阅读说明：本技术 高纯度未变性胶原蛋白及其制造方法 (High-purity undenatured collagen and method for producing same ) 是由 李杰翰 洪雅萍 廖耿毅 许智尧 林美吟 苏育森 萧述文 于 2018-10-16 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种高纯度未变性胶原蛋白及其制造方法,其利用酸及非胃蛋白酶(non-pepsin protease)水解鸡胸骨及粗滤后,所述滤液无需经离心回溶处理,直接进行加盐处理及精滤处理,以在较短的制程时间内获得高纯度未变性胶原蛋白,其中高纯度未变性胶原蛋白的总胶原蛋白含量为60％以上,且含有至少50％的未变性第二型胶原蛋白。(The invention provides a high-purity undenatured collagen and a preparation method thereof, which utilizes acid and non-pepsin (non-pepsin protease) to hydrolyze chicken sternum and perform rough filtration, and the filtrate is directly subjected to salt treatment and fine filtration without centrifugal redissolution treatment so as to obtain the high-purity undenatured collagen in a shorter process time, wherein the total collagen content of the high-purity undenatured collagen is more than 60 percent, and the high-purity undenatured collagen contains at least 50 percent of undenatured second type collagen.)

高纯度未变性胶原蛋白及其制造方法

技术领域

本发明关于一种胶原蛋白及其制造方法，特别是一种高纯度未变性胶原蛋白及其制造方法，其所述高纯度未变性胶原蛋白具有高未变性第二型胶原蛋白含量。

背景技术

第二型胶原蛋白为软骨的主要结构成分，并与其他型胶原蛋白和蛋白多糖等成分并存于软骨中，以支撑组织并具有吸收冲力的功效。由于第二型胶原蛋白具有良好的生物相容性，故常被应用于食品、医疗和美容等领域。

近来研究指出未变性第二型胶原蛋白(Undenatured type II collagen)对类风湿性关节炎具有显著的疗效。虽然市面上已有许多未变性第二型胶原蛋白的产品，但其在不同酸碱度溶液中的溶解度不佳、未变性第二型胶原蛋白的含量低且产品中的总胶原蛋白含量也低。

此外，在常见的制程中，常因加热或化学处理(例如酶处理)造成未变性第二型胶原蛋白降解而失去活性。再者，常见制程所使用的酶或其他试剂通常为非食品级，造成所制得的胶原蛋白产品的应用领域受到限制，制程时间也较长。特别是，常用于纯化胶原蛋白的胃蛋白酶，由于其来源复杂且不明确，目前在国内并未列入食品级酶中。

因此，目前亟需提出一种高纯度未变性胶原蛋白及其制造方法，以改善上述种种问题。

发明内容

本发明的一个方式在于提供一种高纯度未变性胶原蛋白的制造方法，其利用可制得高总胶原蛋白含量(相当于纯度)及高未变性第二型胶原蛋白含量(相当于活性)的胶原蛋白。

本发明的另一个方式在于提供一种高纯度未变性胶原蛋白，其使用上述的制造方法所制得。

根据本发明的上述方式，提出一种高纯度未变性胶原蛋白的制造方法。在一些实施例中，先提供鸡胸骨。接着，对鸡胸骨进行酸水解，以形成酸水解物。所述酸处理在0℃至7℃条件下进行至少30天。然后，将非胃蛋白酶加入酸水解物中进行酶水解，以形成酶水解物。所述非胃蛋白酶与鸡胸骨的重量比为1：60至1：100。之后，对所述酶水解物进行粗滤处理，以形成滤液。然后，对所述滤液进行加盐处理，以形成盐液。在所述加盐处理后，使用不同孔径的陶瓷膜，直接对盐液进行精滤处理，以获得所述高纯度未变性胶原蛋白。胶原蛋白中包含至少50％的未变性第二型胶原蛋白。

依据本发明的一些实施例，在获得胶原蛋白后，可对胶原蛋白进行低温干燥处理。

依据本发明的一些实施例，所述酸水解的步骤使用pH 1.5至2的醋酸来进行。

依据本发明的一些实施例，所述酶水解在12℃至36℃条件下进行8至72小时。

依据本发明的一些实施例，所述加盐处理的盐浓度为0.7M至1.1M。

依据本发明的一些实施例，所述精滤处理包含将盐液稀释为至少300公升的稀释液，以及以每分钟30公升至50公升的流速，将所述盐液通过复数个陶瓷膜，以去除分子量1至300kD的杂质。

依据本发明的一些实施例，所述精滤处理包含进行上述稀释步骤及上述通过复数个陶瓷膜的步骤的复数个循环达4至8天。

依据本发明的一些实施例，所述制造方法不包括在上述精滤处理前进行离心沉淀处理和回溶处理。

根据本发明的上述方式，提出一种高纯度未变性胶原蛋白。在一些实施例中，所述高纯度未变性胶原蛋白使用上述制造方法所制得。所述高纯度未变性胶原蛋白的总胶原蛋白含量为至少60％，且至少50％的高纯度未变性胶原蛋白为未变性第二型胶原蛋白。

依据本发明的一些实施例，所述高纯度未变性胶原蛋白中的灰分为少于1.5％。

附图说明

为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例更明显易懂，所附的附图的详细说明如下：

图1是表示依据本发明的一些实施例所述的高纯度未变性胶原蛋白的制造方法的示意流程图。

其中，附图符号的说明如下：

100：方法；

110：提鸡胸骨；

120：酸水解鸡胸骨，以形成酸水解物；

130：将非胃蛋白酶加入酸水解物中进行酶水解，以形成酶水解物；

140：对酶水解物进行粗滤处理，以形成滤液；

150：对滤液进行加盐处理，以形成盐液；

160：在加盐处理后，直接对盐液进行精滤处理，以获得高纯度未变性胶原蛋白。

具体实施方式

本发明的目的在于提供一种高纯度未变性胶原蛋白及其制造方法，且特别是高纯度未变性食品级胶原蛋白的制造方法，其利用酸及非胃蛋白酶(non-pepsin protease)水解鸡胸骨并经粗滤后，无需离心滤液和回溶沉淀物，直接对滤液进行加盐处理及精滤处理，以在较短的制程时间内获得高纯度未变性胶原蛋白。

本发明此处所称的食品级胶原蛋白使用食品级试剂所制得。所述食品级的规格以取得台湾卫生福利部食品药物管理署的“食品添加物许可证”而订之。

以下请参考图1，其表示依据本发明的一些实施例所述的高纯度未变性胶原蛋白的制造方法的示意流程图100。

如图1所示，在方法100的步骤110中，先提供鸡胸骨。在一个实施例中，提供至少20公斤的鸡胸骨。在一个较佳的实施例中，鸡胸骨的使用量为20公斤至40公斤。一般而言，由于鸡胸骨中的第二型胶原蛋白含量较高，为鸡胸骨总蛋白质的45重量％至70重量％，故鸡胸骨适用于生产未变性第二型胶原蛋白。

在一些实施例中，如步骤110所述，鸡胸骨已先经去肉、切碎及清洗等处理。在一些例子中，所述清洗处理可例如使用乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid；EDTA)来进行。

接下来，如步骤120所示，对鸡胸骨进行酸水解，以形成酸水解物。所述酸水解可在0℃至7℃条件下进行至少30天。在一些实施例中，所述酸水解使用pH 1.5至2的醋酸来进行。倘若酸水解的时间不足，会造成后续的酶水解效率不佳。再者，由于酸水解进行时间较长，倘若温度过高则容易使鸡胸骨变质，从而降低未变性第二型胶原蛋白的含量。

然后，如步骤130所示，将非胃蛋白酶加入酸水解物中进行酶水解，以形成酶水解物。在一个例子中，所述酶水解是在pH 1.9至6条件下进行。在一个实施例中，酶水解在12℃至36℃条件下进行8至72小时。若超过上述pH、温度或时间范围，则酶水解效果不佳。在一个实施例中，步骤120和步骤130之间还可包含调整pH值的步骤，以使酸水解物的pH值可落于酶水解步骤的适当范围。在一些实施例中，非胃蛋白酶与鸡胸骨的重量比为1：60至1：100。具体而言，本发明使用的非胃蛋白酶为食品级酶，其可包括但不限于蛋白酶M(proteaseM)、木瓜酶、菠萝酶、其他适合的酶，或上述酶的组合。在一些实施例中，本发明不包括使用胃蛋白酶进行酶水解。在一个具体例中，酶水解在醋酸溶液中进行。

之后，如步骤140所示，对上述酶水解物进行粗滤处理，以形成滤液。所述粗滤处理可例如使用不同孔径的网筛，将酶水解物中残余的碎鸡骨等固体杂质滤除，并保留滤液进行后续的制程步骤。在另一些实施例中，可使用例如60目(mesh)、300目、500目等不同孔径的网筛进行粗滤处理。本发明此处对网筛的孔径及数量并无特别限制，可依照酶水解物的状况而调整。

接下来，如步骤150所示，对滤液进行加盐处理，以形成盐液。在一些实施例中，所述加盐处理在0.7M至1.1M的盐浓度条件下进行。在一些实施例中，加盐处理可例如添加氯化钠在上述澄清液中，并搅拌至氯化钠完全溶解。

具体而言，盐液中包含因等电点平衡而聚集或沉淀的胶原蛋白粗产物以及盐溶液。本发明不包括使用离心处理将聚集或沉淀的胶原蛋白粗产物与盐溶液分离，而是直接将此盐液进行后续的精滤处理(如步骤160所示)，以降低胶原蛋白的损失，从而提高总胶原蛋白与未变性第二型胶原蛋白含量。在一个例子中，鸡胸骨的处理量为至少20公斤，故加盐处理所产生的盐液的量也十分可观(例如总重量达140公斤以上)。倘若对此盐液进行离心处理，由于离心设备尺寸的限制，而且离心后需回溶沉淀物，需耗费大量的时间。

然后，如步骤160所示，在上述步骤150的加盐处理后，直接对盐液进行精滤处理，以获得本发明的高纯度未变性胶原蛋白。在一些实施例中，所述精滤处理包含将盐液稀释为至少300公升的稀释液，以及以每分钟30公升至50公升的流速，将稀释液通过复数个陶瓷膜，以去除分子量为1至300kD的杂质(例如：盐类、灰分)。在一些实施例中，精滤处理将盐液稀释为300公升至500公升的稀释液。在一些实施例中，所述精滤处理循环进行(即重复通过前述陶瓷膜)达4天至8天。所述循环进行精滤处理包含上述稀释及通过陶瓷膜以排除含有杂质的水这两个步骤的复数个循环，以提高杂质去除率。

在一些实施例中，所述复数个陶瓷膜的每一个可为管状陶瓷膜，其材质包含氧化铝、氧化锆和/或氧化钛。在一个具体例子中，管状陶瓷膜可具有例如120公分的长度，截面积可例如为10mm至25mm。在一些例子中，复数个管状陶瓷膜(例如3个)串联设置，使稀释液可依序通过。本发明通过调整精滤处理的时间、设备(例如陶瓷膜规格或配置)、精滤处理的流速等，以保留胶原蛋白的高纯度及高未变性第二型胶原蛋白含量。

在一些实施例中，本发明的制造方法还包含在形成高纯度未变性胶原蛋白后，对高纯度未变性胶原蛋白进行低温干燥处理。低温干燥处理后的高纯度未变性胶原蛋白呈海绵或片状，以便于保存和延长保存时间。此处所称的低温干燥处理可例如为低于40℃的干燥处理，且可包括但不限于烘干或冻干。

本发明的高纯度未变性胶原蛋白的总胶原蛋白含量(相当于胶原蛋白纯度)为60％以上，且至少50％的高纯度未变性胶原蛋白为未变性第二型胶原蛋白(相当于活性成分)。在一些实施例中，高纯度未变性胶原蛋白中的灰分少于1.5％。在一些例子中，未变性第二型胶原蛋白占总胶原蛋白含量的70重量％以上。

以下提供复数个实施例与比较例说明本发明的高纯度未变性胶原蛋白的制造方法。

实施例1

首先，将去肉并切碎的鸡胸骨20公斤用EDTA清洗三次。接着，在0℃至7℃条件下，将清洗后的鸡胸骨浸泡于pH 2的醋酸中达30天，以形成酸水解物。之后，用醋酸调整酸水解物的pH值为pH 2±0.1，以蛋白酶M(40000U/g，天野酶制品股份公司制造)：鸡胸骨的重量比为1：80，将蛋白酶M加入酸水解物中，并在33℃至36℃条件下反应8小时，以形成酶水解物。之后，粗滤酶水解物并获得滤液。接着，在所述滤液中加入氯化钠并均匀搅拌，形成氯化钠的最终浓度为0.9M的盐液。用大量的去离子水将盐液稀释至300至350公升后，以每分钟30公升的流速依序通过3个管状陶瓷滤膜(由INSIDE CéRAM^TM制)，每个管状陶瓷膜的截面积为25mm、长度为1200mm，这些管状陶瓷膜分别具有8个(水力直径6mm)、23个(水力直径3.5mm)和39个通道(水力直径2.5mm)，可滤除1至300kDa的分子。重复上述稀释及通过陶瓷膜的步骤达四天，可制得实施例1的高纯度未变性胶原蛋白。可进一步将实施例1的高纯度未变性胶原蛋白冻干。实施例1的评价结果如表1和表3所示。

实施例2

首先，将去肉并切碎的鸡胸骨20公斤用EDTA清洗三次。接着，在0℃至7℃条件下，将清洗后的鸡胸骨浸泡于pH 2的醋酸中达30天，以形成酸水解物。之后，用醋酸调整酸水解物的pH值为pH 2±0.1，以蛋白酶M(40000U/g，天野酶制品股份公司制造)：鸡胸骨的重量比为1：60，将蛋白酶M(40000U/g，天野酶制品股份公司制造)加入酸水解物中，并在12℃至15℃条件下反应72小时，以形成酶水解物。之后，粗滤酶水解物并获得滤液。接着，在所述滤液中加入氯化钠并均匀搅拌，形成氯化钠的最终浓度为0.9M的盐液。用大量的去离子水将盐液稀释至300至350公升后，以每分钟50公升的流速依序通过3个管状陶瓷膜(由INSIDE CéRAM^TM制)，每个管状陶瓷膜的截面积为25mm、长度为1200mm，这些管状陶瓷膜分别具有8个(水力直径6mm)、23个(水力直径3.5mm)和39个通道(水力直径2.5mm)，可滤除1至300kDa的分子。重复上述稀释和通过陶瓷膜的步骤达六天，可制得实施例2的高纯度未变性胶原蛋白。可进一步将实施例2的高纯度未变性胶原蛋白低温干燥。实施例2的评价结果如表1至表3所示。

比较例1

首先，将去肉并切碎的鸡胸骨20公斤用EDTA清洗三次。接着，在0℃至7℃条件下，将清洗后的鸡胸骨浸泡于pH 2的醋酸中达30天，以形成酸水解物。之后，以醋酸调整酸水解物的pH值为pH 2±0.1，以胃蛋白酶(pepsin，2000-3500U/mg，Avantor PerformanceMaterials,lnc制)：鸡胸骨的重量比为1：80，将胃蛋白酶加入酸水解物中，并在12℃至15℃条件下反应72小时，以形成酶水解物。之后，粗滤酶水解物并获得滤液。接着，在所述澄清液中加入氯化钠并均匀搅拌，形成氯化钠的最终浓度为0.9M的盐液。以35000×g离心此盐液并获得沉淀物。用约40公升的去离子水回溶上述沉淀物。上述离心回溶的时间耗时六天。之后，用去离子水将盐液稀释至100至150公升后，进行精滤达六天，可制得比较例1的胶原蛋白。比较例1的评价结果如表1至表3所示。

比较例2

比较例2使用市售的未变性第二型胶原蛋白(UCII，美国InterHealthNutraceuticals公司制)进行下述评价。比较例2的评价结果如表1和表2所示。

比较例3

比较例3使用市售的未变性第二型胶原蛋白(

欧洲BIOIBERICA公司制)进行下述评价。比较例3的评价结果如表1和表2所示。

评价方式

1.总胶原蛋白含量

本发明此处所称的总胶原蛋白含量利用胶原蛋白中的羟脯氨酸(Hydroxyproline；Hyp)含量进行检测。Hyp含量越高代表总胶原蛋白含量越高，即胶原蛋白的纯度越高。本发明较佳的总胶原蛋白含量为样品总量的60％以上。

2.未变性第二型胶原蛋白含量

本发明此处所称的未变性第二型胶原蛋白含量用市售的第二型胶原蛋白检测套组(Chondrex制)进行检测，此含量可相当于所制得的胶原蛋白的活性成分含量。本发明较佳的未变性第二型胶原蛋白含量为样品总量的50％以上。

3.溶解度

本发明此处所称的溶解度指低温干燥后的实施例和比较例的胶原蛋白回溶于水、强酸液(模拟胃液，pH值为1至2)或强碱液(pH值为9至10)中时，是否产生结晶或沉淀，或是可完全溶解。本发明此处所称的高溶解度指胶原蛋白完全溶解于上述溶液中，中溶解度代表仅微量不溶物存在于上述溶液中，而低溶解度指胶原蛋白溶解后仍明显有沉淀物。此处所称的溶解度与纯度相关，纯度越高，胶原蛋白中所含的不溶杂质越少，溶解度则越高。

4.蛋白质纯度及含量

本发明此处的蛋白质纯度使用蛋白质电泳胶进行检测，其中电泳胶的色带单一代表蛋白质种类单一、纯度高，且色带颜色深代表蛋白质含量高。

5.灰分

本发明此处所称的灰分可视为所制得的胶原蛋白中所含的杂质。一般而言，灰分的含量越少越佳，且本发明较佳的灰分含量少于1.5重量％。

6.时程

本发明此处所称的时程指进行精滤处理的时间。在比较例1中，此精滤处理为离心、回溶与精滤的时间总和。

表1

	实施例1	实施例2	比较例1	比较例2	比较例3
						总胶原蛋白含量(wt.％)	65.6％	82.2	75.3	30	25
未变性第二型胶原蛋白含量(wt.％)	50％	80.48	70.27	14.5	4
						未变性第二型胶原蛋白/总胶原蛋白	0.76	0.98	0.93	0.48	0.16

表2

表3

	实施例1	实施例2	比较例1
				时程(天)	4天	4天	12天
使用食品级酶	是	是	否

本发明所公开的制造方法使用制造食品级产品规格的试剂(例如酶及反应溶液)并改善制程流程，以缩短制程时间并制造高纯度未变性胶原蛋白。如表1所示，实施例1和2的食品级胶原蛋白中含有高纯度的胶原蛋白及高含量的未变性第二型胶原蛋白。此外，实施例2的高纯度未变性胶原蛋白色带单一、色带颜色深、Hyp含量高且灰分少，其在强酸液、强碱液以及水中都具有良好的溶解度。

另一方面，使用胃蛋白酶进行酶水解，并经离心回溶后才进行精滤的比较例1需耗费较长的时间，大幅增加时间成本。此外，由于胃蛋白酶非食品级酶，因此比较例1的胶原蛋白不可作为食品级胶原蛋白，其应用受到限制。

使用市售产品的比较例2和3则有总胶原蛋白含量(纯度)和未变性第二型胶原蛋白含量(活性)不足的缺点，致使比较例2和3的胶原蛋白的溶解度不佳。

应用本发明的高纯度未变性胶原蛋白及其制造方法，在选用特定酶及省略离心回溶处理后，可在较短的制程时间内，制造高纯度及高未变性第二型胶原蛋白含量的胶原蛋白，且此高纯度未变性胶原蛋白可为食品级并在各种溶液环境中具有良好的溶解度。基于上述优点，本发明所制得的高纯度未变性胶原蛋白适用于各种食品、医疗、美容的领域。

虽然已通过几个实施例公开了如上的本发明，但其并非用以限定本发明，本领域技术人员知晓，在不脱离本发明的精神和范围内，可进行各种变更与修饰，因此，本发明的保护范围当视后附的权利要求书所界定的范围为准。