人甲胎蛋白特异性t细胞受体及其用途
阅读说明：本技术 人甲胎蛋白特异性t细胞受体及其用途 (Human alpha-fetoprotein specific T cell receptor and uses thereof ) 是由 何玉凯 朱伟 E·塞利斯 彭一兵 王岚 于 2018-05-02 设计创作，主要内容包括：本发明提供了特异性识别hAFP<Sub>158</Sub>的T细胞受体及其使用方法。(The invention provides a method for specifically recognizing hAFP 158 And methods of using the same.)
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年5月12日提交的美国临时专利申请62/505,406、2017年12月22日提交的62/609,614和2018年2月1日提交的62/625,051的权益和优先权，并且全部上述专利在允许的情况下全文以引用方式并入。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的R01CA168912的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
序列表
2018年5月1日提交的序列表，作为创建于2018年4月26日、大小为171,818字节、名为“序列表064466.067_ST25”的文本文件，根据37C.F.R.§1.52(e)(5)据此以引用方式并入。
技术领域
本发明整体涉及免疫学，具体地涉及T细胞受体及其在治疗包括癌症在内的免疫疾病中的使用方法。
背景技术
肝细胞癌(HCC)是世界上第5大最常见癌症，每年约有80万新病例。根据美国癌症协会的数据，在美国，肝癌(其中大部分是HCC)的数量在过去十年中增加了一倍，这代表了主要由肥胖的流行导致的快速增长的恶性肿瘤之一。由于大量的现有慢性HBV和HCV患者以及流行性肥胖，HCC的发病率可能会居高不下。更糟糕的是，缺乏有效的管理使得HCC成为成年男性癌症死亡的第2大原因。因此，迫切需要开发新的疗法。肿瘤特异性T细胞的过继转移在控制肿瘤生长方面具有巨大潜力，且无明显毒性。由于从大多数实体瘤(黑素瘤除外)中分离肿瘤特异性T细胞的难度较大，因此用肿瘤抗原特异性TCR基因对患者的自体T细胞进行基因工程改造，将可能为过继细胞转移免疫疗法提供功能性肿瘤特异性T细胞。
HCC经常重新表达人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(hGPC3)和人甲胎蛋白(hAFP)作为肿瘤相关抗原(TAA)。这些抗原不仅用作诊断的生物标志物，而且还可作为免疫疗法的靶点。最近，使用异种移植的HCC模型在免疫受损的小鼠中克隆了hGPC3特异性人TCR基因并证明了其抗肿瘤功效(Dargel等人，2015)。然而，由于TAA在整个HCC中的表达水平往往不相等，因此抗hGPC3治疗可能会选择hGPC3阴性细胞，从而导致复发。理论上，使用针对不同表位和不同肿瘤抗原的TCR组合可避免或延迟肿瘤免疫逃逸。已鉴定出四个HLA-A2限制性hAFP表位(Butterfield等人，2001)。表位hAFP158通常由HCC肿瘤细胞呈递，并且在HCC患者中发现了hAFP158特异性免疫细胞(Butterfield等人，2003)，但其抗肿瘤作用较弱(Butterfield等人，2006)，这可能是由于人hAFP158特异性T细胞的亲和力较低。因此，发现高亲和力的hAFP158特异性TCR可增加靶向AFP抗原的抗肿瘤功效。
已经报道了两种hAFP158特异性TCR基因。最近一项涉及hAFP158表位特异性的人TCR的专利(CN 104087592 A)显示出有限的抗肿瘤作用(Sun等人，2016)。Adaptimmune公司的另一项专利申请(US 2016/0137715 A1)进一步证实了这种较弱的抗肿瘤作用，其中hAFP158表位特异性的野生型人TCR在与人HCC肿瘤细胞共培养时没有产生任何效应子功能。因此，通过突变野生型人TCR的CDR区以增加对HCC肿瘤细胞的识别来形成hAFP158特异性高亲和力TCR并获得了专利(US 2016/0137715 A1)。但是，目前尚无临床资料表明，此类TCR修饰的人T细胞(TCR-T)在体内确实能产生抗肿瘤作用。此外，根据最近的报道，高亲和力TCR-T细胞的过继转移与严重的脱靶毒性相关(Cameron等人，2013；Linette等人，2013；Morgan等人，2013)，因此希望有更多可用的TCR以增加发现具有高抗肿瘤功效和低毒性的最佳TCR的机会。因此，确实需要鉴定出另外的可用于工程改造患者的自体T细胞以用于免疫疗法的TAA特异性TCR。
发明内容
本发明提供了特异性识别hAFP158的T细胞受体。一个实施方案提供了经工程改造的小鼠T细胞受体(mTCR)Vα链多肽，其与SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9或10具有至少90％的序列同一性，其中mTCR特异性地识别hAFP158(SEQ ID NO:1)。
另一个实施方案提供了经工程改造的小鼠T细胞受体(mTCR)Vβ链多肽，其与SEQID NO:11、12、13或14具有至少90％的序列同一性，其中mTCR特异性地识别hAFP158(SEQ IDNO:1)。
另一个实施方案提供了经工程改造的小鼠T细胞受体(mTCR)全长α链多肽，其与SEQ ID NO:15、16、17、18、19、20、21、22或23具有至少90％的序列同一性，其中mTCR特异性地识别hAFP158(SEQ ID NO:1)。
另一个实施方案提供了经工程改造的小鼠T细胞受体(mTCR)全长β链多肽，其与SEQ ID NO:24、25、26或27具有至少90％的序列同一性，其中mTCR特异性地识别hAFP158(SEQID NO:1)。
一个实施方案提供了经工程改造的小鼠T细胞受体(mTCR)α链多肽，其具有与SEQID NO:28、29、30、31、32、33、34、35或36具有至少90％的序列同一性的CDR3区，其中mTCR特异性地识别hAFP158(SEQ ID NO:1)。
另一个实施方案提供了经工程改造的小鼠T细胞受体(mTCR)β链多肽，其具有与SEQ ID NO:37、38、39或40具有至少90％的序列同一性的CDR3区，其中mTCR特异性地识别hAFP158(SEQ ID NO:1)。
可去除所公开的多肽序列中的任一者的前导序列。
一个实施方案提供了经工程改造的小鼠T细胞受体(mTCR)，其具有Vα结构域和Vβ结构域，该Vα结构域与SEQ ID NO:2具有至少90％的序列同一性，其中CDR3区与SEQ ID NO:28具有至少90％的序列同一性，该Vβ结构域与SEQ ID NO:11具有至少90％的序列同一性，其中CDR3区与SEQ ID NO:37具有至少90％的序列同一性。
另一个实施方案提供了经工程改造的小鼠T细胞受体(mTCR)，其具有Vα结构域和Vβ结构域，该Vα结构域与SEQ ID NO:3具有至少90％的序列同一性，其中CDR3区与SEQ IDNO:29具有至少90％的序列同一性，该Vβ结构域与SEQ ID NO:11具有至少90％的序列同一性，其中CDR3区与SEQ ID NO:37具有至少90％的序列同一性。
另一个实施方案提供了经工程改造的小鼠T细胞受体(mTCR)，其具有Vα结构域和Vβ结构域，该Vα结构域与SEQ ID NO:4具有至少90％的序列同一性，其中CDR3区与SEQ IDNO:30具有至少90％的序列同一性，该Vβ结构域与SEQ ID NO:12具有至少90％的序列同一性，其中CDR3区与SEQ ID NO:38具有至少90％的序列同一性。
另一个实施方案提供了经工程改造的小鼠T细胞受体(mTCR)，其具有Vα结构域和Vβ结构域，该Vα结构域与SEQ ID NO:5具有至少90％的序列同一性，其中CDR3区与SEQ IDNO:31具有至少90％的序列同一性，该Vβ结构域与SEQ ID NO:13具有至少90％的序列同一性，其中CDR3区与SEQ ID NO:39具有至少90％的序列同一性。
一个实施方案提供了经工程改造的小鼠T细胞受体(mTCR)，其具有Vα结构域和Vβ结构域，该Vα结构域与SEQ ID NO:6具有至少90％的序列同一性，其中CDR3区与SEQ ID NO:32具有至少90％的序列同一性，该Vβ结构域与SEQ ID NO:11具有至少90％的序列同一性，其中CDR3区与SEQ ID NO:37具有至少90％的序列同一性。
一些实施方案提供了经工程改造的小鼠T细胞受体(mTCR)，其具有Vα结构域和Vβ结构域，该Vα结构域与SEQ ID NO:7具有至少90％的序列同一性，其中CDR3区与SEQ ID NO:33具有至少90％的序列同一性，该Vβ结构域与SEQ ID NO:14具有至少90％的序列同一性，其中CDR3区与SEQ ID NO:40具有至少90％的序列同一性。
另一个实施方案提供了经工程改造的小鼠T细胞受体(mTCR)，其具有Vα结构域和Vβ结构域，该Vα结构域与SEQ ID NO:8具有至少90％的序列同一性，其中CDR3区与SEQ IDNO:34具有至少90％的序列同一性，该Vβ结构域与SEQ ID NO:11具有至少90％的序列同一性，其中CDR3区与SEQ ID NO:37具有至少90％的序列同一性。
另一个实施方案提供了经工程改造的小鼠T细胞受体(mTCR)，其具有Vα结构域和Vβ结构域，该Vα结构域与SEQ ID NO:9具有至少90％的序列同一性，其中CDR3区与SEQ IDNO:35具有至少90％的序列同一性，该Vβ结构域与SEQ ID NO:11具有至少90％的序列同一性，其中CDR3区与SEQ ID NO:37具有至少90％的序列同一性。
一个实施方案提供了经工程改造的小鼠T细胞受体(mTCR)，其具有Vα结构域和Vβ结构域，该Vα结构域与SEQ ID NO:10具有至少90％的序列同一性，其中CDR3区与SEQ IDNO:36具有至少90％的序列同一性，该Vβ结构域与SEQ ID NO:11具有至少90％的序列同一性，其中CDR3区与SEQ ID NO:37具有至少90％的序列同一性。所公开的任何mTCR均可被人源化。
一个实施方案提供了经工程改造以表达所公开的mTCR中的任一者的T细胞。T细胞可以是人T细胞。T细胞也可以是自体T细胞。
另一个实施方案提供了可溶性mTCRα链，其包括SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、16、17、18、19、20、21、22或23的Q21至L242。
另一个实施方案提供了经工程改造的mTCRβ链的细胞外结构域，该mTCRβ链含有SEQ ID NO:50、51、52或53或者SEQ ID NO:24、25、26或27的E18至Y276。
一个实施方案提供了与SEQ ID NO:54、55、56、57、58、59、60、61或62具有至少90％的序列同一性的融合蛋白。
另一个实施方案提供了编码mTCR蛋白或多肽中的任一者的载体。
另一个实施方案提供了与SEQ ID NO:63、64、65、66、67、68、69、70或71具有至少90％的序列同一性的核酸。
另一个实施方案提供了非天然存在的hAFP158表位特异性的小鼠T细胞受体，该受体包括：
a).与SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9或10的第21-132位氨基酸残基具有至少90％的序列同一性的α链可变结构域(Vα)；以及
b).与SEQ ID NO:11、12、13或14的第18-131位氨基酸残基具有至少
90％的序列同一性的β链可变结构域(Vβ)。
另一个实施方案提供了融合蛋白，该融合蛋白包括与第二多肽连接的第一多肽，该第一多肽与根据SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9或10的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，该第二多肽与根据SEQ ID NO:11、12、13或14的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。
另一个实施方案提供了融合蛋白，该融合蛋白包括与第二多肽连接的第一多肽，该第一多肽与根据SEQ ID NO:15、16、17、18、19、20、21、22或23的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，该第二多肽与根据SEQ ID NO:24、25、26或27的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。
另一个实施方案提供了经工程改造以表达由SEQ ID NO:63、64、65、66、67、68、69、70或71编码的TCR的T细胞。T细胞可以是人T细胞。
另一个实施方案提供了杂交瘤，其具有与缺乏TCRα链和β链的供体细胞融合的CD8+Tet158+细胞。杂交瘤通常对hAFP+肿瘤细胞有反应。在某些实施方案中，杂交瘤分泌IL-2。
另一个实施方案提供了融合蛋白，该融合蛋白具有与第二多肽连接的第一多肽，该第一多肽与根据SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9或10的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，该第二多肽与根据SEQ ID NO:11、12、13、14、24、25、26或27的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，其中该融合蛋白与单链抗CD3抗体连接。
另一个实施方案提供了用于治疗对其有需要的受试者的肿瘤的方法：通过对人T细胞进行基因工程改造以表达所公开的mTCR并以有效减轻受试者肿瘤负担的量向受试者施用该经工程改造的T细胞。在某些实施方案中，肿瘤是肝细胞癌。T细胞可以是自体T细胞。
另一个实施方案提供了用于检测肝细胞癌的方法：通过使所公开的多肽或蛋白质与细胞样本接触，其中多肽或蛋白质与细胞的特异性结合指示肝细胞癌细胞。
另一个实施方案提供了与所公开的多肽或蛋白质特异性结合的抗体或其抗原结合片段。
附图说明
图1A-1至图1A-4是通过对Thy1.2+T细胞进行门控以分析用hAFP158肽刺激的小鼠外周血细胞中CD8和IFN-γ的点图。图1A-5是在进行或不进行lv初免的情况下总脾细胞中CD8+IFNg+的％的图。图1B-1至图1B-3是用HepG2(AFP-)(图1B-1)、HepG2(AFP+)(图1B-2)和hAFP158肽(图1B-3)刺激的脾T细胞的点图。图1B-4是用HepG2(AFP-)、HepG2(AFP+)和hAFP158肽刺激的总脾细胞中CD8+IFNg+的％的图。图1C-1至图1C-3是与脾细胞共培养的HepG2细胞的显微照片。图1C-4是剩余存活的HepGe细胞(OD595)与E/T比的关系图，(●)为Lv+Pep，(■)为Pep+Pep。
图2A至图2E示出了免疫AAD小鼠脾细胞的过继转移防止小鼠受到肿瘤攻击并根除NSG小鼠中的HepG2肿瘤异种移植物。图2A是示出约10％的免疫小鼠脾细胞对hAFP158肽有反应而产生IFNg的点图。图2B示出了将未免疫或免疫小鼠的总共1500万个脾细胞(150万个hAFP158特异性CD8 T细胞)注射到NSG小鼠中，然后用HepG2肿瘤细胞对其进行攻击。图2C是表示当肿瘤大小达到直径2cm时向NSG小鼠注射免疫小鼠的150万个脾细胞的图。图2D是在对照(●)和ACT(■)中肿瘤大小(mm3)与肿瘤接种后天数关系的线图。图2E是小鼠1(□)、小鼠2(□)、小鼠3(□)和小鼠4(□)中的肿瘤体积(mm3)与肿瘤接种后天数关系的线图，
图3A是示出hAFP158特异性CD8 T细胞纯度的点图。图3B是示出产生hAFP158特异性IFNγ的细胞的百分比的点图。图3C是示出Flu M1特异性CD8 T细胞纯度的点图。图3D是示出产生Flu M1特异性IFNγ的细胞的百分比的点图。图3E是用Lv+hAFP158的CD8(□)或Flu+M1的CD8处理的小鼠的肿瘤体积(mm3)与肿瘤接种后天数关系的线图。图3F至图3H是来自hAFP免疫小鼠的纯化的CD8 T细胞的点图，其通过Tet158四聚体染色和细胞分选器进一步分离成Tet158+细胞和Tet158-细胞。呈现了分选前后的纯度。图3I是用Tet158+(□)细胞或Tet158-(□)细胞处理的小鼠的肿瘤体积(mm3)与肿瘤接种后天数关系的线图。图3J至图3O是来自图3I的小鼠的图像。
图4A是来自T细胞杂交瘤克隆的IL-2(pg/ml)的条形图。将BW-Lyt2.4融合伴侣细胞和5种不同的杂交瘤克隆与hAFP+(□)或hAFP-(□)HepG2肿瘤细胞一式三份共培养，并通过ELISA检测IL-2的产生。图4B至图4G是用抗Vβ8.3抗体染色的杂交瘤克隆的直方图。图4H至图4M是用Tet158四聚体染色的杂交瘤克隆的直方图。
图5A是表达TCR基因的重组lv的示意图。在EF1α启动子的控制下将成对的TCRα链和β链基因表达为单个分子。在其间***P2A序列，以允许生成相等数量的TCRα链和β链。图5B至图5E是在用三种不同的TCR-lv转导后人T细胞系Jurkat细胞的Tet158四聚体染色的直方图。呈现了直方图和MFI。图5G至图5J、图5L至图5O和图5Q至图5T是来自用TCR-lv转导的3个不同供体的原代人T细胞的点图，其示出了Tet158+CD8 T细胞和CD4 T细胞的百分比和MFI。在不进行lv转导或进行GFP-lv转导的情况下模拟转导细胞经历相同的CD3/CD28处理。图5F、图5K、图5P和图5U是示出Tet158在来自三个不同供体的转导T细胞上的MFI的条形图。示出了TCR-T细胞。仅对CD8 T细胞或CD4 T细胞进行门控并在代表性图中示出。
图6A是来自用TCR基因转导并用AFP-HepG2(灰色阴影)、Huh7(实心阴影)或AFP+HepG2(无阴影)处理的原代人T细胞的IFN-g(pg/ml)的条形图。图6B至图6E是示出CD8对IFNγ和IL-2的细胞内染色的点图。图6F至6I是示出CD4对IFNγ和IL-2的细胞内染色的点图。图6J至图6O是示出hAFP+HepG2肿瘤细胞对CD8和CD4 TCR-T细胞增殖的诱导的点图和直方图。用类似的数据重复两次实验。
图7A是示出用TCR基因转导并用AFP-HepG2(灰色阴影)、Huh7(实心阴影)或AFP+HepG2(无阴影)处理的HLA-A2+人原代T细胞杀伤百分比的条形图。图7B是TCR(□)和模拟(□)的杀伤百分比与E:T比关系的线图。图7C、图7D和图7E是示出在TCR基因转导后通过磁珠分离的供体CD8 TCR-T细胞和CD4 TCR-T细胞的点图。图7F至图7K是模拟转导细胞、CD4TCR-T细胞或CD8 TCR-T细胞与HepG2肿瘤细胞的共培养物的显微照片。照片在共培养2小时和24小时后拍摄。图7E是示出用于测量TCR或模拟转导人T细胞中CD4细胞(黑条)、CD8细胞(白条)和总T细胞(灰条)的杀伤百分比的LDH测定结果的条形图。图7M至图7O是来自图L的代表性细胞的显微照片。
图8是表达TCR-1的慢病毒载体pCDH-EF1-coTCR-1的图谱。
图9是表达TCR-1的慢病毒载体pCDH-EF1-coTCR-2的图谱。
图10是表达TCR-1的慢病毒载体pCDH-EF1-coTCR-3的图谱。
图11A是示出来自免疫小鼠的Tet158+CD8+脾细胞的百分比的点图。图11B至图11P是示出使用不同的抗Vβ链抗体的CD8+、Tet158+细胞中Vβ表达的直方图。
图12A至图12D示出了用重组lv对原代人T细胞的转导。图12A是GFP-lv启动子的图示。图12B和图12C是表达GFP的原代T细胞的代表性图像。图12D是GFP+T细胞的直方图。
图13A是示出用抗Vβ链抗体染色的TCR-T细胞的百分比的直方图。图13B是示出用Tet158四聚体染色的TCR-T细胞的百分比的直方图。
图14A至图14I示出了人TCR-T细胞特异性识别AFP158肽冲击的HLA-A2小鼠脾细胞。图14A是示出用AAD小鼠脾细胞刺激并且不用肽冲击(灰条)、用流感M1肽冲击(黑条)或用AFP158肽冲击(白条)的模拟T细胞、TCR1 T细胞、TCR2 T细胞或TCR3 T细胞中IFN-g产量(pg/ml)的条形图。图14B至图14E是示出用hAFP158肽冲击的HLA-A2细胞刺激的IFNg染色的人T细胞(含有CD4和CD8两者)的百分比的直方图。图14F至图14I是示出用hAFP158肽冲击的HLA-A2细胞刺激的IL-2染色的人T细胞(含有CD4和CD8两者)的百分比的直方图。
图15A至图15T示出了人TCR-T的过继转移在NSG小鼠中产生了针对HepG2肿瘤的抗肿瘤作用。图15A是示出总人TCR-T细胞中Tet158+细胞的％的点图。图15B是表示对照组和TCR-T组中肿瘤生长(无肿瘤小鼠的％)与肿瘤接种后天数关系的线图。图15C是表示对照(●)和TCR-T(■)中肿瘤大小(mm3)与肿瘤接种后天数关系的线图。图15D至图15K是在模拟T处理(D1-4)和TCR-T处理(D5-8)的小鼠中接种后第31天的HepG2肿瘤的照片。图15L至图15O是示出总小鼠血细胞中人CD45+细胞的百分比的代表性点图。图15P是表示对照(●)和TCR-T(■)的总小鼠血细胞中人CD45+细胞百分比的线图。图15Q至图15R是示出NSG小鼠中Tet158+细胞占转移的人T细胞的百分比的代表性点图。图15S是表示Tet158+细胞占总转移的人T细胞的百分比与ACT后天数关系的线图。图15T是表示Tet158+细胞占总转移的CD8(□)T细胞和CD4(□)T细胞的百分比与ACT后天数关系的线图。
图16是9条mTCR序列的V区的示意性比较。
图17是9条mTCRα链(图17A)和β链(图17B)的CDR3的氨基酸序列的示意性比较。
具体实施方式
I.定义
如本文所用，短语“具有抗原特异性”是指TCR可特异性地结合并免疫识别癌症抗原，使得TCR与癌症抗原的结合引发免疫应答。
术语“Tet158”是指HLA-A2/hAFP158四聚体。
术语“hAFP158”是指具有FMNKFIYEI(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的人甲胎蛋白多肽。
缩写“TCR”是指T细胞受体，其是T细胞表面上负责识别由主要组织相容性复合物(MHC)呈递的抗原的特异性受体。
如本文所用，术语“抗体”旨在表示具有“可变区”抗原识别位点的免疫球蛋白分子。术语“可变区”旨在将免疫球蛋白的这种结构域与抗体广泛共享的结构域(诸如抗体Fc结构域)区分开。可变区包括“高变区”，其残基负责抗原结合。高变区包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，通常为轻链可变结构域中的大约第24-34位残基(L1)、第50-56位残基(L2)和第89-97位残基(L3)以及为重链可变结构域中的大约第27-35位残基(H1)、第50-65位残基(H2)和第95-102位残基(H3)；Kabat等人，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD.1991年)和/或来自“高变环”的那些残基(即，轻链可变结构域中的第26-32位残基(L1)、第50-52位残基(L2)和第91-96位残基(L3)以及重链可变结构域中的第26-32位残基(H1)、第53-55位残基(H2)和第96-101位残基(H3)；Chothia和Lesk，1987年，J.Mol.Biol.第196卷，第901-917页)。“框架区”或“FR”残基是除本文所定义的高变区残基以外的那些可变结构域残基。术语抗体包括单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、骆驼化抗体(参见例如，Muyldermans等人，2001年，TrendsBiochem.Sci.第26卷，第230页；Nuttall等人，2000年，Cur.Pharm.Biotech.第1卷，第253页；Reichmann和Muyldermans，1999年，J.Immunol.Meth.第231卷，第25页；国际公布WO 94/04678和WO 94/25591；美国专利6,005,079)、单链Fv(scFv)(参见，例如，参见Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，第269-315页，1994年)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)、胞内抗体和抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，抗Id抗体和抗抗Id抗体的抗体)。具体地，此类抗体包括任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”是指抗体的一个或多个部分，该一个或多个部分包含抗体的互补决定区(“CDR”)以及任选地包括抗体的“可变区”抗原识别位点的框架残基，并且表现出免疫特异性结合抗原的能力。此类片段包括Fab'、F(ab')2、Fv、单链(ScFv)及其突变体、天然存在的变体和包括抗体的“可变区”抗原识别位点的融合蛋白以及异源蛋白(例如，毒素、用于不同抗原的抗原识别位点、酶、受体或受体配体等)。
如本文所用，术语“片段”是指包括至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基或至少250个连续氨基酸残基的氨基酸序列的肽或多肽。
如本文所用，术语“调节”涉及改变作用、结果或活性(例如，信号转导)的能力。此类调节可以是激动性的或拮抗性的。拮抗性调节可以是部分的(即，减弱但不消除)，或者可完全消除此类活性(例如，中和)。调节可包括抗体结合后受体的内化或靶细胞上受体表达的减少。激动性调节可增强或以其他方式增加或增强活性(例如，信号转导)。在又一个实施方案中，此类调节可改变配体与其同源受体之间相互作用的性质，从而改变所引发的信号转导的性质。例如，分子可通过与配体或受体结合而改变此类分子与其他配体或受体结合的能力，从而改变其总体活性。优选地，此类调节将提供可测量的免疫系统活性的至少10％的变化、更优选地此类活性的至少50％的变化、或此类活性的至少2倍、5倍、10倍或仍更优选地至少100倍的变化。
如在结合或表现出作用的情况下使用的术语“基本上”旨在表示所观察到的作用是生理上或治疗上相关的。因此，例如，如果阻断的程度是生理上或治疗上相关的(例如，如果该阻断程度相比于完全阻断大于60％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或大于97％)，则分子能够基本上阻断配体或受体的活性。类似地，如果一个分子与另一分子的免疫特异性和特征相似度大于60％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或大于97％，则认为此类免疫特异性和/或特征基本上相同。
如本文所用，“嵌合抗体”是其中抗体的不同部分源自不同免疫球蛋白分子的分子，诸如具有源自非人抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指包括人框架区和来自非人(通常为小鼠或大鼠)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白被称为“供体”，而提供框架的人免疫球蛋白被称为“受体”。恒定区不必存在，但如果存在，则它们应与人免疫球蛋白恒定区基本上相同，即，至少约85％-99％、优选约95％或更高的同一性。因此，除可能的CDR之外，人源化免疫球蛋白的所有部分与天然人免疫球蛋白序列的对应部分基本上相同。人源化抗体是包括人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。例如，人源化抗体将不涵盖典型的嵌合抗体，因为例如嵌合抗体的整个可变区是非人的。
如本文所用，术语“内源浓度”是指分子被细胞(该细胞可以是正常细胞、癌细胞或感染细胞)天然表达(即，在没有表达载体或重组启动子的情况下)的水平。
如本文所用，术语“治疗(treat、treating、treatment)”和“治疗用途”指消除、减轻或改善疾病或病症的一种或多种症状。
如本文所用，“治疗有效量”是指足以介导此类症状的临床相关消除、减轻或改善的治疗剂的量。如果作用的大小足以影响接收受试者的健康或预后，则该作用是临床上相关的。治疗有效量可指足以延迟或最小化疾病发作(例如，延迟或最小化癌症扩散)的治疗剂的量。治疗有效量也可指在疾病的治疗或管理中提供治疗益处的治疗剂的量。
如本文所用，术语“预防剂”是指可在检测出病症或疾病的任何症状之前用于预防此类病症或疾病的药剂。“预防有效”量是足以介导这种保护的预防剂的量。预防有效量还可指在疾病预防中提供预防益处的预防剂的量。
如本文所用，术语“癌症”是指由细胞异常失控生长导致的肿瘤。如本文所用，癌症明确包括白血病和淋巴瘤。术语“癌症”是指涉及可能转移到远侧位点并表现出与非癌细胞不同的表型性状(例如，在三维底物(诸如软琼脂)中形成菌落或在三维基底膜或细胞外基质制剂中形成管状网络或网状基质)的细胞的疾病。非癌细胞在软琼脂中不形成菌落，并且在三维基底膜或细胞外基质制剂中形成不同的球状结构。
如本文所用，“免疫细胞”是指来自造血起源的任何细胞，包括但不限于T细胞、B细胞、单核细胞、树突细胞和巨噬细胞。
如本文所用，“化合价”是指每个分子可用的结合位点的数目。
如本文所用，术语“免疫的”、“免疫学”或“免疫”应答是接收患者体内针对肽发生的有益体液(抗体介导的)和/或细胞(由抗原特异性T细胞或其分泌产物介导的)应答。此类应答可以是由施用免疫原诱导的主动应答，也可以是由施用抗体或初免T细胞诱导的被动应答。与I类或II类MHC分子缔合的多肽表位的呈递激活抗原特异性CD4+T辅助细胞和/或CD8+细胞毒性T细胞，从而引发细胞免疫应答。这种应答还可涉及单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、嗜酸性粒细胞的活化，嗜中性粒细胞或先天免疫的其他成分的活化或募集。细胞介导的免疫应答的存在可通过增殖测定(CD4+T细胞)或CTL(细胞毒性T淋巴细胞)测定来确定。体液和细胞应答对免疫原的保护或治疗作用的相对贡献可通过从免疫同系动物中分离抗体和T细胞并在第二受试者中测量保护或治疗作用来区分。
如本文所用，“免疫原性试剂”或“免疫原”能够在向哺乳动物(任选地与佐剂结合)施用时诱导针对自身的免疫应答。
如本文所用，术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”在本文可互换使用，并且是指哺乳动物，包括但不限于人、啮齿动物(诸如小鼠和大鼠)以及其他实验动物。
如本文所用，术语“多肽”是指任何长度的氨基酸链，而与是否修饰(例如，磷酸化或糖基化)无关。术语多肽包括蛋白质及其片段。多肽可以是“外源的”，意指它们是“异源的”，即对于所利用的宿主细胞是外来的，诸如由细菌细胞产生的人多肽。多肽在本文中作为氨基酸残基序列公开。这些序列以从氨基到羧基末端的方向从左到右书写。根据标准命名法，氨基酸残基序列由三字母或单字母代码命名，如下所示：丙氨酸(Ala，A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)和缬氨酸(Val，V)。
如本文所用，术语“变体”是指与参考多肽或多核苷酸不同但保留必要特性的多肽或多核苷酸。多肽的典型变体在氨基酸序列上与另一参考多肽不同。通常，差异是有限的，使得参考多肽和变体的序列总体上非常相似并且在许多区域是相同的。变体和参考多肽可通过一个或多个修饰(例如，置换、添加和/或缺失)而在氨基酸序列上不同。置换或***的氨基酸残基可以是或可以不是遗传密码编码的氨基酸残基。多肽的变体可以是天然存在的，诸如等位基因变体，或者可以是未知天然存在的变体。
可对本公开的多肽结构进行修饰和改变，并且仍获得具有与该多肽相似特征的分子(例如，保守氨基酸置换)。例如，某些氨基酸可在不明显丧失活性的情况下置换序列中的其他氨基酸。因为多肽的相互作用能力和性质决定了多肽的生物功能活性，所以可在多肽序列中进行某些氨基酸序列置换，但仍获得具有类似特性的多肽。
在进行此类改变时，可考虑氨基酸的亲水性指数。亲水性氨基酸指数在为多肽赋予相互作用的生物功能方面的重要性是本领域中普遍理解的。已知某些氨基酸可被具有类似亲水性指数或评分的其他氨基酸置换，并且仍然产生具有类似生物活性的多肽。根据其疏水性和电荷特性，已为每个氨基酸指定了亲水性指数。这些指数是：异亮氨酸(+4.5)、缬氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、苏氨酸(-0.7)、丝氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、组氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
据信，氨基酸的相对亲水性决定了所得多肽的二级结构，其继而限定了该多肽与其他分子诸如酶、底物、受体、抗体、抗原和辅因子的相互作用。本领域已知氨基酸可被具有相似亲水性指数的另一氨基酸置换并且仍得到功能上等效的多肽。在此类变化中，亲水性指数在±2内的氨基酸的置换是优选的，亲水性指数在±1内的那些是尤其优选的，并且亲水性指数在±0.5内的那些甚至更是尤其优选的。
类似氨基酸的置换也可在亲水性的基础上进行，特别是在由此产生的生物功能等效多肽或肽旨在用于免疫学实施方案的情况下。已为氨基酸残基分配以下亲水性值：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、脯氨酸(-0.5±1)、苏氨酸(-0.4)、丙氨酸(-0.5)、组氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。应当理解，一种氨基酸可置换具有相似亲水性值的另一种氨基酸，并且仍然得到生物学上等效、特别是免疫学上等效的多肽。在此类变化中，亲水性值在±2内的氨基酸的置换是优选的，亲水性值在±1内的那些是尤其优选的，并且亲水性值在±0.5内的那些甚至更是尤其优选的。
如上所述，氨基酸置换通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑各种前述特征的示例性置换是本领域技术人员众所周知的，并且包括(原始残基：示例性置换)：(Ala：Gly，Ser)、(Arg：Lys)、(Asn：Gln，His)、(Asp：Glu，Cys，Ser)、(Gln：Asn)、(Glu：Asp)、(Gly：Ala)、(His：Asn，Gln)、(Ile：Leu，Val)、(Leu：Ile，Val)、(Lys：Arg)、(Met：Leu，Tyr)、(Ser：Thr)、(Thr：Ser)、(Trp：Tyr)、(Tyr：Trp，Phe)和(Val：Ile，Leu)。因此，本公开的实施方案设想了如上所述的多肽的功能或生物学等效物。具体地，多肽的实施方案可包括与感兴趣的多肽具有约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的变体。
术语“序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列并引入间隙(如果需要)以实现最大序列同一性百分比之后候选序列中的核苷酸或氨基酸与参考核酸序列中的核苷酸或氨基酸相同的百分比。出于确定序列同一性百分比目的的比对可以本领域技术范围内的各种方式来实现，例如使用公开可用的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。可通过已知方法确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
出于本文的目的，给定核苷酸或氨基酸序列C相对于、与或针对给定核酸序列D的序列同一性％(其可另选地被表述为给定序列C相对于、与或针对给定序列D具有或包括一定的序列同一性％)的计算如下：
100乘以分数W/Z，
其中W是由序列比对程序在该程序的C和D的比对中评分为相同匹配的核苷酸或氨基酸数目，并且其中Z是D中核苷酸或氨基酸的总数。应当理解，在序列C的长度不等于序列D的长度的情况下，C相对于D的序列同一性％将不等于D相对于C的序列同一性％。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”涵盖标准药物载体中的任一者，诸如磷酸盐缓冲盐溶液、水和乳剂(诸如油/水或水/油乳剂)以及各种类型的润湿剂。
如本文所用，术语“抗原决定簇”和“表位”可互换使用，并且是指由抗体识别的结构。
如本文所用，“构象表位”是包括抗原的氨基酸序列的不连续部分的表位。抗体基于抗原的3维表面特征、形状或三级结构结合构象表位。
如本文所用，“线性表位”是由来自抗原的氨基酸的连续序列形成的表位。线性表位通常包括约5至约10个连续氨基酸残基。抗体基于抗原的一级序列结合线性表位。
如本文所用，“互补位”，也称为“抗原结合位点”，是抗体的识别并结合抗原的部分。
如本文所用，“过继细胞转移”或ACT是一种免疫疗法，其中收集患者自身的T细胞，进行离体扩增，然后重新注入患者体内。ACT的两种类型是嵌合抗原受体(CAR)和T细胞受体(TCR)T细胞疗法。两种技术均提高了T细胞受体识别和攻击特定抗原的能力。在CAR T细胞疗法中，对T细胞进行工程改造以在其表面产生称为嵌合抗原受体的受体。受体允许T细胞识别并附着在肿瘤细胞上的抗原上。在TCR-T细胞疗法中，从患者体内收集T细胞，对其进行修饰以表达特异于肿瘤抗原的TCR，进行离体扩增，然后重新注入患者体内。
II.T细胞受体组成
提供了T细胞受体基因，其编码与hAFP(优选地与在癌细胞表面上表达的hAFP158)特异性结合的受体。鉴定并合成了特异于HLA-A2/hAFP158的九对小鼠TCRα链基因和β链基因。下文提供了TCR基因的氨基酸序列和核酸序列。还提供了包含一个或多个TCR基因的载体。
另一个实施方案提供了hAFP158特异性(Tet158)小鼠CD8 T细胞，该细胞体外识别并杀伤人HepG2细胞并根除NSG小鼠中的大型HepG2肿瘤异种移植物。
另一个实施方案提供了由Tet158 CD8 T细胞制成的T细胞杂交瘤。T细胞杂交瘤能够鉴定成对的TCRα链基因和β链基因。一个实施方案提供了用特异于HLA-A2/hAFP158的小鼠TCR α链基因和β链基因转导的健康供体CD8 T细胞。经基因工程改造的TCR能够使供体细胞在非常低的E/T比下识别并有效杀伤HepG2肿瘤细胞。这些特异于HLA-A2/hAFP158的小鼠TCR基因有可能经由过继细胞转移来修饰和重定向患者的自体T细胞以治疗HCC肿瘤。
另一个实施方案提供了可溶性T细胞受体。在一个实施方案中，可溶性TCR包括TCR多肽的细胞外结构域。
A.经基因工程改造的T细胞受体
所公开的TCR基因来自重组lv初免和肽增强AAD小鼠。因此，从技术上讲，这些TCR不是“天然存在的”。此外，在获得TCR的Vα和Vβ区后，通过使用已鉴定的α链和β链的V区以及特异于hgp100的HLA-A2小鼠TCR的α链和β链的恒定区(C区)来设计全长α链和β链。因此，整个TCR及其基因不是天然存在的。
1.mTCR-1、2、3、6、8、10、11、17和38Vα结构域的蛋白质序列
一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:2)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-1Vα(TRAV7D-2*01/TRAJ30*01)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:3)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-2Vα(TRAV7D-2*01/TRAJ30*01)：
将mTCR-1α链V区与mTCR-2α链进行比较，仅存在2个氨基酸差异(粗体和下划线)。
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:4)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-3Vα(TRAV7D-2*01/TRAJ12*01)：
mTCR-1α链和mTCR-3α链之间存在多个氨基酸差异(粗体和下划线)。实际上，J段是不同的(在mTCR-3Vα中使用TRAJ12而不是TRAJ30)。
一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:5)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-6Vα(TRAV7D-2*01/TRAJ30*01)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:6)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-8Vα(TRAV7D-2*01/TRAJ12*01)：
mTCR-6α链和mTCR-8α链之间存在多个氨基酸差异(粗体和下划线)。实际上，J段是不同的(在mTCR-8Vα中使用TRAJ12而不是TRAJ30)。
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:7)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-10Vα(TRAV7D-2*01/TRAJ12*01)：
将mTCR-6α链V区与mTCR-8α链进行比较，仅存在1个氨基酸差异(粗体和下划线)。
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:8)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-11Vα(TRAV7D-2*01/TRAJ12*01)：
将mTCR-6α链V区与mTCR-8α链进行比较，仅存在2个氨基酸差异(粗体和下划线)。
一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:9)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-17Vα(TRAV7D-2*01/TRAJ12*01)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:10)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-38Vα(TRAV7D-2*01/TRAJ12*01)：
在某些实施方案中，前导甲硫氨酸和/或信号序列在翻译后修饰的蛋白质中被切割。
2.mTCR-1、2、3、6、8、10、11、17和38Vβ结构域的蛋白质序列
一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:11)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-1、2、8、11、17和38Vβ结构域(TRBV13-1*01/TRBJ2-4*01)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:12)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-3Vβ结构域(TRBV13-1*01/TRBJ2-4*01)：
具有TCR-3Vβ的mTCR-1和mTCR-2之间仅存在一个氨基酸差异(粗体和下划线)。
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:13)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-6Vβ结构域(TRBV13-1*01/TRBJ2-4*01)：
与mTCR-1、2、8和11仅存在一个氨基酸差异，与mTCR-3仅存在2个氨基酸差异，与mTCR-10仅存在3个氨基酸差异。
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:14)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-10Vβ结构域(TRBV13-1*01/TRBJ2-4*01)：
mTCR-6Vβ与TCR-10Vβ之间存在3个氨基酸差异(粗体和下划线)。
在某些实施方案中，前导甲硫氨酸和/或信号序列在翻译后修饰的蛋白质中被切割。
3.全长mTCR-1、2、3、6、8、10、11、17和38α链的蛋白质序列
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:15)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-1α链(TRAV7D-2*01/TRAJ30*01/TRAC)：
mTCR-1、2、3、6、8、10和11α链的恒定区(Cα)(粗体)是相同的，并且它们与来自HLA-A2 Tg小鼠的hgp100特异性TCRα链C区相同。
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:16)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-2α链(TRAV7D-2*01/TRAJ30*01/TRAC)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:17)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-3α链(TRAV7D-2*01/TRAJ12*01/TRAC)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:18)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-6α链(TRAV7D-2*01/TRAJ30*01/TRAC)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:19)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-8α链(TRAV7D-2*01/TRAJ12*01/TRAC)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:20)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-10α链(TRAV7D-2*01/TRAJ12*01/TRAC)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:21)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-11α链(TRAV7D-2*01/TRAJ12*01/TRAC)：
一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:22)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-17α链(TRAV7D-2*01/TRAJ12*01/TRAC)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:23)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-38α链(TRAV7D-2*01/TRAJ12*01/TRAC)：
在某些实施方案中，前导甲硫氨酸和/或信号序列在翻译后修饰的蛋白质中被切割。
在一个实施方案中，基于IMGT和Uniprot网站上的命名法，认为mTCRα链特征如下：
1.M1-S20：在TCRα链成熟时将被移除的前导序列
2.Q21-S268：TCR-1、2、3α链
3.Q21-N132(或D132)：α链V区
4.I133-S268：与特异于hgp100的HLA-A2小鼠TCR相同的TCRα链C区(DQ452619)
5.Q21-L242：TCRα链细胞外结构域
6.S243-L263：成熟TCRα链的跨膜区
7.R264-S268：成熟TCRα链的胞内区
4.全长mTCR-1、2、3、6、8、10、11、17和38β链的蛋白质序列
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:24)具有与90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-1、2、8、11、17和38β链(TRBV13-1*01/TRBJ2-4*01/TRBC1)：
mTCR-1、2、3、6、8、10、11、17和38β链的恒定区(Cβ)(粗体)是相同的，并且它们与来自HLA-A2 Tg小鼠的hgp100特异性TCRβ链C区相同。
在某些实施方案中，前导甲硫氨酸和/或信号序列在翻译后修饰的蛋白质中被切割。
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:25)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-3β链(TRBV13-1*01/TRBJ2-4*01/TRBC1)
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:26)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-6β链(TRBV13-1*01/TRBJ2-4*01/TRBC1)
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:27)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-10β链(TRBV13-1*01/TRBJ2-4*01/TRBC1)
在某些实施方案中，前导甲硫氨酸和/或信号序列在翻译后修饰的蛋白质中被切割。
在一个实施方案中，基于IMGT和Uniprot网站上的命名法，mTCRα链特征如下：
1.M1-M17：在mTCRβ链成熟时将被移除的前导序列
2.E18-S304：mTCRβ链
3.E18-L131：mTCRβ链V区(TRBV13-1*01/TRBJ2-4*01，其中S113(TCR-1&2)或A113(TCR-3)-A116为D区)
4.E132-S304：特异于hgp100的HLA-A mTCR的mTCRβ链C1区(DQ452620)
5.E18-Y276：mTCRβ链细胞外结构域
6.E277-M298：成熟mTCRβ链的跨膜区
7.V299-S304：成熟mTCRβ链胞内(拓扑)区
5.mTCR-1、2、3、6、8、10、11、17和38α链的CDR3区的蛋白质序列
一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:28)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-1α链CDR3区：
AASITNAYKVIFGKGTHLHVLPNIQNPE
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:29)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-2α链CDR3区：
AASTVNAYKVIFGKGTHLHVLPNIQNPE
一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:30)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-3α链CDR3区：
AASMAGGYKVVFGSGTRLLVSPDIQNPE
一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:31)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-6α链CDR3区：
AASMINAYKVIFGKGTHLHVLPNIQNPE
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:32)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-8α链CDR3区：
AASISGGYKVVFGSGTRLLVSPDIQNPE
一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:33)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-10α链CDR3区：
AASIVGGYKVVFGSGTRLLVSPDIQNPE
一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:34)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-11α链CDR3区：
AASKTGGYKVVFGSGTRLLVSPDIQNPE
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:35)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-17α链CDR3区：
AASMTGGYKVVFGSGTRLLVSPDIQNPE
一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:36)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-38α链CDR3区：
AATLTGGYKVVFGSGTRLLVSPDIQNPE
6.mTCR-1、3、6和10β链的CDR3区的蛋白质序列
一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:37)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-1β链CDR3区：
ASSDAGTSQNTLYFGAGTRLSVL
一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:38)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-3β链CDR3区：
ASSDAGTAQNTLYFGAGTRLSVL
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:39)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-6β链CDR3区：
ASSDAGVSQNTLYFGAGTRLSVL
一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:40)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的mTCR-10β链CDR3区：
ASSDHGTGQNTLYFGAGTRLSVL
7.mTCR-1、2、3、6、8、10、11、17和38α链的细胞外结构域(对于可溶性TCR)(下划线是Vα)
TCRα链和β链的细胞外结构域可形成可溶性TCR。如果将它们用可检测的标记物(例如荧光分子)标记，则可将它们用于检测肿瘤细胞上存在的HLA-A2/hAFP158复合物。标记的可溶性TCR具有作为诊断试剂以检测血液中的循环肿瘤细胞以及确定肿瘤组织中的同源抗原表位呈递的潜力，这对于成功将此类TCR-T细胞用于过继细胞转移疗法的环境非常重要。
一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:41)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的可溶性mTCR-1α链(Q21-L242)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:42)具有至少90％、95％、99％、100％序列同一性的可溶性mTCR-2α链(Q21-L242)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:43)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的可溶性mTCR-3α链(Q21-L242)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:44)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的可溶性mTCR-6α链(Q21-L242)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:45)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的可溶性mTCR-8α链(Q21-L242)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:46)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的可溶性mTCR-10α链(Q21-L242)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:47)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的可溶性mTCR-11α链(Q21-L242)：
一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:48)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的可溶性mTCR-17α链(Q21-L242)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:49)具有90％、95％、99％或100％序列同一性的可溶性mTCR-38α链(Q21-L242)：
8.TCR-1、2、3、6、8、10和11β链的细胞外结构域(下划线是Vβ)
一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:50)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的可溶性mTCR-1、2、8、11β链(E18-Y276)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:51)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的可溶性mTCR-3β链(E18-Y276)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:52)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的可溶性mTCR-6β链(E18-Y276)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:53)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的可溶性mTCR-10β链(E18-Y276)：
9.设计的mTCR的融合蛋白序列
融合蛋白
在另一个实施方案中，提供了包含第一多肽结构域和第二多肽的融合蛋白。融合蛋白可任选地包含靶向融合蛋白特异性细胞或组织(例如肿瘤细胞或与肿瘤细胞相关的新脉管系统)的靶向结构域。
融合蛋白还任选地包含将第一多肽结构域与抗原结合结构域分开的肽或多肽接头结构域。
本文所公开的融合蛋白具有式I：
N-R1-R2-R3-C
其中“N”表示融合蛋白的N端，“C”表示融合蛋白的C端，“R1”是所公开的αmTCR链或其片段中的一者。“R2”是肽/多肽接头结构域，“R3”是βmTCR链或其片段。在另选的实施方案中，R1是βmTCR链或其片段，R3是αmTCR链。
任选地，融合蛋白另外含有用于使两个或更多个融合蛋白二聚化或多聚化的结构域。用于使融合蛋白二聚化或多聚化的结构域可以是单独的结构域，或者可包含在融合蛋白的其他结构域中的一者内。
融合蛋白可以是二聚化或多聚化的。二聚化或多聚化可通过二聚化或多聚化结构域在两个或更多个融合蛋白之间或之中发生。另选地，融合蛋白的二聚化或多聚化可通过化学交联发生。形成的二聚体或多聚体可以是同二聚体/同多聚体或异二聚体/异多聚体。
融合蛋白的模块化性质及其在不同组合中二聚化或多聚化的能力为靶向分子提供了丰富的选择，这些分子的功能是增强对肿瘤细胞微环境的免疫应答。
另一个实施方案提供了根据式II的融合蛋白，
N-R1-R2-R3-R2-R4-C
其中“N”表示融合蛋白的N端，“C”表示融合蛋白的C端，“R1”是所公开的αmTCR链或其片段中的一者。“R2”是肽/多肽接头结构域，“R3”是βmTCR链或其片段，“R4”是抗CD3单链抗体。抗CD3单链抗体是本领域已知的并且可商购获得。
一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:54)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的设计的mTCR-1的融合蛋白(α链加下划线，P2A加粗，β链加双下划线)：
α链加下划线，β链加双下划线，P2A和弗林蛋白酶切割位点(来自US2016/0137715A1)加粗。
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:55)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的设计的mTCR-2(α链、P2A和β链)
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:56)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的设计的mTCR-3(α链、P2A和β链)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:57)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的设计的mTCR-6(α链、P2A和β链)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:58)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的设计的mTCR-8(α链、P2A和β链)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:59)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的设计的mTCR-10(α链、P2A和β链)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:60)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的设计的mTCR-11(α链、P2A和β链)：
一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:61)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的设计的mTCR-17(α链、P2A和β链)：
一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:62)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的设计的mTCR-38(α链、P2A和β链)：
10.设计的TCR-1、TCR-2、TCR-3、TCR-6、TCR-8、TCR-10、TCR-11、TCR-17和TCR-38的核苷酸序列：
该序列基于上述蛋白质序列，并为在人细胞中表达而优化了密码子。
一个实施方案提供了具有与(SEQ ID NO:63)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的核酸序列的设计的mTCR-1(α加下划线，P2A加粗，β加双下划线)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:64)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的设计的mTCR-2(α加下划线，P2A加粗，β加双下划线)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:65)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的设计的mTCR-3(α加下划线，P2A加粗，β加双下划线)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:66)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的设计的mTCR-6(α加下划线，P2A加粗，β加双下划线)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:67)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的设计的mTCR-8(α加下划线，P2A加粗，β加双下划线)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:68)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的设计的mTCR-10(α加下划线，P2A加粗，β加双下划线)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:69)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的设计的mTCR-11(α加下划线，P2A加粗，β加双下划线)：
一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:70)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的设计的mTCR-17(α加下划线，P2A加粗体，β加双下划线)：
另一个实施方案提供了与(SEQ ID NO:71)具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的设计的mTCR-38(α加下划线，P2A加粗，β加双下划线)：
B.经基因工程改造的T细胞
另一个实施方案提供了经基因工程改造的CD8+免疫细胞，其表达所公开的小鼠TCR基因以产生与在肿瘤细胞表面上表达的hAFP或其片段特异性结合的TCR。优选地，免疫细胞是人T细胞，例如人细胞毒性T细胞。经工程改造的人细胞毒性T细胞可以是自体人细胞毒性T细胞。TCR基因可进行密码子优化。
另一个实施方案提供了经基因工程改造以表达所公开的小鼠TCR基因的CD4+免疫细胞，优选人CD4+免疫细胞。CD4+细胞包括T辅助细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。经工程改造的人CD4+免疫细胞可以是自体人T辅助细胞。可对TCR基因进行密码子优化。
在该项研究中鉴定出的9个hAFP158特异性小鼠TCR能够使CD4 T细胞具有结合Tet158四聚体的能力，表明它们具有高亲和力且不依赖于CD8的帮助。CD4在过继细胞疗法中的作用尚不清楚。但CD4 TCR-T细胞响应HepG2肿瘤细胞的刺激而产生IL-2可能为维持T细胞增殖提供细胞因子。此外，CD4 TCR-T细胞显示出对HepG2肿瘤细胞的低细胞毒性。因此，尽管CD8 TCR-T可能是杀伤hAFP+肿瘤细胞的主要参与者，但CD4 TCR-T可为T细胞增殖提供帮助，这对于产生体内抗肿瘤作用可为至关重要的。
据信，与人TCR相比，小鼠TCR可在人宿主细胞的表面上提供增加的表达。小鼠TCR也可比外源人TCR更有效地替代人宿主细胞表面上的内源TCR。然而，为避免重复使用TCR-T细胞产生抗TCR反应，可能需要mTCR的人源化。使mTCR人源化的方法是本领域已知的。参见例如美国专利5,861,155和5,859,205、WO2007/131092、EP0460167和Davis等人，ClinCancer Res.，第16卷，第5852–5861页，2010年，其以引用方式全文并入本文。在一个实施方案中，所公开的mTCR基因在被引入T细胞或施用于人类受试者之前被人源化。
C.T细胞杂交瘤
另一个实施方案提供了表达所公开的mTCR多肽的T细胞杂交瘤。例如，杂交瘤可以是将分选的小鼠CD8+Tet158+细胞与缺乏TCRα链和β链的BW-Lyt2.4细胞融合的结果，并如(He.,Y.等人，J Immunol，第174卷，第3808-3817页，2005年)中所述进行选择。实施例中提供了制备杂交瘤的方法。
D.抗体
一个实施方案提供了特异性结合所公开的mTCR蛋白(例如SEQ ID NO:2-62)的抗体。合适的抗体可由本领域技术人员来制备。因此，抗体或抗原结合片段可以是mTCR的激动剂或拮抗剂，或简单地与mTCR或其多肽特异性结合。
在一些实施方案中，所公开的抗体及其抗原结合片段与mTCR或其多肽(例如，SEQID NO:2-62中的任一者)免疫特异性结合。在一些实施方案中，抗体结合mTCR(SEQ ID NO:41-53)的细胞外结构域。
例如，提供了可与所公开的mTCR多肽免疫特异性结合的分子：
(I)排列在细胞(特别是活细胞)的表面上；或者
(II)以内源性浓度排列在细胞(特别是活细胞)的表面上；
还提供了可免疫特异性结合可溶性内源mTCR多肽的组合物。在一些实施方案中，分子减少或阻止可溶性mTCR多肽与其配体结合或以其他方式相互作用。
抗体或其抗原结合片段可使用本领域已知的任何合适方法来制备，诸如下文更详细讨论的那些方法。
1.人和人源化抗体
与所公开的mTCR多肽特异性结合的抗体可以是人或人源化的。许多非人抗体(例如，源自小鼠、大鼠或兔子的非人抗体)在人类中具有天然抗原性，因此当施用于人时会引起不良的免疫反应。因此，在这些方法中使用人或人源化抗体有助于减少抗体施用于人时将引起不良免疫反应的机会。
可采用在不产生内源性免疫球蛋白的情况下能够在免疫时产生完整的人类抗体库的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(J(H))基因的纯合缺失会导致内源性抗体产生的完全抑制。人种系免疫球蛋白基因阵列在此类种系突变小鼠中的转移将导致在抗原攻击时产生人抗体。
任选地，抗体在其他物种中产生并“人源化”以在人体中施用。非人(例如，小鼠)抗体的人源化形式是含有最少的源自非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab’)2或抗体的其他抗原结合子序列)。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体抗体的互补决定区(CDR)的残基被非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠或兔子)的具有期望特异性、亲和力和能力的CDR残基取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被对应的非人残基取代。人源化抗体也可包含既不存在于受体抗体中也不存在于导入的CDR或框架序列中的残基。通常，人源化抗体将包含至少一个可变结构域的基本上全部，并且通常包含两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。最佳地，人源化抗体还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。
用于使非人抗体人源化的方法是本领域众所周知的。一般来讲，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“导入”残基，其通常取自“导入”可变结构域。抗体人源化技术通常涉及使用重组DNA技术来操纵编码抗体分子的一条或多条多肽链的DNA序列。人源化基本上可通过用啮齿动物的CDR或CDR序列取代人抗体的对应序列来执行。因此，非人抗体(或其片段)的人源化形式是嵌合抗体或片段，其中基本上少于完整的人可变结构域已被来自非人物种的对应序列取代。在实践中，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的某些FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代的人抗体。
为了降低抗原性，选择用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链两者)非常重要。根据“最佳拟合”方法，针对已知人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体可变结构域的序列。然后，将最接近啮齿动物序列的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)接受。另一种方法使用源自轻链或重链特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体。
进一步重要的是在保留对抗原高亲和力和其他有利生物学特性的情况下将抗体人源化。为了实现这一目标，可通过使用亲代和人源化序列的三维模型分析亲代序列和各种概念性人源化产品的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是普遍可获得的并且为本领域技术人员所熟悉。可用计算机程序来说明并显示所选的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。对这些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。以这种方式，可从共有序列和导入序列中选择并组合FR残基，从而获得期望的抗体特征，诸如对一种或多种靶抗原增加的亲和力。通常，CDR残基直接且主要基本上参与影响抗原结合。
抗体可与底物结合或用可检测部分标记，或者同时结合与标记。本发明组合物设想的可检测部分包括荧光、酶和放射性标记物。
2.单链抗体
与所公开的mTCR多肽特异性结合的抗体可以是单链抗体。产生单链抗体的方法是本领域技术人员众所周知的。通过使用短肽接头将重链和轻链的可变结构域融合在一起，从而在单个分子上重建抗原结合位点，从而形成单链抗体。在不显著破坏抗原结合或结合特异性的情况下，已经开发出单链抗体可变片段(scFv)，其中一个可变结构域的C端经由15至25个氨基酸肽或接头与另一可变结构域的N端相连。选择接头以允许重链和轻链以其适当的构象取向结合在一起。这些Fv缺乏天然抗体的重链和轻链中存在的恒定区(Fc)。
3.单价抗体
与所公开的mTCR多肽特异性结合的抗体可以是单价抗体。可使用体外方法制备单价抗体。可使用本领域已知的常规技术消化抗体以产生其片段，特别是Fab片段。例如，可使用木瓜蛋白酶进行消化。木瓜蛋白酶消化抗体通常产生两个相同的抗原结合片段，称为Fab片段，每个片段均具有单个抗原结合位点以及一个残留的Fc片段。胃蛋白酶处理产生称为F(ab’)2片段的片段，该片段具有两个抗原结合位点并且仍能够交联抗原。
抗体消化产生的Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域。Fab′片段与Fab片段的区别在于在重链结构域的羧基末端添加了一些残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab’)2片段是包括两个通过铰链区的二硫键连接的Fab'片段的二价片段。Fab’-SH是本文对Fab′的命名，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基。抗体片段最初作为成对的Fab'片段产生，它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
4.杂合抗体
与所公开的mTCR多肽特异性结合的抗体可以是杂合抗体。在杂合抗体中，一个重链和轻链对与在针对一个表位的抗体中发现的重链和轻链对同源，而另一重链和轻链对与在针对另一表位的抗体中发现的重链和轻链对同源。这导致具有多功能化合价的性质，即同时结合至少两个不同表位的能力。可通过产生相应组分抗体的杂交瘤的融合或通过重组技术来形成此类杂合体。此类杂合体当然也可使用嵌合链形成。
5.抗体片段的缀合物或融合物
抗体的靶向功能可通过将抗体或其片段与治疗剂偶联而用于治疗。抗体或片段(例如，免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分)与治疗剂的这种偶联可通过制备免疫缀合物或通过制备融合蛋白(包括抗体或抗体片段和治疗剂)来实现。
抗体或片段与治疗剂的这种偶联可通过制备免疫缀合物、或通过制备融合蛋白、或通过将抗体或片段与核酸(诸如siRNA)连接来实现，这些物质均包括抗体或抗体片段和治疗剂。
在一些实施方案中，修饰抗体以改变其半衰期。在一些实施方案中，期望增加抗体的半衰期，使得其在循环中或在治疗位点存在更长的时间。例如，可能期望在循环中或待治疗的位置上长时间保持抗体的效价。可用延长半衰期的Fc变体工程改造抗体，例如，使用XtendTM抗体半衰期延长技术(Xencor,Monrovia,CA)。在其他实施方案中，减小抗DNA抗体的半衰期以减少潜在的副作用。所公开的缀合物可用于修饰给定的生物学反应。药物部分不应被解释为限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有期望生物活性的蛋白质或多肽。此类蛋白质可包括例如毒素，诸如相思豆毒素、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素。
所公开的抗体和mTCR多肽可与一种或多种可检测标记物缀合或连接。所公开的抗体和mTCR多肽可与至少一种试剂连接以形成检测缀合物。为了提高分子作为诊断剂的功效，其通常与至少一种期望的分子或部分连接或共价结合或复合。此类分子或部分可以是但不限于至少一个报告分子。报告分子被定义为可使用测定法检测到的任何部分。已与抗体或多肽缀合的报告分子的非限制性示例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、发色团、发光分子、光亲和分子、有色颗粒和/或配体，诸如生物素。
E.制剂
可将所公开的抗体、融合蛋白和mTCR多肽配制成药物组合物。包含抗体、融合蛋白或mTCR多肽的药物组合物可通过肠胃外(肌肉内、腹膜内、静脉内(IV)或皮下注射)、透皮(被动或使用离子电渗或电穿孔)或透粘膜(鼻、***、直肠或舌下)施用途径或使用可生物消化的***物进行施用，并可配制成适用于每种施用途径的剂型。
在一些体内方法中，本文所公开的组合物以治疗有效量施用于受试者。如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗、抑制或减轻所治疗疾病的一种或多种症状或以其他方式提供期望药理和/或生理作用的剂量。精确剂量将根据多种因素而变化，诸如受试者依赖性变量(例如年龄、免疫系统健康等)、疾病和所进行的治疗。
对于所公开的组合物，随着进一步研究的进行，将出现关于用于治疗各种患者的各种病症的合适剂量水平的信息，并且普通技术人员考虑到治疗背景、接受者的年龄和总体健康状况将能够确定正确的剂量。所选择的剂量取决于期望的治疗效果、施用途径和期望的治疗时间。对于所公开的免疫调节剂，通常每天以0.001至20mg/kg体重的剂量水平向哺乳动物施用。通常，对于静脉内注射或输注，剂量可以更低。
在某些实施方案中，局部施用所公开的组合物，例如通过直接注射到待治疗的部位。通常，注射引起组合物局部浓度的增加，该浓度高于全身施用所能达到的浓度。
可将组合物与如上所述的基质组合，以通过减少多肽从待治疗部位的被动扩散而有助于增加多肽组合物的局部浓度。
1.肠胃外施用制剂
在一些实施方案中，本文所公开的组合物，包括那些包含肽和多肽的组合物，通过肠胃外注射以水溶液施用。该制剂也可以是悬浮液或乳液的形式。通常，提供了包括有效量的肽或多肽并且任选地包括药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体的药物组合物。此类组合物任选地包括以下中的一者或多者：稀释剂、无菌水、各种缓冲剂内容(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的缓冲盐水；以及添加剂，诸如洗涤剂和增溶剂(例如TWEEN 20(聚山梨醇酯-20)、TWEEN 80(聚山梨醇酯-80))、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)和防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇)和填充物质(例如乳糖、甘露醇)。非水溶剂或媒介物的示例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油和玉米油)、明胶和可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。可在使用前将制剂冻干并重新溶解/重悬。该制剂可通过例如穿过细菌保留过滤器进行过滤、通过将灭菌剂掺入组合物中、通过辐照组合物或通过加热组合物来进行灭菌。
2.口服施用制剂
在实施方案中，组合物被配制用于口服递送。口服固体剂型在Remington'sPharmaceutical Sciences，第18版，1990(Mack Publishing Co.Easton Pa.18042)第89章中进行了一般性描述。固体剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、锭剂或含片、扁囊剂、丸剂、粉剂或颗粒剂，或将材料掺入聚合物化合物诸如聚乳酸、聚乙醇酸等的颗粒制剂或脂质体中。此类组合物可影响所公开的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。参见，例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，(1990,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.18042)第1435-1712页，其以引用方式并入本文。组合物可以液体形式制备，或者可为干燥粉末(例如冻干)形式。可使用脂质体或类蛋白包封配制组合物。可使用脂质体包封，并且脂质体可用各种聚合物衍生化(例如，美国专利5,013,556)。另请参见Marshall,K.In：由G.S.Banker和C.T.Rhodes编辑的Modern Pharmaceutics，第10章，1979年。通常，制剂将包括肽(或其化学修饰形式)和惰性成分，该惰性成分在胃环境中保护肽并在肠中释放生物活性物质。
可对试剂进行化学修饰，从而使衍生物的口服递送有效。通常，所设想的化学修饰是至少一个部分附着于组分分子本身，其中该部分允许从胃或肠吸收到血流中或直接吸收到肠粘膜中。还期望增加一种或多种组分的整体稳定性并增加体内循环时间。PEG化是用于药物用途的示例性化学修饰。可使用的其他部分包括：丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚脯氨酸、聚-1,3-二氧戊环和聚-1,3,6-三氧六环[参见，例如Abuchowski和Davis(1981)，“Soluble Polymer-EnzymeAdducts”，发表于Enzymes as Drugs，Hocenberg和Roberts编辑，(Wiley-Interscience:New York,N.Y.)第367-383页；和Newmark等人，(1982)J.Appl.Biochem.第4卷，第185-189页]。
另一个实施方案提供了用于口服施用的液体剂型，包括药学上可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂和糖浆剂，其可包含其他组分，包括惰性稀释剂、佐剂(诸如润湿剂、乳化剂和助悬剂)以及甜味剂、调味剂和加香剂。
控释口服制剂可能是期望的。可将试剂掺入到允许通过扩散或浸出机制释放的惰性基质例如胶中。也可将缓慢降解的基质掺入到制剂中。控释的另一种形式是基于Oros治疗系统(Alza Corp.)，即药物被包封在半透膜中，该膜由于渗透作用允许水进入并通过单个小开口将药物推出。
对于口服制剂，释放的位置可以是胃、小肠(十二指肠、空肠或回肠)或大肠。在一些实施方案中，通过保护试剂(或衍生物)或通过在胃环境之外(诸如在肠中)释放试剂(或衍生物)来进行释放将避免胃环境的有害作用。为了确保完全的胃抵抗力，在至少pH 5.0下不可渗透的包衣是必不可少的。用作肠溶衣的较常见惰性成分的示例有：偏苯三甲酸醋酸纤维素(CAT)、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP 55、邻苯二甲酸乙酸乙烯酯(PVAP)、Eudragit L30DTM、AquatericTM、邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)、EudragitLTM、Eudragit STM和ShellacTM。这些包衣可用作混合膜。
3.局部施用制剂
所公开的免疫调节剂可局部施用。尽管局部施用在施用于肺、鼻、口腔(舌下、颊)、***或直肠粘膜时尤其有效，但其对大多数肽制剂效果并不理想。
当组合物以气雾剂或喷雾干燥颗粒(空气动力学直径小于约5微米)的形式递送时，组合物可在吸入的同时被递送到肺部并跨过肺上皮内层进入血流。
可使用设计用于治疗产品的肺部递送的多种机械装置，包括但不限于雾化器、计量吸入器和粉末吸入器，这些均是本领域技术人员所熟悉的。可商购获得的装置的一些具体示例是Ultravent雾化器(Mallinckrodt Inc.,St.Louis,Mo.)、Acorn II雾化器(Marquest Medical Products,Englewood,Colo.)、Ventolin计量吸入器(Glaxo Inc.,Research Triangle Park,N.C.)以及Spinhaler粉末吸入器(Fisons Corp.,Bedford,Mass.)。Nektar、Alkermes和Mannkind均具有可吸入胰岛素粉末制剂，这些制剂已获得批准或在临床试验中可将该技术应用于本文所述的制剂。
用于粘膜施用的制剂通常是喷雾干燥的药物颗粒，可将其掺入片剂、凝胶、胶囊、悬浮剂或乳剂中。标准药物赋形剂可从任何配方商处获得。
也可制备透皮制剂。这些通常是软膏、洗剂、喷雾剂或贴剂，所有这些都可使用标准技术制备。透皮制剂可能需要包含渗透促进剂。
4.受控递送聚合物基质
本文所公开的融合蛋白、mTCR多肽和抗体也可以控释制剂的形式施用。控释聚合物装置可被制成用于在植入聚合物装置(棒、柱、膜、盘)或注射剂(微粒)后全身长期释放。基质可以是微粒的形式诸如微球，其中试剂分散在固体聚合物基质或微胶囊中，其中芯的材料与聚合物壳的材料不同，并且肽分散或悬浮在芯中，芯本质上可以是液体或固体。除非本文具体定义，否则微粒、微球和微胶囊可互换使用。另选地，聚合物可被铸成薄片或薄膜(范围从纳米到四厘米不等)，可以是通过研磨或其他标准技术产生的粉末，甚至可以是凝胶，诸如水凝胶。
不可生物降解或可生物降解的基质均可用于递送融合多肽、抗体或编码它们的mTCR多肽或核酸，但在一些实施方案中优选可生物降解的基质。这些可以是天然或合成聚合物，但在一些实施方案中由于降解和释放特性的更好表征而优选合成聚合物。聚合物基于需要释放的时间段来选择。在某些情况下，线性释放可能是最有用的，但在另一些情况下，脉冲释放或“批量释放”可提供更有效的结果。聚合物可以是水凝胶的形式(通常吸收高达约90重量％的水)，并且可任选地与多价离子或聚合物交联。
这些基质可通过溶剂蒸发、喷雾干燥、溶剂萃取和其他技术人员熟知的方法来形成。可生物消化的微球可使用开发用于制备药物递送微球的任何方法来制备，例如，如Mathiowitz和Langer,J.，Controlled Release，第5卷，第13-22页，1987年；Mathiowitz等人，Reactive Polymers，第6卷，第275-283页，1987年；以及Mathiowitz等人，J.Appl.Polymer Sci.，第35卷，第755-774页，1988年中所述。
这些装置可被配制成局部释放以治疗植入或注射区域(通常所提供的剂量比全身治疗所需的剂量要小得多)或全身递送。这些可植入或皮下注射到肌肉、脂肪中，或被吞咽。
III.使用方法
在某些实施方案中，所公开的抗体、mTCR多肽和经工程改造的免疫细胞可用于检测或治疗癌症。优选的待检测、诊断或治疗的癌症包括肝细胞癌或表达hAFP的任何其他癌症。
A.过继转移
在一个实施方案中，将免疫细胞工程改造成表达所公开的mTCR。免疫细胞是T细胞，优选人T细胞。细胞可以是自体的或异源的。细胞通常在体外转导。转导的细胞可任选地在体外扩增以获得可施用于对其有需要的受试者的大群转导细胞。此类受试者通常患有或被认为患有表达hAFP的癌症或肿瘤。T细胞可以是CD8+或CD4+细胞。可以一种或多种剂量将转导细胞施用于受试者。
过继转移可与其他癌症治疗疗法结合使用。此类另外的疗法包括化疗、放疗和手术或其组合。TCR-T的过继转移可与癌症疫苗结合使用，从而使TCR-T在体内进一步扩增，以减少转移的TCR-T细胞数量和相关的毒性。
一个实施方案提供了一种通过施用表达所公开的mTCR中的一者的经工程改造的T细胞来减轻对其有需要的受试者的肿瘤负担的方法，其中经工程改造的mTCR细胞抑制或减少表达hAFP的肿瘤。受试者可任选地用癌症的联合疗法进行治疗。优选的待治疗的癌症是肝细胞癌。
B.检测或诊断
所公开的抗体或mTCR多肽可如上所述进行标记。标记的多肽可应用于癌细胞样本，其中标记的多肽与癌细胞样本的特异性结合指示包括肝细胞癌在内的hAFP特异性癌症。
标记的检测可任选地量化以确定样本中的癌细胞数量。样本通常是肝组织样本，但可包括血液或血清样本。
IV.组合物和试剂盒
还提供了组合物和试剂盒。此类试剂盒可包括容器，每个容器具有在该方法中利用的各种试剂(通常为浓缩形式)中的一者或多者，包括例如已附着于标记物的或任选地具有用于将结合剂与抗体(以及标记物本身)偶联的试剂的一种或多种结合剂(抗体)、缓冲液和/或用于分离(任选地通过显微解剖)以支持本发明实践的试剂和仪器。通常还将包括描述本发明的配体检测方法中试剂盒组分的标签或指示或其一组使用说明，其中该说明可与试剂盒或其组分的包装说明书和/或包装有关。
另外的实施方案提供了与本文所述的免疫检测方法一起使用的免疫检测试剂盒。
由于抗体或mTCR多肽通常用于检测hAFP，因此试剂盒中通常会包括抗体和mTCR多肽。因此，免疫检测试剂盒将在合适的容器装置中包括与mTCR多肽结合的第一抗体和/或任选地免疫检测试剂。
试剂盒的免疫检测试剂可采用多种形式中的任一种，包括与给定抗体缔合和/或与给定抗体连接的那些可检测标记。还设想了与二级结合配体缔合和/或附着的可检测标记。示例性的二级配体是对第一抗体具有结合亲和力的那些二级抗体。
用于本试剂盒的其他合适的免疫检测试剂包括双组分试剂，该双组分试剂包括对第一抗体具有结合亲和力的第二抗体以及对第二抗体具有结合亲和力的第三抗体，该第三抗体与可检测标记连接。如本文所述，许多示例性标记在本领域中是已知的，并且/或者所有此类标记均可适当地与本发明结合使用。
试剂盒还可包括用于治疗癌症的治疗剂，诸如表达所公开的mTCR多肽的经工程改造的免疫细胞。
实施例
实施例1：用lv初免和肽增强免疫AAD小鼠可诱导高水平的hAFP158特异性CD8 T细胞，该细胞可识别和杀伤人HepG2肿瘤细胞。
材料和方法
小鼠：HLA-A2转基因AAD小鼠(Pichard,V.等人，J Immunother，第31卷，第246-253页，2008年)和NSG小鼠购自Jackson实验室，并饲养于特定的无病原体动物设施中。动物实验方案已获得奥古斯塔大学动物护理和使用委员会的批准。
免疫：如(Morgan,RA.等人，J Immunother，第36卷，第133-151页，2013年)描述的，用表达hAFP或流感病毒M1蛋白的重组慢病毒载体(lv)皮下免疫小鼠。十二天后，如(Linette,G.P.等人，Blood，第122卷，第863-871页，2013年)描述的，用hAFP158(FMNKFIYEI)(SEQ ID NO:1)或M158(GILGFVFTL)(SEQ ID NO:72)肽以及PolyI:C和抗CD40抗体一起增强小鼠。
结果
为了诱导能够识别人HLA-A2呈递的hAFP表位的小鼠CD8 T细胞，用重组hAFP-lv免疫HLA-A2转基因AAD小鼠。AAD小鼠表达人HLA-A2α1-α2结构域和小鼠H-2dα3结构域的嵌合MHC I分子，该分子结合小鼠CD8分子以帮助免疫引发(Pichard,V.等人，J Immunother，第31卷，第246-253页，2008年)。研究发现，hAFP-lv免疫在AAD小鼠中重复诱导适当水平的hAFP158表位特异性CD8应答(图1A)。然而，检测CD8应答并未针对先前在人体内鉴定的其他3个hAFP表位(hAFP137、hAFP325和hAFP542)(Vora,S.R.等人，Oncologist，第14卷，第717-725页，2009年)(数据未显示)进行检测。单独用hAFP158肽免疫未诱导可测量的CD8应答。但用hAFP158表位增强免疫显著增加了hAFP-lv初免小鼠而非hAFP158肽初免小鼠(图1A)中hAFP158特异性CD8应答的强度。至关重要的是，来自免疫小鼠的小鼠CD8 T细胞与hAFP+共培养后可产生IFNγ，而与hAFP-、HepG2肿瘤细胞共培养后则不能(图1B)。该数据表明，hAFP疫苗激活的小鼠CD8 T细胞能够识别hAFP+HepG2肿瘤细胞并对其产生应答。此外，在与免疫小鼠的脾细胞共培养过夜后，hAFP+HepG2肿瘤细胞以剂量依赖性方式被杀伤(图1C)。这些数据共同表明，用hAFP-lv初免和hAFP158肽增强免疫AAD小鼠可诱导高水平的hAFP158特异性CD8 T细胞，该细胞可识别和杀伤hAFP+人HepG2肿瘤细胞。
实施例2：用hAFP-lv和hAFP158免疫的AAD小鼠的脾细胞的过继转移不仅可预防NSG小鼠中的大型HepG2肿瘤异种移植物并且可将其根除。
材料和方法
将未免疫或免疫小鼠的总共1500万个脾细胞(150万个hAFP158特异性CD8 T细胞)注射到NSG小鼠中，然后用HepG2肿瘤细胞对其进行攻击。在治疗模型中，当肿瘤直径达到2cm时向NSG小鼠共注射1500万个免疫小鼠脾细胞。用类似的数据进行两次实验。
结果
在本过继转移实验中，发现用hAFP-lv和hAFP158肽免疫的AAD小鼠的脾细胞而非未免疫小鼠的脾细胞可完全预防NSG小鼠的HepG2肿瘤细胞攻击(图2A和图2B)。大约10％的免疫小鼠脾细胞对hAFP158肽有反应而产生IFNγ。从免疫的AAD小鼠中显著过继转移脾细胞可完全根除直径达20mm的HepG2肿瘤(图2C)。
实施例3：hAFP158特异性小鼠CD8 T细胞的过继转移根除了NSG小鼠中的人HepG2肿瘤。
材料和方法
为了进一步鉴定负责根除已建立的HepG2肿瘤的免疫细胞，使用CD8磁珠从用hAFP-lv和hAFP158肽免疫的AAD小鼠中分离CD8 T细胞(图3A)。还从用表达流感病毒M1抗原和M158肽的lv免疫的AAD小鼠中分离CD8 T细胞并将其用作对照。
细胞系：HEK293T细胞和人肝癌细胞系HepG2购自ATCC。Huh7(HLA-A11)的HCC细胞系由佐治亚州癌症中心的Ande博士赠送，AFP-HepG2细胞由奥古斯塔大学的She Jingxiong博士提供。通过蛋白质印迹和免疫染色验证hAFP表达和HLA类型。将细胞在含10％FBS的DMEM培养基中培养。
免疫：如(Morgan,RA.等人，J Immunother，第36卷，第133-151页，2013年)描述的，用表达hAFP或流感病毒M1蛋白的重组慢病毒载体(lv)皮下免疫小鼠。十二天后，如(Linette,G.P.等人，Blood，第122卷，第863-871页，2013年)描述的，用hAFP158(FMNKFIYEI)(SEQ ID NO:1)或M158(GILGFVFTL)(SEQ ID NO:72)肽以及PolyI:C和抗CD40抗体一起增强小鼠。
肿瘤接种：将五百万个HepG2肿瘤细胞接种到NSG小鼠的侧腹。每隔一天监测肿瘤生长情况。
结果
发现从hAFP免疫的小鼠中过继转移CD8 T细胞可根除NSG小鼠的HepG2肿瘤(图3B)。相比之下，在接受来自流感病毒M1抗原免疫小鼠的CD8 T细胞的NSG小鼠中，HepG2肿瘤继续生长。接下来，通过Tet158四聚体染色和细胞分选进一步分离hAFP158-特异性CD8 T细胞(图3C)。过继转移后，虽然Tet158-CD8 T细胞未抑制HepG2肿瘤的生长，但Tet158+CD8 T细胞却可根除NSG小鼠中的HepG2肿瘤(图3D)。体外和体内数据共同验证了特异于HLA-A2呈递的hAFP158表位的小鼠CD8 T细胞可识别和杀伤人HCC肿瘤细胞。
实施例4：由Tet158+CD8 T细胞形成的T细胞杂交瘤与HLA-A2/hAFP158四聚体结合，并且一些对hAFP+HepG2肿瘤细胞有反应而产生IL-2。
材料和方法
T细胞杂交瘤：T细胞杂交瘤通过将分选的小鼠CD8+Tet158+细胞与缺乏TCRα链和β链的BW-Lyt2.4细胞融合来形成，并如(He.,Y.等人，J Immunol，第174卷，第3808-3817页，2005年)中所述进行选择。
免疫和四聚体染色：脾细胞用表面标记物和抗Vβ抗体板(BD Biosciences,SanDiego,CA)进行染色。HLA-A2/hAFP158四聚体(Tet158)由埃默里大学的NIH四聚体中心实验室友情提供。
结果
为了鉴定和克隆来自单个T细胞的成对TCRα链和β链基因，建立了T细胞杂交瘤细胞系。在生成T细胞杂交瘤之前，使用抗Vβ板抗体表征TCR Vβ链。数据显示，>90％的Tet158+CD8 T细胞可用抗Vβ8.3抗体染色(图11A至图11B)。其余不到10％的Tet158+CD8 T细胞可用抗Vβ2、Vβ5.1/5.2、Vβ4和Vβ11的抗体染色。接下来，使用分选的Tet158+ CD8 T细胞从两个细胞融合实验中获得了总共39个可被Tet158四聚体染色的T细胞杂交瘤克隆(数据未显示)。其中，有5个克隆可对hAFP+HepG2肿瘤细胞的刺激有反应并产生IL-2(图4A)，而其他34个杂交瘤则不产生或产生极低水平的IL-2(数据未显示)。共5个杂交瘤可被抗Vβ8.3抗体染色(图4B)。进一步的分析表明，这5个T细胞杂交瘤可与Tet158四聚体结合，但具有不同的平均荧光强度(图4C)，表明它们的TCR对HLA-A2/hAFP158复合物的亲和力可能不同。另一方面，剩余的34个T细胞杂交瘤中有4个由不能被抗Vβ8.3抗体染色的Vβ链组成(数据未显示)。
实施例5：从14个T细胞杂交瘤中鉴定出九组成对的TCRα链和β链基因。
材料和方法
鉴定TCRα链和β链基因：从T细胞杂交瘤中分离总RNA。进行了5-RACE技术(Hong,Y.等人，Hepatology，第59卷，第1448-1458页，2014年)以扩增TCRα链和β链基因。用oligo dT引物制备cDNA，然后将PolyC添加到cDNA的5末端。通过使用5'pGI引物(CACCGGGIIGGGIIGGGIIGG)(SEQ ID NO:73)和与α链(GGCATCACAGGGAACG)(SEQ ID NO:74)或β链(CCAGAAGGTAGCAGAGACCC)(SEQ ID NO:75)的恒定(C)区对应的3'引物进行PCR。基于获得的TCRα和β可变(V)区的部分序列，对应于α(ATGAAATCCTTTAGTATTTCCC)(SEQ ID No:76)或β(ATGGGCTCCAGGCTCTTTCTG)(SEQ ID NO:77)链的V区的特异性引物与αC区(GCACATTGATTTGGGAGTC)(SEQ ID No:78)或βC区：(GGGTAGCCTTTTGTTTGTTTG)(SEQ ID NO:79)的内部引物一起使用以扩增和验证V区。最后，获得并验证TCRα链和β链的序列。
结果
在本实验中，对在与HepG2肿瘤细胞共培养后能够产生IL-2的14个杂交瘤的成对TCRα链和β链基因进行扩增并测序。结果汇总于表1中。在14个杂交瘤中，鉴定出9组独特的TCR基因。TCR2(克隆1G8)和TCR4(克隆2F6)的序列相同，TCR3(克隆10A3)和TCR5(克隆6D9)的序列也相同。TCR6(克隆5B3)、TCR7(克隆5B10)和TCR13(克隆11B10)相同，TCR38(克隆2C3)和TCR39(克隆3E4)也相同。然后将TCR1-3、6、8、10、11、17和38的α链和β链的氨基酸序列与NCBI和IMGT数据库进行比较。序列数据显示，所有九条TCRα链均具有相同的可变区(TRAV7D-2)，并且TCRβ链也共享相同的可变区(TRBV13-1)，这与来自抗Vβ8.3抗体染色(图16)的数据一致。详细分析表明，TCR1和TCR2的序列非常相似。TCR1和TCR2的β链相同，而TCR1和TCR2的α链在V-J连接处有两个氨基酸差异。另一方面，TCR3与TCR1和TCR2的差别更大。尽管TCR3的β链与TCR1和TCR2仅存在一个氨基酸差异，但α链的J区由不同的J基因编码。TCR1和TCR2α链的J基因为TRAJ30，而TCR3α链的J基因为TRAJ12。
在α链(图17A)和β链(图17B)的CDR3区中发现了本文鉴定的9个TCR基因中的所有氨基酸差异。
表1.TCR基因克隆汇总
表1.汇总了14条配对的TCRα链和β链。TCR4和TCR2相同。TCR5和TCR3相同。TCR6、TCR7和TCR13相同。TCR38和TCR39相同。
1.TCRA-1和TCRA-2的蛋白质序列在V-J连接之间存在2AA差异
2.TCRA-3与TCRA-1和TCRA-2明显不同。实际上，TCRA-3的J区与TCRA-1和TCRA-2完全不同。
3.TCRB-1和TCRB-2的蛋白质序列相同。
4.TCRB-3和TCRB-1的蛋白质序列相同，除了在V-D连接之间有一个从丝氨酸(116S)到丙氨酸(116A)的AA差异。
5.V-J之间的TCRB中的D区为9nt，与数据库中的任何序列均无明显同源性。
实施例6：配对的TCRα链和β链基因在原代人T细胞中的表达形成了与Tet158四聚体结合的功能性TCR。
材料和方法
TCR基因和重组lv：使用上述鉴定的V-D-J区和C区设计并合成TCRα链和β链基因。将P2A序列(Cho、H.I.等人，Cancer Res，第69卷，第9012-9019页，2009年)***到α链和β链之间以分离α链和β链。将整个基因进行密码子优化并克隆到lv中。
人T细胞的转导：通过阴性选择从血沉棕黄层中分离出人T细胞。然后加入CD3/CD28四聚体抗体复合物(Stemcell Technologies,Vancouver)以活化细胞，2天后用重组lv进行转导。
结果
在该实验中，研究了hAFP特异性TCR基因是否可以工程改造人T细胞以产生TCR重定向的T细胞(TCR-T)，以及此类TCR-T细胞是否会获得特异性识别和杀伤hAFP+肿瘤细胞的能力。为此，合成了三个TCR基因(TCR1、TCR2和TCR3)并将其克隆到lv中。将P2A序列***到TCRα基因和β基因之间，以在靶T细胞中产生数量相等的TCRα链和β链(图5A)。为了研究TCRα链和β链在表达后是否能形成功能性TCR，用TCR-lv转导Jurkat细胞，并且发现三组TCR基因中的任一组的基因转移均可有效地使Jurkat细胞具有结合Tet158四聚体的能力，表明Jurkat细胞中的TCR基因表达能够形成功能性TCR(图5B)。接下来，研究了这些TCR基因是否能够工程改造原代人T细胞以使其重定向从而识别HLA-A2/hAFP158复合物。首先，发现健康供体的人T细胞可在CD3/CD28激活后被重组lv有效地转导。使用GFP作为报告蛋白，在MOI为10时，约60％的人T细胞可被GFP-lv转导(图12)。接下来，用TCR基因转导原代人T细胞表明，其中约20％-30％可有效结合Tet158四聚体(图5C)。尽管来自不同供体的T细胞可以不同的效率转导，但3组TCR基因之间没有明显的转导差异。然而，与TCR1和TCR2转导的细胞相比，TCR3基因转导的CD8 T细胞和CD4 T细胞上的Tet158四聚体的平均荧光强度(MFI)始终更高，这表明TCR3对HLA-A2/hAFP158的亲和力可更高，这与杂交瘤细胞上Tet158四聚体染色(图4C)的数据一致。CD8 TCR-T细胞和CD4 TCR-T细胞都可结合Tet158四聚体，这表明TCR与HLA-A2/hAFP158的结合不依赖于CD8。然而，CD8 TCR-T上Tet158染色的MFI始终高于CD4 TCR-T细胞上的MFI(图5D)，这表明CD8有助于增强TCR与HLA-A2/hAFP158复合物的结合。另外，TCR-T细胞用抗TCR Vβ8.3或Tet158四聚体染色。Tet158四聚体+细胞的百分比与抗TCR Vβ8.3+细胞的百分比几乎相同(图13)。
实施例7：由HLA-A2呈递的hAFP158肽特异性激活人TCR-T细胞。
材料和方法
在将TCR基因转导的人T细胞与HLA-A2+hAFP+HepG2细胞、HLA-A2+hAFP-HepG2细胞或HLA-A2-hAFP+肿瘤细胞共培养过夜后，通过ELISA检测IFNγ。
结果
为了研究HLA-A2呈递的hAFP158肽是否能特异性激活人TCR-T细胞，在用hAFP158肽冲击的HLA-A2小鼠脾细胞刺激人TCR-T细胞后，检测细胞因子的产生。数据表明，用hAFP158肽冲击的HLA-A2细胞可特异性刺激人TCR-T细胞产生IFNγ。相比之下，在用流感病毒M1肽刺激后的人TCR-T培养物中未检测到IFNγ。模拟转导的人T细胞对hAFP158肽刺激没有反应(图14A)。IFNγ的产生主要来自CD8 T细胞(图14B)，而IL2也由CD4 T细胞产生(图14C)。接下来，我们发现人TCR-T细胞可被HLA-A2+hAFP+HepG2肿瘤细胞激活而产生IFNγ。相比之下，HLA-A2+hAFP-或HLA-A2-hAFP+人肿瘤细胞不能激活TCR-T细胞(图6A)。同样，IFNγ主要在CD8 TCR-T细胞中产生(图6B)。但是，CD4(图6C)和CD8(图6B)TCR-T细胞均能够产生IL-2。同样，三个TCR之间没有显著差异。此外，研究了HepG2肿瘤细胞对TCR-T增殖的诱导。我们发现，在与HepG2肿瘤细胞共培养之后，人TCR-T细胞(特别是CD8 T细胞)经历了显著的增殖(图6D)。
实施例8：人CD8 TCR-T细胞对HLA-A2+hAFP+肿瘤细胞具有强而特异性的细胞毒性。
材料和方法
细胞因子的ELISA：IFNγ和IL-2的ELISA按照制造商(Biolegend,San Diego,CA)指导的进行。
细胞毒性测定：将TCR-T细胞添加到正在生长的HepG2肿瘤细胞中。按照(Promega,Madison,WI)指导的，使用LDH测定法进行细胞毒性测定。
碘化丙啶(PI)染色：按照(BD Biosciences,San Diego,CA)指导的，用PI染色死细胞。
结果
在该实验中，研究了人TCR-T细胞的细胞毒性活性。使用LDH测定，我们首先发现，在E/T比为5时，人TCR-T细胞可在共培养的24小时内有效杀伤80％的HepG2肿瘤细胞。相比之下，TCR-T细胞对AFP-或HLA-A2-肿瘤细胞没有产生明显的细胞毒性作用(图7A)。对HepG2肿瘤细胞的细胞毒性是剂量依赖性的(图7B)。即使在E/T比为0.5的情况下(Tet158+细胞约为30％，因此Tet158四聚体+T细胞与靶细胞的比例仅为0.15)，共培养24小时后杀伤率也>50％。通过使用纯化的CD8 T细胞和CD4 T细胞进行细胞毒性测定，我们发现HepG2肿瘤细胞的杀伤活性主要来自于CD8 T细胞(图7C至图7E)。然而，CD4 TCR-T细胞也具有低水平的细胞毒性，在1.5/1的比例下导致特异性杀伤15％的HepG2肿瘤细胞(图7E)。共培养24小时后，CD8 TCR-T细胞环绕(可被吸引至)HepG2肿瘤细胞以形成簇(图7D)。另一方面，CD4 TCR-T和模拟转导的T细胞没有形成明显的簇。另外，PI染色显示该簇中的大多数肿瘤细胞是死细胞(图7F)。与LDH测定一致，大部分细胞毒性活性来自于CD8 TCR-T细胞。PI染色显示，CD4TCR-T细胞具有较低的hepG2肿瘤细胞杀伤活性(15％)，这与LDH测定一致。模拟转导的人T细胞不诱导HepG2肿瘤细胞的细胞死亡。
实施例9：人TCR-T的过继转移对NSG小鼠的HepG2肿瘤产生抗肿瘤作用。
材料和方法：
为了研究人TCR-T的体内抗肿瘤作用，将携带4天HepG2肿瘤的NSG小鼠用2,000万个人TCR-T细胞进行过继转移。通过测量长度、宽度和高度来监测肿瘤的生长。肿瘤体积计算为1/2(长×宽×高)。
结果：
在该实验中，研究了人TCR-T细胞的体内抗肿瘤作用。用lv转导原代人T细胞，在过继转移之前，约40％的总T细胞(25％的CD8 T细胞和54％的CD4 T细胞)是Tet158+TCR-T细胞(图11A)。我们发现人TCR-T细胞的过继转移可抑制NSG小鼠中HpeG2肿瘤的生长(图11B)。经TCR-T处理的小鼠中有一只出现肿瘤，但经过继转移3周后肿瘤被根除(图11C至图11D)。转移的人T细胞动力学显示，在不存在人IL-2的情况下，模拟T和TCR-T细胞均存活约3-4周(图11E)。但是与模拟T细胞相比，TCR-T中Tet158+细胞的百分比在转移后第8天显著增加，尤其是CD4 TCR-T细胞(图11F)，表明可能存在抗原诱导的TCR-T扩增。
序列表
<110> 奥古斯塔大学研究所公司
何玉凯
朱伟
E·塞利斯
彭一兵
王岚
<120> 人甲胎蛋白特异性T细胞受体及其用途
<130> 064466.067
<150> 62/505,406
<151> 2017-05-12
<150> 62/609,614
<151> 2017-12-22
<150> 62/625,051
<151> 2018-02-01
<160> 105
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Phe Met Asn Lys Phe Ile Tyr Glu Ile
1 5
<210> 2
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
Met Lys Ser Phe Ser Ile Ser Leu Val Val Leu Trp Leu Gln Leu Asn
1 5 10 15
Trp Val Asn Ser Gln Gln Lys Val Gln Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ile
20 25 30
Val Pro Glu Gly Gly Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg
35 40 45
Asn Val Asp Tyr Phe Trp Trp Tyr Arg Gln His Ser Gly Lys Ser Pro
50 55 60
Lys Met Leu Met Ser Ile Phe Ser Asn Gly Glu Lys Glu Glu Gly Arg
65 70 75 80
Phe Thr Val His Leu Asn Lys Ala Ser Leu His Thr Ser Leu His Ile
85 90 95
Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ala Ser
100 105 110
Ile Thr Asn Ala Tyr Lys Val Ile Phe Gly Lys Gly Thr His Leu His
115 120 125
Val Leu Pro Asn
130
<210> 3
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
Met Lys Ser Phe Ser Ile Ser Leu Val Val Leu Trp Leu Gln Leu Asn
1 5 10 15
Trp Val Asn Ser Gln Gln Lys Val Gln Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ile
20 25 30
Val Pro Glu Gly Gly Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg
35 40 45
Asn Val Asp Tyr Phe Trp Trp Tyr Arg Gln His Ser Gly Lys Ser Pro
50 55 60
Lys Met Leu Met Ser Ile Phe Ser Asn Gly Glu Lys Glu Glu Gly Arg
65 70 75 80
Phe Thr Val His Leu Asn Lys Ala Ser Leu His Thr Ser Leu His Ile
85 90 95
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<223> 合成的
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<223> 合成的
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Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr
165 170 175
Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly
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Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe
195 200 205
Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala
210 215 220
Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln
225 230 235 240
Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly
245 250 255
Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
260 265
<210> 23
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
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1 5 10 15
Trp Val Asn Ser Gln Gln Lys Val Gln Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ile
20 25 30
Val Pro Glu Gly Gly Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg
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Asn Val Asp Tyr Phe Trp Trp Tyr Arg Gln His Ser Gly Lys Ser Pro
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Lys Met Leu Met Ser Ile Phe Ser Asn Gly Glu Lys Glu Glu Gly Arg
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Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ala Thr
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Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp
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Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr
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Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly
180 185 190
Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe
195 200 205
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210 215 220
Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln
225 230 235 240
Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly
245 250 255
Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
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<211> 304
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 24
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1 5 10 15
Met Glu Ala Ala Val Thr Gln Ser Pro Arg Asn Lys Val Thr Val Thr
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Gly Gly Asn Val Thr Leu Ser Cys Arg Gln Thr Asn Ser His Asn Tyr
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<211> 304
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val
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Leu Val Ser Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser
290 295 300
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<211> 304
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 26
Met Gly Ser Arg Leu Phe Leu Val Leu Ser Leu Leu Cys Thr Lys His
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Met Glu Ala Ala Val Thr Gln Ser Pro Arg Asn Lys Val Thr Val Thr
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<220>
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<223> 合成的
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<220>
<223> 合成的
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<223> 合成的
<400> 32
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<223> 合成的
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<220>
<223> 合成的
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<223> 合成的
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<220>
<223> 合成的
<400> 41
Gln Gln Lys Val Gln Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ile Val Pro Glu Gly
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Gly Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg Asn Val Asp Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 42
Gln Gln Lys Val Gln Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ile Val Pro Glu Gly
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Gly Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg Asn Val Asp Tyr
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Phe Trp Trp Tyr Arg Gln His Ser Gly Lys Ser Pro Lys Met Leu Met
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65 70 75 80
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 43
Gln Gln Lys Val Gln Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ile Val Pro Glu Gly
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<211> 222
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<220>
<223> 合成的
<400> 44
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成的
<400> 45
Gln Gln Lys Val Gln Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ile Val Pro Glu Gly
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<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 46
Gln Gln Lys Val Gln Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ile Val Pro Glu Gly
1 5 10 15
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50 55 60
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100 105 110
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115 120 125
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 47
Gln Gln Lys Val Gln Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ile Val Pro Glu Gly
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Tyr Lys Val Val Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Leu Val Ser Pro Asp
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Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg Ser
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Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn
130 135 140
Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr Val
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Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp
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Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn
180 185 190
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65 70 75 80
Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ala Ser Met Thr Gly Gly
85 90 95
Tyr Lys Val Val Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Leu Val Ser Pro Asp
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115 120 125
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<223> 合成的
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<223> 合成的
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<220>
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<400> 53
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<220>
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<223> 合成的
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<211> 602
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<210> 57
<211> 602
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 57
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195 200 205
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Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln
225 230 235 240
Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly
245 250 255
Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser Gly Ser Arg Ala
260 265 270
Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala
275 280 285
Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Gly Ser Arg Leu Phe
290 295 300
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305 310 315 320
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tccaggctct ttctggtctt gagcctcctg tgtacaaaac acatggaggc tgcagtcacc 960
caaagcccta gaaacaaggt gacagtaaca ggaggaaacg tgacattgag ctgtcgccag 1020
actaatagcc acaactacat gtactggtat cggcaggaca ctgggcatgg gctgaggctg 1080
atccattact catatggtgc tggcaacctt caaataggag atgtccctga tgggtacaag 1140
gccaccagaa caacgcaaga agacttcttc ctcctgctgg aattggcttc tccctctcag 1200
acatctttgt acttctgtgc cagcagtgat gctgggacta gtcaaaacac cttgtacttt 1260
ggtgcgggca cccgactatc ggtgctagag gatctgagaa atgtgactcc acccaaggtc 1320
tccttgtttg agccatcaaa agcagagatt gcaaacaaac gaaaggctac cctcgtgtgc 1380
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gtccacagtg gggtcagcac ggaccctcag gcctacaagg agagcaatta tagctactgc 1500
ctgagcagcc gcctgagggt ctctgctacc ttctggcaca atcctcgaaa ccacttccgc 1560
tgccaagtgc agttccatgg gctttcagag gaggacaagt ggccagaggg ctcacccaaa 1620
cctgtcacac agaacatcag tgcagaggcc tggggccgag cagactgtgg gattacctca 1680
gcatcctatc aacaaggggt cttgtctgcc accatcctct atgagatcct gctagggaaa 1740
gccaccctgt atgctgtgct tgtcagtaca ctggtggtga tggctatggt caaaagaaag 1800
aattcatga 1809
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1 5
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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Gly Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg Asn Val Asp Tyr
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1 5 10 15
Gly Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg Asn Val Asp Tyr
20 25 30
Phe Trp Trp Tyr Arg Gln His Ser Gly Lys Ser Pro Lys Met Leu Met
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Ser Ile Phe Ser Asn Gly Glu Lys Glu Glu Gly Arg Phe Thr Val His
50 55 60
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65 70 75 80
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Gly Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg Asn Val Asp Tyr
20 25 30
Phe Trp Trp Tyr Arg Gln His Ser Gly Lys Ser Pro Lys Met Leu Met
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<223> 合成的
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Gly Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg Asn Val Asp Tyr
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Gly Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg Asn Val Asp Tyr
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Gly Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg Asn Val Asp Tyr
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Gly Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg Asn Val Asp Tyr
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Gln Gln Lys Val Gln Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ile Val Pro Glu Gly
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Gly Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg Asn Val Asp Tyr
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<223> 合成的
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Gln Gln Lys Val Gln Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ile Val Pro Glu Gly
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Gly Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg Asn Val Asp Tyr
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<220>
<223> 合成的
<400> 89
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<223> 合成的
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<223> 合成的
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<220>
<223> 合成的
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 93
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<213> 人工序列
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<223> 合成的
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<213> 人工序列
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<223> 合成的
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<213> 人工序列
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<223> 合成的
<400> 99
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 101
Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ala Thr Leu Thr Gly Gly
1 5 10 15
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<213> 人工序列
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<223> 合成的
<400> 102
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<213> 人工序列
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<223> 合成的
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1 5 10 15
Gln Asn Thr Leu Tyr Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Ser Val Leu Glu
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 104
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1 5 10 15
Gln Asn Thr Leu Tyr Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Ser Val Leu Glu
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<223> 合成的
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Ser Gln Thr Ser Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp His Gly Thr Gly
1 5 10 15
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Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro
35 40
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