一种抑制肿瘤转移的氨基富勒烯材料
阅读说明：本技术 一种抑制肿瘤转移的氨基富勒烯材料 (Amino fullerene material for inhibiting tumor metastasis ) 是由 王春儒 霍佳伟 李�杰 姜俐赜 白春礼 于 2020-12-01 设计创作，主要内容包括：本公开涉及氨基富勒烯衍生物在制备具有抑制肿瘤转移作用的药物中的应用,本公开氨基富勒烯衍生物可特异性结合MYH9,可以用于制备靶向MYH9的药物。本公开的氨基富勒烯衍生物还具有氨基化修饰个数可调控、且材料制备稳定可控的优点,能够调节肿瘤细胞上皮间质转化过程,具有高效抑制肿瘤细胞运动迁移能力。(The disclosure relates to an application of an amino fullerene derivative in preparation of a drug with a tumor metastasis inhibition effect, and the amino fullerene derivative disclosed by the disclosure can be specifically combined with MYH9, and can be used for preparing a drug targeting MYH 9. The amino fullerene derivative disclosed by the invention also has the advantages of adjustable amination modification number and stable and controllable material preparation, can adjust the epithelial-mesenchymal transition process of tumor cells, and has the capability of efficiently inhibiting the movement and migration of the tumor cells.)
技术领域
本公开涉及生物医药领域，特别涉及一种具有抑制肿瘤转移能力的氨基富勒烯材料。
背景技术
原发肿瘤和肿瘤转移通常同时发生。尽管原发肿瘤可以通过手术成功切除，但很难完全消除转移性病变。肿瘤转移是癌症致死的重要原因之一，肿瘤转移及其相关并发症导致了90％以上的癌症死亡率。因此，有效的癌症治疗不仅取决于破坏原发性肿瘤，而且更重要的是取决于攻击和预防肿瘤的转移。上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)是上皮细胞上皮样特征减少并获得间充质细胞特性的生理过程。EMT是肿瘤细胞侵袭转移所必要的初始步骤，EMT过程中上皮细胞失去细胞极性和细胞黏附能力,并获得迁移和侵袭性。在肿瘤转移过程中,肿瘤细胞的运动迁移能力显著增强，并且EMT相关标志物出现显著变化，如E-钙黏蛋白(E-cadherin)功能的丧失,N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)及及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)表达水平的上调。因此，降低肿瘤细胞的运动迁移能力、阻断EMT过程，能够有效抑制肿瘤转移，降低癌症死亡率。
富勒烯(fullerene)是一系列由偶数个碳原子组成，有12个五元环，其余为六元环组成的类球形团簇分子，如C60、C70、C76、C78和C84等，其中C60和C70是产量最大且应用最为广泛的富勒烯材料。富勒烯具有独特的分子结构与理化性质，能够高效清除活性氧类，在抗氧化损伤、肿瘤诊断与治疗、神经退行性疾病与代谢类疾病防治等生物医学领域具有重要应用前景。
对富勒烯进行化学衍生化，能够显著提高其生物相容性，富勒烯衍生物的分子结构与理化性质是影响其生物活性的关键因素。羟基化富勒烯衍生物通过阻断肿瘤血管或抑制血管新生、增强免疫浸润、减低氧化应激等多重机制调控肿瘤微环境，直接抑制肿瘤生长，相比于传统化疗药物疗效和安全性具有突出优势。特殊结构的富勒烯衍生物能够通过诱导凋亡、自噬或阻断细胞周期等机制直接抑制肿瘤细胞。
目前羟基化富勒烯衍生物、羟基化金属富勒烯衍生物或纳米富勒烯颗粒都存在以下问题：1)现有检测技术难以检测确定修饰的羟基数量，目前只能通过X射线光电子能谱(XPS)半定量地检测羟基数量；2)至少需要修饰10个以上的羟基才能实现较好的水溶性。
氨基化修饰的富勒烯衍生物对生物膜结构具有很强的亲和性，容易被细胞摄取，具有显著抗病毒、抗菌活性，但是目前还没有氨基化富勒烯衍生物在肿瘤治疗领域的基础与应用研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制肿瘤转移的氨基化富勒烯材料，将富勒烯进行氨基化修饰，分别制备得到基于C60的具有固定氨基数量且分子结构明确的氨基富勒烯衍生物，以及基于C70的含有不同氨基数量的氨基富勒烯衍生物的混合物。这类氨基富勒烯衍生物物能够降低肿瘤细胞的运动迁移能力，同时抑制肿瘤细胞的上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程，从而抑制原发性肿瘤的转移和扩散。
具体地，本公开提供了：
一种式(I)的氨基富勒烯衍生物在制备具有抑制肿瘤转移作用的药物中的应用，
其中F为富勒烯，所述富勒烯选自含空心富勒烯、金属富勒烯、杂环富勒烯和内嵌富勒烯中的至少一种；
其中R为所述富勒烯的氨基修饰基团，R的一端通过含氮基团、苯基、巯基与所述富勒烯结合，R的另一端为任一含氮基团，所述含氮基团包括伯氨、叔胺、仲胺、季胺的任一种或几种；
优选地，R为-NR1-R’-NR2R3,其中R1，R2，R3可独立的或同时是氢，或任选的被取代的C1-C6烷基、环烷基、含杂原子的烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基，或R1和R2和/或R3一起形成环化的取代基；优选地，R2、R3同时为氢；
R’是任选的被取代的C1-C6烷基、环烷基、含杂原子的烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基，或R1和R’一起形成环化的取代基；其中当R1和R2和/或R3一起形成环化的取代基时，R’不存在；
其中m选自1-12的整数。
本公开一方面，如式(I)的氨基富勒烯衍生物，其中富勒烯为空心富勒烯、金属富勒烯、杂环富勒烯和内嵌富勒烯中的至少一种，优选地富勒烯选自C2n、[email protected]2n、[email protected]2n、[email protected]2n、M3[email protected]2n、M2C2@C2n、M2[email protected]2n、M2[email protected]2n和MxA3-x[email protected]2n中的任一种或其混合物，其中，M和A均为金属元素，所述M和A均选自Sc、Y和镧系金属元素中的任意一种；优选地，所述富勒烯选自含C2n的一种或多种富勒烯分子，其中2n为碳原子数，30≤n≤60；优选地，所述富勒烯选自C60、C70、C76、C78、C80、C84的一种或多种；更优选的，所述富勒烯选自C60、C70的一种或多种。
本公开一方面，如式(I)的氨基富勒烯衍生物，其中所述富勒烯的氨基修饰基团R选自(2-氨基乙基)氨基、(3-氨基丙基)氨基、(4-氨基丁基)氨基、(5-氨基戊基)氨基、(2-氨基苯基)氨基、(3-氨基苯基)氨基、(4-氨基苯基)氨基、(4-氨基)哌啶基、哌嗪基、4-氨基苯基、(4-氨基甲基)苯基、(4-氨基苯基)巯基、(4-氨基环己基)巯基、4-哌啶基巯基、(1-氨基乙基)巯基、(1-氨基丙基)巯基、(1-氨基丁基)巯基、(1-氨基戊基)巯基的一种或几种；其中m选自1-12的整数；优选3、4、5、6、10。
本公开的另一方面，如前所述的任一种氨基富勒烯衍生物在制备抑制肿瘤细胞运动和迁移能力的药物中的应用。
本公开的一方面，如前所述的任一种氨基富勒烯衍生物在制备抑制肿瘤细胞上皮间质转化过程的药物中的应用；优选地，所述抑制上皮间质转化过程包括抑制一种或多种调控因子；优选地，所述调控因子包括Vimentin、Snail、N-Caderin、E-Caderin；优选地，所述抑制上皮间质转化过程包括抑制一种或多种调控因子包括抑制Vimentin、Snail、N-Caderin、E-Caderin中一种或多种的基因表达，和/或抑制Vimentin、Snail、N-Caderin、E-Caderin中一种或多种的蛋白表达。
本公开的一方面，如前所述的任一种氨基富勒烯衍生物在制备靶向MYH9的药物中应用，优选地，所述氨基富勒烯衍生物可与MYH9的C末端结构域结合。
本公开的一方面，如前所述的任一种氨基富勒烯衍生物在制备MYH9抑制剂中应用，优选地，所述氨基富勒烯衍生物可与MYH9的C末端结构域结合。
本公开的另一方面，如前所述的任一种氨基富勒烯衍生物的任一项应用，所述肿瘤选自癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病的一种或多种；优选地，所述肿瘤选自肝癌、肺癌、结肠直肠癌、肾癌、胰腺癌、骨癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、食管癌、胃癌、口腔癌、鼻癌、喉癌、胆管癌、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、脑膜瘤、皮肤癌、黑色素瘤淋巴瘤、脑胶质瘤、白血病或肉瘤中的一种或多种；优选地，所述肿瘤为原发性肿瘤。
本公开的另一方面，如前所述的任一种氨基富勒烯衍生物的任一项应用，所述具有抑制肿瘤转移作用的药物包括所述氨基富勒烯衍生物的一种或多种，以及药学上可接受的载体，优选地，所述药物的制剂形式选自溶液剂、注射剂、颗粒剂、冻干粉剂、乳状剂、混悬剂、油剂、纳米制剂中的一种或多种，优选注射剂。
本公开的另一方面，如前所述的任一种氨基富勒烯衍生物的任一项应用，所述药物还可以包括另一种或多种抗肿瘤药物。
本公开的氨基富勒烯衍生物具有优异的水溶性，且相对于现有的纳米富勒烯、羟基富勒烯或金属富勒烯对肿瘤细胞转移的抑制作用，具有以下优点：氨基化修饰个数可调控，分子组成与结构易于表征检测(元素分析检测氮碳的质量百分比例，即可计算得到氨基数量；通过电喷雾质谱(ESI-MS)或基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)可检测分子量)，材料制备稳定可控，能够高效抑制肿瘤细胞运动迁移能力，分子生物学作用靶标明确等。
附图说明
图1示出了氨基富勒烯TAPC-3的分子结构(左)和高分辨质谱(右)；
图2示出了氨基富勒烯TAPC-4的分子结构(左)和高分辨质谱(右)；
图3示出了氨基富勒烯分子TAPC-3的液相色谱；
图4示出了氨基富勒烯分子TAPC-4的液相色谱；
图5示出了氨基富勒烯混合物C70-EDA的分子结构(左)和基质辅助激光解析-飞行时间质谱(右)；
图6示出了不同浓度TAPC-3和TAPC-4培养对A549、4T1细胞转移能力的抑制作用；
图7示出了不同浓度C70-EDA培养对A549、DU145、HCT116、DLD1细胞转移能力的抑制作用；
图8示出了PCR检测不同浓度TAPC-4培养对A549细胞转移过程相关因子的调控作用；
图9示出了Western blot检测不同浓度TAPC-4培养对A549细胞转移过程相关因子的调控作用；
图10示出了PCR检测不同浓度C70-EDA培养对HCT116、DLD1细胞转移过程相关因子的调控作用；
图11示出了Western blot检测不同浓度C70-EDA培养对HCT116、DLD1细胞转移过程相关因子的调控作用；
图12示出了基因工程手段鉴定C70-EDA与MYH9蛋白的结合位置；
图13示出了免疫荧光验证氨基富勒烯分子TAPC-4培养DU145细胞不同时间对MYH9蛋白亚定位的影响；
图14示出了免疫荧光验证氨基富勒烯混合物C70-EDA培养A549细胞不同时间对MYH9蛋白亚定位的影响；
图15示出了由C60富勒烯制备氨基富勒烯衍生物；
图16示出了由C60富勒烯经C60Cl6前体制备氨基富勒烯衍生物。
具体实施方式
根据本公开的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本公开上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
I.定义
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围内适合用于与人类和动物的组织接触而没有，与合理利益/风险比相称的，过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
术语“治疗”包括抑制、缓解、预防或消除与所治疗的疾病、病症或失调相关的一种或多种症状或副作用。
术语“减少”、“抑制”、“减轻”或“减小”的使用是相对于对照的。本领域技术人员将容易地确定用于每个实验的适当对照。例如，将用化合物处理的受试者或细胞中的降低了的反应与未用化合物处理的受试者或细胞中的反应进行比较。
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗、抑制或减轻被治疗的疾病状态的一种或多种症状或以其它方式提供期望的药理学和/或生理学作用的剂量。精确的剂量将根据多种因素而变化，如受试者依赖的变量(例如，年龄、免疫系统健康等)、疾病或病，以及所施用的治疗。有效量的效果可以相对于对照。这些对照在本领域中是已知的并且在本文中讨论，并且可以是例如在药物或药物组合施用之前或没有施用时的受试者的状况，或在药物组合的情况下，可以将组合效果与仅施用一种药物的效果进行比较。
术语“赋形剂”在本文中用于包括可以包含在微粒中或其上的不是治疗或生物活性化合物的任何其它化合物。因此，赋形剂应当是药学上或生物学上可接受的或相关的，例如赋形剂通常对受试者无毒性。“赋形剂”包括单一的这种化合物，并且还旨在包括多种化合物。
术语“药物组合物”意指包含氨基富勒烯衍生物以及依施用方式和剂型的性质而定的至少一种选自以下药学上可接受的成分的组合物，包括但不限于：载体、稀释剂、佐剂、赋形剂、防腐剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、矫味剂、香味剂、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂、分散剂、温敏材料、温度调节剂、黏附剂、稳定剂、助悬剂等。
如本文所用，术语“富勒烯”是一系列由偶数个碳原子组成，有12个五元环，其余为六元环组成的类球形团簇分子。富勒烯包括空心富勒烯、内嵌富勒烯，所述内嵌富勒烯为在富勒烯的碳笼结构内包入金属或金属原子簇。
术语“金属富勒烯”、“内嵌富勒烯”是指在富勒烯的碳笼结构内包入各种不同的金属或金属原子簇，形成一类具有特殊结构和性质的化合物，此类化合物通常被称为内嵌富勒烯，一般用[email protected]2n形式表示，其中M代表金属元素。
术语“氨基富勒烯衍生物”是指对富勒烯进行氨基化修饰，修饰后的富勒烯外部包括一个或多个相同或不同的含氨基的取代基团，上述修饰方法均可按照现有技术公开的方法进行修饰。
如本文所用，术语“肿瘤”系指或描述了哺乳动物尤其是人的生理状况，其典型特点是细胞无调控地生长。肿瘤的实例包括但不限于实体瘤、癌(carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。
术语“原发性肿瘤”是和继发性肿瘤相对而言的，原发肿瘤是指肿瘤，首先出现在某一个部位如肺、肝、肠、头部，或者是皮肤等，可以称之为原发性肺癌、原发性肝癌、原发性肠癌等。
术语“MYH9”是指肌球蛋白重链-9(myosin heavy chain 9)，最初是通过下拉测定和MS筛选鉴定的。MYH9是一种位于细胞质的蛋白质，负责细胞运动和上皮-间质转化调控。来自大规模临床样品的Omics数据显示MYH9在各种癌症中过表达，并与不良预后相关，表明其是潜在的抗肿瘤靶标。MYH9的C末端对于调节细胞运动至关重要：它包含ACD和cACD以控制细丝装配和特定的磷酸化位点(S1916，S1943)来介导细胞迁移。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本公开的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本公开上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本公开上述内容所实现的技术均属于本公开的范围。
II.具体实施方式
本公开的一个方面，涉及一种抑制肿瘤转移的氨基富勒烯衍生物。所述氨基富勒烯衍生物可由式(I)表示。
在一个实施例中，所述富勒烯选自含空心富勒烯、金属富勒烯、杂环富勒烯和内嵌富勒烯中的至少一种；
在一个实施例中，所述氨基富勒烯衍生物，其中富勒烯为空心富勒烯、金属富勒烯、杂环富勒烯和内嵌富勒烯中的至少一种，优选地富勒烯选自C2n、[email protected]2n、M2@C2n、[email protected]2n、M3[email protected]2n、M2C2@C2n、M2[email protected]2n、M2[email protected]2n和MxA3-x[email protected]2n中的任一种或其混合物，其中，M和A均为金属元素，所述M和A均选自Sc、Y和镧系金属元素中的任意一种；
在一个实施例中，所述富勒烯是一系列由偶数个碳原子组成，有12个五元环，其余为六元环组成的类球形团簇分子，可由C2n表示，其中2n为碳原子数，30≤n≤60；
在一个实施例中，所述富勒烯优选地包括C60、C70、C76、C78、C80和C84的一种或多种，更优选地包括C60和C70的一种或多种。
在一个实施例中，所述氨基富勒烯衍生物，包括由一个或多个相同或不同的氨基修饰基团R的氨基衍生物组成的混合物。
在一个实施例中，如式(I)的氨基富勒烯衍生物，其中所述富勒烯的氨基修饰基团R可通过含氮基团、苯基、巯基的任一种或几种与所述富勒烯结合；R的另一端为任一含氮基团，所述含氮基团包括伯氨、叔胺、仲胺、季胺的任一种或几种；其中m选自1-12的整数。
在一个实施例中，如式(I)的氨基富勒烯衍生物，其中所述富勒烯的氨基修饰基团R可由-NR1-R’-NR2R3表示，其中R1，R2，R3可独立的或同时是氢，或取代或未取代的C1-C6烷基、C3-C6环烷基、含杂原子的C1-C6烷基、C3-C6杂环烷基、芳基、杂芳基，或R1和R2和/或R3一起形成环化的取代基，其中当R1和R2和/或R3一起形成环化的取代基时，R’不存在；优选地，R2、R3同时为氢；R’是取代或未取代的C1-C6烷基、C3-C6环烷基、含杂原子的C1-C6烷基、C3-C6杂环烷基、芳基、杂芳基，或R1和R’一起形成环化的取代基；其中m选自1-12的整数。
在一个实施例中，如式(I)的氨基富勒烯衍生物，其中所述富勒烯的氨基修饰基团R选自(2-氨基乙基)氨基(-NHCH2CH2NH2)、(3-氨基丙基)氨基(-NH CH2CH2CH2NH2)、(4-氨基丁基)氨基(-NHCH2CH2CH2CH2NH2)、(5-氨基戊基)氨基(-NHCH2CH2CH2CH2NH2)、(2-氨基苯基)氨基(3-氨基苯基)氨基(4-氨基苯基)氨基(4-氨基)哌啶基、哌嗪基、4-氨基苯基(4-氨基甲基)苯基中的一种或几种；其中m选自1-12的整数；
更优选的，R选自(2-氨基乙基)氨基(EDA)、(4-氨基)哌啶基(TAPC)；
优选地，其中m选自3、4、5、6、10。
在一个实施例中，所述氨基富勒烯衍生物为TAPC三加成(TAPC-3)和/或四加成(TAPC-4)的C60，或其混合物；
在本公开的一个具体实施例中，所述氨基富勒烯衍生物结构为：
在一个实施例中，所述氨基富勒烯衍生物为EDA修饰的C70，或由不同数量EDA修饰的C70中的一种或多种组成的混合物；
在本公开的一个具体实施例中，所述氨基富勒烯衍生物结构为：
在一个实施例中，如式(I)的氨基富勒烯衍生物，其中所述富勒烯的氨基修饰基团R选自(4-氨基苯基)巯基、(4-氨基环己基)巯基、4-哌啶基巯基、(1-氨基乙基)巯基、(1-氨基丙基)巯基、(1-氨基丁基)巯基、(1-氨基戊基)巯基的一种或几种；其中m选自1-12的整数，优选3、4、5、6、10。
需要说明的是，形成氨基富勒烯衍生物的具体方法不受特别限制，本领域技术人员可以根据富勒烯的具体组成以及药物的具体要求，选择适当的方法合成氨基富勒烯衍生物。例如，根据本发明的实施例，可以通过亲核加成反应，将非取代的上述富勒烯进行氨基化修饰。例如，根据本发明的具体实施例，可根据不同氨基修饰基团反应物，在适当的条件下反应，得到固定数量或不同数量氨基修饰的富勒烯衍生物；例如，根据本发明的具体实施例，在不同反应温度下，得到加成了不同数量的EDA的氨基衍生物及其混合物。
本公开另一方面，涉及前述任一种氨基富勒烯衍生物的在制备抑制肿瘤细胞转移的药物中的应用。
在一个实施例中，所述氨基富勒烯衍生物能够降低肿瘤细胞的运动迁移能力。
在一个实施例中，所述氨基富勒烯衍生物能够抑制肿瘤细胞的上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程，从而抑制肿瘤的转移和扩散。
在一个实施例中，所述氨基富勒烯衍生物能抑制肿瘤细胞上皮间质转化过程相关的一种或多种调控因子，从而抑制肿瘤的转移和扩散。其中优选的一种或多种调控因子包括Vimentin、Snail、N-Caderin、E-Caderin。
在一个实施例中，所述氨基富勒烯衍生物能抑制肿瘤细胞上皮间质转化过程，包括抑制一种或多种调控因子包括抑制Vimentin、Snail、N-Caderin、E-Caderin中一种或多种的基因表达，和/或抑制Vimentin、Snail、N-Caderin、E-Caderin中一种或多种的蛋白表达。
在一个实施例中，所述氨基富勒烯衍生物可特异性结合MYH9的C末端附近的尾部结构域，触发细胞质MYH9向细胞边缘的转移，抑制癌细胞迁移和EMT过程。
在一个实施例中，所述氨基富勒烯衍生物可以用于制备MYH9抑制剂。
在一个实施例中，所述氨基富勒烯衍生物可以用于制备靶向MYH9的药物。
在一个实施例中，前述任一种氨基富勒烯衍生物的应用，其中所述肿瘤包括肝癌、肺癌、结肠直肠癌、肾癌、胰腺癌、骨癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、食管癌、胃癌、口腔癌、鼻癌、喉癌、胆管癌、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、脑膜瘤、皮肤癌、黑色素瘤、肉瘤、淋巴瘤、脑胶质瘤或白血病中的一种或多种肿瘤细胞的转移；优选地，所述肿瘤为原发性肿瘤。。
在本公开的一个具体实施例中，所述氨基富勒烯衍生物能够抑制非小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌以及结直肠癌的肿瘤细胞迁移能力；优选地，所述氨基富勒烯衍生物为TAPC修饰的富勒烯C60，EDA修饰的富勒烯C70。
在本公开的一个具体实施例中，所述氨基富勒烯衍生物能够抑制非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤细胞EMT相关的调控因子；优选地，所述氨基富勒烯衍生物为TAPC修饰的富勒烯C60，EDA修饰的富勒烯C70。
本公开的另一个方面，涉及抑制肿瘤转移的药物，所述药物包括所述氨基富勒烯衍生物，以及药学上可接受的载体。
在一个实施例中，所述药物组合物的制剂形式包括但不限于溶液剂、注射剂、颗粒剂、冻干粉剂、乳状剂、混悬剂、油剂、纳米制剂中的一种或多种，优选注射剂。
在一个具体的实施例中，所述氨基富勒烯衍生物的应用方式选自口服、注射中的一种或多种，所述注射选自静脉注射、肌肉注射、腹腔注射等。
在一个实施例中，所述药物还包括另一种或多种抗肿瘤药物。
本公开还涉及所述氨基富勒烯衍生物的制备方法。
本公开还涉及所述氨基富勒烯衍生物在制备抗肿瘤的药物中的应用，所述药物还可以包括另一种或多种抗肿瘤药物。
III.实施例
下面参照实施例进一步阐释本发明。对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据本申请说明书的教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：制备氨基富勒烯分子
合成方法：5g C60溶于625mL氯苯中，加入13g 4-(叔丁氧羰基氨基)哌啶和5mL过氧化氢异丙苯(80％),室温搅拌(600rpm)48h，取反应液稀释10倍后进行HPLC检测，反应完全，停止反应，反应液依次用300mL饱和氯化铵溶液和300mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，60℃浓缩蒸干，得红棕色固体。
将反应产物用甲苯溶解后，进行柱层析分离，洗脱剂为乙酸乙酯/甲苯10％、12％、15％、20％。分离得到叔丁氧羰基保护的三加成和四加成的氨基富勒烯样品。
1g分离后的氨基富勒烯样品中加入375mL TFA/CHCl3(10％)，室温搅拌2h，浓缩蒸干蒸干，得红色固体(98.5％)，固体溶于水后进行透析，冻干后得脱保护的红色固体。将脱保护后的样品溶于水后，反复过离子交换柱3次，最后用水将柱子中残留的样品洗脱下来，样品水溶液经过孔径0.22μm滤膜过滤后进行透析，冻干，得到TAPC三加成(TAPC-3)和四加成(TAPC-4)产物。
结构表征：利用电喷雾质谱(ESI-MS，正离子模式)检测TAPC-3和TAPC-4的分子量(图1-2)；使用高效液相色谱(HPLC，LC-2030，岛津)，C18色谱柱(4.6*250mm，安捷伦)，水-乙腈作为流动相，紫外检测器(检测波长：310nm)，流量为1mL/min，对TAPC-3和TAPC-4的纯度进行检测(图3-4)。
结论：ESI-MS检测的分子量与TAPC-3和TAPC-4的理论分子量完全一致，HPLC检测两者的纯度均在95％以上，能够用于进一步的生物试验。
实施例2：制备氨基富勒烯混合物C70-EDA
合成方法：氨类分子能够通过其氨基与富勒烯碳笼进行亲核加成反应，该反应是吸热过程，反应温度是影响反应产物的关键性因数。将100mL C70的邻二甲苯溶液(2mg/mL)滴加到EDA(100mL)中，在N2保护下于不同温度(包括50℃，100℃和130℃)下搅拌。直到溶液变成红棕色，并通过旋转蒸发除去过量的EDA和溶剂。然后将粗产物在室温和氮气下继续与EDA(100mL)反应12小时；除去EDA，并将终产物用盐酸(1mM)溶解，并通过用超纯水透析两天而纯化。将多种EDA改性的C70盐酸盐(缩写为C70-EDA)冷冻干燥成粉末。通过元素分析来表征C70-EDA，以确定经修饰的EDA部分的数目，主要取决于反应温度。
结构表征：通过基质辅助激光解析-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS，正离子模式，α-氰基肉桂酸作为)检测50℃下合成C70-EDA的分子量分布(图5)；使用元素分析测试C70-EDA中C、H、N元素的质量含量，进而根据N与C的比例计算得到平均每个C70修饰的氨基数量。
表1示出了不同温度条件合成的氨基富勒烯混合物C70-EDA的组成元素分析：
结论：根据元素分析结果，计算出反应温度为50℃、100℃和130℃时，C70反应加成的乙二胺分子的数量分别为10.2、7.0和4.4，反应温度越低加成数量越多。MALDI-TOF-MS检测结果显示50℃下制备的C70-EDA是由加成了不同数量的乙二胺的氨基衍生物组成混合物，其中乙二胺的数量主要分布在6到11区间。
实施例3：其他氨基富勒烯衍生物的制备
1.由C60富勒烯制备氨基富勒烯衍生物
5g C60溶于氯苯中，加入10倍于C60摩尔量的叔丁氧羰基保护的胺类(加入5mL过氧化氢异丙苯(80％))、苯胺类或溴代苯胺类，室温搅拌48h，取反应液稀释10倍后进行HPLC检测，反应完全后，反应液依次用饱和氯化铵溶液和饱和碳酸氢钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，60℃浓缩蒸干，得到反应产物。
将反应产物用甲苯溶解后，进行柱层析分离，洗脱剂为不同比例的乙酸乙酯/甲苯溶液。分离得到叔丁氧羰基保护的不同加成数的氨基富勒烯。之后加入TFA/CHCl3(10％)溶液，室温搅拌2h脱除叔丁氧羰基，浓缩蒸干，固体溶于水后进行透析，冻干，得到不同类型的氨基富勒烯(图15)。
2.由C60富勒烯经C60Cl6前体制备氨基富勒烯衍生物
由C60制备C60Cl6前体：将1g的C60溶于100mL氯苯中，滴加入4g的氯化碘，室温下搅拌1h后，将产物经溶剂过滤器(尼龙滤膜，0.22μm)过滤后，加入500mL的乙醇沉淀，过滤收集沉淀，使用乙醇洗涤3次，60℃下真空干燥24h，制备得到红色固体产物C60Cl6；
氨基富勒烯衍生物制备：将1g的C60Cl6溶于500mL甲苯中，滴入7倍于C60Cl6摩尔量的叔丁氧羰基保护的胺类、巯基胺类的甲苯冰醋酸溶液(甲苯与冰醋酸的体积比为100:1)，再加入3.84g Na2CO3，室温搅拌20h。过滤收集滤液，分别用Na2CO3溶液和水洗涤，在40℃下旋转蒸发干燥，得到深棕红色固体粗产物；使用甲苯溶解后，进行硅胶柱层析分离，洗脱剂为乙酸乙酯/甲苯(v/v)25％、50％，分离得到不同加成数的产物。将分离后产物溶于氯仿中，加入10％的三氟乙酸，室温搅拌反应10h，旋转蒸发干燥除去氯仿和三氟乙酸，得到不同加成数的氨基富勒烯衍生物(图16)。
实施例4：氨基富勒烯分子抑制肿瘤细胞的迁移能力
细胞：A549(非小细胞肺癌细胞系)、4T1(乳腺癌细胞系)。
分组：空白对照组为超纯水，实验组分别是浓度为5μM和10μM的TAPC-3或TAPC-4的水溶液。
Transwell小室测量细胞迁移能力的方法：使用膜孔径为0.4μm的Transwell小室(Costar#3413)；4T1细胞使用含10％胎牛血清(Mediatech，35-081)的1640培养基(Mediatech，10-040)培养；A549细胞使用含10％胎牛血清(Mediatech，35-081)的DMEM培养基(Mediatech，10-013)培养。将细胞正常培养24小时后，使用不同剂量的待测样品处理细胞12小时，使用0.25％的胰酶(Mediatech，25-053)将细胞消化计数，悬浮在无血清的培养基中，然后添加到Transwell上腔室中，下腔室中加入含20％胎牛血清的培养基。在37℃培养箱中孵育6小时后，取出小室，使用结晶紫染色液(Beyotime，C0121)对小室聚碳酸酯膜上的细胞进行染色，使用光学显微镜拍照并统计细胞数目。
结论：相比于对照组，实验组中从上室向下室迁移从而拦截在聚碳酸酯膜上的细胞数目明显减少，说明TAPC-3和TAPC-4氨基富勒烯分子可以抑制A549，4T1细胞的转移(图6)。
实施例5：氨基富勒烯混合物抑制肿瘤细胞的迁移能力
细胞：A549、DU145(前列腺癌细胞系)、HCT116(结肠癌细胞系)、DLD1(结直肠癌细胞系)。
分组：空白对照组为超纯水，实验组分别是浓度为10μM和25μM的C70-EDA的水溶液。
Transwell小室测量细胞迁移能力的方法：使用膜孔径为0.4μm的Transwell小室(Costar#3413)；DU145细胞使用含10％胎牛血清(Mediatech，35-081)的1640培养基(Mediatech，10-040)培养；A549、HCT116、DLD1细胞使用含10％胎牛血清(Mediatech，35-081)的DMEM培养基(Mediatech，10-013)培养。将细胞正常培养24小时后，使用不同剂量的待测样品处理细胞12小时，使用0.25％的胰酶(Mediatech，25-053)将细胞消化计数，悬浮在无血清的培养基中，然后添加到Transwell上腔室中，下腔室中加入含20％胎牛血清的培养基。在37℃培养箱中孵育6小时后，取出小室，使用结晶紫染色液(Beyotime，C0121)对小室聚碳酸酯膜上的细胞进行染色，使用光学显微镜拍照并统计细胞数目。
结论：相比于对照组，实验组中从上室向下室迁移从而拦截在聚碳酸酯膜上的细胞数目明显减少，说明C70-EDA氨基富勒烯混合物可以抑制A549、DU145、HCT116、DLD1细胞的转移(图7)。
实施例6：氨基富勒烯分子TAPC抑制肿瘤细胞EMT相关调控因子
细胞：A549细胞系
分组：空白对照组为超纯水，实验组分别是浓度为5μM和10μM的TAPC-4的水溶液。
PCR检测EMT相关调控因子的转录水平：A549细胞使用含10％胎牛血清(Mediatech，35-081)的DMEM培养基(Mediatech，10-013)培养。A549细胞在六孔板中正常培养24小时后，使用不同剂量的待测样品处理细胞12小时，使用TRIzol S3(Invitrogen LifeTechnologies,15596-026)裂解液提取培养细胞的总RNA，之后使用1st Strand cDNASynthesis SuperMix(NovoScript,E044-01A)试剂盒，根据说明书将1μg总RNA转换为cDNA，再使用SYBR One-Step qRT-PCR Kit(NovoScript,E092-01A)试剂盒以20μL反应体积进行荧光定量，定量过程中使用的参比基因为GAPDH，目的基因为Vimentin、Snail、N-Caderin、E-Caderin。所使用的引物序列如下。
结论：实验组较对照组在参比基因表达量不变的前提下，Vimentin、Snail、N-Caderin基因表达量随浓度的增加而降低，E-Caderin基因表达量随浓度的增加而增加，对这些因子的调控情况说明了氨基富勒烯分子TAPC抑制肿瘤细胞EMT过程(图8)。
Western blot检测EMT相关调控因子的蛋白水平：A549细胞使用含10％胎牛血清(Mediatech，35-081)的DMEM培养基(Mediatech，10-013)培养。A549细胞在六孔板中正常培养24小时后，使用不同剂量的待测样品处理细胞12小时，将处理后的A549细胞在含有蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(Beyotime，P1048)的RIPA裂解缓冲液(Beyotime，P0013)中裂解。随后，将细胞裂解液在5x上样缓冲液(Beyotime，P0015)中煮沸5分钟，然后用SDS-聚丙烯酰胺凝胶(Genscript，M42012)溶解，然后转移至PVDF膜上。用anti-N-Caderin(Abcam，ab18203)，anti-Vimentin(Proteintech，10366-1)，anti-GAPDH(Cell signalingtechnology，5174)的抗体进行孵育，然后将膜与结合的第二抗体(Cell signalingtechnology，7074)一起孵育，所有抗体均已在封闭缓冲液中稀释，并通过增强的化学发光试剂盒(Absin，abs920)可视化抗原-抗体反应。
结论：实验组较对照组在参比蛋白GAPDH表达量不变的前提下，Vimentin、N-Caderin蛋白表达量随浓度的增加而降低，对这些因子的调控情况说明了氨基富勒烯分子TAPC抑制肿瘤细胞EMT过程(图9)。
实施例7：氨基富勒烯混合物C70-EDA抑制肿瘤细胞EMT相关调控因子
细胞：HCT116，DLD-1细胞
PCR检测EMT相关调控因子的转录水平：分组情况为——空白对照组为超纯水，实验组分别是浓度为10μM、20μM和40μM的C70-EDA水溶液。
HCT116，DLD-1细胞使用含10％胎牛血清(Mediatech，35-081)的DMEM培养基(Mediatech，10-013)培养。HCT116，DLD-1细胞在六孔板中正常培养24小时后，使用不同剂量的待测样品处理细胞12小时，使用TRIzol S3(Invitrogen Life Technologies,15596-026)裂解液提取培养细胞的总RNA，之后使用1st Strand cDNA Synthesis SuperMix(NovoScript,E044-01A)试剂盒，根据说明书将1μg总RNA转换为cDNA，再使用SYBR One-Step qRT-PCR Kit(NovoScript,E092-01A)试剂盒以20μL反应体积进行荧光定量，定量过程中使用的参比基因为GAPDH，目的基因为Vimentin、Snail、N-Caderin。所使用的引物序列如下。
结论：实验组较对照组在参比基因表达量不变的前提下，Vimentin、Snail、N-Caderin基因表达量随浓度的增加而降低，对这些因子的调控情况说明了氨基富勒烯混合物C70-EDA抑制肿瘤细胞EMT过程(图10)。
Western blot检测EMT相关调控因子的蛋白水平：分组情况为——空白对照组为超纯水，实验组分别是浓度为5μM、10μM和20μM的C70-EDA水溶液。
HCT116，DLD-1细胞使用含10％胎牛血清(Mediatech，35-081)的DMEM培养基(Mediatech，10-013)培养。HCT116，DLD-1细胞在六孔板中正常培养24小时后，使用不同剂量的待测样品处理细胞12小时，将处理后的HCT116，DLD-1细胞在含有蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(Beyotime，P1048)的RIPA裂解缓冲液(Beyotime，P0013)中裂解。随后，将细胞裂解液在5x上样缓冲液(Beyotime，P0015)中煮沸5分钟，然后用SDS-聚丙烯酰胺凝胶(Genscript，M42012)溶解，然后转移至PVDF膜上。用anti-N-Cadherin(Abcam，ab18203)，anti-E-Cadherin(Abcam，ab15148)，anti-Vimentin(Proteintech，10366-1)，anti-β-actin(Cell signaling technology，4970)的抗体进行孵育，然后将膜与结合的第二抗体(Cell signaling technology，7074)一起孵育，所有抗体均已在封闭缓冲液中稀释，并通过增强的化学发光试剂盒(Absin，abs920)可视化抗原-抗体反应。
结论：实验组较对照组在参比蛋白β-actin表达量不变的前提下，Vimentin、N-Caderin蛋白表达量随浓度的增加而降低，E-Caderin蛋白表达量随浓度的增加而增加，对这些因子的调控情况说明了氨基富勒烯混合物C70-EDA抑制肿瘤细胞EMT过程(图11)。
实施例8a：氨基富勒烯可结合MYH9的C末端结构域
MYH9蛋白基因序列来源于NCBI数据库，将MYH9的1959个氨基酸拆分为五段，分别为Δ1：1-300、Δ2：280-850、Δ3：790-1100、Δ4：1080-1500、Δ5：1400-1959段，其中Δ1段为MYH9蛋白质的N端，Δ5段为MYH9蛋白质的C端，由上海捷瑞生物技术有限公司合成5条MYH9片段的DNA序列，将其插入pET28a质粒中，用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导HIS融合蛋白在大肠杆菌BL21中进行表达，得到5段蛋白，进行SDS凝胶电泳，得到5段蛋白的电泳条带(图12中间图)。之后将5段蛋白分别与亲和素修饰的氨基富勒烯C70-EDA在4℃下孵育1小时后，使用链霉亲和素修饰的磁珠(Yeasen，47503ES03)捕获蛋白-C70-EDA复合物。收集的珠子用洗涤缓冲液(含0.1％NP-40的1x PBS)漂洗3次。在30μL上样缓冲液中加热洗脱所得蛋白，并通过10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，胶体用考马斯亮蓝染色进行分析。
结论：如图12所示，左图为MYH9蛋白被切分5段蛋白，中图为5段蛋白的凝胶电泳条带，右图为氨基富勒烯分别与5段蛋白孵育后再通过链霉亲和素修饰的磁珠捕获氨基富勒烯结合的蛋白片段的凝胶电泳条带，发现只有第5段蛋白(Δ5：1400-1959)被捕获检出，说明氨基富勒烯结合在MYH9蛋白的Δ5片段(即C末端)。
实施例8b：氨基富勒烯可触发细胞质MYH9向细胞边缘的转移
细胞：DU145、A549细胞
分组情况：使用10μM氨基富勒烯分子TAPC-4分别处理DU145细胞0小时、4小时、8小时进行时间梯度实验；使用25μM氨基富勒烯混合物C70-EDA分别处理A549细胞0小时、4小时、8小时进行时间梯度实验；
用于免疫荧光实验的细胞在室温下用甲醇固定5分钟，并用PBS缓冲液洗涤2次。在室温下将样品在含3％BSA的PBS溶液中封闭1小时，并在4℃下与对MYH9特异性的抗体(1：1000；Abcam，ab238131)孵育过夜。将Alexa Fluor偶联的二抗(Invitrogen，A-21244)在室温下孵育1小时。然后使用Hoechst 33342对细胞核进行复染，并通过激光扫描共聚焦显微镜(Olympus)获得图像。
结论：如图13-14所示，氨基富勒烯分子TAPC-4及氨基富勒烯C70-EDA在时间梯度上均观察到显着介导MYH9蛋白的亚细胞定位，MYH9的大多数蛋白散布在细胞质上，而不散布在细胞边缘或细胞核中。但是，使用氨基富勒烯处理后，MYH9从细胞质转移到细胞边缘。
实施例9：羟基修饰的富勒烯衍生物与氨基富勒烯衍生物的效果对比
与羟基修饰的富勒烯衍生物相比，氨基富勒烯衍生物在抑制肿瘤转移方面的优势在于：
1.结构明确，氨基富勒烯分子TAPC-3和TAPC-4均有明确分子量和质谱数据(如实施例1所示)，羟基富勒烯不易调控羟基修饰个数，没有明确分子式。
2.水溶性好，羟基修饰的富勒烯要修饰多个羟基(大于10个)实现较好的水溶性，三加成数的氨基富勒烯就可以有很好的水溶性。
3.对肿瘤转移的抑制效果显著，本公开使用的TAPC-4氨基富勒烯，在浓度10μM就可以抑制约80％的4T1肿瘤细胞迁移，70％的A549肿瘤细胞迁移(图6)。即使用较小剂量的氨基富勒烯，就可以达到显著的抑制肿瘤细胞迁移的效果。