一种利用dna去甲基化酶基因创造表型变异转基因植物的方法
阅读说明：本技术 一种利用dna去甲基化酶基因创造表型变异转基因植物的方法 (Method for creating phenotypic variation transgenic plant by using DNA demethylase gene ) 是由 张冰玉 苏晓华 常英英 吴晓娟 于 2019-11-01 设计创作，主要内容包括：本发明属于植物育种领域,尤其是植物生物技术育种领域,具体涉及一种利用DNA去甲基化酶基因创造表型变异转基因植物的方法。本发明利用农杆菌介导法,将化学诱导启动子与拟南芥DNA去甲基化酶基因AtDME导入84K杨基因组中,获得转AtDME 84K杨植株,利用雌激素分别诱导转基因植株无菌离体叶片AtDME表达3h、12h和24h后,诱导叶片再生获得表型变异植株。该研究利用化学诱导启动子人工启动外源去甲基化酶基因表达,创造表型变异种质,丰富了植物育种资源。(The invention belongs to the field of plant breeding, in particular to the field of plant biotechnology breeding, and particularly relates to a method for creating phenotypic variation transgenic plants by using DNA demethylase genes. The invention utilizes an agrobacterium-mediated method to introduce a chemically induced promoter and an arabidopsis DNA demethylase gene AtDME into a 84K poplar genome to obtain an AtDME 84K poplar plant, and after estrogen is utilized to respectively induce sterile in vitro leaves of the transgenic plant to express the AtDME for 3h, 12h and 24h, the leaves are induced to regenerate to obtain a phenotype variation plant. The research utilizes a chemical induction promoter to artificially start the expression of exogenous demethylase genes, creates phenotypic variation germplasm and enriches plant breeding resources.)
技术领域
本发明属于植物育种领域，尤其是植物生物技术育种领域，具体涉及一种利用DNA去甲基化酶基因创造表型变异转基因植物的方法。
背景技术
杨树属于杨柳科(Salicacae)杨属(Populus L.)植物，为多年生木本乔木。杨树不仅是重要的造林绿化树种和工业用材树种，而且还是多年生林木基因工程的模式树种。
我国自20世纪40年代开展杨树杂交育种以来，选育出了一批生长表现优良的杨树品种，并在国内各大栽培区推广种植，取得了良好的社会和经济效益。随着经济的发展，社会对杨树良种的需求日益增长，但受育种资源缺乏的限制，杨树良种选育效果和速度难以满足现代经济社会发展的需求。
杨树育种工作首先要具备包含足够丰富遗传变异的育种资源。作为育种工作的物质基础，育种资源的丰富度直接决定良种选育的效率。当前，除深入挖掘我国特有杨树种质资源、规模化引进国外优良基因资源外，利用人工方法(辐射诱变技术、转基因技术等)创造新的种质资源是解决杨树育种资源短缺的又一有效手段。
DNA甲基化是重要的表观遗传学改变之一，DNA甲基化水平的变化会引起植物表观遗传特征的变化，并且这种表观变异可传递给后代。研究表明，杂交、环境胁迫、甲基化抑制剂处理、遗传转化等方法都能够改变植物基因组甲基化状态，从而获得新的可遗传的表型变异。最终，通过对这种可遗传的表型变异的选择，可以达到植物改良的目标。
在拟南芥中，DME基因(DEMETER)是其四种碱基切除修复酶(BER)糖基化酶的同源物之一，专门切除5-甲基胞嘧啶(5mC)而不是受损的碱基，从而催化活性DNA去甲基化，在植物主动去甲基化过程中起关键作用。
发明内容
为了解决植物育种种质资源匮乏的问题，本发明提供了一种利用DNA去甲基化酶基因创造表型变异转基因植物的方法，利用该方法能够获得大量表型发生改变的植物新种质。
为此，本发明一方面提供了一种利用拟南芥AtDME基因创造表型变异转基因植物的方法，其包括以下步骤：
1、获得拟南芥AtDME基因；
2、构建含有化学诱导启动子和拟南芥AtDME基因的化学诱导型植物表达载体；
3、采用步骤2构建的植物表达载体转化宿主细胞；
4、采用步骤3获得的宿主细胞遗传转化植物细胞，获得转AtDME基因的植株；
5、采用化学试剂处理转基因植株，获得转AtDME基因的表型变异的植株；
所述植物为能进行遗传转化的植物，优选为杨树，更加优选为84K杨。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述的化学诱导型植物表达载体为植物表达载体pER8-DME。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述的宿主细胞为农杆菌，优选为农杆菌GV3101。
在本发明进一步优选的实施方案中，步骤4为采用获得的宿主细胞对植物的离体叶片进行遗传转化，诱导再生不定芽，获得转AtDME基因的植株。
在本发明进一步优选的实施方案中，步骤5为采用100μM的17-β-***，对植物的离体叶片进行处理，处理时间为3h、12h或24h，诱导再生不定芽，获得转AtDME基因的表型变异的植株。
在本发明进一步优选的实施方案中，还包括对表型变异的植株进行表型变异的测定。
在本发明更加优选的实施方案中，测定的指标包括植株株高、叶片的长宽、植株地径、功能叶片叶绿素含量、光合参数、叶片可溶性糖含量、叶片可溶性蛋白含量、POD活性和SOD活性。
本发明另一方面提供了一种含有拟南芥AtDME基因的化学诱导型植物表达载体，其为植物表达载体pER8-DME。
本发明另一方面提供了所述的植物表达载体的制备方法，包括以下步骤：
1、以pET30b-DME质粒为模版，用AtDME基因全长引物扩增AtDME基因的全长序列；
2、将扩增得到的全长AtDME基因，连接到克隆载体pMDTM19-T Vector中，获得pMD19-T-DME重组质粒；
3、分别酶切pMD19-T-DME和pER8-GFP，回收pMD19-T-DME中的D3片段和pER8线性片段，连接获得中间载体pER8-D3，用酶切pER8-D3载体，获得线性化pER8-D3片段；
4、以pET30b-DME质粒为模版，扩增其中的D1-1和D1-2片段，与线性化pER8-D3片段连接，获得pER8-DME植物表达载体。
本发明再一方面提供了所述植物表达载体转化的宿主细胞，优选为农杆菌，更加优选为农杆菌GV3101。
由上述分析可知，本发明创造了一种利用去甲基酶基因获得植物变异种质的基因工程方法，该方法将对我国的作物及林木育种和生产产生积极的推动作用。
附图说明
图1：植物表达载体pER8-AtDME载体构建图。
图2：转AtDME基因84K杨潮霉素抗性芽(A)及抗性植株(B)。
图3：转AtDME基因84K杨抗性植株潮霉素基因PCR检测。
M：DL2000 Marker；1：阴性对照；2：阳性对照；3～8：转AtDME基因抗性植株。
图4：转AtDME基因84K杨抗性植株HD引物PCR检测。
M：DL2000 Marker；1：阴性对照；2：阳性对照；3～8：转AtDME基因抗性植株。
图5：转基因84K杨离体叶盘外源基因AtDME的***诱导表达情况。
图6：转AtDME 84K杨***诱导后再生植株生长性状及光合参数变化情况。
图7：转AtDME 84K杨***诱导后再生植株的生化指标变化情况。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
实施例1：转AtDME基因84K杨及表型变异植株的获得
1、拟南芥去甲基化基因AtDME的化学诱导型植物表达载体构建
以pET30b-DME质粒为模版，用AtDME基因全长引物(DME-F、DME-R)PCR扩增DME基因的cDNA全长序列(引物序列见表1)。采用TA克隆的方法将DME基因重组到pMDTM19-T Vector(Takara公司，日本)，获得重组质粒pMD19-T-DME。转化E.coli DH5α，经过蓝白斑筛选，挑取阳性克隆进行序列测定。
用XhoⅠ和SpeⅠ(NEB公司，美国)双酶切pMD19-T-DME和化学诱导植物表达启动子pER8-GFP，酶切回收pMD19-T-DME中的D3片段和pER8线性片段，用T4 DAN酶(NEB公司，美国)连接，转化大肠杆菌后挑取单克隆进行PCR检测，所用引物为pER8载多克隆位点通用引物pXhoⅠ-F和pSpeⅠ-R(引物序列见表1)，获得中间载体pER8-D3。并用Xho I单酶切pER8-D3质粒，获得线性化的pER8-D3备用。
以pET30b-DME质粒为模版，分别以D1-1F、D1-1R和D1-2F、D1-2R为引物(引物序列见表1)，扩增D1-1和D1-2片段，分别纯化后，按照无缝连接试剂盒的说明书的方法，与线性化的pER8-D3片段混合，进行重组反应。将全部重组混合物转化大肠杆菌感受态，在琼脂培养板经过抗性筛选，阳性克隆PCR验证后提取质粒，最终获得DME基因的化学诱导植物表达载体pER8-DME(参见附图1)。质粒测序结果表明，pER8-DME中DME1序列正确，***位点准确无误，载体构建成功。
表1 PCR反应引物
注：下划线分别为XhoⅠ和SpeⅠ的识别位点。
2、农杆菌介导的84K杨遗传转化
电击转化法将pER8-AtDME植物表达载体转入农杆菌GV3101中。取84K杨无菌苗叶片，采用叶盘法进行遗传转化:(1)用添加抗生素的液体LB培养基(50mg L-1Rif+50mg L- 1Spectinomycin)过夜培养阳性农杆菌GV3101至OD值达到0.6～0.8；(2)超净台内除去叶缘，主叶脉切口2-3个，放入转化菌液内，轻轻摇晃12-15分钟；(3)取出叶片，滤纸吸干后，转移到分化培养基(MS+0.5mg L-1 6-BA+0.05mg L-1NAA)上，25℃暗培养3～4天；(4)转移叶盘至含有200mg L-1Timentin的选择分化培养基上(MS+0.5mg L-1 6-BA+0.05mg L-1NAA+潮霉素3mg L-1)，诱导再生不定芽(参见附图2A)；(5)切取潮霉素抗性芽(1.0～1.5cm)，转移至生根选择培养基(1/2MS+0.05mg L-1IBA+0.02mg L-1NAA+潮霉素3mg L-1)中诱导生根，获得潮霉素抗性植株(参见附图2B)。(6)提取抗性植株叶片DNA，以抗性植株总DNA为模板，用HP及HD基因特异引物(引物序列见表2)进行PCR检测，获得的6株潮霉素抗性植株的DNA均可扩增出与预期目的条带大小相符的目的条带，说明诱导表达系统及目的基因已成功导入84K杨基因组(参见附图3和附图4)。
表2 PCR检测引物序列
3、离体叶片17-β-***处理及外源基因表达检测
将转基因84K杨及未转化野生型对照无菌苗叶片(第3～5片叶子)，切成1.0cm×1.0cm大小的叶盘，垂直主脉切2-3个伤口，平铺于添加100μmol·L-1 17-β***的不定芽分化培养基上，野生型对照处理0h、12h，转基因植株处理0h、3h、6h、12h、24h、48h、96h和144h。处理后随机各取5个叶盘，液氮冷冻后保存于-80度冰箱，用于RNA提取，并采用qRT-PCR检测转基因植株离体叶盘中外源基因AtDME在***诱导下的表达情况。结果显示，用100μmol·L-1的17-β-***处理后，野生型植株处理12h与处理前一样，都没有目的基因的表达；转基因植株未经诱导时没有表达目的基因，诱导3h时目的基因的表达量已基本达到最大值，之后增加趋势平缓，24h时开始下降(参见附图5)。说明***诱导启动子在杨树中能够立即响应17-β-***的诱导并受其严格控制，最适***处理时间是3h，效果能持续至12h，但其后随着时间的延长效果减弱。
4、17-β-***处理后叶片诱导植株再生
将17-β-***处理0h、3h、12h和24h的叶盘转入无17-β-***分化培养基中诱导分化生芽，再生出不定芽，当再生芽生长到2.0cm左右时，切下转入生根培养基中诱导生根，获得***处理后的再生植株分别为40株、15株、16株和18株。
5、再生植株的温室移栽
从转AtDME基因84K杨离体叶片***诱导处理3h、12h、24h后再生植株中，每个处理随机取3个株系，以未诱导的转基因(0h)、非转基因野生型为对照，每个株系4个重复，洗去小苗根部的残留培养基，放入0.5％多菌灵水溶液中浸泡10分钟，移栽到用1.0％的多菌灵水溶液消毒24h后的扦插土壤中，塑料薄膜保湿，加盖单层遮阳网，放入全自动日光温室，5天后逐渐揭开薄膜，之后进行正常水肥及病虫害防治管理。
6、再生植株的表型变异测定
用不锈钢刻度尺测植株株高及叶片的长宽，用游标卡尺测植株地径，用手持式SPAD-502叶绿素仪测定功能叶片叶绿素含量，用Li-6400 XT便携式光合测定仪(LI-COR，USA)测定光合参数，用苏州科铭公司相应的试剂盒测定叶片可溶性糖含量、可溶性蛋白含量，用南京建成公司试剂盒测定POD活性，用北京Solarbio公司试剂盒测定SOD活性。
转AtDME基因植株离体叶片***诱导后的再生植株与非转基因对照及诱导0h的转AtDME基因植株相比，3个处理都有株系的叶长宽比、Gs、Ci、Tr以及可溶性蛋白含量极显著低于对照，相对叶绿素含量、WUE和保护酶活性显著高于对照；处理3、12h有株系的Pn极显著高于对照，处理3、24h均有株系的可溶性糖含量极显著高于对照，其他差异不显著。
表3转AtDME基因84K杨离体叶片***诱导后再生植株的生长性状
注：*在0.05水平上差异显著，**在0.01上差异极显著。
由上述描述可知，为进一步扩大我国杨树育种资源的丰富度，本发明采用转基因的方法，将拟南芥去甲基化重要基因(AtDME基因)转入84K杨(Populus alba×P.glandulosa‘84K’)基因组，获得转基因植株；通过诱导启动子调控外源基因的定时表达，不同程度改变转基因植株的甲基化水平，创制表型变异的转基因84K杨新种质。
序列表
<110> 中国林业科学研究院林业研究所
<120> 一种利用DNA去甲基化酶基因创造表型变异转基因植物的方法
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccgctcgaga tgaattcgag ggctgatccg 30
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctagactagt ttaggttttg ttgttcttca atttgct 37
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acgctgaagc tagtcgactc tagcctcgag atgaattcga gggctga 47
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttcgcttctt gctctcata 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggagatggtg cacttgttc 19
<210> 6
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttggccaaag aaatttttgg gatggactcg agctcgagca ctgggtatag c 51
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgctgaagct agtcgact 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aggcctggat cgactagt 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
taaatagctg cgccgatggt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggtttccact atcggcgagt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ctgtcgggcg tacacaaatc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gtgcatgtga tcccgctaag 20