阅读说明：本技术 一种重组大肠杆菌及其在筛选赤藓糖醇生产菌株中的应用 (recombinant escherichia coli and application thereof in screening erythritol production strains ) 是由 张娟 邱学良 李江华 堵国成 陈坚 于 2019-11-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种重组大肠杆菌及其在筛选赤藓糖醇生产菌株中的应用,属于微生物技术领域。本发明的筛选赤藓糖醇生产菌株的方法所使用的重组大肠杆菌能很好的对不同浓度的赤藓糖醇进行正相关感应,因此,本发明的筛选赤藓糖醇生产菌株的方法具有灵敏度高的优势。在工业上发酵生产赤藓糖醇多采用高浓度葡萄糖作为发酵底物,而本发明的筛选赤藓糖醇生产菌株的方法可克服高浓度葡萄糖的干扰,在高浓度葡萄糖的干扰下,本发明的筛选赤藓糖醇生产菌株的方法所使用的重组大肠杆菌仍能很好的对不同浓度的赤藓糖醇进行正相关感应,并且,相关性较无葡萄糖干扰时更高,因此,本发明的筛选赤藓糖醇生产菌株的方法具有抗干扰能力强的优势。(The invention discloses recombinant escherichia coli and application thereof in screening erythritol producing strains, and belongs to the technical field of microorganisms.)

一种重组大肠杆菌及其在筛选赤藓糖醇生产菌株中的应用

技术领域

本发明涉及一种重组大肠杆菌及其在筛选赤藓糖醇生产菌株中的应用，属于微生物技术领域。

背景技术

赤藓糖醇是在自然界中发现的相对分子质量最小的糖醇，其不仅拥有糖醇类产品所有的卓越功能，如防龋齿和适于糖尿病患者食用等，还独具有热量极低(≤1.66kJ·g)和耐受量极高(无副作用)的特性。赤藓糖醇具有良好的食品加工适应性和生理保健功能，目前正作为一种新型功能性保健食品原料被广泛用于食品、医药、化妆品及化工等领域。

生产赤藓糖醇的菌种有真菌和细菌等，其中，有许多菌种除了产赤藓糖醇外，还产其他如木糖醇、乙醇、甘油等多元醇。目前，用于商业的赤藓糖醇生产菌株主要是日本的Aureobasidium sp.变异株以及韩国的Candida magnoliae。鉴于赤藓糖醇重要的应用价值和巨大的市场需求，寻求发酵性能优良的赤藓糖醇生产菌株仍然是所有研究开发工作的基础。

现有的筛选赤藓糖醇生产菌株的方法主要是先对待筛选菌株进行培养，然后通过高效液相色谱(HPLC)法测定发酵液中赤藓糖醇的含量，该方法需要复杂的样品处理，检测周期也比较长，不适合赤藓糖醇发酵液的快速检测，也难以实现赤藓糖醇生产菌株的高通量筛选。因此，急需找到一种效率更高的筛选赤藓糖醇生产菌株的方法以克服现有筛选方法的缺陷。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种效率高的筛选赤藓糖醇生产菌株的方法。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一种重组质粒，所述重组质粒以pET-22b(+)质粒为表达载体，表达编码转录调控因子的基因以及标记基因；所述编码转录调控因子的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒以pET-22b(+)质粒为表达载体，表达编码转录调控因子的基因、标记基因以及转录调控因子结合序列；所述转录调控因子结合序列如SEQ ID No.5所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒是通过在pET-22b(+)质粒T7启动子的下游***标记基因，并且，将pET-22b(+)质粒上的LacI基因的核苷酸序列替换为编码转录调控因子的基因的核苷酸序列、Lac O基因的核苷酸序列替换为转录调控因子结合序列得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述标记基因为编码荧光蛋白的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述编码荧光蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

本发明还提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌含有上述重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)为表达宿主。

本发明还提供了一种筛选赤藓糖醇生产菌株的方法，所述方法为将上述重组大肠杆菌接种至待筛选菌株的发酵上清液中进行培养，得到培养液；根据此培养液中标记基因的表达量即可确认待筛选菌株的赤藓糖醇生产能力。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基为含有葡萄糖的培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖在培养基中的浓度为10～300g/L。

本发明还提供了上述重组质粒或上述重组大肠杆菌或上述筛选赤藓糖醇生产菌株的方法在筛选赤藓糖醇生产菌株中的应用。

[有益效果]

(1)本发明提供了一种可用于筛选赤藓糖醇生产菌株的重组质粒，此重组质粒含有编码转录调控因子的基因以及标记基因，将此重组质粒导入大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)中后，可获得一种可用于筛选赤藓糖醇生产菌株的重组大肠杆菌，将此重组大肠杆菌接种至待筛选菌株的发酵上清液中进行培养时，若待筛选菌株可生产赤藓糖醇，那么，此待筛选菌株生产得到的赤藓糖醇会解除重组质粒中转录调控因子eryD对标记基因的抑制，使得标记基因可表达，进而使得共培养获得的培养液中可检测到标记基因的表达，此时，只需通过酶标仪对共培养获得的发酵液进行检测，即可筛选出赤藓糖醇生产菌株，因此，使用本发明的重组质粒筛选赤藓糖醇生产菌株具有操作简单、检测周期短、检测效率高的优势。

(2)本发明提供了一种可用于筛选赤藓糖醇生产菌株的重组大肠杆菌，此重组大肠杆菌含有可表达编码转录调控因子的基因以及标记基因的重组质粒，将此重组大肠杆菌接种至待筛选菌株的发酵上清液中进行培养时，若待筛选菌株可生产赤藓糖醇，那么，此待筛选菌株生产得到的赤藓糖醇会解除重组质粒中转录调控因子eryD对标记基因的抑制，使得标记基因可表达，进而使得共培养获得的培养液中可检测到标记基因的表达，此时，只需通过酶标仪对共培养获得的发酵液进行检测，即可筛选出赤藓糖醇生产菌株，因此，使用本发明的重组大肠杆菌筛选赤藓糖醇生产菌株具有操作简单、检测周期短、检测效率高的优势。

(3)本发明提供了一种筛选赤藓糖醇生产菌株的方法，此方法为将含有编码转录调控因子的基因以及标记基因的重组质粒的重组大肠杆菌接种至待筛选菌株的发酵上清液中进行培养，若待筛选菌株可生产赤藓糖醇，那么，此待筛选菌株生产得到的赤藓糖醇会解除重组质粒中转录调控因子eryD对标记基因的抑制，使得标记基因可表达，进而使得共培养获得的培养液中可检测到标记基因的表达，此时，只需通过酶标仪对共培养获得的发酵液进行检测，即可筛选出赤藓糖醇生产菌株，因此，使用本发明的方法筛选赤藓糖醇生产菌株具有操作简单、检测周期短、检测效率高的优势，若在使用本发明的方法筛选赤藓糖醇生产菌株的过程中使用多孔酶标板，还可实现对赤藓糖醇生产菌株的高通量选育。

(4)本发明的筛选赤藓糖醇生产菌株的方法所使用的重组大肠杆菌能很好的对不同浓度的赤藓糖醇进行正相关感应，因此，本发明的筛选赤藓糖醇生产菌株的方法具有灵敏度高的优势。

(5)在工业上发酵生产赤藓糖醇多采用高浓度葡萄糖作为发酵底物，而本发明的筛选赤藓糖醇生产菌株的方法可克服高浓度葡萄糖的干扰，在高浓度葡萄糖的干扰下，本发明的筛选赤藓糖醇生产菌株的方法所使用的重组大肠杆菌仍能很好的对不同浓度的赤藓糖醇进行正相关感应，并且，相关性较无葡萄糖干扰时更高，因此，本发明的筛选赤藓糖醇生产菌株的方法具有抗干扰能力强的优势。

(6)使用本发明的方法检测共培养获得的发酵液中标记基因的表达量的结果与使用液相色谱法检测共培养获得的发酵液中赤藓糖醇的含量的结果趋势一致，因此，本发明的筛选赤藓糖醇生产菌株的方法具有准确度高的优势。

附图说明

图1：质粒pET-22b(+)的质粒图谱。

图2：重组质粒pET-22b(+)-eryD-1的质粒图谱。

图3：重组质粒pET-22b(+)-eryD-2的质粒图谱。

图4：赤藓糖醇诱导对重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-3发酵获得的发酵液中荧光强度的影响。

图5：赤藓糖醇诱导浓度对重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-3发酵获得的发酵液中荧光强度的影响。

图6：葡萄糖浓度对重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-3发酵获得的发酵液中荧光强度的影响。

具体实施方式

下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；下述实施例中涉及的pET-22b(+)质粒购自南京金斯瑞公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L、氨苄青霉素100ng/mL。

LB固体培养基：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L、琼脂20g/L、氨苄青霉素ng/mL。

YPD液体培养基：胰蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L。

YPD固体培养基：胰蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L、琼脂20g/L。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

赤藓糖醇含量的检测方法：

采用高效液相色谱法(1260Infinity，Agilent，USA)对发酵液上清液中赤藓糖醇和葡萄糖进行准确测定。流动相：稀硫酸(5mm)；柱：胺○RHPX-87H离子排阻柱；柱温：40℃；流速：0.6mL/min；检测器：1260RID。

实施例1：可用于筛选赤藓糖醇生产菌株的重组大肠杆菌的构建

具体步骤如下：

(1)重组大肠杆菌的初步构建

通过化学合成获得核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的编码转录调控因子eryD的基因(具体可见表1)、核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的编码荧光蛋白GFP的基因(具体可见表1)以及核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的ery Operon中位于eryA基因上游的启动子(具体可见表1)；通过基因编辑在pET-22b(+)质粒T7启动子的下游***编码转录调控因子eryD的基因，并且，通过基因编辑在pET-22b(+)质粒T7启动子的上游按顺序反向侧***eryOperon中位于eryA基因上游的启动子以及编码荧光蛋白GFP的基因，获得重组质粒pET-22b(+)-eryD-1(质粒pET-22b(+)的质粒图谱见图1、重组质粒pET-22b(+)-eryD-1的质粒图谱见图2)。

将获得的重组质粒pET-22b(+)-eryD-1导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中；将转化后的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)划线于LB固体培养基上，于37℃的条件下培养10h；挑取阳性转化子接种于LB液体培养基中，于37℃的条件下培养16h，收集菌体，提取基因组进行PCR验证，验证正确，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-1。

将重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-1划线于LB固体培养基上，于37℃的条件下培养10h；挑取单菌落接种于LB液体培养基中，于37℃的条件下培养10h；将种子液以10％(v/v)的接种量接种至含有浓度为0.5mM的IPTG的LB液体培养基中，于37℃的条件下培养16h，获得发酵液；取200μL发酵液，通过酶标仪测定发酵液中的荧光强度，检测结果如下：发酵液中未观察到荧光。

可见，重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-1构建失败，推测可能的原因有两个：一个是T7启动子渗漏表达eryD，造成对ery Operon启动子的阻遏，导致荧光蛋白没有表达；另一个原因是启动子的RBS序列到编码荧光蛋白GFP的基因的起始密码子的距离过长或启动子的RBS序列不能正常发挥作用所造成的启动子在大肠杆菌中不能成功启动。

(2)重组质粒的改造

为找到重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-1构建失败的原因，在重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-1的基础上，通过基因编辑将eryD基因从质粒上敲除，结果发现：发酵液中还是没有明显的荧光蛋白表达。可见，重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-1构建失败的原因并非T7启动子渗漏表达eryD。

为找到重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-1构建失败的原因，在重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-1的基础上，通过环状PCR将编码荧光蛋白GFP的基因的起始密码子上游的16bp序列从质粒上敲除，结果发现：发酵液中还是没有明显的荧光蛋白表达。可见，重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-1构建失败的原因并非启动子的RBS序列到编码荧光蛋白GFP的基因的起始密码子的距离过长所造成的启动子在大肠杆菌中不能成功启动。

为找到重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-1构建失败的原因，在重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-1的基础上，通过环状PCR用质粒pET-22b(+)自带的RBS序列“AAGGAG”***到编码荧光蛋白GFP的基因的起始密码子上游，距离编码荧光蛋白GFP的基因的翻译起始位点ATG的距离有8个碱基对，结果发现：发酵液中还是没有明显的荧光蛋白表达。可见，重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-1构建失败的原因也并非启动子的RBS序列不能正常发挥作用所造成的启动子在大肠杆菌中不能成功启动。

基于上述情况，重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-1构建失败的原因极有可能在于ery Operon中位于eryA基因上游的启动子在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中不能单独表达，或者，表达太弱。因此，化学合成核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的eryA起始密码子上游200bp的转录调控因子结合序列(具体可见表1)；通过基因编辑用eryA起始密码子上游200bp的转录调控因子结合序列替代质粒pET-22b(+)的Lac O基因的核苷酸序列，通过基因编辑用编码转录调控因子eryD的基因的核苷酸序列替代质粒pET-22b(+)的LacI基因的核苷酸序列，并且，通过基因编辑在pET-22b(+)质粒T7启动子的下游***编码荧光蛋白GFP的基因，构建新的重组质粒pET-22b(+)-eryD-2(重组质粒pET-22b(+)-eryD-2的质粒图谱见图3)。

将获得的重组质粒pET-22b(+)-eryD-2导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中；将转化后的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)划线于LB固体培养基上，于37℃的条件下培养10h；挑取阳性转化子接种于LB液体培养基中，于37℃的条件下培养16h，收集菌体，提取基因组进行PCR验证，验证正确，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-2。

将重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-2划线于LB固体培养基上，于37℃的条件下培养10h；挑取单菌落接种于LB液体培养基中，于37℃的条件下培养10h；将种子液以10％(v/v)的接种量接种至含有浓度为0.5mM的IPTG的LB液体培养基中，于37℃的条件下培养16h，获得发酵液；取200μL发酵液，通过酶标仪测定发酵液中的荧光强度，检测结果如下：发酵液中没有明显的荧光蛋白表达。可见，重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-2依旧构建失败。

(3)重组大肠杆菌的进一步改造

在重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-2的基础上，通过基因编辑将核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的eryA起始密码子上游200bp的转录调控因子结合序列截短为核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的104bp的转录调控因子结合序列(具体可见表1)，结果发现：发酵液中有明显的荧光蛋白表达。将此重组大肠杆菌命名为重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-3。

实施例2：可用于筛选赤藓糖醇生产菌株的重组大肠杆菌的验证

具体步骤如下：

(1)重组大肠杆菌的第一步验证

将实施例1获得的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-3划线于LB固体培养基上，于37℃的条件下培养10h；挑取单菌落接种于LB液体培养基中，于37℃的条件下培养10h；将种子液以10％(v/v)的接种量接种至含有浓度为0.5mM的IPTG的LB液体培养基中，于37℃的条件下培养16h，获得发酵液A。

将实施例1获得的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-3划线于LB固体培养基上，于37℃的条件下培养10h；挑取单菌落接种于LB液体培养基中，于37℃的条件下培养10h；将种子液以10％(v/v)的接种量接种至含有浓度为0.5mM的IPTG以及浓度为100mM的赤藓糖醇的的LB液体培养基中，于37℃的条件下培养16h，获得发酵液B。

取10μL发酵液A和发酵液B，分别通过荧光显微镜测定发酵液A和发酵液B中的荧光强度，检测结果见图4。

由图4可知，添加赤藓糖醇可明显增加重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-3发酵获得的发酵液中的荧光强度。可见，重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-3可以响应赤藓糖醇，具有应用于赤藓糖醇高通量检测的潜力。

(2)重组大肠杆菌的第二步验证

将重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-3划线于LB固体培养基上，于37℃的条件下培养10h；挑取单菌落接种于LB液体培养基中，于37℃的条件下培养10h；将种子液以10％(v/v)的接种量接种至分别含有浓度为5mmol/L、10mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、250mmol/L、500mmol/L、1000mmol/L的赤藓糖醇的的LB培养基中，于37℃的条件下培养，获得发酵液。

从培养3h开始，每隔20min通过酶标仪测定发酵液中的荧光强度，检测结果见图5。

由图5可知，浓度在250mmol/L以下的赤藓糖醇并没有起到增强重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-3对荧光蛋白表达的作用，反而使得发酵液中荧光蛋白的表达水平降低了；浓度在250mmol/L和500mmol/L之间的赤藓糖醇则可显著增加增强重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-3对荧光蛋白表达的作用，使得发酵液中荧光蛋白的表达水平显著提高。可见，重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-3对赤藓糖醇的响应区间为250～500mmol/L，灵敏度较高。

(3)重组大肠杆菌的第三步验证

将重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-3划线于LB固体培养基上，于37℃的条件下培养10h；挑取单菌落接种于LB液体培养基中，于37℃的条件下培养10h；将种子液以10％(v/v)的接种量接种至含有浓度为100g/L的葡萄糖，且分别含有浓度为5mmol/L、10mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、250mmol/L、500mmol/L、1000mmol/L的赤藓糖醇的的LB培养基中，于37℃的条件下培养，获得发酵液。

从培养3h开始，每隔20min通过酶标仪测定发酵液中的荧光强度，检测结果见图6。

由图6可知，在浓度为100g/L的葡萄糖的干扰下，重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-3对赤藓糖醇的响应区间变为10～250mmol/L，且重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-3在培养250min时，能很好的对实验浓度的赤藓糖醇进行正相关感应。可见，添加葡萄糖后，重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-3对赤藓糖醇的灵敏性反而提高，抗干扰能力强。

综上所述，重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-3可对赤藓糖醇响应，对赤藓糖醇浓度的灵敏度较高，可克服高浓度葡萄糖的干扰，并且，在高浓度葡萄糖的干扰下，对赤藓糖醇的灵敏度更高，因此，重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-3可用于筛选赤藓糖醇生产菌株。

实施例3：可用于筛选赤藓糖醇生产菌株的重组大肠杆菌的应用

具体步骤如下：

随机抽取五株可产赤藓糖醇的yarrowia lipolytica，由于yarrowia lipolytica的发酵生产赤藓糖醇需要较高的溶氧，采用2mL的96孔板进行发酵培养，孔板分别采用密封膜和不锈钢盖子进行封口。

将抽取得到的可产赤藓糖醇的yarrowia lipolytica划线于YPD固体培养基上，于30℃的条件下培养40h，得到yarrowia lipolytica的单菌落；挑取yarrowia lipolytica的单菌落接种于YPD液体培养基中，于30℃的条件下培养20h，得到yarrowia lipolytica的种子液；将yarrowialipolytica的种子液以5％(v/v)的接种量接种至YPD液体培养基中，并在YPD液体培养基中补加葡萄糖至YPD液体培养基中葡萄糖的浓度为150g/L，于30～35℃的条件下培养40～150h，得到发酵液；将发酵液离心，得到发酵上清液；将重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-3划线于LB固体培养基上，于37℃的条件下培养10h，得到重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-3的单菌落；挑取重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-3的单菌落接种于LB液体培养基中，于37℃的条件下培养16h，得到重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-3的种子液；将重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-3的种子液以10％的接种量接种至发酵上清液中，并在发酵上清液中加入0.5mM的IPTG以及100ng/mL的氨苄青霉素，于37℃的条件下培养3h，3h后，通过酶标仪测定培养液中的荧光强度，并且，通过高效液相色谱法测定培养液中赤藓糖醇的含量。

通过酶标仪测得的培养液中的荧光强度与通过高效液相色谱法测得的培养液中赤藓糖醇的含量变化一致。这进一步证明了重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-eryD-3可用于筛选赤藓糖醇生产菌株。

表1各基因的核苷酸序列

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种重组大肠杆菌及其在筛选赤藓糖醇生产菌株中的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 951

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcagatg cagacgattc tctggcgctt cgcgccgcct ggcttcattt cgtcgccggc 60

atgactcagt ctgccgttgc caagcgcctt ggcctgcctt cggtgaaagc gcatcgtctc 120

atcgccaagg ccgttgccga cggcgcggtg aaagtgacca tcgacggtga catcaccgaa 180

tgcatcgatc tggaaaaccg tctggccgat ctttacggcc tcgattattg cgaggtcgca 240

cccgatattg gcgaggaagg cctgccgctg atggcgcttg gccatgcggg cgcgaatttc 300

atgcgccgcg aaatcgaaca tggcgatcat gaggtcatcg gcatcggcca tggccgcaca 360

ctttcggcag cggttggtta tatgccgcgt gtcatggcca atgatctgcg tttcgtctcg 420

cttctgggcg gcctcacgcg caattttgcc gccaacccgc atgacgtgat gcaccgcatc 480

gcggaaaaaa ccggaatgcc cgcttatgtg atgccggtgc ccttcttcgc caatacggcg 540

gaagaccgcg aagtgctgct ggcccaacgc ggtgtcacca cggttttcga catgggttgc 600

cgtgcggaac tgaagatcgt cggcattgga acggtcgatg cgcaggcgca gcttgtcaca 660

tccggcatga tagaacttgg cgaagtggaa gagatcgcca acctcggcgg cgtcggcgaa 720

atgctcggcc atttcttcaa tgccaatggc caatggctgg aaaccgcgct gacgggccgc 780

accatcgcgg cttccgtgga aaacgccgat atgagccgta tcgtggcgct tgcaggcggt 840

ctttccaagg tggacgccat tcgcgccgtg ctgaaaagcg ggcgtcttta cggcctcatc 900

accgacgaac ggacagcaaa ggcccttatc ggccagccga atggaaaatg a 951

<210> 2

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgggtaagg gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60

gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120

aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaagctgc ctgttccttg gccaacactt 180

gtcactactc ttacttatgg tgttcaatgc ttttcaagat acccagatca tatgaagcgg 240

cacgacttct tcaagagcgc catgcctgag ggatacgtgc aggagaggac catcttcttc 300

aaggacgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgagggaga caccctcgtc 360

aacagaatcg agcttaaggg aatcgatttc aaggaggacg gaaacatcct cggccacaag 420

ttggaataca actacaactc ccacaacgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 480

atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 540

cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600

ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 660

cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactgta caaataa 717

<210> 3

<211> 742

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tatcaaacgc cttcagcaat cctgccggtt gtcgttatgg aaacggatga tgcggcccgg 60

ctcaaaccgc ctgacggtga tcgtccgcaa gcggaacgct caatttctat atcgcccaat 120

atggccagtt atcgcataag cagatgaccc cgcataagcg gtgcaggccg tgacggacaa 180

gagcatgaca tcctccacac gttccagacc cgctcccccg gctcctgaaa ccagatgtgc 240

cgcaatcaga aacttatgat agcggcgtgt tatcaactgc tgaaatgatg ttataaagcc 300

tgatagctgt caatccgatg ttttgaaaac cttcgtgatt tggcataaaa tcgggcagaa 360

ttcgcgctga gccatagcga aatccaccgc taaatatggc ttgcccttat gagcgggcgg 420

cctttcgccc gccttgcaac catcgggata acacaaaaat aaatctaata aatacaatat 480

attgataaag acccactcat atctcccggt tttatatcgg acacatgatg ccggttccct 540

ccccttttag acgtagggtt ttccaccaca ttcaccttat gttgaaaaaa atacgccttg 600

ttaaaaattt tacagacagt tcgccagcgt tatgttatct ccaacatgcg ccatcgcccg 660

atttcgccat ggaaggggct gcgagcgacc tgttttcagt cgcgggagga aatccggatg 720

tttatgaaag cctgtgtcag cc 742

<210> 4

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccttttagac gtagggtttt ccaccacatt caccttatgt tgaaaaaaat acgccttgtt 60

aaaaatttta cagacagttc gccagcgtta tgttatctcc aacatgcgcc atcgcccgat 120

ttcgccatgg aaggggctgc gagcgacctg ttttcagtcg cgggaggaaa tccggatgtt 180

tatgaaagcc tgtgtcagcc 200

<210> 5

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctccaacatg cgccatcgcc cgatttcgcc atggaagggg ctgcgagcga cctgttttca 60

gtcgcgggag gaaatccgga tgtttatgaa agcctgtgtc agcc 104