阅读说明：本技术 一种白刺提取物的应用及含其的皮肤外用剂 (Application of Nitraria tangutorum bobr extracts and skin external preparation containing same ) 是由 李慧 摩根多斯桑托斯 章漳 蒋丹丹 秦优 于 2018-07-20 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种白刺提取物的应用及含其的皮肤外用剂。该应用具体为,白刺提取物在制备抗氧化剂、黑色素合成抑制剂、弹性纤维水解抑制剂和抗皮肤衰老蛋白表达上调剂中的一种或多种的应用。白刺提取物尤其是白刺种子提取物,具有清除自由基活性、抑制酪氨酸酶活性、抑制弹性蛋白酶活性和提高人成纤维细胞中抗衰老蛋白表达的作用,能够调控真皮中胶原蛋白的合成,具有延缓衰老功效。(The invention provides application of Nitraria tangutorum bobr extracts and a skin external preparation containing the Nitraria tangutorum bobr extracts, and particularly provides application of or more of the Nitraria tangutorum bobr extracts in preparation of antioxidants, melanin synthesis inhibitors, elastic fiber hydrolysis inhibitors and anti-skin-aging protein expression up-regulating agents.)

一种白刺提取物的应用及含其的皮肤外用剂

技术领域

本发明涉及一种白刺提取物的应用及含其的皮肤外用剂。

背景技术

随着护肤品市场的不断发展和日趋成熟，涌现出越来越多的品牌，消费者对于护肤品功效的需求，希望能看到切实有效的护肤效果，因此要求护肤品活性物的功效机理研究水平需要提升，随着对于功效机理的阐释越来越深入，不能仅局限于单纯的对表象进行描述，需要融合尖端的生物技术，随着细胞生物学技术水平的不断发展，皮肤生物学的发现也不断加深，发现了和皮肤功能结构相关的更多的靶点和调控机理。

皮肤是人体最大的器官，覆盖全身，主要承担着保护身体、排汗、感觉冷热和压力等功能，使体内各种组织和器官免受物理性、机械性、化学性和病原微生物性的侵袭。

皮肤衰老分为内源性老化和外源性老化两种形式。内源性老化是自然老化，是随着年龄增加的不可抗拒的生理因素引起的老化过程，属于基因层面的老化，明显特征为皱纹的出现和皮肤的松弛。外源性老化主要是环境因素引起的老化，如紫外线辐射，高温，寒冷，环境污染，营养缺乏、疾病以及不良生活习惯等，其中紫外线辐射是最主要因素，因此称为光老化，表现为皮肤暴露部位粗燥、皱纹加深加粗、不规则性色素沉着、血管扩张、表皮角化不良、真皮弹力纤维变性及降解产物蓄积等，理论上可以预防减缓。自由基衰老学说其认为过多的自由基是造成皮肤光老化的重要原因，皮肤由于暴露在紫外线等外界环境中，紫外线产生的活性氧以及其它外界环境中的活性氧，都会在皮肤中产生各种自由基，造成对氧化应激的损伤，最终导致皮肤的老化。

一般来说，真皮衰老表现为厚度变薄、胶原蛋白和弹性蛋白合成减少、分解增加，分解酶活性增强。老化过程中真皮厚度减少20-80％，并伴随着组织和功能逐渐退化。胶原蛋白是人体内含量最多的一种蛋白质，胶原蛋白能赋予皮肤韧性、弹力及防水功能等，是维持皮肤和组织器官的形态和结构，也是修复各损伤组织的重要原料物质，还是细胞外基质的主要组成成分。胶原蛋白合成的减少是老化皮肤的重要特征。真皮中最主要的胶原蛋白是I型胶原蛋白(COL I)，V型胶原蛋白(COLV)是最主要的胶原之一，是一种形成调节性原纤维的胶原蛋白，与***状真皮，包围基膜的基质定位并与COL I共聚。

在真皮中，许多蛋白首先以前体形式表达，然后通过蛋白酶解加工方式变为成熟的蛋白，才能行使正常的功能。BMP-1(骨形成蛋白-1)是胞外基质分子组装过程中的主要蛋白酶，便参与这一加工过程，主要作用是对细胞外基质(extracellular matrix，ECM)中的一些蛋白进行肽链的切割，能把许多生物分子的前体加工修饰成具有生物功能的结构蛋白和活性酶，其中包括许多基质分子如I型、III型、V型、VII型前胶原蛋白，脂肪氧化酶(LOX)，小富含亮氨酸的蛋白聚糖(SLRP)等等。简单来说就是BMP-1使胶原蛋白功能化，确保胶原在生物合成的过程中以理想的方式加工修饰，形成正确的蛋白质构象。

胶原蛋白是对抗皮肤老化各种指标中的黄金标准，但目前化妆品市场上绝大部分产品宣称的功效和机理都只是围绕着如何提高胶原含量(如促进生成、补给、保护)。近年来的研究显示胶原蛋白的三维构象和结构对皮肤光泽度也有很重要的影响。对于皮肤而言，胶原蛋白是光传播的通道，胶原纤维介导的光散射对真皮内部光传播渗透起着重要的作用。如果皮肤胶原蛋白含量多，结构正常且有序排列，就会让光线直接投射进入皮肤，表观上就会有通透光泽；而如果胶原蛋白少，结构异常，排列混乱，就会形成光路的漫反射(胶原蛋白束的散射效应)，从而看起来灰暗，发黄，无光泽。

UV暴露引起的光老化会引起皮肤弹性蛋白酶的活性增加。弹性蛋白酶分布于多种组织和细胞中，弹性蛋白酶活性增加可导致皮肤弹性纤维的水解，从而加速真皮内胶原蛋白和弹性蛋白的分解，使皮肤失去弹性，出现皱纹等皮肤老化现象。

此外受到UV暴露的刺激作用影响，色素沉着的程度也随之增加。是由皮肤上的黑色素细胞合成色素并将其转移到周围的角质形成细胞所导致的。色素沉着的过程是一种复杂的过程，主要是由于黑素细胞内的生物化学反应引起，即酪氨酸在作为催化剂的酪氨酸酶的作用下，生成多巴醌，再通过酶的催化作用或非酶的氧化作用形成黑色素。其中关键在于黑色素的合成，黑色素的合成受到酪氨酸酶的控制。

因此，研究如何提高皮肤抗衰老的能力对于延缓皮肤衰老具有重要意义。

天然植物来源的提取物以其悠久的应用历史，卓越的多重的功效越来越多的应用于护肤领域。

白刺(Nitraria tangutorum Bobr.)为蒺藜科白刺属植物，又名地枣、酸胖、沙漠樱桃、唐古特白刺，主要分布于陕西北部、内蒙古西部、宁夏、甘肃河西、青海、新疆及西藏东北部，生于荒漠和半荒漠的湖盆沙地、河流阶地、山前平原积沙地、有风积沙的粘土地。由于对严酷生境的长期适应进化，使白刺所具有耐干旱、抗高温、耐盐碱、耐贫瘠、抗沙埋、耐严寒等生物学特性，其强抗逆性，在自然界中较为少见。传统记载白刺有健脾胃、助消化、安神、解表、排毒、下乳、牲畜催肥等功效。近代研究表明白刺籽油可抗氧化、抗疲劳、抗辐射、保护肝损伤；白刺总黄酮对血管内皮细胞损伤具有保护作用。白刺种子含粗脂肪10％～12％，其中不饱和脂肪酸含量高达95％，其中以亚油酸含量为最高，一般相对含量在65％～70％，这是白刺籽油有别于其他种籽油最显著的特点之一；此外，白刺种子中还含有VE、黄酮、植物甾醇、尿囊素等物质。

发明内容

本发明所解决的技术问题是针对现有技术中缺乏可用于提高皮肤抗氧化、抗衰老能力的活性物质的问题，而提供了一种白刺提取物的应用及含其的皮肤外用剂。本发明发现白刺提取物作用机理明确、安全可靠，具有抗氧化、美白、抗衰老的功效。

本发明人通过大量研究发现：1)白刺提取物具有清除自由基的作用；2)白刺提取物具有抑制酪氨酸酶活性的作用；3)白刺提取物具有抑制弹性蛋白酶活性、提高人成纤维细胞中抗衰老蛋白表达的作用，可调控真皮中胶原蛋白的合成，适用于具有延缓衰老功效的化妆品中。

本发明主要通过以下技术手段解决上述技术问题：

本发明提供了一种白刺提取物在制备抗氧化剂、黑色素合成抑制剂、弹性纤维水解抑制剂和抗皮肤衰老蛋白表达上调剂中的一种或多种的应用。

本发明中，所述抗氧化剂可为本领域常规的一类能帮助捕获并中和自由基的物质，例如自由基清除剂。

本发明中，所述黑色素合成抑制剂可为本领域常规的可抑制黑色素合成的物质，例如酪氨酸酶抑制剂。

本发明中，所述弹性纤维水解抑制剂可为本领域常规的可抑制弹性纤维水解的物质，例如弹性蛋白酶抑制剂。一般而言，皮肤中弹性纤维的水解，会加速真皮内胶原蛋白和弹性蛋白的分解，使皮肤失去弹性，出现皱纹等皮肤老化现象。

本发明中，所述抗皮肤衰老蛋白可为本领域常规的和皮肤衰老相关的蛋白，例如胶原蛋白和弹性蛋白。

本发明中，所述抗皮肤衰老蛋白表达上调剂可为本领域常规可影响皮肤衰老相关的蛋白表达的物质，例如BMP-1(骨形成蛋白-1)表达上调剂、胶原蛋白I表达上调剂和胶原蛋白V表达上调剂中的一种或多种。

本领域技术人员均知，所述BMP-1可加工修饰I型、III型、V型和VII型前胶原蛋白，可使胶原蛋白功能化。

本发明中，所述白刺提取物在所述抗氧化剂中的浓度较佳地为0.025～0.075mg/mL，更佳地为0.05mg/mL。

本发明中，所述白刺提取物在所述黑色素合成抑制剂中的浓度较佳地为0.25～0.75mg/mL，更佳地为0.5mg/mL。

本发明中，所述白刺提取物在所述弹性纤维水解抑制剂中的浓度较佳地为0.5～1.5mg/mL，更佳地为1mg/mL。

本发明中，所述白刺提取物在所述抗皮肤衰老蛋白表达上调剂中的浓度较佳地为0.05～1mg/mL，例如0.05mg/mL、1mg/mL。

当所述抗皮肤衰老蛋白为BMP-1时，所述白刺提取物在所述抗皮肤衰老蛋白表达上调剂中的浓度较佳地为0.05mg/mL。

当所述抗皮肤衰老蛋白为胶原蛋白I或胶原蛋白V时，所述白刺提取物在所述抗皮肤衰老蛋白表达上调剂中的浓度较佳地为1mg/mL。

本发明中，所述抗氧化剂、黑色素合成抑制剂、弹性纤维水解抑制剂和抗皮肤衰老蛋白表达上调剂适用于化妆品或者护肤品中。

本发明中，所述白刺提取物可按本领域常规方法制得，例如为将白刺(Nitrariatangutorum Bobr.)与超临界CO₂混合，经萃取，得萃取液，即可。

其中，所述白刺的提取部位可为白刺可用于入药的任一部位，较佳地为白刺种子。所述白刺种子一般是指白刺(Nitraria tangutorum Bobr.)的成熟种子。

当所述白刺的提取部位为白刺种子时，所述白刺提取物为白刺种子提取物。

其中，较佳地，将所述白刺经预处理，例如粉碎；更佳地，所述粉碎后还经过筛处理，所述过筛的目数可为40目。

其中，所述萃取的压力可为本领域常规的压力，例如30～40MPa，较佳地为35MPa。

其中，所述萃取的温度可为本领域常规的温度，例如40～50℃，较佳地为45℃。

其中，所述超临界CO₂的流量可为本领域常规的流量，例如20～30kg/h，较佳地为25kg/h。

其中，所述萃取的时间可为本领域常规的时间，例如2～3h，较佳地为2.5h。

其中，所述萃取液可按本领域常规操作经纯化处理，例如，将所述萃取液经大孔吸附树脂层析，即可。

所述大孔吸附树脂的种类可为AB-8。

所述层析的洗脱液可为乙醇水溶液，所述乙醇水溶液的浓度较佳地为65～75％，更佳地为70％，百分比是指体积百分比。

所述层析的洗脱液的体积可为4～6倍柱体积，例如5倍柱体积。

所述层析之前还可经除杂处理，例如以水洗脱除杂，所述水的洗脱体积可为1倍柱体积；较佳地，在所述水洗脱除杂后还可以5倍柱体积的25～35％的乙醇水溶液洗脱除杂，例如30％的乙醇水溶液洗脱除杂，百分比是指体积百分比。

其中，较佳地，所述白刺提取物的制备方法为：将白刺种子与超临界CO₂混合，经萃取，所述萃取的压力为30～40MPa，所述萃取的温度围为40～50℃，所述超临界CO₂的流量为20～30kg/h，所述萃取的时间为2～3h，得萃取液，即可；更佳地，所述白刺提取物的制备方法为：将白刺种子与超临界CO₂混合，经萃取，所述萃取的压力为35MPa，所述萃取的温度围为45℃，所述超临界CO₂的流量为25kg/h，所述萃取的时间为2.5h，得萃取液，即可。

本发明还提供了一种白刺提取物作为化妆品或者护肤品中的抗氧化活性成分、美白活性成分和抗衰老活性成分的应用。

其中，所述白刺提取物的定义如前所述。

本发明还提供了一种皮肤外用剂，其含有0.001～10％白刺提取物，百分比是指在所述皮肤外用剂中的重量百分比(g/100mL)。

其中，所述白刺提取物的定义如前所述。

其中，所述白刺提取物的含量较佳地为0.0025～0.15％，例如0.005％、0.05％或0.1％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的重量百分比。

当所述白刺提取物在所述皮肤外用剂中作为抗氧化剂时，所述白刺提取物的含量为较佳地为0.0025～0.0075％，更佳地为0.005％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的重量百分比。

当所述白刺提取物在所述皮肤外用剂中作为黑色素合成抑制剂时，所述白刺提取物的含量为较佳地为0.025～0.075％，更佳地为0.05％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的重量百分比。

当所述白刺提取物在所述皮肤外用剂中作为皮肤弹性纤维水解抑制剂时，所述白刺提取物的含量较佳地为0.05～0.15％，更佳地为0.1％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的重量百分比。

当所述白刺提取物在所述皮肤外用剂中作为抗皮肤衰老蛋白表达上调剂时，所述白刺提取物的含量较佳地为0.005～0.1％，例如0.005％或0.1％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的重量百分比。

当所述抗皮肤衰老蛋白为BMP-1时，所述白刺提取物的含量较佳地为0.005％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的重量百分比。

当所述抗皮肤衰老蛋白为胶原蛋白I或胶原蛋白V时，所述白刺提取物的含量较佳地为0.1％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的重量百分比。

本发明中，所述的皮肤外用剂还可以包含其他活性成分，所述其他活性成分较佳地为保湿活性成分、抗氧化活性成分、控油活性成分、美白活性成分和抗衰老活性成分中的一种或多种。所述其他活性成分的含量为本领域常规的含量。

按照本领域常识，根据不同的剂型和目的，所述的皮肤外用剂中还可以含有本领域中常规使用的介质或基质赋形剂，只要所述赋形剂为化妆品或药学领域中可接受的赋形剂。所述赋形剂的含量为本领域常规的含量。

其中，所述赋形剂的形式可以为水相、油相、凝胶、水包蜡型乳液、水包油型乳液或油包水型乳液的形式。

本发明的皮肤外用剂还可以进一步包含常规的用于化妆品领域中的任何其他组分，例如防腐剂、芳香剂、亲水性活性剂和亲脂性活性剂中的一种或多种。上述其他组分的含量可为本领域常规的含量。

本发明中，所述皮肤外用剂还可以包含颗粒相，所述的颗粒相可为颜料、珠光剂和填充剂中的一种或多种。

本发明中，所述的皮肤外用剂的形式可以为任何合适的产品形式，所述的产品形式包括、但不限于气溶胶型喷雾剂、霜剂、乳液、固体、液体、分散体、泡沫、凝胶、化妆水、摩丝、软膏、粉剂、贴剂、润发油、手按泵型喷雾剂、棒状物、面膜和湿纸巾中的一种或多种。众所周知地，本发明的皮肤外用剂可为化妆品、皮肤病学或药物局部施用产品，其制备方法可为本领域常规的制备方法。

在本发明的优选实施方式一中，所述的皮肤外用剂为化妆水，所述的皮肤外用剂包含下述重量百分比的组分：甘油5％，多元醇类A 3-6％，甜菜碱1％，泛醇0.5％，甘草酸二钾0.05-0.1％，聚乙二醇-32 0.5％，表面活性剂A 0.15-0.2％，防腐剂A 0.4-0.45％，黄原胶0-0.15％，香料0.03％和所述白刺提取物0.001％-10％；其余用去离子水补充至100％；其中，所述的多元醇类A为丁二醇、1,2-戊二醇和双丙甘醇中的一种或多种；所述表面活性剂A为聚山梨醇酯-20和/或PEG-40氢化蓖麻油；所述防腐剂A为羟苯甲酯和/或苯氧乙醇。

其中，所述白刺提取物较佳地为白刺种子提取物。所述白刺种子提取物的含量较佳地为0.0025～0.15％，更佳地为0.005～0.1％，例如0.005％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的重量百分比。

在本发明的优选实施方式二中，所述的皮肤外用剂为精华液，所述皮肤外用剂包含下述重量百分比的组分：甘油5％，多元醇类B 3-6％，泛醇1％，甘草酸二钾0.1％，尿囊素0.1％，表面活性剂B 0.05-3.6％，防腐剂B 0.25-0.45％，黄原胶0.2-0.4％，丙烯酸树脂Pemulen TR-2 0.3％和香料0.05％；和所述白刺提取物0.001％-10％；其余用去离子水补充至100％；其中，所述的多元醇类B为丁二醇和/或1,3-丙二醇；所述表面活性剂B为聚甘油-2油酸酯和/或聚甘油-10油酸酯；所述防腐剂B为羟苯丙酯、羟苯甲酯和苯氧乙醇中的一种或多种。

按照本领域常识，所述丙烯酸树脂Pemulen TR-2为一种丙烯酸(酯)类/C_10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物，由美国诺誉化工公司生产。

按照本领域常识，所述黄原胶为糖类，经黄单胞杆菌发酵，产生的一种胞外微生物多糖。

其中，所述白刺提取物较佳地为白刺种子提取物。所述白刺种子提取物的含量较佳地为0.0025～0.15％，更佳地为0.005～0.1％，例如0.1％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的重量百分比。

在本发明的优选实施方式三中，所述的皮肤外用剂为乳液，所述皮肤外用剂包含下述重量百分比的组分：甘油5％，1,3-丙二醇5％，泛醇1％，生育酚乙酸酯0.5％，聚二甲基硅氧烷2％，乳化剂A165 2％，油类C 2-3％，异硬脂酸异丙酯3％，鲸蜡硬脂醇0.5％，防腐剂C 0.3％，黄胶原0.5％和EDTA二钠0.1％；所述皮肤外用剂中还包含三乙醇胺，所述三乙醇胺的含量以调节所述皮肤外用剂的pH值至5.5-7为准；所述白刺提取物0.001％-10％；其余用去离子水补充至100％；所述油类C为矿油和/或异十六烷；所述防腐剂C为羟苯甲酯和/或羟苯丙酯。

按照本领域常识，所述乳化剂A165为市售商品，其含有甘油硬脂酸酯和PEG-100硬脂酸酯。所述丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物为赛比克公司生产的牌号为Sepinov EMT 10的增稠剂。

其中，所述白刺提取物较佳地为白刺种子提取物。所述白刺种子提取物的含量较佳地为0.0025～0.15％，更佳地为0.005～0.1％，例如0.005％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的重量百分比。

在本发明的优选实施方式四中，所述的皮肤外用剂为乳霜，所述皮肤外用剂包含下述重量百分比的组分：甘油5％，1,3-丙二醇5％，泛醇1％，生育酚乙酸酯0.5％，聚二甲基硅氧烷2％，乳化剂A165 2％，油类D 2-8％，异硬脂酸异丙酯3％，鲸蜡硬脂醇2-3％，防腐剂D 0.3％，丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物2％和EDTA二钠0.1％；所述皮肤外用剂中还包含三乙醇胺，所述三乙醇胺的含量以调节所述皮肤外用剂的pH值至5.5-7为准；所述白刺提取物0.001％-10％；其余用去离子水补充至100％；其中，所述油类D为矿油和/或异十六烷；所述防腐剂D为羟苯甲酯和/或羟苯丙酯。

其中，所述白刺提取物较佳地为白刺种子提取物。所述白刺种子提取物的含量较佳地为0.0025～0.15％，更佳地为0.005～0.1％，例如0.1％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的重量百分比。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

(1)本申请发现白刺提取物尤其是白刺种子提取物，具有清除自由基、抑制酪氨酸酶活性、抑制弹性蛋白酶活性、提高人成纤维细胞中抗衰老蛋白表达的作用，能够调控真皮中胶原蛋白的合成，具有延缓衰老功效，尤其是清除自由基、抑制弹性蛋白酶的作用。相比于空白对照，成纤维细胞中胶原蛋白I、胶原蛋白V和BMP1生成率分别136％、115％和151％，对于日后研发抗衰老相关的护肤品或者化妆品有重要意义。

(2)本申请首次发现白刺提取物尤其是白刺种子提取物，可促进骨形成蛋白-1(BMP-1)的生成，对于白刺提取物的作用机理以及作用于BMP-1靶点的活性成分的研究具有重要意义。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1白刺种子提取物的制备

将晒干的白刺种子粉碎，过40目筛，装入超临界萃取仪中，按一次投料量300g，萃取压力35MPa，萃取温度45℃，CO₂流量25kg/h，的条件进行超临界CO₂萃取，萃取时间2.5小时，从分离釜中接取白刺籽油；共投料5次，共提取原料1.5Kg，得白刺籽油150g。称取10g白刺籽油，通过大孔吸附树脂AB-8，依次用1倍柱体积的水和5倍柱体积的30％乙醇洗脱，洗脱液弃去。然后用5倍柱体积的70％乙醇洗脱，收集洗脱液并浓缩蒸干，得到白刺种子提取物干粉0.9g。

实施例2

按下述组分及用量，配制成化妆水，百分比是指各组分在化妆水中的重量百分比：

甘油5％，丁二醇3％，甜菜碱1％，泛醇0.5％，甘草酸二钾0.1％，尿囊素2.0％，聚乙二醇-32 0.5％，羟乙基纤维素0.15-0.2％，IS-45 0.4％，黄原胶0.15％，香料0.03％和白刺种子提取物0.005％；其余用去离子水补充至100％。

按照本领域常规的化妆水的制备方法，制得本实施例中的皮肤外用剂。

实施例3

按下述组分及用量，配制成精华液，百分比是指各组分在精华液中的重量百分比：

甘油5％，丁二醇3％，泛醇1％，甘草酸二钾0.1％，尿囊素0.1％，烟酰胺4％，羟乙基纤维素0.05％，羟苯甲酯0.15％，苯氧乙醇0.3％，黄原胶0.2％，丙烯酸树脂Pemulen TR-2 0.3％，香料0.05％和白刺种子提取物0.1％；其余用去离子水补充至100％。

按照本领域常规的精华液的制备方法，制得本实施例中的皮肤外用剂。

实施例4

按下述组分及用量，配制成乳液，百分比是指各组分在乳液中的重量百分比：

甘油5％，1,3-丙二醇5％，泛醇1％，生育酚乙酸酯0.5％，甘草酸二钾0.1％，聚二甲基硅氧烷2％，乳化剂A165 2％，异硬脂酸异丙酯3％，矿油3％，鲸蜡硬脂醇0.5％，羟苯甲酯0.2％，羟苯丙酯0.1％，黄胶原0.5％和EDTA二钠0.1％，三乙醇胺调节乳液的pH值至5.5-7；白刺种子提取物0.005％；其余用去离子水补充至100％。

按照本领域常规的乳液的制备方法，制得本实施例中的皮肤外用剂。

实施例5

按下述组分及用量，配制成乳霜，百分比是指各组分在乳霜中的重量百分比：

甘油5％，1,3-丙二醇5％，泛醇1％，生育酚乙酸酯0.5％，甘草酸二钾0.1％，聚二甲基硅氧烷2％，乳化剂A165 2％，异硬脂酸异丙酯3％，矿油2％，鲸蜡硬脂醇2％，羟苯甲酯0.2％，羟苯丙酯0.1％，丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物2％和EDTA二钠0.1％；三乙醇胺调节乳液的pH值至5.5-7；白刺种子提取物0.1％；其余用去离子水补充至100％。

按照本领域常规的乳霜的制备方法，制得本实施例中的皮肤外用剂。

效果实施例1白刺种子提取物的活性检测

(1)DPPH法清除自由基活性检测

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)是一种稳定的氮中心有机自由基，其乙醇溶液呈深紫色，约在517nm左右有强吸收；当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使DPPH吸收减弱，逐渐消失。DPPH乙醇溶液褪色程度与其接受的电子数呈定量关系，因此可用分光光度计进行快速定量分析，检测自由基清除情况，评价抗氧化剂清除自由基能力、抗氧化能力和抗衰老能力。

DPPH乙醇溶液的配制：准确称量6mg DPPH，用95％乙醇溶解并定容于50mL容量瓶中，超声辅助溶解。使用时再用95％乙醇稀释四倍，得到浓度为3mg/100mL(76μM)的DPPH乙醇溶液，避光保存(0～4℃)。

待测样品预处理：将实施例1制备得到的白刺种子提取物、抗坏血酸标准品溶解于去离子水，并用去离子水稀释到适合的浓度备用。

实验步骤：将待测样品溶液2mL加入试管中，之后加入2mLDPPH乙醇溶液，混匀。室温下避光在黑暗处反应30min，在525nm处测定吸光度Abs；除样品组外，分别设样品溶剂对照组，空白对照组和溶剂对照组(DPPH的溶剂)，阳性对照组为抗坏血酸组。

清除率I(％)＝[1-(T-T₀)/(C-C₀)]×100％

式中：

T₀：待测样品液加等体积95％乙醇的吸光度(样品溶剂对照组)；

T：待测样品液加等体积DPPH溶液的吸光度(样品组)；

C₀：蒸馏水加等体积95％乙醇的吸光度(溶剂对照组)；

C：蒸馏水加等体积DPPH溶液的吸光度(空白对照组)。

表1清除自由基作用的测定结果

由表1可知，白刺种子提取物具有清除DPPH自由基的作用。相比于空白对照组，白刺种子提取物组自由基清除率为88％。

(2)酪氨酸酶活性抑制率的检测

实验步骤：在96孔板中加入磷酸盐缓冲溶液(pH6.8，30mM)70μL、1.66mM酪氨酸溶液80μL、样品溶液80μL混合均匀，在37℃恒温箱中温育5分钟以上，加入酪氨酸酶溶液(125U/ml)(购自Sigma，货号为T3824)10μL，在37℃恒温10min后，用酶标仪测定475nm波长的吸光度A₄₇₅，样品溶液包括实施例1制备得到的白刺种子提取物配制的溶液和熊果苷标准品溶液(均以去离子稀释到合适的浓度)，其中熊果苷标准品溶液是作为阳性对照组。用去离子水替换样品水溶液，作为参比溶液同样测定吸光度，酪氨酸酶活性抑制率计算公式为：抑制率(％)＝(A₀-(A₄₇₅-B))/A₀×100％，其中A₀是参比溶液的吸光度，A₄₇₅是样品溶液的吸光度，B是样品空白溶液的吸光度。

表2酪氨酸酶抑制活性的测定结果

由表2可知，白刺种子提取物具有抑制酪氨酸酶的作用。相比于空白对照组，白刺种子提取物组酪氨酸酶抑制率为21％。

(3)弹性蛋白酶活性抑制率的检测

实验步骤：在96孔板中加入10μL样品溶液和130μL含有1.015mM反应底物Succ-Ala-Ala-Ala-p-硝基酰替苯胺的0.1M Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0)，在25℃下温育5分钟，加入15μL弹性蛋白酶溶液(0.5U/mL)，继续在25℃下温育30min，然后用酶标仪测定410nm波长的吸光度A₄₁₀，样品溶液包括实施例1制备得到的白刺种子提取物配制的溶液和Elastatinal溶液(均以去离子稀释到合适的浓度)，其中Elastatinal溶液(弹性(蛋白)酶抑制剂，购自sigma公司，货号为E0881)是作为阳性对照组。用去离子水替换样品水溶液，作为参比溶液同样测定吸光度。

弹性蛋白酶活性抑制率计算公式为：抑制率(％)＝(A₀-(A₄₁₀-B))/A₀×100％，其中A₀是参比溶液的吸光度，A₄₁₀是样品溶液的吸光度，B是样品空白溶液的吸光度。

表3弹性蛋白酶活性抑制的测定结果

由表3可知，白刺种子提取物具有抑制弹性蛋白酶的作用。相比于空白对照组，白刺种子提取物弹性蛋白酶抑制率为22％。

(4)成纤维细胞胶原蛋白I生成率测定

将人成纤维细胞种入96孔板中(5000细胞/孔)，培养72小时后移除培养基，分别加入实施例1制备得到的白刺种子提取物配制的溶液和抗坏血酸标准品溶液(均以去离子稀释到合适的浓度)再培养48小时，移除上清液后，用细胞免疫荧光法测定细胞中COL I的含量，同时测定细胞层的DNA含量(picogreen试剂盒)进行COL I的含量数据标准化。测试结果会表明与未受测试的对照组相比，空白对照组I型存积胶原的生成率为100％。生成率率大于100％为有促进作用。

表4 COL I的含量测定结果

由表4可知，白刺种子提取物具有促进胶原蛋白I分泌的作用。相比于空白对照组，白刺种子提取物处理组人成纤维细胞中COL I的生成率为136％。

(5)成纤维细胞胶原蛋白V生成率测定

将人成纤维细胞种入96孔板中(5000细胞/孔)，培养72小时后移除培养基，分别加入实施例1制备得到的白刺种子提取物配制的溶液和抗坏血酸标准品溶液(均以去离子稀释到合适的浓度)再培养48小时，移除上清液后，用细胞免疫荧光法测定细胞中COL V的含量，同时测定细胞层的DNA含量(picogreen试剂盒)进行COL V的含量数据标准化。测试结果会与未受测试的对照组相比，空白对照组V型存积胶原的生成率为100％。生成率率大于100％为有促进作用。

表5 COL V的含量测定结果

由表5可知，白刺种子提取物具有促进胶原蛋白V分泌的作用，相比于空白对照组，白刺种子提取物处理组人成纤维细胞中COL V的生成率是115％。

(6)成纤维细胞BMP1生成率测定

将人成纤维细胞种入96孔板中(5000细胞/孔)，培养72小时后移除培养基，加入实施例1制备得到的白刺种子提取物配制的溶液(以去离子稀释到合适的浓度)再培养24小时，收集细胞培养上清液，采用BMP1ELISA试剂盒测定细胞培养上清液中BMP1的含量；，同时测定细胞层的DNA含量(picogreen试剂盒，购自thermo fisher)进行BMP1的含量数据标准化。测试结果会与未受测试的对照组相比，空白对照组BMP1的生成率为100％。生成率率大于100％为有促进作用。

表6 BMP1的含量测定结果

由表6可知，白刺种子提取物具有促进BMP1的作用。相比于空白对照组，白刺种子提取物处理组人成纤维细胞中的BMP1生成率可达151％。