病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料及其制备方法和应用 (Virus-like silicon dioxide-graphene composite material and preparation method and application thereof ) 是由 冯艳林 曹济民 宁鑫 王建霖 于 2021-07-16 设计创作，主要内容包括：病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料及其制备方法和应用,属于生物医用材料技术领域,解决伤口修复剂无法对应于程序化的伤口修复各个阶段的技术问题。解决方案为：S1、制备石墨烯分散液；S2、将EDC溶液与NHS溶液加入石墨烯分散液中,离心后超声分散制备一次沉淀物分散液；S3、一次沉淀物分散液中逐滴加入二氧化硅纳米粒子悬浊液,离心混合溶液后清洗并超声分散,制得病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料,其原料组成及其重量份数为：病毒状二氧化硅纳米粒子悬浊液68.5-81份,石墨烯溶液8.3-35份。本发明可以多阶段程序性地促进止血、炎症及增殖,在加速伤口愈合方面具有巨大优势,具有广泛的应用需求和现实意义。(A virus-like silicon dioxide-graphene composite material, a preparation method and application thereof belong to the technical field of biomedical materials, and solve the technical problem that a wound repair agent cannot correspond to each stage of programmed wound repair. The solution is as follows: s1, preparing a graphene dispersion liquid; s2, adding the EDC solution and the NHS solution into the graphene dispersion liquid, centrifuging, and performing ultrasonic dispersion to prepare a primary precipitate dispersion liquid; s3, dropwise adding a silicon dioxide nanoparticle suspension into the primary precipitate dispersion liquid, centrifugally mixing the solution, cleaning and ultrasonically dispersing to obtain the virus-like silicon dioxide-graphene composite material, wherein the virus-like silicon dioxide-graphene composite material comprises the following raw materials in parts by weight: 68.5-81 parts of virus-shaped silicon dioxide nano particle suspension and 8.3-35 parts of graphene solution. The invention can promote hemostasis, inflammation and proliferation in a multi-stage procedural way, has great advantages in the aspect of accelerating wound healing, and has wide application requirements and practical significance.)
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料及其制备方法和应用。
背景技术
日常生活中，皮肤损伤每天都在发生，比如烧伤、烫伤、机械损伤及糖尿病足、压疮等所导致的皮肤损伤。而皮肤受损时，身体就启动了一系列“愈合级联”机制以修复受伤组织，伤口的愈合过程是一个多阶段有序进行的生理过程，主要有四个阶段：止血期-炎症期-增殖期-重塑期，止血在组织损伤后就立即发生，在这个阶段，身体激活人体血液凝固系统，血管收缩，凝血级联止血；在第二阶段炎症期，也称为防御阶段，重点在于破坏细菌，避免感染，这一阶段中性粒细胞首先出现在伤口处，分泌炎性介质和趋化因子招募淋巴细胞和单核细胞，单核细胞分化成巨噬细胞，这些炎症细胞产生ROS和蛋白酶，保护伤口不受外源性细菌感染，这个过程大概需要2-3天，一旦伤口处细菌被清除，进入增殖阶段；在增殖期阶段，角质层细胞首先向损伤组织处迁移，然后在周围会形成新生血管，然后逐渐恢复上皮组织的功能，而且成纤维细胞和巨噬细胞在新生组织的形成过程中同样具有比较重要的作用，这个过程大概需要2-10天；在重塑阶段，胶原纤维逐渐增多，而胶原酶和基质金属蛋白酶可以降解胶原纤维等细胞外基质，使纤维结缔组织得以重建，这个过程持续的时间比较长大概会持续6-12个月。这四个阶段之间互相有重叠，彼此关联，并不是完全独立的，是一个整体。正是因为伤口愈合的精密性和复杂性，如果不是按照这个过程及时、有序地进行，或者受到自身或外界条件的干扰，那么就会延迟整个修复进程，甚至不能完成修复。所以，了解伤口愈合的调控机制可以为接下来设计材料用于治愈伤口提供理论依据。
目前，各种各样的纳米材料（如碳纳米管、石墨烯、银纳米粒子、金属氧化物等）被广泛应用于加速伤口愈合过程，但是，他们中的大多数只能促进某个阶段,并不能分层、逐步推进伤口愈合的多个阶段。因此，开发程序化的纳米系统分别对应于伤口修复的各个阶段来加速伤口愈合是目前伤口修复剂亟待解决的技术问题。
发明内容
为了克服现有技术的不足，解决伤口修复剂无法对应于程序化的伤口修复各个阶段的技术问题，本发明提供病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料及其制备方法和应用。
对于伤口止血阶段，粘连和封闭创面是首要任务，近来研究发现，纳米粒子可以快速封闭创面，促进止血，各种纳米材料已经被应用，其原理在于将合适的纳米粒子悬浊液滴入创面起到纳米桥连效应，确保伤口组织的粘连。
本发明的设计构思为：一方面，具有明显粗糙表面的病毒状纳米粒子已经得到研究者们的普遍关注，另一方面，表面具有尖刺的病毒状纳米粒子在形态上仿制了生物学中病毒、花粉颗粒等具有尖刺状颗粒的几何形态。考虑到表面粗糙的纳米粒子有利于粘附生物膜，那么我们猜想，也有可能作为粘连剂可以有效的促进伤口闭合。而且，病毒状纳米材料可以很好地抓捕细菌，增强材料与细菌的相互作用。
受到以上启发，病毒状纳米材料可以很好地止血并且捕获细菌。石墨烯是目前研究最多的一类抗菌抗病毒材料，但是，石墨烯只能促进伤口修复的炎症和增殖阶段。因此，将病毒状纳米材料与石墨烯结合起来，利用病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料来多阶段程序性加速伤口愈合，可以多阶段程序性地促进止血、炎症及增殖，在加速伤口愈合方面具有巨大优势，具有广泛的应用需求和现实意义。
本发明通过以下技术方案予以实现。
病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料，其中：所述复合材料的原料组成及其重量份数为：病毒状二氧化硅纳米粒子悬浊液68.5-81份，石墨烯溶液8.3-35份，首先将病毒状二氧化硅氨基化，然后利用石墨烯上的羧基官能团使病毒状二氧化硅连接到石墨烯上。。
病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料的制备方法，包括以下步骤：
S1、称取10-50mg石墨烯粉末加入超纯水中，超声分散制得石墨烯分散液；
S2、称取1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶液10-50mg以及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶液40-80mg，共同加入步骤S1制备的石墨烯分散液中，室温下避光搅拌，制得混合溶液；离心混合溶液获得一次沉淀物，采用超纯水重复清洗一次沉淀物至少3次，然后将一次沉淀物超声分散到20mL的超纯水中，制得一次沉淀物分散液；
S3、首先，称取20-60mg的病毒状二氧化硅，加入20mL的超纯水，超声混匀得到病毒状二氧化硅纳米粒子悬浊液，逐滴加入到步骤S2制得的一次沉淀物分散液中，室温搅拌24小时；然后，离心混合溶液获得二次沉淀物，采用超纯水重复清洗二次沉淀物至少3次；最后，将二次沉淀物烘干，制得病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料。制得的病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料可以应用在多阶段程序性伤口愈合修复剂中。
进一步地，所述步骤S1中石墨烯粉末通过以下步骤制得：
S1-1、称取1g石墨粉、0.5g硝酸钠加入圆底烧瓶中，然后加入25mL浓硫酸，搅拌使其混合均匀；
S1-2、将步骤S1-1配制的反应混合液置于冰浴中，称取3g高锰酸钾缓慢加入反应混合液中；
S1-3、将圆底烧瓶移至油浴，温度设定为35℃，搅拌2小时；
S1-4、加入46mL超纯水，将温度控制在98℃，搅拌15分钟；
S1-5、加入140mL浓度为15%的双氧水溶液，待温度降到室温后离心取沉淀物，并用浓度为10%的盐酸溶液清洗，重复5次后将沉淀物分散在超纯水中，冷冻干燥获得石墨烯粉末。
进一步地，所述步骤S3中二氧化硅纳米粒子悬浊液通过下述步骤制得：
S3-1、称取0.8g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）加入圆底烧瓶，然后加入50mL超纯水，搅拌使其混合均匀，再加入500µL浓度为0.2mol/L的氢氧化钠（NaOH）溶液；
S3-2、将圆底烧瓶移至油浴，温度设定为60℃，搅拌2小时形成胶束；
S3-3、缓慢加入提前配好的正硅酸乙酯（TEOS）和环己烷混合液，正硅酸乙酯与环己烷的体积比为1:4，将温度控制在60℃，搅拌48小时；
S3-4、待温度降到室温后离心取沉淀物，采用超纯水重复清洗沉淀至少3次，真空干燥获得病毒状二氧化硅纳米粒子悬浊液。
与现有技术相比本发明的有益效果为：
本发明提供的病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料利用其病毒结构进行抓捕细菌以进行止血，以石墨烯进行杀菌及促进增殖，从而促进伤口愈合的各个阶段，达到多阶段程序性加速伤口愈合的目的。
附图说明
图1为病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料的扫描电子显微镜图；
图2为病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料的透射电子显微镜图；
图3为病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料对皮肤的粘附性能曲线图；
图4为病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料抑制大肠杆菌生长作用的细菌生长曲线图；
图5为图4中病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料抑制大肠杆菌生长作用的涂布平板实验图；
图6为病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料抑制金黄色葡萄球菌生长作用的细菌生长曲线图；
图7为图6中病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料抑制金黄色葡萄球菌生长作用的涂布平板实验图；
图8为病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料与磷酸盐缓冲液（PBS）关于细胞增殖和迁移实验对比图；
图9为小鼠伤口愈合实验过程图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件。
实施例1
病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料，其中：所述复合材料的原料组成及其重量份数为：病毒状二氧化硅纳米粒子悬浊液70份，石墨烯溶液30份。
病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料的制备方法，包括以下步骤：
S1、称取30mg石墨烯粉末加入超纯水中，超声分散制得石墨烯分散液；所述石墨烯粉末通过以下步骤制得：
S1-1、称取1g石墨粉、0.5g硝酸钠加入圆底烧瓶中，然后加入25mL浓硫酸，搅拌使其混合均匀；
S1-2、将步骤S1-1配制的反应混合液置于冰浴中，称取3g高锰酸钾缓慢加入反应混合液中；
S1-3、将圆底烧瓶移至油浴，温度设定为35℃，搅拌2小时；
S1-4、加入46mL超纯水，将温度控制在98℃，搅拌15分钟；
S1-5、加入140mL浓度为15%的双氧水溶液，待温度降到室温后离心取沉淀物，并用浓度为10%的盐酸溶液清洗，重复5次后将沉淀物分散在超纯水中，冷冻干燥获得石墨烯粉末；
S2、称取EDC30mg以及NHS溶液50mg，共同加入步骤S1制备的石墨烯分散液中，室温下避光搅拌，制得混合溶液；离心混合溶液获得一次沉淀物，采用超纯水重复清洗一次沉淀物3次，然后将一次沉淀物超声分散到一定体积的超纯水中，制得一次沉淀物分散液；
S3、首先，称取70mg的病毒状二氧化硅，加入20mL的超纯水，超声混匀得到病毒状二氧化硅纳米粒子悬浊液，逐滴加入到步骤S2制得的一次沉淀物分散液中，室温搅拌24小时；
所述二氧化硅纳米粒子悬浊液通过下述步骤制得：
S3-1、称取0.8gCTAB加入圆底烧瓶，然后加入50mL超纯水，搅拌使其混合均匀，再加入500µL浓度为0.2mol/L的NaOH溶液；
S3-2、将圆底烧瓶移至油浴，温度设定为60℃，搅拌2小时形成胶束；
S3-3、缓慢加入提前配好的4mLTEOS+16mL环己烷混合液，将温度控制在60℃，搅拌48小时；
S3-4、待温度降到室温后离心取沉淀物，采用超纯水重复清洗沉淀3次，真空干燥获得病毒状二氧化硅纳米粒子悬浊液；
然后，离心混合溶液获得二次沉淀物，采用超纯水重复清洗二次沉淀物3次；最后，将二次沉淀物烘干，制得病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料，如图1和图2所示。制得的病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料可以应用在多阶段程序性伤口愈合修复剂中。
使用制得的病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料进行皮肤粘附试验，包括以下步骤：
一、病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料的纳米桥连效应来促进止血期：纳米桥连效应将主要通过测量病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料对皮肤组织的粘附能力来衡量；
1）、从小鼠身上获得约长30mm×宽15mm的两块皮肤；
2）、在小鼠的两块皮肤之间滴加病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料；
3）、将两块皮肤贴到一起，手指按压30秒；
4）、在岛津ASG-X试验机上以1毫米/分钟的恒定速率进行拉伸实验，拉伸结果如图3所示。
二、病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料的抗菌性质来促进止炎症期：
1、细菌培养
1）液体细菌培养液的配制：称取10g胰蛋白胨、5g酵母粉、5g氯化钠加入到1L超纯水中，用5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至7.2，放入高压灭菌锅中灭菌，取出备用；
2）固体细菌培养液的配制：称取10g胰蛋白胨、5g酵母粉、5g氯化钠、20g琼脂加入到1L超纯水中，用5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至7.2，放入高压灭菌锅中灭菌，60℃取出倒入培养品中，冷却后备用；
3）取灭菌后的培养基加入抗生素，终浓度为20µg/mL，取冻存的细菌菌种15µL加入到20mL培养液中，37℃摇床培养过夜，转数为150rpm；
2、称取5mg病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料加入到1mL细菌培养液中，配制成5mg/mL的溶液；
3、取生长好的细菌溶液稀释不同倍数测其600nm处的吸收值，调节吸收值=0.1后，待用；
4、病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料抗菌检测：取144µL配制好的5mg/mL的病毒状二氧化硅-石墨烯细菌培养液加入156µL细菌培养液配制成2.4mg/mL的溶液，分别将其对倍稀释得到浓度为1.2 mg/mL、0.6 mg/mL、0.3 mg/mL、0.15 mg/mL的溶液，各取50µL加入到96孔板，其中每孔重复三次，然后每孔分别加入100µL吸收值=0.1的细菌溶液，20分钟后移入细菌培养摇床，37℃、150rpm培养，每隔1小时检测细菌生长600nm处的吸收值，并绘制生长曲线，如图4至图7所示。
上述第4步用涂布平板法对病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料进行抗菌检测，具体步骤如下：
取160µL配制好的5mg/mL的病毒状二氧化硅-石墨烯细菌培养液，加入到840µL吸收值=0.1的细菌溶液中；取840µL吸收值=0.1的细菌溶液加160µL细菌培养液作为对比；将上述加和不加病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料的细菌培养液放入细菌培养摇床，37℃、150rpm培养30分钟；将上述加和不加病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料的细菌培养液分别稀释10000倍，取30µL加入到固体培养基中，涂布均匀后放入37℃培养24小时，拍照。
三、病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料促进细胞粘附和增殖，减少疤痕来促进增殖期和重塑期
石墨烯由于对血管内皮细胞和皮肤成纤维细胞有一定的促进增殖及较强的迁移促进作用，因此，为模拟伤口部位的微环境，采用Transwell系统，上腔种植巨噬细胞Raw264.7，下腔内植入成纤维细胞3T3，进行划痕。在上腔中加入病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料，使细胞因子释放在下腔3T3细胞上作用。观察步骤4、病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料对于小鼠伤口愈合的评价。
选择雌性BALB/c小鼠为动物模型。如图9所示，将小鼠麻醉后在其背部切割1.5cm长的伤口，滴加病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料，手指捏压使其充分粘附。每天测量伤口尺寸，绘制伤口愈合曲线。14天后，处死小鼠，取伤口组织经苏木精-伊红染色后研究伤口的病理变化。同时，通过羟脯氨酸法评估伤口处肉芽组织的生长情况。
实施例2
病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料，其中：所述复合材料的原料组成及其重量份数为：病毒状二氧化硅纳米粒子悬浊液75份，石墨烯溶液25份。
病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料的制备方法，包括以下步骤：
S1、称取25mg石墨烯粉末加入超纯水中，超声分散制得石墨烯分散液；所述石墨烯粉末通过以下步骤制得：
S1-1、称取1g石墨粉、0.5g硝酸钠加入圆底烧瓶中，然后加入25mL浓硫酸，搅拌使其混合均匀；
S1-2、将步骤S1-1配制的反应混合液置于冰浴中，称取3g高锰酸钾缓慢加入反应混合液中；
S1-3、将圆底烧瓶移至油浴，温度设定为35℃，搅拌2小时；
S1-4、加入46mL超纯水，将温度控制在98℃，搅拌15分钟；
S1-5、加入140mL浓度为15%的双氧水溶液，待温度降到室温后离心取沉淀物，并用浓度为10%的盐酸溶液清洗，重复5次后将沉淀物分散在超纯水中，冷冻干燥获得石墨烯粉末；
S2、称取EDC30mg以及NHS溶液50mg，共同加入步骤S1制备的石墨烯分散液中，室温下避光搅拌，制得混合溶液；离心混合溶液获得一次沉淀物，采用超纯水重复清洗一次沉淀物4次，然后将一次沉淀物超声分散到一定体积的超纯水中，制得一次沉淀物分散液；
S3、首先，称取75mg的病毒状二氧化硅，加入20mL的超纯水，超声混匀得到病毒状二氧化硅纳米粒子悬浊液，逐滴加入到步骤S2制得的一次沉淀物分散液中，室温搅拌24小时；
所述二氧化硅纳米粒子悬浊液通过下述步骤制得：
S3-1、称取0.8gCTAB加入圆底烧瓶，然后加入50mL超纯水，搅拌使其混合均匀，再加入500µL浓度为0.2mol/L的NaOH溶液；
S3-2、将圆底烧瓶移至油浴，温度设定为60℃，搅拌2小时形成胶束；
S3-3、缓慢加入提前配好的5mLTEOS+20mL环己烷混合液，将温度控制在60℃，搅拌48小时；
S3-4、待温度降到室温后离心取沉淀物，采用超纯水重复清洗沉淀4次，真空干燥获得病毒状二氧化硅纳米粒子悬浊液；
然后，离心混合溶液获得二次沉淀物，采用超纯水重复清洗二次沉淀物4次；最后，将二次沉淀物烘干，制得病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料。制得的病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料可以应用在多阶段程序性伤口愈合修复剂中。
实施例3
病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料，其中：所述复合材料的原料组成及其重量份数为：病毒状二氧化硅纳米粒子悬浊液80份，石墨烯溶液20份。
病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料的制备方法，包括以下步骤：
S1、称取20mg石墨烯粉末加入超纯水中，超声分散制得石墨烯分散液；所述石墨烯粉末通过以下步骤制得：
S1-1、称取1g石墨粉、0.5g硝酸钠加入圆底烧瓶中，然后加入25mL浓硫酸，搅拌使其混合均匀；
S1-2、将步骤S1-1配制的反应混合液置于冰浴中，称取3g高锰酸钾缓慢加入反应混合液中；
S1-3、将圆底烧瓶移至油浴，温度设定为35℃，搅拌2小时；
S1-4、加入46mL超纯水，将温度控制在98℃，搅拌15分钟；
S1-5、加入140mL浓度为15%的双氧水溶液，待温度降到室温后离心取沉淀物，并用浓度为10%的盐酸溶液清洗，重复5次后将沉淀物分散在超纯水中，冷冻干燥获得石墨烯粉末；
S2、称取EDC30mg以及NHS溶液50mg，共同加入步骤S1制备的石墨烯分散液中，室温下避光搅拌，制得混合溶液；离心混合溶液获得一次沉淀物，采用超纯水重复清洗一次沉淀物5次，然后将一次沉淀物超声分散到一定体积的超纯水中，制得一次沉淀物分散液；
S3、首先，称取80mg的病毒状二氧化硅，加入20mL的超纯水，超声混匀得到病毒状二氧化硅纳米粒子悬浊液，逐滴加入到步骤S2制得的一次沉淀物分散液中，室温搅拌24小时；
所述二氧化硅纳米粒子悬浊液通过下述步骤制得：
S3-1、称取0.8gCTAB加入圆底烧瓶，然后加入50mL超纯水，搅拌使其混合均匀，再加入500µL浓度为0.2mol/L的NaOH溶液；
S3-2、将圆底烧瓶移至油浴，温度设定为60℃，搅拌2小时形成胶束；
S3-3、缓慢加入提前配好的6mLTEOS+24mL环己烷混合液，将温度控制在60℃，搅拌48小时；
S3-4、待温度降到室温后离心取沉淀物，采用超纯水重复清洗沉淀5次，真空干燥获得病毒状二氧化硅纳米粒子悬浊液；
然后，离心混合溶液获得二次沉淀物，采用超纯水重复清洗二次沉淀物5次；最后，将二次沉淀物烘干，制得病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料。制得的病毒状二氧化硅-石墨烯复合材料可以应用在多阶段程序性伤口愈合修复剂中。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
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