产品中广泛应用了数十年，同时在皮肤医学上作为辅助剂应用在皮肤保湿、皮肤老化的治疗以及腐蚀性化妆步骤后的皮肤再生方面。在过去的几十年中，多项研究证明了矿物泉水的生物功效并认为他们的化学和热力性质对皮肤细胞生理学和内稳态具有直接的影响。我国的《饮用天然国家标准》对矿泉水的定义为：从地下深处自然涌出的或经人工揭穿、未受污染的地下矿泉水，其含有一定量的矿物盐、微量元素或二氧化碳气体。冰川水是冰川融水渗入地下，经地岩、地磁、地热、高压等作用，渗透、过滤、矿化，以泉涌形式喷涌而出的天然矿泉水，被赋予很高的能量与活性。冰川水的特点为：接近零污染，高能态水，表面张力大，低氘，富含天然微量元素，且比例均衡，天然弱碱性，结构化小分子团水，水龄长，均在1000 年以上。例如CN 201410499970.0公开了冰川水在制备皮肤外用剂中的应用，及一种含冰川水的皮肤外用剂，其具有增加皮肤弹性、抗皱、修复受损皮肤，以及减少色素沉着和美白的功效。然而，尚未有冰川水或含冰川水的方法在改善人体皮肤表皮内稳态及皮肤屏障功能上的应用。

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供了一种含冰川水的制剂、制备方法及其应用，尤其是其在改善人体皮肤表皮内稳态及屏障功能上的应用。本发明的含冰川水的制剂天然、安全，具有激发表皮细胞的增殖与分化、表皮更快的再生与修复能力，以及促进屏障功能修复的效果。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种含冰川水的制剂，所述制剂含有冰川水和诃子提取物，所述冰川水最终体积百分比1.0-5.0％，所述诃子提取物终浓度为5-10μg/mL。

较佳地，所述冰川水最终体积百分比为2.0％，且所述诃子提取物终浓度为10μg/mL。

更佳地，所述诃子提取物是由以下方法制备，所述方法包括下列步骤：

(1)取诃子粉碎至20～60目；

(2)室温下以10倍体积的70％乙醇超声提取2次以上，每次30min以上，得粗提取液；

(3)将步骤(2)所得提取液过滤，得滤液；

(4)将上述滤液合并、旋转蒸发至干，得诃子提取物。

较佳地，所述步骤(2)中，所述超声的频率为400-550W，所述超声的时间为25-40min。更佳地，所述步骤(2)中，所述超声的频率为500W，所述超声的时间为30min。

更佳地，所述步骤(3)中，所述过滤为先使用纱布初步过滤得初滤液，再使用8000rpm/min离心过滤10min。本发明实施例中使用的纱布优选为双层纱布。

本发明中，术语“制剂”指液体制剂，即药物分散在液体分散介质中组成的液态制剂，尤其是如本领域技术人员理解的溶液型/混悬型/喷雾型液体制剂。

本发明中，冰川水母液的浓度为100％的纯冰川水，根据实验设计配比成1％，2％和5％的最终体积百分比。本发明中，最终体积百分比指其在应用时在体系中的实际体积百分比。同样地，诃子提取物也制备于母液中，其初始浓度为500μg/mL，根据实验设计稀释成终浓度为5μg/mL和10μg/mL。终浓度为如本领域技术人员理解的，应用时其在体系中的实际浓度。

本发明中，冰川水取自喜马拉雅山的多吉曲登尼玛泉(海拔5128米)，每升的该冰川水含有下述组分：Sr⁺0.2-0.5mg、K⁺0.5-10.0mg、Na⁺0.99-5.0mg、 Ca²⁺14.0-30.0mg以及Mg²⁺2.0-10.0mg；溶解性总固体含量为60-150mg/L；该冰川水的pH值为7.4，该冰川水中的氘含量为132ppm。喜马拉雅冰川水预处理时通过0.22μm的过滤器过滤，并储存在4℃中待用。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种含冰川水的制剂的制备方法，将上述浓度的诃子提取物和上述体积百分比的冰川水混匀即得。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述含冰川水的制剂的应用，所述应用为在改善人体皮肤表皮内稳态及屏障功能上的应用，所述制剂含有冰川水，所述冰川水最终体积百分比为1.0-5.0％。

较佳地，所述冰川水最终体积百分比为2.0％。

更佳地，所述制剂还含有诃子提取物，所述诃子提取物终浓度为5μg/mL 或10μg/mL。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

三维重组人体全层皮肤模型(3D全层皮肤模型)也称组织工程皮肤、人体皮肤替代物等。三维重组人体皮肤模型指采用生物相容性良好的基质材料，通过体外培养技术，将人体来源的真皮成纤维细胞、表皮角质细胞等接种于其上，构建了含有表皮、真皮和真表皮连接处的完整结构的皮肤组织模型，高度还原人皮肤的三维结构和功能。本发明使用3D全层皮肤模型评价含冰川水的制剂的安全性、功效性。

本发明的积极进步效果在于：1)含2.0％冰川水的制剂可以明显促进表皮细胞的增殖、表皮厚度的增加；2)含2.0％冰川水的制剂对于表皮屏障功能重要因子(天然保湿因子)丝聚合蛋白表达量有明显的促进作用；3)冰川水与诃子提取物组合，可以起到抗皮肤老化、保湿锁水和紧致的作用。

附图说明

图1为效果实施例1中冰川水处理后的3D皮肤模型与正常人体皮肤形态学对比；图1A为2％冰川水处理组的3D皮肤模型，图1B为正常人体皮肤组织结构；使用石蜡切片进行苏木精伊红染色，图1A为目镜×物镜：10×10，图1B为目镜×物镜：10×25。

图2为效果实施例1中马森三色染色法染色的3D全层皮肤模型表皮及真皮形态，图2A为空白对照组，图2B为2％冰川水组，图2C为5％冰川水组，目镜×物镜：10×10。

图3为效果实施例1中马森三色染色后，空白对照组、2％冰川水组、5％冰川水组的表皮厚度图像量化数据分析的柱形图，与空白对照组相比，2％冰川水组表皮厚度变化(μm)，***P<0.001。

图4为效果实施例1中3D全层皮肤模型Ki-67免疫染色图，图4A为空白对照组，图4B为2％冰川水组，图4C为5％冰川水组，目镜×物镜：10×10，图4A、图4B和图4C中箭头表示的是Ki-67免疫染色阳性区域。

图5为效果实施例1中Ki-67免疫染色后，空白对照组、2％冰川水组、 5％冰川水组中Ki-67染色表征的表皮细胞增殖指数量化数据分析的柱形图，与空白对照组相比，**P<0.01。

图6为效果实施例1中3D全层皮肤模型丝聚合蛋白免疫染色图，图6A 为空白对照组，图6B为2％冰川水组，图6C为5％冰川水组，目镜×物镜： 10×10，图6A、图6B和图6C中箭头表示的是丝聚合蛋白免疫染色阳性区域。

图7为效果实施例1中丝聚合蛋白免疫染色后，空白对照组、2％冰川水组、5％冰川水组中丝聚合蛋白阳性染色区域经真表皮连接处的长度标准化后量化数据分析的柱形图，与空白对照组相比，2％冰川水组，**P<0.01。

图8为效果实施例4中在成纤维细胞培养过程中，根据DNA含量归一化后评估了不同浓度的冰川水对I型胶原蛋白分泌含量的影响。1％冰川水、 2％冰川水及5％冰川水中I型胶原蛋白含量量化数据相较于空白对照的比例柱形图。

图9为效果实施例4中成纤维细胞培养过程中，根据DNA含量归一化后评估了2％冰川水、5μg/mL诃子提取物、10μg/mL诃子提取物及2％冰川水+10μg/mL诃子提取物对I型胶原蛋白分泌含量的影响，其I型胶原蛋白含量量化数据相较于空白对照的比例柱形图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1 3D全层皮肤模型的构建

1.1皮肤细胞培养

角质细胞(NHEK)和成纤维细胞(NHDF)的原始培养来自于两位健康人进行常规外科手术遗弃的皮肤，遵守赫尔辛基宣言(上海细胞和组织库 -SOBC，上海)。NHDF从一位42岁女性捐献者的脸部分离，NHEK来自于 16岁男性捐献者的***。

1.2体外人皮肤替代物培养

真皮替代物(DE)的准备，来自成年捐献者(42岁)的NHDF以2.5×10⁵ cells/cm²的浓度接种在壳聚糖-胶原-糖胺聚糖骨架材料(购自BASF)上。该真皮替代物(DE)在37℃，5％CO₂的环境下生长21天。皮肤替代物(SE) 的准备，来自于捐献者(16岁)的NHEK以2.5×10⁵cells/cm²的密度接种在 21天的DE上。7天的浸没培养后，将SE提到气-液表面，样品在第35天时收获，并用于组织学和免疫组织学的研究。

在3D皮肤模型中，表皮角质细胞和真皮成纤维细胞在模拟人体自然条件的微环境下共培养，形成组分、结构和功能都近似于真实人体皮肤的组织工程皮肤，采用Masson(马森)三色染色法观察体外重建的皮肤模型和正常人体皮肤的显微结构，染色结果显示体外重建皮肤模型具有组织形态同样良好的真皮和表皮；在透射电镜下观察重建皮肤模型基底膜带的超微结构，可见与正常人皮肤一样典型的半桥粒、胞膜层、透明层、致密层、网状层结构。利用这种多方位的相似性，体外重组皮肤模型可用于进行表皮、真皮及真表皮连接处分子的机理性和应用性研究。也可根据不同功能相关的分子靶标和调研方向对重组皮肤进行修饰，满足各种细分化的测试需求，如伤口愈合模型、老化皮肤模型、疾病皮肤模型等。

实施例2冰川水制剂的制备

冰川水制备：冰川水取自喜马拉雅山的多吉曲登尼玛泉(海拔5128米)，每升的该冰川水含有下述组分：Sr⁺0.2-0.5mg、K⁺0.5-10.0mg、Na⁺0.99-5.0mg、 Ca²⁺14.0-30.0mg以及Mg²⁺2.0-10.0mg；溶解性总固体含量为60-150mg/L；该冰川水的pH值为7.4，该冰川水中的氘含量为132ppm。喜马拉雅冰川水预处理时通过0.22μm的过滤器过滤，并储存在4℃中待用。

诃子提取物的制备：取诃子30g，粉碎至20～60目，于室温下以10倍体积的70％乙醇500W超声提取2次，每次30min，将滤液合并，滤液旋转蒸发(旋蒸仪EYELA SB-1100，上海爱朗仪器有限公司)至干，得到诃子提取物约16.9g，4度避光干燥。

含冰川水制剂母液的制备：将冰川水和诃子提取物混合，制成含有诃子提取物和冰川水的制剂母液，具体配制方法参见下表1。

表1含冰川水制剂的制备

实施例3含冰川水的制剂在3D全层皮肤模型上的效用

含冰川水的制剂每天以表1的终浓度加入到3D全层皮肤模型培养基中，从NHDF接种后第一次培养基换液开始(第一天)直到研究结束(第35天)。 35天皮肤替代物培养以未添加冰川水作为空白对照组。

实施例4组织学、免疫组织学及图像采集和数据分析

皮肤模型在所有的细胞培养的第35天收获，迅速移至中性缓冲液4％的***中固定24h并埋入石蜡或于冷冻包埋剂中，于-20℃冷冻。石蜡包埋***固定的样品之后被切成5μm的切片。

马森三色染色法-将组织切片脱蜡和再水化后，组织切片先由魏格特氏铁苏木精染色液染色，纯水润洗后滴加布里希猩红-酸性品红溶液，纯水润洗后滴加磷钨酸溶液，之后滴加亮绿溶液，分别按顺序在纯水、无水乙醇及甲基环己烷中润洗，封片，并进行常规组织学分析。

免疫组织化学-热导的抗原修复处理之后，组织切片在5％H₂O₂/3％牛血清白蛋白BSA(Sigma)中孵育来灭活内源性过氧化物酶。非特异性结合在包含5％BSA的磷酸盐缓冲液PBS中受阻。之后切片与一抗(见表2)在 5％BSA的磷酸盐缓冲液中室温状态下孵育过夜。在与过氧化物酶结合的二抗(EnVision,Dakocytomation)孵育一小时后，抗原由二氨基联苯胺盐酸盐作为底物进行检测。组织切片随后由Harris苏木精(25％,Sigma Aldrich)复染。

表2免疫组织化学实验中使用的一抗

DAB标记的免疫染色和样本由马森三色染色法染色，通过Axio Scope A1显微镜观察(Zeiss)，由AxioCam HRc照相机和Zen软件(Zeiss)采集图片。16位图片以标记图片文件格式(tiff)被保存。获得同样方法不同条件下12张有代表性的图片。图像处理和分析由可用显微镜自带的 MBF_ImageJ软件进行。采集的参数有马森三色染色的表皮增厚数据，Ki67细胞核阳性细胞指数以及丝聚合蛋白免疫染色的阳性区域总表面积。

所有的数据都表示为平均值±标准差的形式。所有的数据统计学显著性利用T检验运行来评估。35天喜马拉雅冰川水处理相关的每组数据与35天空白对照。统计上的显著差异通过*号标注：^nsP>0.05,*P<0.05,**P<0.01 以及***P<0.001。

实施例5 2D细胞实验

评估不同浓度配比的冰川水&诃子提取物制剂在成纤维细胞培养过程中对I型胶原蛋白表达的影响。在96孔板中对成纤维细胞饥饿培养72h后，含冰川水的制剂以表1的浓度应用添加，培养48h后结束。统计上的显著差异通过*号标注：^nsP>0.05,*P<0.05,**P<0.01以及***P<0.001。

效果实施例1组织学、免疫组织化学和图像分析结果

如图1所示，通过马森三色染色法染色的皮肤模型形态分析显示，与正常人体皮肤形态学对比，喜马拉雅冰川水处理的3D全层皮肤模型表皮、真表皮连接处和真皮层外观正常，未出现细胞毒性，与未处理空白组相似。

另外，用2％浓度喜马拉雅冰川水处理的3D全层皮肤模型，表皮层分化地更厚(图2)。与此相反，同样的培养时间，未处理对照组的3D全层皮肤模型表皮细胞只有两到三层，表皮层薄并且排列松散。

图像处理和分析(图3)显示2％喜马拉雅冰川水-处理组比未处理组表皮厚度显著增加86.6％，而5％冰川水组结果并不理想。

总而言之，这些结果显示2％冰川水刺激表皮形态发生并且促进基于老化皮肤细胞设计的3D全层皮肤模型的表皮再生，2％浓度冰川水能显著改善表皮厚度。在3D重建皮肤模型中，2％浓度的冰川水能显著提升真皮乳突层的厚度。

为了分析在老化情况下，冰川水对3D皮肤模型表皮层上的影响，进行了免疫组织学和图像分析，研究了表皮层增殖和分化标志物的表达，如Ki-67、丝聚合蛋白。

Ki-67：细胞增殖(表皮更新，再生和修复)。35天的培养之后，相应的 15天表皮化，免疫组织分析显示Ki-67和预期一致，只在基底层特异性表达(图4)。与未处理对照组比较，由喜马拉雅冰川水处理过的皮肤模型Ki-67 阳性细胞数量显著增加。通过自动图像分析得到表皮快速增殖细胞比例相比较空白对照组，冰川水2％浓度组显著增加21.2％，冰川水5％浓度组显著增加18.8％(如图5所示)。说明喜马拉雅冰川水有效促进表皮细胞增殖。

丝聚合蛋白(Filaggrin)：天然保湿因子。天然保湿因子的合成，是一种存在于人体表皮层中的蛋白质-丝聚合蛋白于角质层的角化细胞内降解而产生的亲水性吸湿物质。天然保湿因子能在角质层中与水结合，并通过调节、贮存水份达到保持角质细胞间含水量的作用，使皮肤自然呈现水润状态。

丝聚合蛋白也是参与皮肤屏障的重要因子，主要功能是参与表皮细胞的分化及皮肤屏障的形成。表皮物理屏障作用、表皮保水作用、表皮酸性环境的维持、表皮防晒作用。与未经处理的对照相比，冰川水2％浓度组显著增加25倍，冰川水5％浓度组没有显著差异(如图7所示)。说明2％冰川水组可显著激发丝聚合蛋白的表达，快速再生的表皮细胞有助于产生较厚的表皮层，且有利于形成角质层(图6)。

具体效果数据可见下表3。

表3功效数据

对于表皮分化，表皮分化终末期通过丝聚合蛋白标志物表达证明(图6)。显著地，2％喜马拉雅冰川水处理的皮肤模型样本显示丝聚合蛋白强烈的阳性染色，而对于35天培养未处理组皮肤模型只检测到零星的蛋白簇，说明 2％冰川水对表皮后期分化过程的增强。图像分析(图7)显示2％喜马拉雅冰川水处理组丝聚合蛋白表达显著增加，表明2％喜马拉雅冰川水处理组的皮肤模型更成熟，改善了皮肤屏障功能。

效果实施例2对成纤维细胞培养过程中I型胶原蛋白表达的影响

根据DNA含量归一化后评估了不同浓度的冰川水和诃子提取物水对I 型胶原分泌含量的影响(图8和图9)，在用1％喜马拉雅冰川水对I型胶原分泌未表现出明显差异；2％浓度的冰川水对I型胶原分泌表现出明显促进作用(相较于空白对照，增强14％)；5％浓度的冰川水对I型胶原分泌表现出明显促进作用(相较于空白对照，增强31％)；2％浓度的喜马拉雅冰川水 +10μg/mL的诃子提取物复合物对I型胶原蛋白分泌表现出明显促进作用(相较于空白对照增强199％，具有显著差异；相较于2％浓度冰川水增强185％，具有显著差异；相较于10μg/mL的诃子提取物增强107％，具有显著差异)。上述具体效果数据可见下述表4。

表4在2D细胞层面上I型胶原蛋白功效数据

总之，组织学和免疫组织学结果显示表皮厚度增加是角质细胞增殖增强的结果，同时伴随增强的细胞粘附和完整的终端分化，说明培养基中2％喜马拉雅冰川水的添加可以改善表皮内稳态。该方法的应用说明冰川水显著激发表皮细胞的增殖和分化、表皮更快的再生和修复能力，促进屏障功能修复。对于细胞层面成纤维细胞对I型胶原蛋白的分泌量来看，2％浓度的喜马拉雅冰川水的应用或10μg/mL的诃子提取物都有明显的促进分泌作用，且2％浓度的喜马拉雅冰川水+10μg/mL的诃子提取物复合物的应用体现出协同的效果，表现了更加优异的促进I型胶原蛋白分泌的功效。综合这些数据，通过诱导跟皮肤增殖、屏障功能及抗老化、保湿相关的主要标志物，突出了喜马拉雅冰川水对维持并改善皮肤内稳态及健康，改善皮肤屏障功能及保湿的特性。