阅读说明：本技术 ***a型合成肽疫苗及其制备方法和应用 (Foot-and-mouth disease A type synthetic peptide vaccine and preparation method and application thereof ) 是由 吴冬荀 蔡薇 肖进 向王震 于 2019-11-08 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种用于制备口蹄疫A型合成肽疫苗及其制备方法和应用。口蹄疫A型合成肽疫苗包括抗原多肽组合物,抗原多肽组合物包括序列1和序列2所示的多肽。本发明提供的口蹄疫合成肽疫苗具有良好的免疫效力,且疫苗的抗原为化学合成多肽,不含口蹄疫病毒核酸粒子,安全性高。因此本发明的疫苗可以有效应对目前口蹄疫流行毒株、不存在生物安全性,易于大规模合成,具有良好的应用前景。本发明还提供了所述多肽和肽疫苗的制备方法以及其制药用途。(The invention provides synthetic peptide vaccines for preparing foot-and-mouth disease A type, a preparation method and application thereof, the foot-and-mouth disease A type synthetic peptide vaccine comprises an antigen polypeptide composition, and the antigen polypeptide composition comprises polypeptides shown in a sequence 1 and a sequence 2.)

***A型合成肽疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体而言，本发明涉及一种***合成肽疫苗，以及其制备方法。

背景技术

***(foot and mouth disease，简称FMD)是一种偶蹄动物发生的急性、高度接触性、发热性传染病，在世界范围内广泛分布。***的传染性高，传播迅速，感染猪、猪、羊等牲畜后将导致幼畜死亡，成年动物生产能力急剧下降，因此严重危害畜牧业的发展和肉食及其畜产品的生产和供应。目前，***使动物及动物产品的市场流通和国际贸易受到极大的封锁和限制，给流行国家和地区畜牧业生产造成巨大的经济损失。

***是由***病毒(FMDV)感染引起的。***病毒属于细小核糖核酸病毒，具有多型性、易变性等特点。目前，已知全世界有7种血清型的***病毒：A、O、C、Sat1(南非I型)、Sat2(南非II型)、Sat3(南非III型)和Asia I(亚洲I型)。这些主型中的每一种又分若干亚型，目前发现的亚型已有70多种。血清型A、O、C和Asia I型的***病毒最为常见，其中血清型A病毒的变种最多，具有超过30种亚型。研究结果表明，***病毒的衣壳蛋白是由四种结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4组成的，每种各60个。VP1-VP3组成衣壳蛋白亚单位，位于衣壳蛋白的外侧，而VP4位于病毒颗粒的内部。

***病毒各型之间的抗原性不同，彼此之间不能交互免疫。而且，在同一种血清型中抗原差异的程度也很大，以至于能够有效地抵抗一种亚型的***疫苗可能针对同一血清型中的另一种亚型没有保护性。此外，***毒株的抗原性还在不断发生变化，随着时间的推移，原有疫苗的效力减弱甚至消失，因此给***的防治工作带来了很大的困难。

当前在我国猪群中流行的***主要是O型和A型***。我国对***实行强制性免疫，疫苗免疫是防治***的主要手段。但是，我国现行使用的***疫苗主要是病毒灭活疫苗，其存在着生物安全性差、副反应大、产品质量不稳定等问题。相比之下，目前世界上很多国家已经停止使用灭活疫苗，也禁止从使用灭活疫苗的国家进口畜产品。由此可见，在***防治方面，我国已落后于世界发展形势。

在***新型疫苗的研究方面，先后有基因工程亚单位疫苗、***病毒载体疫苗、***基因工程修饰疫苗的研究报道，但是其在免疫效果、生物安全性方面都存在着诸多问题，影响了这些新型疫苗的使用。此外，这些疫苗对于当前已经发生变异的流行毒株往往效果较差，不能有效地保护动物。因此，本领域仍然存在对于安全、有效的***新型疫苗的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于制备***A型合成肽疫苗的抗原多肽，多肽组合物，以及含有该多肽组合物的疫苗。

为实现上述目的，本实验室根据***A型流行毒的抗原表位设计了2条氨基酸组成的多肽序列，分别为序列表中序列1和序列2所示的多肽。

采用固相法合成，与ISA50V佐剂混合制成油乳剂疫苗。通过效力试验证明，***A型合成肽疫苗针对AF/72强毒攻击的PD₅₀值均超过6，达到保护要求，具有保护试验动物猪免受病毒攻击的能力。安全性试验证明***合成肽疫苗对豚鼠、小鼠及猪无副反应出现，安全性高，无散毒危险，所以具有良好的推广前景和市场价值。

合成肽疫苗极大的提高了安全性和特异性，并且其制备工艺更简单、生产成本更低廉、疫苗质量更加可靠，利于规模化生产。作为一种新型***疫苗，其优点可以为企业和市场带来新的竞争力和经济增长点，市场空间巨大。

本发明采用了以下技术方案：

本发明提供一种用于制备***合成肽疫苗的抗原多肽，为序列表中序列1或序列2所示的多肽。

本发明提供的用于制备***合成肽疫苗的抗原多肽组合物，包括序列表中序列1所述多肽和序列表中序列2所述多肽的组合物。

本发明中所述的多肽片段可以是通过固相有机合成得到的肽物质。

当选取两种序列所述的多肽组合物组成疫苗时，它们的摩尔比为(0.5-1.5):(0.5-1.5)；最优选的，它们的摩尔比为1:1。

所述的多肽组合物在制备***合成肽疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明提供的一种***合成肽疫苗，包含上述的多肽组合物。

所述肽疫苗还包含佐剂。

本发明提供了所述的***合成肽疫苗的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)用注射用水将所述多肽组合物稀释为10-100μg/ml(优选50μg/ml)的浓度，从而得到多肽抗原水相；

(2)将佐剂灭菌(在121℃条件下灭菌30分钟)；

(3)在20～28℃条件下，按照所述多肽抗原水相与所述佐剂1:1的体积比，先将佐剂加入乳化罐内，在90～150rpm下搅拌1.5～3分钟，然后缓慢加入多肽抗原水相，然后搅拌20～30分钟，再在8000～10000rpm下搅拌15-30分钟，静置3-10分钟(优选5分钟)，分装。

优选地，所述佐剂为选自白油、50V、50VII(MONTANIDE ISA 50V、50VII佐剂(法国SEPPIC公司))中的一种或多种。

本发明还提供了上述多肽聚合物中的多肽的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)以氨基树脂为起始原料，以由9-芴甲氧羰基保护的氨基酸为单体，按照所述氨基酸序列依次缩合接上氨基酸以合成所述多肽，每步缩合反应后用乙酰咪唑封闭未反应的氨基端；

(2)合成完毕后加入裂解试剂，从而将所述多肽从氨基树脂上裂解下来；

(3)使用***沉淀所述多肽；

(4)对所述多肽进行超滤纯化，然后进行无菌处理。

在上述制备方法中，所述步骤(1)具体包括以下步骤：

(1-a)脱保护反应：将氨基树脂置于体积百分比为15％～30％的六氢吡啶的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液中，在20～28℃条件下反应25～40分钟，从而脱除氨基树脂上的9-芴甲氧羰基保护基团；

(1-b)洗涤：氮气吹干，然后用N-甲基吡咯烷酮洗涤氨基树脂；

(1-c)缩合反应：加入1-羟基苯丙三氮唑(HOBT)、二异丙基碳二亚胺(DIC)与由9-芴甲氧羰基保护的氨基酸，然后在20～28℃条件下反应0.5～2.5小时；

(1-d)洗涤：氮气吹干，然后用N-甲基吡咯烷酮洗涤氨基树脂；

(1-e)封闭反应：加入重量体积百分比为1.5％～4％的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液，在20～28℃条件下反应20～40分钟。

在上述制备方法中，所述步骤(2)中裂解试剂的组分为体积比为85:8::6:1的三氟乙酸:三异丙基硅烷:苯酚:水；并且，所述步骤(2)的裂解时间为1-4小时。

在上述制备方法中，所述步骤(3)具体包括：

(3-a)使用***沉淀所述多肽，然后用二甲基甲酰胺洗涤；

(3-b)在加入10％的DMSO情况下，使沉淀得到的多肽的氨基酸序列中两个半胱氨酸之间形成二硫键；或者，使所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸残基之间反应形成共价连接；优选地，在加入1％的DIC和0.5％的HOBT情况下使所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸残基的羧基与氨基、或者在0.1M H₂SO₄情况下羧基与羟基之间反应形成共价连接。

在上述制备方法中，所述步骤(4)具体包括以下步骤：

(4-a)使用切向过滤膜包在20～28℃条件下超滤所述多肽，从而除去小分子杂质；

(4-b)使用0.2μm滤器除菌保存。

还一方面，本发明提供了上述多肽或多肽疫苗在制备用于预防猪A型***的生物制品中的用途。

具体而言，本发明通过对国内***新近流行毒株的序列测定并结合***疫苗毒株序列，研究***主要抗原位点的变异情况，针对主要变异的氨基酸位点统计其变异的频率，同时结合计算机辅助进行***抗原位点的分析预测，对可能的抗原位点肽段进行化学合成，即针对易变异位点根据统计的变异频率，在这些位点使用不同的氨基酸，得到涵盖当前所有可能变异位点的多种候选多肽抗原。进而，通过大量的动物试验对这些候选多肽抗原进行筛选，得到能够引起动物的免疫反应，而且免疫反应水平高，能够很好的保护动物免受***流行毒株攻击的多肽抗原。此外，本发明人根据筛选实验结果对***病毒抗原位点进行了优化，进行了大量的筛选获得了免疫效果优异的多肽，增强了多肽抗原组合的免疫效果。

合成肽疫苗效力实验、安全性实验结果表明，本发明提供的***合成肽疫苗具有良好的免疫效力，并且对豚鼠、小鼠、本动物猪均安全，因此本发明的疫苗可以有效应对目前***病毒的抗原变异、不存在生物安全性，易于大规模合成，具有良好的应用前景。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1、***合成肽疫苗的多肽抗原固相合成

本发明通过对国内***新近流行毒株的序列测定并结合***疫苗毒株序列，研究***主要抗原位点的变异情况，针对主要变异的氨基酸位点统计其变异的频率，同时结合计算机辅助进行***抗原位点的分析预测，对可能的抗原位点肽段进行化学合成，即针对易变异位点根据统计的变异频率，在这些位点使用不同的氨基酸，得到涵盖当前所有可能变异位点的多种候选多肽抗原。进而，通过大量的动物试验对这些候选多肽抗原进行筛选，得到能够引起动物的免疫反应，而且免疫反应水平高，能够很好的保护动物免受***流行毒株攻击的多肽抗原。此外，本发明人根据筛选实验结果对***病毒抗原位点进行了优化，并有效组合了T细胞表位和B细胞表位，增强了多肽抗原的免疫效果。

通过筛选并鉴定的本发明的合成肽抗原可以使用美国433A全自动多肽合成仪，利用Merrifield固相合成法制备，其中采用了由9-芴甲氧羰基(Fmoc)修饰的氨基酸，固相载体为美国sigma的Rink Amide MBHA树脂。生产过程通常包括多肽抗原的固相合成、多肽的裂解、抗原纯化与除菌保存。

合成肽抗原的固相合成

1.1.1合成原料准备

合成多肽抗原的序列如下：

序列表中序列1所示的多肽和序列表中序列2所示的多肽。

依据抗原的序列以及1mmol的合成规模，准备合适的Fmoc修饰的氨基酸[购自上海吉尔生化]，加入相应的氨基酸小瓶中。同样按要求称量Rink Amide MBHA树脂，放入反应腔中，将上下盖子拧紧，贴标签，记录所合成肽的名称、批号、反应腔的皮重及所称树脂的重量。将反应腔装入合成仪。配制合成试剂，包括N-甲基吡咯烷酮(NMP)、乙酰咪唑(AIM)、哌啶(PIP)、甲醇等放置到相对应的试剂瓶中。

1.1.2合成仪状态检测

检查多肽合成仪是否正常运行。开机后，运行Run Self Test程序，仪器自检各项指标是否正常。另外检查N₂是否充足，系统表压是否正常。合成前应对仪器的性能有所了解，所以要对每种合成试剂的流速进行测定。发送Flow Rate1-18到合成仪，选择MainMenu—Module Test—按Prer或next找ModuleA、ModuleD、ModuleI、ModuleI、ModuleA—按Start—按more进行测量或观察，若流量不合适，则调节下阀门压力，直至达到要求。

1.1.3合成肽抗原的合成开始

在合成仪的程序中将合成需要的方法Std Fmoc 1.0Sol DIC90发送到合成仪上。File-New-Sequence-编辑合成肽的序列，保存。File-New-Run，检查Chemistry；Sequence是否为所存名字；设定Cycles；保存。最后发送到合成仪上。

Main Menu—Cycle Monitor—begin，开始运行。

1.1.4合成肽抗原的合成

如上述的多肽序列，合成的时候是从C端开始至N端，依照给定的顺序，依次不断地重复如下合成步骤：

(1)脱保护反应：将上述氨基树脂置于体积百分比为15％～30％的六氢吡啶的NMP溶液中，在20～28℃条件下反应25～40分钟脱除氨基树脂上的Fmoc保护基团；

(2)洗涤：氮气吹干，NMP洗涤氨基树脂；

(3)缩合反应：加入HOBT、DIC与Fmoc保护的氨基酸在20～28℃条件下反应0.5-2.5小时；

(4)洗涤：氮气吹干，NMP洗涤氨基树脂；

(5)封闭反应：加入重量体积百分比为1.5％～4％的乙酰咪唑的NMP溶液，在20～28℃条件下反应20～40分钟。

1.1.5合成肽抗原合成结束

抗原合成结束后合成仪将自动停止。然后从多肽合成仪上取下反应器，再用100％甲醇洗涤多肽树脂3次，然后在通风橱内吹干，将多肽树脂转移至棕色瓶内，放入-20℃冰箱内，封口膜密封备用。

1.2合成肽抗原的裂解及鉴定

1.2.1合成肽抗原的裂解

按照体积比例(三氟乙酸(TFA)/三异丙基硅烷(TIS)/苯酚/水＝85/8/6/1)配制裂解液，然后从冰箱内取出合成的多肽树脂，放入圆底烧瓶内，在通风橱内向烧瓶内加入配制好的裂解液和磁搅拌子，然后稳定地放置在磁力搅拌器上，室温下持续搅拌1h直至反应完全。反应结束后，使用带冷阱的旋转蒸发仪持续蒸发30～120分钟除去粗产品中的TFA。接着使用***收集、沉淀多肽，然后用二甲基甲酰胺(DMF)多次清洗多肽抗原的粗品，最后将混合在一起的树脂用砂芯漏斗过滤出来，即得到多肽抗原。

1.2.2合成肽抗原的鉴定

抗原合成完毕后用基质辅助激光解吸飞行时间质谱法(MALDL-TOF)和反相高压液相色谱法(RP-HPLC)进行定性定量分析。

1.3合成肽抗原的构象形成

用15％DMSO将多肽抗原配制成浓度为2mg/ml的多肽溶液，然后用0.1N NaOH或0.1N HCl调整初步分离多肽溶液的pH值为5.5～7.5，在25℃的环境下在转速为110rpm的摇床上放置48小时，使形成二硫键，形成环状结构。

或者，进行如下首尾环化：

首尾氨基酸的“-COOH”与“-NH₂”环化方法参见Mengfen等Peptide ProteinReserch 1996.48:229-239；使首尾氨基酸的“-COOH”与“-OH”进行反应而形成环状结构的方法参见Mmenhofer等Chem.Soc 1970.92:3771-3777。由此得到能够模拟病毒粒子天然构象的多肽环化结构。

1.4合成肽抗原的纯化除菌

合成肽抗原使用循环式切向过滤膜包在20～28℃条件下进行超滤(TangentialFlow Device循环式切向过滤膜包以及与其配套的蠕动泵)，多肽抗原是大分子不能通过一定孔径的滤膜，而前期合成过程以及后期环化反应形成或引进的小分子杂质则可以通过滤膜。然后再通过孔径为0.2μm过滤器除菌，将最后得到的溶液分装到无菌塑料瓶内，贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件，分装后，储存于-20℃或-40℃备用。

为了便于运输和长期保存的需要，将多肽抗原进行冷冻干燥以得到固体状态的多肽。将预先冻好的多肽抗原取出，在Labconco冷冻干燥机上进行干燥，得到固体状态的多肽抗原。同时贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件。

实施例2、***A型合成肽疫苗的配制

1.1抗原水相的配制

分别称取依照实施例1制备的多肽1或多肽2所示的合成肽抗原，按照摩尔比例为1:1混合，然后用灭菌注射用水将合成肽抗原总浓度稀释至50μg/ml。将所得抗原溶液经孔径为0.2μm的过滤器过滤，除菌。

1.2油相佐剂制备

将油相佐剂50V经121℃灭菌30min，备用。

1.3合成肽疫苗的乳化

用灭菌的蒸馏水2000ml清洗IKA乳化设备3次，然后在20～28℃条件下按油相佐剂和抗原水相为1:1的体积比，先将油相加入乳化罐内，开动电机以90～150rpm慢速转动搅拌2min后，同时缓慢加入水相抗原，加完后搅拌30min，再以10000rpm高速搅拌20min，静置5min，使疫苗乳化成油包水的单相疫苗，得到含摩尔比为1:1的多肽1、多肽2混合疫苗。

按照相同的方法配制只含有单一组分的疫苗，抗原浓度为50μg/ml。

实施例3、***A型合成肽疫苗的效力试验

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1合成肽疫苗

按照实施例1制备实施例3中选择的如多肽1(序列1)和多肽2(序列2)的多肽抗原，然后按照实施例2配制含有多肽1及多肽2混合组分的***A型合成肽疫苗，对应批号为：A1901、A1902、A1903，以及多肽1(序列1)制成的疫苗对应批号A1904、多肽2(序列2)制成的疫苗对应批号A1905。

1.1.2试验动物

挑选品种相同，4月龄、体重40Kg左右，***中和抗体呈阴性的健康架子猪27头(兰州白银猪场)。

1.1.3***病毒毒种AF/72株[中牧实业股份有限公司]

用3～4日龄乳鼠[自繁]测定并调整毒价，置于-70℃冷冻保存备用。

1.2试验方法

将健康易感猪90头，随机分成6组，每组15头，第1组免疫A1901、第2组免疫A1902、第3组免疫A1903，第4组免疫A1904，第5组免疫A1905，第6组免疫同类制品对照苗***A型灭活疫苗(AF/72株)。每组分3个剂量组，具体免疫剂量为：1头份(5头)，1/3头份(5头)，1/9头份(5头)，其中，A1901、A1902、A1903、A1904、A1905每头份为1ml，同类制品对照苗每头份为3ml。免疫时采用颈部肌肉注射，注射剂量及具体分组情况详见表1。接种后28日后，第2、4、6、8、10、12组的猪攻击AF/72强毒。对照猪2头，其中2头猪舌上表面两侧分两点皮内注射AF/72强毒，每点均为0.1ml(共0.2ml，含10³ID₅₀)，连续观察10日。

1.3结果判定

对照猪应3个以上蹄出现病变(水泡或溃疡)，免疫猪出现任何***症状即判为不保护。根据免疫猪的保护数，按Read-Muench法计算被检疫苗的PD₅₀。12组待检疫苗均按照上述方法进行效力实验。

2.试验结果与讨论

2.1试验结果

上述3批实验室疫苗、对照疫苗按照1.2方法免疫动物，28日后攻AF/72强毒，10天后判定结果，结果见表1。

表1.***A型合成肽疫苗效力试验结果

2.2结果讨论

由上述结果可以看出：三批次的***A型合成肽疫苗A1901、A1902、A1903分别免疫动物，21日后使用AF/72强毒攻击后的PD₅₀值分别是：9.00、9.00、9.00，同类制品对照疫苗使用AF/72攻毒后的PD₅₀值为7.49。而单独多肽免疫第7-8组免疫OA1904，第9-10组免疫OA1905强毒攻击后的PD₅₀值也达到7.6以上。

上述结果表明：***A型合成肽疫苗针对AF/72强毒强毒攻击的PD₅₀值均超过6，达到保护要求。说明多肽疫苗具有保护试验动物猪免受病毒攻击的能力。且***A型合成肽疫苗针对AF/72强毒攻击的PD₅₀值高于猪***灭活苗的PD₅₀值，说明多肽疫苗比常规灭活苗相比，具有更好的保护效果。本试验证明合成肽苗既符合疾病预防的要求，又符合食品安全的要求，市场空间很广阔。

实施例5、***A型合成肽疫苗的安全性试验

1.材料与方法

1.1合成肽疫苗

同实施例3。

1.2试验动物[自繁]

350～450g的豚鼠；18～22g的小鼠；至少6月龄的健康易感猪。

1.3试验方法

1.3.1用体重350～450g的豚鼠15只，每只皮下注射疫苗2ml；用体重18～22g的小鼠15只，每只皮下注射疫苗0.5ml。连续观察7日，均不得出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部不良反应或全身反应。

1.3.2用至少6月龄的健康易感猪(细胞中和抗体效价不高于1:8)9头，于每头猪舌背面皮内注射疫苗20个点，每点0.1ml，逐日观察4日后，每头猪肌肉注射疫苗6ml，继续逐日观察6日。均不得出现***症状或明显的因注射疫苗引起的毒性反应。

2.试验结果

2.1疫苗对豚鼠和小鼠的安全性

豚鼠15只，每只皮下注射疫苗2ml；小鼠15只，每只皮下注射0.5ml。连续观察7日，均没有出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部不良反应或全身反应，具体结果如下表3。

表3.豚鼠和小鼠的疫苗安全性试验结果

2.2.疫苗对健康易感猪的安全性

将合成肽疫苗取出平衡到室温后，于每头猪舌皮内分20个点注射疫苗2ml，每点0.1ml，逐日观察至少4日。之后，每头猪肌肉注射疫苗9ml，继续逐日观察6日。具体结果见表4。

表4.健康易感猪的疫苗安全性试验结果

上述结果说明***A型合成肽疫苗对豚鼠、小鼠及猪安全性高，无散毒危险，所以具有良好的推广前景和市场价值。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

序列表

<110> 中牧实业股份有限公司

<120> ***A型合成肽疫苗及其制备方法和应用

<130> WHOI190096

<160> 2

<170> Patent-In 3.5

<210> 1

<211> 56

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

Glu Arg Thr Tyr Ser Ala Ala Glu Asp Glu Thr Ala Leu Glu Lys Val

1 5 10 15

Tyr Asn Gly Thr Thr Lys Tyr Ser Thr Gly Asn Ala Gly Arg Arg Gly

20 25 30

Asp Leu Gly Ser Leu Ala Ala Arg Val Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser

35 40 45

Phe Asn Phe Gly Ala Ile Arg Ala

50 55

<210> 2

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

His Lys Arg Thr Tyr Asn Ser Glu Asp Ala Gln Ala Ala Ser Glu Lys

1 5 10 15

Val Tyr Asn Gly Thr Thr Lys Tyr Ser Thr Gly Asn Ala Gly Thr Arg

20 25 30

Gly Asp Leu Gly Ser Leu Ala Glu Arg Val Ala Thr Gln Leu Pro Ala

35 40 45

Ser Phe Asn Phe Gly Ala Ile Arg Ala

50 55