阅读说明：本技术 可诱导的嵌合细胞激素受体 (Inducible chimeric cytokine receptors ) 是由 A·R·纳格尔 S·帕克 里格斯 J·F·查帕罗 R·J·林 T·J·范布拉孔 于 2019-03-01 设计创作，主要内容包括：本发明提供对例如小分子或蛋白质的配体有反应的可诱导的嵌合细胞激素受体,所述受体用于改进包含所述可诱导的嵌合细胞激素受体的如T细胞的经遗传修饰的免疫细胞的功能活性的用途,及包含所述细胞的组合物。(The present invention provides inducible chimeric cytokine receptors responsive to ligands such as small molecules or proteins, the use of the receptors to improve the functional activity of genetically modified immune cells such as T cells comprising the inducible chimeric cytokine receptors, and compositions comprising the cells.)

可诱导的嵌合细胞激素受体

相关申请的交叉参考

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参考序列表

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技术领域

本发明大体上涉及可诱导的嵌合细胞激素受体，其与免疫细胞(例如T细胞)一起使用以治疗疾病。

背景技术

嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞已进入临床并且已证实极有前景的结果(Maus,M.等人，2014，《血液(Blood)》123，2625-35)。尽管大多数个体已使用衍生自个体的自身T细胞的自体CAR-T细胞进行治疗，但衍生自健康供体的同种异体CAR-T细胞提供更具商业可行性的现成选项，具有治疗较宽广范围的个体的潜力。

通过使来自健康供体的T细胞赋予由肿瘤相关抗原特异性活化的CAR来产生同种异体CAR-T细胞。不表达功能性TCR(例如，经剔除或敲低)的同种异体CAR-T细胞缺乏基础TCR信号。基础TCR信号增加持久性。TCR调动Ca²⁺，最终导致NFAT及NFkB活化。尽管细胞激素可经STAT5增加持久性，但这不会再现天然TCR信号传导。因此，需要改进同种异体CAR-T细胞持久性的组合物及方法。

发明内容

本发明提供对例如，小分子或蛋白质的配体有反应的可诱导的嵌合细胞激素受体，所述受体用于改进经遗传修饰的T细胞(例如，经基因修饰的抗原特异性T细胞，如嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞)的功能活性的用途，包含可诱导的嵌合细胞激素受体的细胞，及包含所述细胞的组合物。确切地说，本发明提供用于增强CAR-T细胞的治疗功效的方法及组合物。

在一个方面，本发明提供可诱导的嵌合细胞激素受体，其包含：二聚化域；酪氨酸激酶活化域；和酪氨酸效应域。

在一些实施例中，酪氨酸激酶活化域包含蛋白质的(或衍生自其的)詹纳斯激酶(JAK)结合域。在某些这些实施例中，酪氨酸激酶活化域还包含跨膜域。

在一些实施例中，酪氨酸激酶活化域包含受体酪氨酸激酶(RTK)的(或衍生自其的)酪氨酸激酶域。在某些这些实施例中，酪氨酸激酶活化域还包含跨膜域。

在一些实施例中，酪氨酸效应域包含至少一个受体的(或衍生自其的)STAT活化域。在一些实施例中，酪氨酸效应域包含两种受体(或衍生自其的)至少两个STAT活化域。在一些实施例中，酪氨酸效应域包含至少三个、四个或更多个受体的(或衍生自其的)STAT活化域。

在一些实施例中，酪氨酸效应域包含至少一种受体酪氨酸激酶(RTK)的(或衍生自其的)细胞质尾的一部分。

在一些实施例中，二聚化域结合于配体，如AP1903、AP20187、二聚FK506、或二聚FK506样类似物。

在一些实施例中，二聚化域包含FKBP多肽。在一些实施例中，FKBP多肽为FKBP12多肽。在一些实施例中，FKBP12多肽包含氨基酸取代F36V(SEQ ID NO.:218)。

在一些实施例中，二聚化域包含选自由如下组成的组的氨基酸序列：(i)包含一个或多个氨基酸取代的FKBP多肽，(ii)未经修饰的FKBP多肽的两个或三个串联重复序列，及(iii)包含一个或多个氨基酸取代的FKBP多肽的两个或三个串联重复序列。

在一些实施例中，二聚化域包含选自SEQ ID NO.:69-87的二聚化域序列。

在一些实施例中，二聚化域包含选自SEQ ID NO.:69-73的FKBP二聚化域序列。

在一些实施例中，二聚化域包含多肽的(或衍生自其的)氨基酸序列，所述多肽选自由如下组成的组：FKBP12、FKBP12(F36V)、OX-40的胞外域及TNFR2超家族受体的胞外域。在示例性实施例中，TNFR2超家族受体为BCMA、TACI或BAFFR。

在一些实施例中，二聚化域结合小分子。在示例性实施例中，小分子为AP1903、AP20187、二聚FK506、或二聚FK506样类似物。在一些实施例中，二聚化域结合蛋白质。

在一些实施例中，二聚化域包含蛋白质的(或衍生自其的)氨基酸序列，所述蛋白质选自由如下组成的组：FKBP、亲环素、类固醇结合蛋白、***结合蛋白、糖皮质激素结合蛋白、维生素D结合蛋白、四环素结合蛋白、细胞激素受体的胞外域、受体酪氨酸激酶、TNFR家族受体及免疫辅受体。

在一些实施例中，衍化二聚化域的免疫辅受体选自由如下组成的组：红血球生成素受体、催乳素受体、生长激素受体、血小板生成素受体、粒细胞群落刺激因子受体、GP130、共同γ链受体、共同β链受体、IFNα受体、IFNγ受体、IFNλ受体、IL2/IL15受体、IL3受体、IL4受体、IL5受体、IL7受体、IL9受体、IL10受体、IL12受体、IL13受体、IL20受体、IL21受体、IL22受体、IL23受体、IL27受体、TSLP受体、G-CSF受体、GM-CSF受体、CNTF受体、OSM受体、LIF受体、CT-1受体、TGFBR1/ALKL5、TGFBR2、EGFR/HER1、ERBB2/HER2、ERBB3/HER3、ERRB4/HER4、INSR、IGF-1R、IRR、PDGFRA、PDGFRB、CSF-1R、KIT/SCFR、FLK2/FLT3、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3、FGFR-4、CCK4、TRKA、TRKB、TRKC、MET、RON、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、AXL、MER、TYRO3、TIE、TEK、RYK、DDR1、DDR2、RET、ROS、LTK、ALK、ROR1、ROR2、MUSK、AATYK、AATYK2、AATYK3、RTK106、TNFR1、Fas、TRAILR1、TRAILR2、NGFR、DR3、DR6、EDAR、TNFR2、LTbR、OX40、CD40、CD27、CD30、4-1BB、RANK、Fn14、TACI、BAFFR、HVEM、BCMA、GITR、TROY、RELT、XEDAR、TRAILR3、TRAILR4、OPG、DcR3、PD-1、CD80、CD86、ICOS-L、ICOS、CTLA-4、BTLA、CD160、LAG3及TIM3。

在一些实施例中，酪氨酸激酶活化域包含受体的(或衍生自其的)JAK结合域。在一个示例性实施例中，受体为激素受体。

在一些实施例中，酪氨酸激酶活化域包含蛋白质或受体的(或衍生自其的)JAK结合域，所述蛋白质或受体选自由EPOR、GP130、PRLR、GHR、GCSFR及TPOR/MPLR组成的组。

在一些实施例中，酪氨酸激酶活化域包含RTK的(或衍生自其的)酪氨酸激酶域，其中所述RTK选自由如下组成的组：EGFR/HER1、ERBB2/HER2、ERBB3/HER3、ERRB4/HER4、INSR、IGF-1R、IRR、PDGFRA、PDGFRB、CSF-1R、KIT/SCFR、FLK2/FLT3、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3、FGFR-4、CCK4、TRKA、TRKB、TRKC、MET、RON、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、AXL、MER、TYRO3、TIE、TEK、RYK、DDR1、DDR2、RET、ROS、LTK、ALK、ROR1、ROR2、MUSK、AATYK、AATYK2、AATYK3及RTK106。在一个示例性实施例中，RTK为EGFR。

在一些实施例中，酪氨酸激酶活化域包含选自SEQ ID NO.:88-133的酪氨酸激酶活化域序列。

在一些实施例中，存在于酪氨酸激酶活化域中的跨膜域包含蛋白质的(或衍生自其的)跨膜域，所述蛋白质选自由如下组成的组：EPOR、GP130、PRLR、GHR、GCSFR、PD-1及TPOR/MPLR。

在一些实施例中，跨膜域包含衍生自TPOR/MPLR的跨膜域。在一些实施例中，跨膜域衍生自SEQ ID NO.:64的天然的TPOR/MPLR序列的氨基酸478-582。

在一些实施例中，跨膜域包含SEQ ID NO.:64的天然的TPOR/MPLR序列的氨基酸区478-582的缺失变异体。在一些实施例中，缺失变异体包含SEQ ID NO.:64的天然的TPOR/MPLR序列的氨基酸区478-582。在一些实施例中，缺失变异体包含从SEQ ID NO.:64的天然的TPOR/MPLR序列的区域489-510缺失1至18个氨基酸。

在一些实施例中，跨膜域包含SEQ ID NO.:64的天然的TPOR/MPLR的氨基酸区478-582的***变异体。在一些实施例中，***变异体包含在SEQ ID NO.:64的天然的TPOR/MPLR的氨基酸478-582。在一些实施例中，***变异体包含在SEQ ID NO.:64的天然的TPOR/MPLR的氨基酸478-582。在示例性实施例中，***于***变异体中的氨基酸选自由如下组成的组：亮氨酸、缬氨酸及异亮氨酸。

在一些实施例中，酪氨酸效应域包含受体的(或衍生自其的)至少一个STAT活化域。在一些实施例中，酪氨酸效应域包含两种受体的(或衍生自其的)至少两个STAT活化域。在一些实施例中，酪氨酸效应域包含至少三个、四个或更多个效应子的(或衍生自其的)STAT活化域。在一些实施例中，受体为激素受体及/或细胞激素受体。

在一些实施例中，酪氨酸效应域包含至少一个、两个、三个、四个或更多个受体的(或衍生自其的)STAT活化域，其中所述受体选自由如下组成的组：BLNK、IL2RG、EGFR、EpoR、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNAR1/2、IFNLR1、IL10R1、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、IL2Rb、IL2small、IL7R、IL7Ra、IL9R、IL15R及IL21R。

在一些实施例中，酪氨酸效应域包含至少一个、两个、三个、四个或更多个受体的(或衍生自其的)细胞尾(包含可经磷酸化的一个或多个酪氨酸残基的受体的细胞质尾的一部分)，其中所述受体为细胞激素受体、激素受体及/或RTK。

在一些实施例中，可诱导的嵌合细胞激素受体包含二聚化域；酪氨酸激酶活化域，其包含跨膜域及JAK结合域；和酪氨酸效应域，其包含受体的(或衍生自其的)至少一个STAT活化域。在某些这些实施例中，酪氨酸效应域可包含至少两个、三个、四个或更多个受体的(或衍生自其的)STAT活化域。

在一些实施例中，可诱导的嵌合细胞激素受体包含二聚化域；酪氨酸激酶活化域，其包含跨膜域及JAK结合域；和酪氨酸效应域，其包含受体的(或衍生自其的)至少一个细胞尾。在某些这些实施例中，酪氨酸效应域可包含至少两个、三个、四个或更多个受体的(或衍生自其的)细胞尾。

在一些实施例中，可诱导的嵌合细胞激素受体包含含有FKBP多肽的二聚化域；含有跨膜域及JAK结合域的酪氨酸激酶活化域，其中所述跨膜域包括选自由如下组成的组的蛋白质的(或衍生自其的)跨膜域：EPOR、GP130、PRLR、GHR、GCSFR、PD-1及TPOR，及所述JAK结合域包括选自由如下组成的组的蛋白质的(或衍生自其的)JAK结合域：EPOR、GP130、PRLR、GHR、GCSFR及TPOR；和酪氨酸效应域，其包含受体的(或衍生自其的)至少一个STAT活化域，所述受体选自由如下组成的组：BLNK、IL2RG、EGFR、EpoR、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNAR1/2、IFNLR1、IL10R1、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、IL2Rb、IL2small、IL7R、IL7Ra、IL9R、IL15R及IL21R。在某些这些实施例中，酪氨酸效应域包含至少两种、三种、四种或更多种受体的(或衍生自其的)STAT活化域。

在一些实施例中，酪氨酸效应域包含选自SEQ ID NO.:134-176的酪氨酸效应域序列。

在一些实施例中，二聚化域位于可诱导的嵌合细胞激素受体的N端。

在一些实施例中，二聚化域位于可诱导的嵌合细胞激素受体的C端。

在一些实施例中，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体包含膜靶向模体。在示例性实施例中，膜靶向模体包含肉豆蔻酰化模体。

在一些实施例中，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体经肉豆蔻酰基化。

在一些实施例中，可诱导的嵌合细胞激素受体包含公开于表2A或2B中的序列。在一些实施例中，可诱导的嵌合细胞激素受体包含选自SEQ ID NO.:1-58、187-215及225-311的序列。

在另一个方面，本发明提供多核苷酸，其包含编码本文所述的可诱导的嵌合细胞激素受体的核酸序列。在另一个方面，本发明提供包含多核苷酸的表达载体。

在另一个方面，本发明提供工程化免疫细胞，其包含本文所公开的至少一种可诱导的嵌合细胞激素受体。在一些实施例中，工程化免疫细胞包含至少两种可诱导的嵌合细胞激素受体。在一些实施例中，工程化免疫细胞包含本文所公开的至少三种或四种可诱导的嵌合细胞激素受体。当免疫细胞中存在超过一种可诱导的嵌合细胞激素受体时，每个受体的二聚化域、酪氨酸激酶活化域及酪氨酸效应域可相同或不同。

在另一个方面，本发明提供工程化免疫细胞，其包含编码本文所公开的可诱导的嵌合细胞激素受体的至少一个多核苷酸。

在一些实施例中，工程化免疫细胞还包含嵌合抗原受体(CAR)或编码CAR的多核苷酸。

在一些实施例中，免疫细胞选自由如下组成的组：T细胞、树突细胞、杀伤树突细胞、肥大细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞及B细胞。

在一些实施例中，免疫细胞衍生自干细胞。在示例性实施例中，免疫细胞衍生自成体干细胞、非人类干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导型多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞。

在一些实施例中，免疫细胞为T细胞。在一些实施例中，免疫细胞为自体T细胞。在一些实施例中，免疫细胞为同种异体T细胞。

在另一个方面，本发明提供一种调节个体中工程化免疫细胞的方法，所述方法包括对个体给予配体，所述个体先前已给予本文所述的工程化免疫细胞，其中所述二聚配体结合于可诱导的嵌合细胞激素受体的二聚化域。在一个示例性实施例中，配体为AP1903。

在另一个方面，本文提供一种制备工程化免疫细胞的方法，所述方法包括将包含编码可诱导的嵌合细胞激素受体的多核苷酸的多核苷酸或表达载体引入到免疫细胞中。在一个示例性实施例中，免疫细胞选自由如下组成的组：T细胞、树突细胞、杀伤树突细胞、肥大细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、B细胞及衍生自干细胞的免疫细胞。在一个示例性实施例中，免疫细胞为T细胞。

在另一个方面，本发明提供一种分离的免疫细胞，其包含：(i)至少一种可诱导的嵌合细胞激素受体，其包含如本文所公开的二聚化域、酪氨酸激酶活化域及酪氨酸效应域；和(ii)嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外配体结合域、跨膜域及胞内信号传导域。

在一些实施例中，分离的免疫细胞包含至少两种可诱导的嵌合细胞激素受体。在一些其它实施例中，分离的免疫细胞包含三种或四种可诱导的嵌合细胞激素受体。

在一些实施例中，本发明的分离的免疫细胞展示在与结合于二聚化域的配体接触后相对于不表达可诱导的嵌合细胞激素受体的分离的免疫细胞的持久性改进的持久性。

在一些实施例中，本发明的分离的免疫细胞展示在与结合于二聚化域的配体接触后相对于由不表达可诱导的嵌合细胞激素受体的分离的免疫细胞显示的STAT的活化，增加的STAT的活化。在细胞中活化的STAT可为STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6或其组合。

在一些实施例中，与不表达可诱导的嵌合细胞激素受体的分离的免疫细胞所显示的STAT的活化相比，在与结合于二聚化域的配体接触后，通过本发明的分离的免疫细胞的STAT的活化随着配体的剂量而增加。

在一些实施例中，本发明的分离的免疫细胞展示与通过不表达可诱导的嵌合细胞激素受体的分离的免疫细胞展示的细胞毒性相比，在与结合于二聚化域的配体接触后细胞毒性增加。

在一些实施例中，与不表达可诱导的嵌合细胞激素受体的分离的免疫细胞相比，本发明的分离的免疫细胞在与结合于二聚化域的配体接触后扩增。

在一些实施例中，本发明的分离的免疫细胞上干细胞记忆(Tscm)及/或中枢记忆(Tcm)的细胞标记的水平在与结合于二聚化域的配体接触后与不表达可诱导的嵌合细胞激素受体的分离的免疫细胞上这些标记的水平相比增加或不变。

在一个方面，本文提供一种产生分离的免疫细胞的方法，所述分离的免疫细胞包含本文所公开的可诱导的嵌合细胞激素受体，所述方法包括如下步骤：(a)提供免疫细胞；(b)将编码包含胞外配体结合域、跨膜域及胞内信号传导域的嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸引入到免疫细胞中；(c)将编码可诱导的嵌合细胞激素受体的多核苷酸引入到免疫细胞中。

在一些实施例中，以上方法的步骤c)包括将可诱导的嵌合细胞激素受体稳定地表达于细胞中。

在一些实施例中，在以上方法的步骤c)中，通过转座子/转座酶系统、基于病毒的基因转移系统或电穿孔将编码可诱导的嵌合细胞激素受体的多核苷酸引入到细胞中。

在一些实施例中，在以上方法的步骤b)中，通过转座子/转座酶系统或基于病毒的基因转移系统将编码嵌合抗原受体的多核苷酸引入到细胞中

在一些实施例中，基于病毒的基因转移系统包含重组逆转录病毒或慢病毒。

在以上方法的一些实施例中，步骤(b)发生在步骤(c)之前或步骤(c)发生在步骤(b)之前。

在一个方面，本发明提供包含本文所述的分离的免疫细胞的医药组合物。

在一个方面，本发明提供一种用于治疗个体的病症的方法，其中所述方法包括给予包含本文所公开的可诱导的细胞激素受体的分离的免疫细胞或给予包含此类免疫细胞的医药组合物。

在另一个方面，本发明提供本文所公开的分离的免疫细胞或包含分离的免疫细胞的医药组合物用于治疗病症的用途。

在一些实施例中，将细胞或医药组合物提供给个体不止一次。

在一些实施例中，将细胞或医药组合物以间隔至少约1、2、3、4、5、6、7或更多天提供给个体。

在一些实施例中，在给予分离的免疫细胞或医药组合物之前，个体先前已用治疗剂进行治疗。在一个示例性实施例中，治疗剂为抗体或化疗剂。

在一些实施例中，使用本发明方法治疗的病症为病毒性疾病、细菌性疾病、癌症、发炎性疾病、免疫性疾病或老化相关疾病。癌症可为恶性血液病或实体癌症。

在一些实施例中，使用本发明方法治疗的恶性血液病选自急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性嗜酸性粒细胞白血病(CEL)、骨髓发育不良综合征(MDS)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)或多发性骨髓瘤(MM)。

在一些实施例中，使用本发明方法治疗的实体癌症选自胆管癌、膀胱癌、骨及软组织癌、脑肿瘤、乳癌、***、结肠癌、结肠直肠腺癌、结肠直肠癌、硬纤维瘤、胚胎癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、胃腺癌、多形性成胶质细胞瘤、妇科肿瘤、头颈鳞状细胞癌、肝癌、肺癌、恶性黑色素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰管腺癌、原发性星形细胞瘤、原发性甲状腺癌、***癌、肾癌、肾细胞癌、横纹肌肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、尿路上皮细胞癌、子宫肉瘤或子宫癌。

附图说明

图1描绘示例性可诱导的嵌合细胞激素受体的示意图。

图2A描绘FKBP结合雷帕霉素(rapamycin)以抑制mTOR的示意图。

图2B描绘FKBP^F36V结合于雷帕霉素样化合物的示意图。

图2C描绘AP1903将FKBP^F36V二聚化的示意图。

图3描绘示例性可诱导的嵌合细胞激素受体的示意图。

图4描绘概述测试所示可诱导的嵌合细胞激素受体的功能的STAT5分析的结果的条形图。

图5A描绘概述测试所示可诱导的嵌合细胞激素受体的功能的基于细胞的报告子分析的结果的图。

图5B描绘概述测试所示可诱导的嵌合细胞激素受体的功能的基于细胞的报告子分析的结果的图。

图6描绘概述测试所示可诱导的嵌合细胞激素受体的功能的基于细胞的报告子分析的结果的图。

图7描绘概述测试所示可诱导的嵌合细胞激素受体的功能的基于细胞的报告子分析的结果的图。

图8描绘概述测试所示可诱导的嵌合细胞激素受体的功能的基于细胞的报告子分析的结果的图。

图9描绘概述测试所示可诱导的嵌合细胞激素受体的功能的基于细胞的报告子分析的结果的图。

图10A描绘概述测试所示可诱导的嵌合细胞激素受体的功能的基于细胞的报告子分析的结果的图。

图10B描绘概述测试所示可诱导的嵌合细胞激素受体的功能的基于细胞的报告子分析的结果的图。

图10C描绘显示工程化嵌合细胞激素受体的传统方法的示意图。

图10D描绘显示在本发明中用于工程化嵌合细胞激素受体所使用的方法的示意图。

图10E描绘在实例5C的基于细胞的报告子分析中所测试的嵌合受体的示意图。

图10F描绘概述测试所示可诱导的嵌合细胞激素受体的功能的基于细胞的报告子分析的结果的图。

图11描绘概述测试所示可诱导的嵌合细胞激素受体的功能的基于细胞的报告子分析的结果的图。

图12描绘AP-1结合于启动子序列的NFAT的示意图。

图13描绘导致经Myc/Max上调Fos的MEK/ERK途径的示意图。

图14描绘概述测试所示可诱导的嵌合细胞激素受体的功能的基于细胞的报告子分析的结果的图。

图15描绘BTK途径的示意图。

图16描绘概述所示可诱导的嵌合细胞激素受体对细胞生长的影响的图。

图17描绘概述所示可诱导的嵌合细胞激素受体对细胞存活率的影响的图。

图18描绘概述所示可诱导的嵌合细胞激素受体对细胞表型的影响的图。

图19描绘概述所示可诱导的嵌合细胞激素受体对细胞表型的影响的图。

图20描绘概述所示可诱导的嵌合细胞激素受体对细胞激素释放的影响的图。

图21描绘概述所示可诱导的嵌合细胞激素受体对细胞激素释放的影响的图。

图22描绘概述在不存在信号传导下所示可诱导的嵌合细胞激素受体对增殖的影响的图。

图23描绘概述在不存在信号传导下所示可诱导的嵌合细胞激素受体对细胞激素释放的影响的图。

图24描绘概述在不存在信号传导下所示可诱导的嵌合细胞激素受体对细胞激素释放的影响的图。

图25描绘概述所示可诱导的嵌合细胞激素受体对细胞生长的影响的图。

图26描绘具有双重酪氨酸效应域的示例性可诱导的细胞激素受体的示意图。

图27A描绘概述测试所示可诱导的嵌合细胞激素受体的功能的基于细胞的报告子分析的结果的图。

图27B描绘概述测试所示可诱导的嵌合细胞激素受体的功能的基于细胞的报告子分析的结果的图。

图28A描绘包含CAR及可诱导的细胞激素受体的示例性构建体的示意图。

图28B显示经包含显示于图28A中的构建体的载体转导的T细胞的转导效率。

图28C描绘概述所示可诱导的嵌合细胞激素受体的FACS分析测试功能的结果的图。

图29描绘概述测试所示可诱导的嵌合细胞激素受体的功能的FACS分析的结果的图。

图30A描绘包含CAR及可诱导的细胞激素受体的示例性构建体的示意图。

图30B描绘概述测试所示CAR-T细胞的细胞毒性的体外分析的结果的图。

图30C描绘概述测试所示CAR-T细胞的细胞毒性的体外分析的结果的图。

图30D描绘概述测试所示CAR-T细胞的细胞毒性的体外分析的结果的图。

图30E描绘概述测试所示CAR-T细胞的细胞毒性的体外分析的结果的图。

图31A描绘概述所示处理组的肿瘤体积分析的结果的图。

图31B描绘概述所示处理组的肿瘤体积分析的结果的图。

图31C描绘概述所示处理组的肿瘤体积分析的结果的图。

图31D描绘概述所示处理组的肿瘤体积分析的结果的图。

图31E描绘概述所示处理组的肿瘤体积分析的结果的图。

图31F描绘概述所示处理组的肿瘤体积分析的结果的图。

图31G描绘概述所示处理组的肿瘤体积分析的结果的图。

图31H描绘概述所示处理组的总体存活率的图。

图32A描绘概述所示CAR-T细胞的扩增的图。

图32B描绘概述所示可诱导的嵌合细胞激素受体对细胞表型的影响的图。

图33A描绘概述测试所示可诱导的嵌合细胞激素受体的功能的基于细胞的报告子分析的结果的图。

图33B描绘概述测试所示可诱导的嵌合细胞激素受体的功能的基于细胞的报告子分析的结果的图。

图33C描绘概述测试所示可诱导的嵌合细胞激素受体的功能的基于细胞的报告子分析的结果的图。

图33D描绘概述测试所示可诱导的嵌合细胞激素受体的功能的基于细胞的报告子分析的结果的图。

图34A描绘包含CAR及可诱导的细胞激素受体的示例性构建体的示意图。

图34B描绘概述测试所示CAR-T细胞的细胞毒性的体外分析的结果的图。

图34C描绘概述测试所示CAR-T细胞的细胞毒性的体外分析的结果的图。

图34D描绘概述测试所示CAR-T细胞的细胞毒性的体外分析的结果的图。

图34E描绘概述测试所示CAR-T细胞的扩增的分析的结果的图。

图34F描绘概述测试所示CAR-T细胞的扩增的分析的结果的图。

图35A描绘包含CAR及可诱导的嵌合细胞激素受体的示例性构建体的示意图。

图35B描绘显示包含所示可诱导的嵌合细胞激素受体的对照CAR-T细胞的扩增的图。

图35C描绘显示包含所示可诱导的嵌合细胞激素受体的CAR-T细胞的扩增的图。

图35D描绘显示包含所示可诱导的嵌合细胞激素受体的CAR-T细胞的扩增的图。

图35E描绘显示包含所示可诱导的嵌合细胞激素受体的CAR-T细胞的扩增的图。

图36A描绘示例性可诱导的嵌合细胞激素受体的示意图。

图36B描绘概述测试所示可诱导的嵌合细胞激素受体的功能的基于细胞的报告子分析的结果的图。

图36C描绘概述测试所示可诱导的嵌合细胞激素受体的功能的基于细胞的报告子分析的结果的图。

图37A描绘示例性可诱导的嵌合细胞激素受体的示意图。

图37B为受体BCMA、TACI及BAFFR与其配体BAFF及APRIL间的相互作用的示意图。

图37C描绘概述测试所示可诱导的嵌合细胞激素受体的功能的基于细胞的报告子分析的结果的图。

图37D描绘概述测试所示可诱导的嵌合细胞激素受体的功能的基于细胞的报告子分析的结果的图。

图38A显示野生型TpoR及各种跨膜缺失变异体的氨基酸序列。

图38B显示野生型TpoR及各种跨膜***变异体的氨基酸序列。

图38C描绘概述测试所示可诱导的嵌合细胞激素受体的功能的基于细胞的报告子分析的结果的图。

图39A描绘示例性可诱导的嵌合细胞激素受体的示意图。

图39B描绘概述测试所示可诱导的嵌合细胞激素受体的功能的基于细胞的报告子分析的结果的图。

图40A描绘概述包含所示可诱导的嵌合细胞激素受体的CAR-T细胞的体外细胞毒性分析的结果的图。

图40B描绘概述包含所示可诱导的嵌合细胞激素受体的CAR-T细胞的体外细胞毒性分析的结果的图。

图40C描绘概述包含所示可诱导的嵌合细胞激素受体的CAR-T细胞的体外细胞毒性分析的结果的图。

图40D描绘概述包含所示可诱导的嵌合细胞激素受体的CAR-T细胞的体外细胞毒性分析的结果的图。

图40E描绘概述包含所示可诱导的嵌合细胞激素受体的CAR-T细胞的体外细胞毒性分析的结果的图。

图40F描绘概述包含所示嵌合受体的CAR-T细胞的体外细胞毒性分析的结果的图。

图41A描绘概述所示可诱导的嵌合细胞激素受体对细胞激素释放的影响的图。

图41B描绘概述所示可诱导的嵌合细胞激素受体对细胞激素释放的影响的图。

图42A描绘概述所示可诱导的嵌合细胞激素受体对细胞激素释放的影响的图。

图42B描绘概述所示可诱导的嵌合细胞激素受体对细胞激素释放的影响的图。

图43描绘概述包含所示嵌合细胞激素受体的CAR-T细胞的浓化的图。

图44A描绘概述包含所示嵌合细胞激素受体的CAR-T细胞的记忆子集分布的图。

图44B描绘概述包含所示嵌合细胞激素受体的CAR-T细胞的记忆子集分布的图。

图44C描绘概述包含所示嵌合细胞激素受体的CAR-T细胞的记忆子集分布的图。

图44D描绘概述包含所示嵌合细胞激素受体的CAR-T细胞的记忆子集分布的图。

图44E描绘概述包含所示嵌合细胞激素受体的CAR-T细胞的记忆子集分布的图。

图44F描绘概述包含所示嵌合细胞激素受体的CAR-T细胞的记忆子集分布的图。

图44G描绘概述包含所示嵌合细胞激素受体的CAR-T细胞的记忆子集分布的图。

图45A描绘概述所示可诱导的嵌合细胞激素受体对细胞表型的影响的图。

图45B描绘概述所示可诱导的嵌合细胞激素受体对细胞表型的影响的图。

图45C描绘概述所示可诱导的嵌合细胞激素受体对细胞表型的影响的图。

图45D描绘概述所示可诱导的嵌合细胞激素受体对细胞表型的影响的图。

图45E描绘概述所示可诱导的嵌合细胞激素受体对细胞表型的影响的图。

图45F描绘概述所示可诱导的嵌合细胞激素受体对细胞表型的影响的图。

图45G描绘概述所示可诱导的嵌合细胞激素受体对细胞表型的影响的图。

具体实施方式

本发明提供嵌合受体及其用于改进免疫细胞的体内持久性及治疗功效的用途。本文提供对配体，如小分子(例如，AP1903)或蛋白质(例如，Epo、Tpo或PD-L1)敏感的受体。还提供包含此类可诱导的嵌合细胞激素受体的细胞，包含此类细胞的组合物，及用于改进分离的T细胞(例如CAR-T细胞)的功能活性的方法。本文还提供具有改进的持久性的CAR-T细胞、及使用此类CAR-T细胞治疗病症的方法。

一般技术

除非另有指示，否则本发明的实务将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学及免疫学的常规技术，这些技术在所属领域范围内。此类技术充分阐释于文献中，如，《分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《分子生物学方法(Methods inMolecular Biology)》，Humana出版社；《分子生物实验室记录(Cell Biology:ALaboratory Notebook)》(J.E.Cellis编，1998)学术出版社(Academic Press)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《细胞及组织培养物的介绍(Introduction to Cell and Tissue Culture)》(J.P.Mather及P.E.Roberts，1998)Plenum出版社；《细胞及组织培养物实验室手册(Cell and Tissue Culture:LaboratoryProcedures)》(A.Doyle、J.B.Griffiths及D.G.Newell编，1993-1998)约翰·威利父子出版公司(J.Wiley and Sons)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社公司)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir及C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller及M.P.Calos编，1987)；《分子生物学现行规范(Current Protocols inMolecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR：聚合酶链反应(PCR:ThePolymerase Chain Reaction)》，(Mullis等人编，1994)；《免疫学现行规范(CurrentProtocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)；《分子生物学简要规范(ShortProtocols in Molecular Biology)》(威利父子出版公司，1999)；《免疫生物学(Immunobiology)》(C.A.Janeway及P.Travers，1997)；《抗体(Antibodies)》(P.Finch，1997)；《抗体：实用方法(Antibodies:a practical approach)》(D.Catty.编，IRL出版社，1988-1989)；《单克隆抗体：实用方法(Monoclonal antibodies:a practical approach)》(P.Shepherd及C.Dean编，牛津大学出版社(Oxford University Press)，2000)；《使用抗体：实验室手册(Using antibodies:a laboratory manual)》(E.Harlow及D.Lane(冷泉港实验室出版社，1999)；《抗体(The Antibodies)》(M.Zanetti及J.D.Capra编，HarwoodAcademic Publishers，1995)。

定义

如本文所用，“自体”意指用于治疗个体的源自所述个体或源自人类白细胞抗原(HLA)相容供体的细胞、细胞系或细胞群。

如本文所用，“同种异体”意指用于治疗个体的细胞或细胞群不源自所述个体而源自供体。

如本文所用，术语“内源性”是指来自生物体、细胞、组织或系统或产生于其内部的任何材料。

如本文所用，术语“外源性”是指从生物体、细胞、组织或系统引入或产生于其外部的任何材料。

如本文所用，“免疫细胞”是指功能上参与先天性及/或适应性免疫反应的起始及/或执行的造血源细胞。免疫细胞的实例包括T细胞，例如，α/βT细胞及γ/δT细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、不变NKT细胞、肥大细胞、骨髓衍生的吞噬细胞、树突细胞、杀伤树突细胞、巨噬细胞及单核细胞。如本文所用，术语“免疫细胞”也指衍生自(例如，但不限于)干细胞的细胞。干细胞可为成体干细胞、非人类胚胎干细胞，更尤其非人类干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导型多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞。

术语“多肽”、“寡肽”、“肽”及“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸链，优选相对短的链(例如10-100个氨基酸)以及包含约10-250、10-500、10-1000、50-200、50-500或50-1000个氨基酸的较长链。链可呈直链或分支链，其可包含经修饰的氨基酸，并且/或可间隔非氨基酸。所述术语还包括已天然修饰或通过干预修饰的氨基酸链；例如，二硫键的形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，如与标记组分结合。所述定义中还包括(例如)包含氨基酸(包括(例如)非天然氨基酸等)的一种或多种类似物的多肽以及所属领域中已知的其它修饰。应明了，多肽可呈单链或相关链存在。

如本文所用，术语“表达”是指通过启动子驱动的特定核苷酸序列的转录及/或转译。

如本文所用，“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可以操作方式连接于待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括所属领域中已知的所有表达载体，包括粘质粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)及并入重组多核苷酸的病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒)。

如本文所用，“可以操作方式连接”是指单个核酸片段上核酸序列的缔合，使得一个核酸序列的功能受另一个核酸序列影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时(即，编码序列在启动子的转录控制下)，所述启动子可以操作方式连接于所述编码序列。

如本文所用，“表达控制序列”意指导引核酸的转录的核酸序列。表达控制序列可为启动子(如组成型或可诱导的启动子)或增强子。表达控制序列可以操作方式连接于待转录的核酸序列。

“启动子”及“启动子序列”可互换使用并且是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的DNA序列。通常，编码序列位于启动子序列的3′。所述领域的技术人员应明了，不同启动子可导引基因在不同组织或细胞类型中、或在发育的不同阶段、或响应于不同环境或生理条件的表达。

在本发明的任何载体中，载体任选地包含本文所公开的启动子。

“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可或已用于并入多核苷酸***物的载体的接受者。宿主细胞包括单个宿主细胞的继代，并且由于天然、偶然或故意突变，所述继代可能不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态学或在基因组DNA补体方面)。宿主细胞包括用本发明的多核苷酸体内转染的细胞。

如本文所用，术语“胞外配体结合域”是指能够结合配体的寡肽或多肽。优选地，所述域能够将与细胞表面分子相互作用。例如，可选择胞外配体结合域以识别充作与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记的配体。

术语“茎域”或“铰链域”在本文中可互换使用，是指用于将跨膜域连接于胞外配体结合域的任何寡肽或多肽。确切地说，茎域用于为胞外配体结合域提供更大的灵活性及可接近性。

术语“胞内信号传导域”是指蛋白质的部分，其转导效应子信号功能信号并导引细胞执行特定功能。

如本文所用，“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合搭配物，其与共刺激配体特异性结合，由此介导细胞的共刺激反应，如(但不限于)增殖。共刺激分子包括(但不限于)MHCI类分子、BTLA及Toll配体受体。共刺激分子的实例包括CD27、CD28、CD8、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、与淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及与CD83等特异性结合的配体。

“共刺激配体”是指抗原呈现细胞上的分子，其特异性结合T细胞上的同源共刺激信号分子，由此提供除了通过(例如)TCR/CD3复合体与加载有肽的MHC分子结合而提供的主要信号之外的信号，介导T细胞反应，包括(但不限于)增殖活化、分化等。共刺激配体可包括(但不限于)CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导的共刺激配体(ICOS-L)、胞内黏附分子(ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、淋巴细胞毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、结合Toll配体受体的激动剂或抗体及与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体还尤其包括与存在于T细胞上的共刺激分子特异性结合的抗体，如(但不限于)CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体。

“抗体”为能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点特异性结合于标靶(如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等)的免疫球蛋白分子。如本文所用，所述术语不仅包括完整多克隆或单克隆抗体，而且包括其抗原结合片段(如Fab、Fab'、F(ab')₂及Fv)、及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型，包括(例如，但不限于)单链(scFv)及域抗体(包括(例如)鲨鱼及骆驼科抗体)、及包含抗体、抗体模拟物或提供特定蛋白质-蛋白质相互作用的任何蛋白质的融合蛋白。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”或“抗原结合部分”是指完整抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合于所给定抗原的能力。抗体的抗原结合功能可通过完整抗体的片段执行。包含在术语抗体的“抗原结合片段”内的结合片段的实例包括Fab；Fab'；F(ab')₂；由VH及CH1域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL及VH域组成的Fv片段；单域抗体(dAb)片段(Ward等人，Nature 341:544-546，1989)及分离的互补决定区(CDR)。

“优先地结合”或“特异性结合”(在本文中可互换使用)于标靶(例如，BCMA蛋白质)的抗体、抗体结合物或多肽为所属领域中熟知的术语，及确定此类特异性或优先结合的方法也为所属领域中熟知的。如果分子以比其与替代细胞或物质的反应或缔合更频繁地、更快速地、以持续时间更长地并且/或以与特定细胞或物质的更强亲和力地反应或缔合，那么称所述分子展现“特异性结合”或“优先结合”。如果抗体以比其结合于其它物质的更大亲和力、结合性、更容易地并且/或以持续时间更长地结合，那么所述抗体“特异性结合”或“优先结合”于靶标。还应明了，通过阅读这一定义，例如，特异性或优先地结合于第一靶标的抗体(或部分或表位)可或可不特异性或优先地结合于第二靶标。因此，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管其可包括)排他性结合。通常但不是必须地，提及结合意指优先结合。

如所属领域中已知，如在本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的链，并且包括DNA及RNA。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基、及/或其类似物、或可通过DNA或RNA聚合酶并入链中的任何受质。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸及其类似物。如果存在，可在链的组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可间杂非核苷酸组分。可在聚合后(如)通过与标记组分结合进一步修饰多核苷酸。其它类型的修饰包括(例如)“封端”、以类似物取代天然的核苷酸中的一种或多种、核苷酸间修饰，如具有不带电荷的键结(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、胺磷酰酯、氨基甲酸酯等)的修饰及具有带电荷的键结(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰、包含侧基部分(如蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的修饰、包含螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、包含烷基化剂的修饰、具有经修饰的键结(例如，α变旋异构核酸等)的修饰、以及多核苷酸的未修饰形式。此外，通常存在于糖中的任何羟基可(例如)经膦酸酯基、磷酸酯基置换，通过标准保护基保护，或被活化以制备对额外核苷酸的额外键结，或可结合于固体担体。5'及3'端OH可经磷酸化或经胺或1至20个碳原子的有机封端基部分取代。其它羟基也可衍生为标准保护基。多核苷酸也可包含所属领域中通常已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括(例如)2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-迭氮基-核糖、碳环糖类似物、α-或β-变旋异构糖、差向异构糖，如***糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖(sedoheptulose)、非环状类似物及无碱基核苷类似物(如甲基核苷)。一个或多个磷酸二酯键结可经替代性连接基置换。这些替代性连接基包括(但不限于)其中的磷酸酯经P(O)S(“硫代酸酯”)、P(S)S(“二硫代酸酯”)、(O)NR₂(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH₂(“甲缩醛”)置换的实施例，其中每个R或R'独立地为H或任选地包含醚(-O-)键的经取代或未经取代的烷基(1-20个C)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。并非多核苷酸中的所有键结均必须相同。前面描述适用于本文提及的所有多核苷酸，包括RNA及DNA。

如本文所用，“转染”是指细胞摄取外源或异源RNA或DNA。当已将所述RNA或DNA引入胞内时，所述细胞已被外源或异源RNA或DNA“转染”。当经转染的RNA或DNA影响表型变化时，细胞已被外源或异源RNA或DNA“转型”。可将转型RNA或DNA整合(共价连接)到构成细胞基因组的染色体DNA中。

如本文所用，“转型”是指将核酸片段转移到宿主生物体的基因组中，导致遗传上稳定的遗传。包含经转型的核酸片段的宿主生物体被称为“转殖基因”或“重组”或“经转型”的生物体。

如本文所用，“大体上纯”是指材料至少50％纯度(即，不含污染物)，更优选地，至少90％纯度，更优选地，至少95％纯度，又更优选地，至少98％纯度，并且最优选地，至少99％纯度。

如本文所用，“治疗”为用于获得有益或所需的临床结果的方法。出于本发明的目的，有益或所需的临床结果包括(但不限于)如下中的一种或多种：减少肿瘤或癌细胞的增殖(或破坏肿瘤或癌细胞)，抑制肿瘤细胞的转移，缩小或减小肿瘤尺寸，消退疾病(例如，癌症)，减少由疾病(例如，癌症)引起的症状，提高罹患疾病(例如，癌症)者的生活质量，减少治疗疾病(例如，癌症)所需的其它药物的剂量，延迟疾病(例如，癌症)的进展，治愈疾病(例如，癌症)，及/或延长患有疾病(例如，癌症)的个体的生存期。

“改善”意指与不给予治疗相比减轻或改善一种或多种症状。“改善”还包括缩短或减少症状的持续时间。

如本文所用，药物、化合物或医药组合物的“有效剂量”或“有效量”为足以实现任何一种或多种有益或所需的结果的量。对于预防性使用，有益或所需的结果包括消除或降低风险，减轻严重度，或延迟疾病(包括疾病的生化、组织学及/或行为症状、其并发症及出现于疾病发展中的中间病理表型)的开始。对于治疗性用途，有益或所需的结果包括临床结果，如降低各种疾病或病症(如癌症)的一种或多种症状的发生率或改善所述一种或多种症状，减少治疗疾病所需的其它药物的剂量，增强另一种药物的效果，及/或延迟疾病的进展。有效剂量可以一次或多次投药给予。出于本发明的目的，药物、化合物或医药组合物的有效剂量为足以直接或间接完成预防性或治疗性治疗的量。如在临床情况中所了解，药物、化合物或医药组合物的有效剂量可或可不与另一种药物、化合物或医药组合物结合来实现。因此，在给予一种或多种治疗剂的情况下可考虑“有效剂量”，并且如果与一种或多种其它药剂结合，单一药剂可视作以有效量给与，可出现所需的结果或实现所需的结果。

如本文所用，术语“个体”是指任何脊椎动物，包括(但不限于)人类及其它灵长类动物(例如，黑猩猩、食蟹猕猴及其它猿猴类)、农场动物(例如，牛、羊、猪、山羊及马)、运动动物、宠物(包括家养哺乳动物，例如，狗及猫)、实验室动物(例如，兔、囓齿动物(如小鼠、大鼠及天竺鼠))及鸟类(例如，家禽、野禽及猎禽，如鸡、火鸡及其它鹑鸡、鸭、鹅等)。在一些实施例中，个体为哺乳动物。在示例性实施例中，个体为人类。

如本文所用，“载体”意指构建体，其能够在宿主细胞中递送，并且优选地表达所关注的一个或多个基因或序列。载体的实例包括(但不限于)病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘质粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体、及某些真核细胞(如生产细胞)。

如本文所用，“药学可接受的载体”或“药学可接受的赋形剂”包括当与活性成分组合时允许所述成分保留生物活性并且不与个体免疫系统反应的任何材料。实例包括(但不限于)任何标准医药载体，如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(如油/水乳液)及各种类型的润湿剂。用于气雾剂或肠胃外给予的优选稀释剂为磷酸盐缓冲盐水(PBS)或生理(0.9％)盐水。包含此类载体的组合物通过熟知的常规方法来调配(参见，例如，《雷明顿医药科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》，第18版，A.Gennaro编，宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版社公司(Mack Publishing Co.，Easton，PA)，1990；和《雷明顿药学科学和实践(Remington，The Science and Practice of Pharmacy)》第21版马克出版社，2005)。

本文中提及“约”某一值或参数时包括(并描述)针对所述值或参数本身的实施例。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。数字范围包括定义所述范围的数字。

应了解，在本文中用语句“包含”描述实施例的任何处，还提供以“由...组成”及/或“基本上由...组成”描述的其它类似实施例。

在本发明的方面或实施例根据马库西群组(Markush groups)或其它替代物群组描述之处，本发明不仅包括作为整体列出的整个群组，但不包括各个组别的每个成员及主要群组的所有可能的子集，而且包括缺少群组成员中的一个或多个的主要群组。本发明还设想明确排除所要求保护的发明中的任何群组成员中的一个或多个。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语具有如熟习本发明所属领域技术者通常所了解的相同含义。如果发生冲突，将由本说明书(包括定义)控制。在本说明书及权利要求书中，词语“包括(comprise)”或变化形式(如“包括(comprises/comprising)”)将被理解为意指包括所关注的所述整数或整数组但不排除任何其它整数或整数组。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。

本文描述示例性方法及材料，然而，与本文所述方法及材料类似或等效的方法及材料还可用于本发明的实务或测试中。材料、方法及实例仅为说明性而非限制性。

可诱导的嵌合细胞激素受体及改进的分离的免疫细胞

本文提供可诱导的嵌合细胞激素受体、包含此类受体的细胞、及包括此类细胞的方法。还提供此类可诱导的嵌合细胞激素受体用于改进分离的免疫细胞(例如，分离的T细胞，如包含嵌合抗原受体(CAR)的分离的T细胞)的功能活性的用途。本文所提供的方法及组合物适用于改进包含CAR的免疫细胞(如CAR-T细胞)的体内及体外持久性、细胞毒性、记忆表型及/或治疗功效。

在一些实施例中，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体以任何顺序包含：二聚化域、酪氨酸激酶活化域及酪氨酸效应域。任选地，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体可包括膜靶向模体。在包含可诱导的嵌合细胞激素受体的宿主细胞中本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体的由配体介导的二聚化诱导由受体介导的信号传导事件。在一些实施例中，这一信号传导可导致改进的持久性。例如，在一个示例性实施例中，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体通过配体二聚化将活化JAK-STAT途径并且模拟由天然细胞激素受体诱导的信号传导。“模拟”意指通过本发明的可诱导的嵌合细胞激素受体活化的信号传导级联类似于通过天然细胞激素受体活化的信号传导级联，而通过本发明的嵌合细胞激素受体诱导的活化程度可不同于通过天然细胞激素受体诱导的活化程度。例如，如果本发明的可诱导的嵌合细胞激素受体及天然细胞激素受体均活化STAT转录因子；那么可能的是，这两种受体活化STAT的水平可以相似或不同。

可诱导的嵌合细胞激素受体的“二聚化域”可以是可通过可结合于二聚化域的配体诱导二聚化或甚至三聚化或多聚化的任何氨基酸序列。因此，二聚化域为配体结合域。在一些实施例中，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体的二聚化域可存在于细胞膜外部。在一些实施例中，可诱导的嵌合细胞激素受体的二聚化域可存在于细胞膜内部。

在一些实施例中，结合于二聚化域的配体为二聚配体。例如，二聚化域可包含FK506结合蛋白(“FKBP”)的氨基酸序列。FKBP蛋白特异性结合于药物FK506。为FK506的多聚类似物的配体(即，包含FK506的至少两个拷贝或其衍生物的配体)可通过配体结合于第一蛋白及第二蛋白并且由此使得其在一起诱导各包含FKBP的氨基酸序列的第一蛋白及第二蛋白的二聚化。第一蛋白及第二蛋白可以相同或不同。因此，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体可通过将可诱导的嵌合细胞激素受体暴露于结合于可诱导的嵌合细胞激素受体的二聚化域的适宜二聚配体而诱导二聚化。

在一些实施例中，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体的二聚化域可包含(例如)FKBP、亲环素、类固醇结合蛋白、***结合蛋白、糖皮质激素结合蛋白、维生素D结合蛋白或四环素结合蛋白的(或衍生自其的)氨基酸序列。如本文所用，“FKBP多肽”、“亲环素多肽”或类似是指具有各别蛋白质的氨基酸序列或其部分或变异体的多肽，其中其部分或变异体保留以高亲和力结合于对应的配体(例如，就FKBP多肽来说，配体FK506及相关分子)的能力。

在一些实施例中，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体的二聚化域可包含细胞激素受体的胞外域的(或衍生自其的)氨基酸序列，所述细胞激素受体如(例如，但不限于)：红血球生成素受体、催乳素受体、生长激素受体、血小板生成素受体、粒细胞群落刺激因子受体、GP130、共同γ链受体、共同β链受体、IFNα受体、IFNγ受体、IFNλ受体、IL2/IL15受体、IL3受体、IL4受体、IL5受体、IL7受体、IL9受体、IL10受体、IL12受体、IL13受体、IL20受体、IL21受体、IL22受体、IL23受体、IL27受体、TSLP受体、G-CSF受体、GM-CSF受体、CNTF受体、OSM受体、LIF受体、CT-1受体、TGFBR1/ALKL5及TGFBR2。在一些实施例中，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体的二聚化域可包含受体酪氨酸激酶(RTK)的胞外域的(或衍生自其的)氨基酸序列，所述受体酪氨酸激酶(RTK)如：EGFR/HER1、ERBB2/HER2、ERBB3/HER3、ERRB4/HER4、INSR、IGF-1R、IRR、PDGFRA、PDGFRB、CSF-1R、KIT/SCFR、FLK2/FLT3、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3、FGFR-4、CCK4、TRKA、TRKB、TRKC、MET、RON、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、AXL、MER、TYRO3、TIE、TEK、RYK、DDR1、DDR2、RET、ROS、LTK、ALK、ROR1、ROR2、MUSK、AATYK、AATYK2、AATYK3及RTK106。细胞激素受体及RTK的胞外域可通过对应的配体或激动剂(例如，就血小板生成素受体多肽来说，对应的配体包括(例如)TPO、艾曲波帕(eltrombopag)及相关分子)二聚化。

在一些实施例中，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体的二聚化域可包含(例如)TNFR家族受体的胞外域的(或衍生自其的)氨基酸序列，所述TNFR家族受体如：TNFR1、Fas、TRAILR1、TRAILR2、NGFR、DR3、DR6、EDAR、TNFR2、LTbR、OX40、CD40、CD27、CD30、4-1BB、RANK、Fn14、TACI、BAFFR、HVEM、BCMA、GITR、TROY、RELT、XEDAR、TRAILR3、TRAILR4、OPG、DcR3。TNFR家族受体的胞外域在结合于三聚TNFR配体结合后多聚化。衍生自TNFR家族受体(包含BCMA胞外域)的示例性二聚化域氨基酸序列为：MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNA(SEQ ID NO:216)。在一些实施例中，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体的二聚化域可包含或衍生自(例如)如以下的免疫辅受体或配体的胞外域的(或衍生自其的)氨基酸序列：PD-1、CD80、CD86、ICOS-L、ICOS、CTLA-4、BTLA、CD160、LAG3或TIM3。免疫辅受体的胞外域在结合呈现对应的配体的细胞后聚集。衍生自免疫辅受体(包含胞外PD-1)的示例性二聚化域氨基酸序列为：MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLV(SEQ ID NO:217)。

在一些实施例中，二聚化域可包含FKBP多肽氨基酸序列。FKBP为具有脯氨酰基异构酶活性并且结合于药物FK506及其它相关药物的一组蛋白质。

任选地，FKBP可为人类FKBP12(也称为FKBP1A；GenBank:CAG46965.1)。任选地，FKBP12多肽可包含F36V突变。包含F36V突变的FKBP12以高亲和力结合于二聚配体AP1903(Jemal,A.等人，《CA：临床医师癌症杂志(CA Cancer J.Clinic.)》58，71-96(2008)；Scher,H.I.及Kelly,W.K.，《临床肿瘤学杂志(Journal of Clinical Oncology)》11，1566-72(1993))。此外，包含F36V突变的FKBP12以比野生型FKBP12结合AP1903高得多的亲和力结合于AP1903。

示例性二聚化域氨基酸序列(包含具有F36V突变的FKBP12多肽)为：GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLES(SEQ ID NO:218)。

在一些实施例中，可诱导的嵌合细胞激素受体的二聚化域可包含FKBP的氨基酸序列，所述FKBP包含选自由如下组成的组的修饰：(i)包含一个或多个氨基酸取代的FKBP多肽，(ii)未经修饰的(天然的)FKBP氨基酸序列的两个或三个串联重复序列，及(iii)包含一个或多个氨基酸取代的FKBP多肽的两个或三个串联重复序列。在一些实施例中，FKBP蛋白为人类FKBP蛋白(GenBank:CAG46965.1)及对本文所述的FKBP的修饰对人类FKBP蛋白进行。在一些实施例中，FKBP中的一个或多个氨基酸取代包括如下中的一个或多个：F36V、L106P、E31G、R71G及K105E、参考人类FKBP蛋白的残基(GenBank:CAG46965.1)。在所述实施例中，在二聚化域包含本文所公开的二聚化域序列的两个或三个串联重复序列的情况下，每个重复序列可包含所述序列的不同突变。例如，在一个示例性实施例中，二聚化域包含FKBP序列的三个串联重复序列，其中所述重复序列中的一个包含天然FKBP序列，第二重复序列包含包含F36V取代的FKBP，及第三重复序列包含以任何顺序包含F36V及L106P取代的FKBP。

在一些实施例中，可诱导的嵌合细胞激素受体的二聚化域可包含FKBP的氨基酸序列，所述FKBP包含选自由如下组成的组的修饰：(i)包含F36V取代的FKBP多肽，(ii)包含F36V及L106P取代的FKBP多肽，(iii)包含E31G、F36V、R71G及K105E取代的FKBP多肽，及(iv)任何这些FKBP多肽的两个或三个串联重复序列。

在一些实施例中，二聚化域可为亲环素多肽氨基酸序列。亲环素为结合于环孢素(环孢菌素A)的蛋白质。亲环素包括(例如)亲环素A及亲环素D。

在一些实施例中，二聚化域可具有公开于美国专利第9434935号中的配体结合区的任何特征，所述专利针对所有目的以引用的方式并入本文中。

在一些实施例中，本发明的可诱导的嵌合细胞激素受体的二聚化域可包含选自由如下组成的组的多肽的(或衍生自其的)氨基酸序列：FKBP12(F36V)、OX-40的胞外域、及TNFR2超家族受体的胞外域(例如，BCMA、TACI、BAFFR)。

在一些实施例中，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体的二聚化域包含公开于表1B中的二聚化域氨基酸序列。

如本文所用，“二聚”配体可任选地包含适宜结合分子的超过两个拷贝(即配体可呈多聚)；然而，基于此类配体二聚化对应的结合分子的能力，如本文所用，此类配体仍可被认为呈“二聚”。类似地，在一些实施例中，如本文所提供的二聚化域可能能够支持多聚化(例如，在相同分子中提供二聚化域的多个拷贝的情况下)；然而，基于这种域二聚化的能力，如本文所用，这种域也仍可被认为是“二聚化域”。通常，凋亡蛋白酶-9信号传导可在凋亡蛋白酶-9分子的二聚化后有效地诱导(即不需要三聚化或其它多聚化)。此外，除非上下文另有明确说明，否则本文提及“配体”是指二聚配体(例如，当提及诱导本文所提供的嵌合凋亡蛋白酶-9蛋白的二聚化的“配体”时)。

如本文所用，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体的酪氨酸激酶活化域可包含RTK的跨膜域，接着是詹纳斯激酶(JAK)结合域或酪氨酸激酶。JAK及RTK激酶通过多聚化活化。JAK包括JAK1、JAK2、JAK3及TYK2，并且结合于由Box 1及Box 2模体组成的近膜模体。活化JAK2激酶(包含红血球生成素受体跨膜、Box 1及Box 2模体)的示例性酪氨酸激酶活化域氨基酸序列为：SEPVSGPTPSDLDPLILTLSLILVVILVLLTVLALLSHRRALKQKIWPGIPSPESEFEGLFTTHKGNFQLWLYQNDGCLWWSPCTPFTEDPPASLEVLSERC(SEQ ID NO:219)。在一些实施例中，跨膜域可含有减少配体非依赖性二聚化的突变。

在一些实施例中，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体的酪氨酸激酶活化域包含蛋白质的(或衍生自其的)JAK结合域。在一些实施例中，蛋白质为受体。在一些实施例中，蛋白质为激素受体或细胞激素受体。

在一些实施例中，酪氨酸激酶活化域包含蛋白质的(或衍生自其的)JAK结合域，所述蛋白质选自由如下组成的组：催乳素受体(PRLR)、生长激素受体(GHR)、血小板生成素受体/骨髓增生性白血病蛋白受体(TPOR/MPLR)、红血球生成素受体(EPOR)、粒细胞群落刺激因子受体(GCSFR)或GP130。术语“衍生自”意指对天然序列进行一个或多个修饰。例如，可仅使用天然序列的一部分，或可修饰天然序列以包含取代、***及/或缺失突变、或这些修饰的组合。在一些实施例中，JAK结合域包含TPOR或EPOR的(或衍生自其的)JAK结合域。

在一些实施例中，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体的酪氨酸激酶活化域包含蛋白质的(或衍生自其的)跨膜域，所述蛋白质选自由如下组成的组：PRLR、GHR、TPOR/MPLR、EPOR、GCSFR及GP130。

在一些实施例中，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体的酪氨酸激酶活化域包含PD-1的(或衍生自其的)跨膜域。在这些实施例中，酪氨酸激酶活化域还包含如本文所述的受体的(或衍生自其的)JAK结合域或酪氨酸激酶域。

在一些实施例中，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体的酪氨酸激酶活化域包含跨膜域及JAK结合域或跨膜域及酪氨酸激酶域，其中所述跨膜域衍生自细胞激素/激素受体(例如，TpoR)、单体化细胞激素/激素受体(例如，EpoR L241G L242P)、或单体受体(例如，PD1)。如本文所用，“单体化细胞激素/激素受体”是指细胞激素受体或激素受体，其为呈天然形式的同源二聚物或异二聚物，但经突变以呈单体受体存在。

在一些实施例中，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体的酪氨酸激酶活化域包含TPOR/MPLR的(或衍生自其的)跨膜域。天然的TPOR/MPLR的示例性全长序列显示于表1A中(SEQ ID NO.:64)。在一些实施例中，酪氨酸激酶活化域包含显示于表1A中的TPOR/MPLR序列的(或衍生自其的)跨膜域。例如，在一些实施例中，酪氨酸激酶活化域包含显示于表1A中的TPOR/MPLR的氨基酸478-582(这一序列也以“TPOR/MPLR(478-582)(野生型序列)”显示于表1C中)。

在一些其它实施例中，酪氨酸激酶活化域包含显示于表1A中的衍生自TPOR/MPLR的氨基酸478-582的序列。在这些实施例中，可诱导的嵌合细胞激素受体的酪氨酸激酶活化域包含衍生自显示于表1A中的TPOR/MPLR的氨基酸478-582的序列，其中所述序列包含选自由如下组成的组的一个或多个突变：取代、缺失、***及其组合。在一个示例性实施例中，酪氨酸激酶活化域包含显示于表1A中的TPOR/MPLR的氨基酸序列478-582的缺失变异体。在一些实施例中，缺失变异体包括自显示于表1A中的TPOR/MPLR的区域478-582缺失1个、1至20个、1至19个、1至18个、1至17个、1至16个、1至15个、1至14个、1至13个、1至12、1至11个、1至10个、1至9个、1至8个、1至7个、1至6个、1至5个、1至4个、1至3个、1至2个氨基酸。在一些实施例中，缺失变异体包括自显示于表1A中的TPOR/MPLR的区域489-510缺失1个、1至20个、1至19个、1至18个、1至17个、1至16个、1至15个、1至14个、1至13个、1至12、1至11个、1至10个、1至9个、1至8个、1至7个、1至6个、1至5个、1至4个、1至3个、1至2个氨基酸。在一个示例性实施例中，酪氨酸激酶活化域包含显示于表1C中的TPOR/MPLR的氨基酸序列478-582的缺失变异体。

在一些实施例中，酪氨酸激酶活化域包含显示于表1A中的TPOR/MPLR的氨基酸序列478-582的***变异体。在一些实施例中，***变异体包含在显示于表1A中的TPOR/MPLR的区域478-582中***1个、1至10个、1至9个、1至8个、1至7个、1至6个、1至5个、1至4个、1至3个、1至2个氨基酸。在一个示例性实施例中，酪氨酸激酶活化域包含显示于表1C中的TPOR/MPLR的氨基酸序列478-582的***变异体。在一些实施例中，***于***变异体中的氨基酸选自由如下组成的组：亮氨酸、缬氨酸及异亮氨酸。

在一些实施例中，可诱导的嵌合细胞激素受体的酪氨酸激酶活化域包含衍生自显示于表1A中的TPOR/MPLR的氨基酸478-582的序列，其中所述序列包含这一区域中氨基酸的缺失及***的组合。在一个示例性实施例中，可诱导的嵌合细胞激素受体的酪氨酸激酶活化域包含衍生自显示于表1A中的TPOR/MPLR的氨基酸478-582的序列，其中所述序列包含从区域478-582缺失1至18个氨基酸及在区域478-582中***1至8个氨基酸。在另一个示例性实施例中，可诱导的嵌合细胞激素受体的酪氨酸激酶活化域包含衍生自显示于表1A中的TPOR/MPLR的氨基酸489-510的序列，其中所述序列包含自区域489-510缺失1至18个氨基酸及在区域489-510中***1至8个氨基酸。在一些实施例中，***于***变异体中的氨基酸选自由如下组成的组：亮氨酸、缬氨酸及异亮氨酸。

在一些实施例中，可诱导的嵌合细胞激素受体的酪氨酸激酶活化域包含公开于表1C中的序列。

在一些实施例中，可诱导的嵌合细胞激素受体的酪氨酸激酶活化域包含缺失及/或***PRLR、GHR、EPOR、GCSFR或GP130的跨膜域的变异体。表1A中公开天然的PRLR、GHR、EPOR、GCSFR及GP130的示例性全长序列及其登录号。根据本发明，可定位PRLR、GHR、EPOR、GCSFR及GP130的跨膜域及可制备这些跨膜域的***及/或缺失变异体。

在一些实施例中，酪氨酸激酶活化域的跨膜及/或JAK结合域可衍生自(例如)共同γ链受体、共同β链受体、IFNα受体(IFNAR)、IFNγ受体(IFNGR)、IFNλ受体(IFNLR)、IL2/IL15受体(IL2R/IL15R)、IL3受体(IL3R)、IL4受体(IL4R)、IL5受体(IL5R)、IL7受体(IL7R)、IL9受体(IL9R)，IL10受体(IL10R)、IL12受体(IL12R)、IL13受体(IL13R)、IL20受体(IL20R)、IL21受体(IL21R)、IL22受体(IL22R)、IL23受体(IL23R)、IL27受体(IL27R)、TSLP受体(TSLPR)、G-CSF受体(GCSFR)、GM-CSF受体(GMCSFR)、CNTF受体(CNTFR)、OSM受体(OSMR)、LIF受体(LIFR)或CT-1受体(CT1R)。

在一些实施例中，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体的酪氨酸激酶活化域包含受体酪氨酸激酶(RTK)的(或衍生自其的)酪氨酸激酶域。来自活化RTK激酶的RTK的示例性酪氨酸激酶活化域(包含表皮生长因子受体跨膜及激酶域)为：GLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYL(SEQ ID NO:220)。在一些实施例中，酪氨酸激酶活化域包含衍生自其它RTK的跨膜域及酪氨酸激酶域，所述其它RTK如以下：EGFR/HER1、ERBB2/HER2、ERBB3/HER3、ERRB4/HER4、INSR、IGF-1R、IRR、PDGFRA、PDGFRB、CSF-1R、KIT/SCFR、FLK2/FLT3、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3、FGFR-4、CCK4、TRKA、TRKB、TRKC、MET、RON、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、AXL、MER、TYRO3、TIE、TEK、RYK、DDR1、DDR2、RET、ROS、LTK、ALK、ROR1、ROR2、MUSK、AATYK、AATYK2、AATYK3或RTK106。

在一些实施例中，酪氨酸激酶活化域包含EGFR的(或衍生自其的)酪氨酸激酶域。

在一些实施例中，酪氨酸激酶活化域包含公开于表1B中的酪氨酸激酶活化域序列。

在一些实施例中，酪氨酸效应域可含有至少一种受体的细胞质尾(细胞尾)的一部分，所述至少一种受体如：细胞激素受体、激素受体、或RTK、或酪氨酸激酶转接蛋白。如本文所使用的“细胞尾”为包含一个或多个酪氨酸残基的部分，所述一个或多个酪氨酸残基能够在活化后被激酶磷酸化。于细胞尾或转接蛋白内的酪氨酸被经活化的酪氨酸激酶磷酸化。经磷酸化的酪氨酸模体募集信号转导因子。来自细胞激素受体(包含IL2Rb远端细胞尾)的示例性酪氨酸效应域氨基酸序列为：VTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV(SEQ ID NO:221)。

某些受体(如细胞激素受体及激素受体)的细胞尾包含STAT活化域(在本文中也可称为STAT结合域)。在一些实施例中，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体的酪氨酸效应域包含受体的(或衍生自其的)至少一个STAT活化域。在一些实施例中，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体的酪氨酸效应域包含两种、三种、四种或更多种受体的(或衍生自其的)至少两个、三个、四个或更多个STAT活化域。受体可为细胞激素受体及/或激素受体。

在一些实施例中，可诱导的嵌合细胞激素受体的酪氨酸效应域包含至少一种、两种、三种、四种或更多种受体(例如，细胞激素受体、激素受体或RTK)或酪氨酸激酶转接蛋白的(或衍生自其的)细胞尾(包含能够被激酶磷酸化的一个或多个酪氨酸残基的细胞质尾的一部分)。在一个示例性实施例中，可诱导的嵌合细胞激素受体的酪氨酸效应域包含细胞激素受体的(或衍生自其的)细胞尾及激素受体的(或衍生自其的)细胞尾。在另一个示例性实施例中，可诱导的嵌合细胞激素受体的酪氨酸效应域包含细胞激素受体的(或衍生自其的)细胞尾及RTK的(或衍生自其的)尾。在又另一个示例性实施例中，可诱导的嵌合细胞激素受体的酪氨酸效应域包含激素受体的(或衍生自其的)细胞尾及RTK的(或衍生自其的)细胞尾。在又另一个示例性实施例中，可诱导的嵌合细胞激素受体的酪氨酸效应域包含激素受体的(或衍生自其的)细胞尾；RTK的(或衍生自其的)细胞尾；和细胞激素受体的(或衍生自其的)细胞尾。涵盖其中细胞尾中的至少一种包含酪氨酸激酶转接蛋白的含可磷酸化的酪氨酸的部分的细胞尾的类似组合。当可诱导的嵌合细胞激素受体的酪氨酸效应域包含超过一个细胞尾时，所述细胞尾可以任何顺序存在。

在一些实施例中，可诱导的嵌合细胞激素受体的酪氨酸效应域包含两个细胞激素受体的(或衍生自其的)STAT活化域。在一些实施例中，可诱导的嵌合细胞激素受体的酪氨酸效应域包含选自由如下组成的组的至少一个受体的(或衍生自其的)STAT活化域：BLNK(B-细胞连接蛋白)、IL2RG、EGFR、EpoR、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNAR1/2、IFNLR1、IL10R1、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、IL2Rb、IL2small、IL7R、IL7Ra、IL9R、IL15R及IL21R。当酪氨酸效应域包含超过一个STAT活化域时，所述STAT活化域为串联的，其中一个域呈膜近端的而其它域呈膜远端的。

在一些实施例中，可诱导的嵌合细胞激素受体的酪氨酸效应域包含第一受体的(或衍生自其的)细胞尾，所述第一受体选自由如下组成的组：BLNK、IL2RG、EGFR、EpoR、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNAR1/2、IFNLR1、IL10R1、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、IL2Rb、IL2small、IL7R、IL7Ra、IL9R、IL15R及IL21R，及第二受体的(或衍生自其的)细胞尾，所述第二受体选自由如下组成的组：BLNK、IL2RG、EGFR、EpoR、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNAR1/2、IFNLR1、IL10R1、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、IL2Rb、IL2small、IL7R、IL7Ra、IL9R、IL15R及IL21R。在这些实施例中，来自第一受体的细胞尾可呈膜近端的并且来自第二受体的细胞尾可呈膜远端的，或反之亦然。本发明涵盖其中可诱导的嵌合细胞激素受体的酪氨酸效应域包含超过两个(如三个、四个或更多个)来自这一段落中所述的受体的细胞质的类似实施例。

在一些实施例中，可诱导的嵌合细胞激素受体的酪氨酸效应域包含公开于表1B中的至少一个酪氨酸效应域序列。在一些实施例中，酪氨酸效应域包含公开于表1B中的至少两个酪氨酸效应域序列。当存在公开于表1B中的超过一个酪氨酸效应域序列时，任何序列可呈膜近端的及其它序列可呈膜远端的。

在一些实施例中，酪氨酸效应域包含来自如以下的细胞激素受体的细胞尾的序列：共同γ链受体、共同β链受体、IFNα受体、IFNγ受体、IFNλ受体、IL2/IL15受体、IL3受体、IL4受体、IL5受体、IL7受体、IL9受体、IL10受体、IL12受体、IL13受体、IL20受体、IL21受体、IL22受体、IL23受体、IL27受体、TSLP受体、G-CSF受体、GM-CSF受体、CNTF受体、OSM受体、LIF受体、CT-1受体、红血球生成素受体、生长激素受体、催乳素受体、血小板生成素受体或GP130。来自RTK(包含EGFR远端细胞尾)的示例性酪氨酸效应域氨基酸序列为：VIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLPVPEYINQSVPKRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAVGNPEYLNTVQPTCVNSTFDSPAHWAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA(SEQ IDNO:222)。在一些实施例中，酪氨酸效应域包含来自如以下的RTK的细胞尾的序列：GFR/HER1、ERBB2/HER2、ERBB3/HER3、ERRB4/HER4、INSR、IGF-1R、IRR、PDGFRA、PDGFRB、CSF-1R、KIT/SCFR、FLK2/FLT3、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3、FGFR-4、CCK4、TRKA、TRKB、TRKC、MET、RON、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、AXL、MER、TYRO3、TIE、TEK、RYK、DDR1、DDR2、RET、ROS、LTK、ALK、ROR1、ROR2、MUSK、AATYK、AATYK2、AATYK3或RTK106。来自酪氨酸激酶转接蛋白(包含BLNK酪氨酸域)的示例性酪氨酸效应域氨基酸序列为：ASESPADEEEQWSDDFDSDYENPDEHSDSEMYVMPAEENADDSYEPPPVEQETRPVHPALPFARGEYIDNRSSQRHSPPFSKTLPSKPSWPSEKARLTSTLPALTALQKPQVPPKPKGLLEDEADYVVPVEDNDENYIHPTESSSPPPEKAPMVNR(SEQ ID NO:223)。在一些实施例中，酪氨酸效应域包含来自或结合于如以下的转接蛋白的序列：ALX、BLNK、Grb7、Nsp、SLP-76、SOCS、TSAd、APS、Bam32、Crk、Gads、Grb2、Nck、SLAP、Shc、FRS2、Dab、Dok、IRS、eps8、AFAP110、Gab、ADAP、Carma1、Cas、CIN85、Cortactin、E3B1、Vinexin、SKAP-55、BANK、BCAP、Dof、Paxillin、LAT、LAX、LIME、NTAL、PAG、SIT或者TRIM。

在一些实施例中，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体的酪氨酸效应域可包含来自一个或多个细胞激素受体、RTK及/或转接蛋白的序列。在一些实施例中，所述序列可为串联的。在一些实施例中，酪氨酸效应域可包含(例如)来自细胞激素受体、RTK或酪氨酸激酶转接蛋白的较短的含酪氨酸肽。在一些实施例中，酪氨酸效应域可为能够结合包括(例如)以下的一种或多种蛋白质的合成序列：磷光体-酪氨酸结合蛋白(PTB)域、Src同源性2(SH2)域、C2域及/或Src同源性3(SH3)域。

在一些实施例中，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体包含二聚化域；包含跨膜域及JAK结合域的酪氨酸激酶活化域；和包含至少一个受体的(或衍生自其的)STAT活化域的酪氨酸效应域。在一些这些实施例中，二聚化域包含FKBP多肽；跨膜域包括蛋白质的(或衍生自其的)跨膜域，所述蛋白质选自由如下组成的组：EPOR、GP130、PRLR、GHR、GCSFR、PD-1及TPOR；JAK结合域包含蛋白质的(或衍生自其的)JAK结合域，所述蛋白质选自由如下组成的组：EPOR、GP130、PRLR、GHR、GCSFR及TPOR；并且STAT活化域包括至少一种受体的(或衍生自其的)STAT活化域，所述至少一种受体选自由如下组成的组：BLNK、IL2RG、EGFR、EpoR、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNAR1/2、IFNLR1、IL10R1、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、IL2Rb、IL2small、IL7R、IL7Ra、IL9R、IL15R及IL21R。

在一些实施例中，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体包含选自表1B的二聚化域、选自表1B或表1C的酪氨酸激酶活化域及选自表1B的酪氨酸效应域。

在一些实施例中，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体包含选自表2A或表2B的序列。在一些实施例中，可诱导的嵌合细胞激素受体包含选自SEQ ID NO.:1-58、187-215及225-311的序列。

表1A提供本发明中提供的天然的受体的示例性全长序列，由所述天然的受体衍生得到跨膜蛋白。表1A中提供的序列为参考序列，与所述参考序列有关的后来突变表示于(例如)表1B及1C中。

表1A：示例性的天然的受体

可用于本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体中的示例性氨基酸序列示于表1B中。

表1B

可用于本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体中的TPOR/MPLR(或衍生自其的)示例性跨膜及JAK结合序列示于表1C中。

表1C

在另一个方面，本文提供分离的免疫细胞，其包含本文所公开的一种或多种可诱导的嵌合细胞激素受体。在其它实施例中，本文所提供的分离的免疫细胞包含(i)本文所公开的一种或多种可诱导的嵌合细胞激素受体及(ii)嵌合抗原受体(CAR)。有利地，相对于不表达可诱导的嵌合细胞激素受体的细胞，本文所提供的分离的免疫细胞展示在与结合于二聚化域的配体接触后改进的持久性。在一些实施例中，相对于不表达可诱导的嵌合细胞激素受体的细胞，本文所提供的分离的免疫细胞展示在与结合于二聚化域的配体接触后改进的细胞毒性、增加的扩增及/或增加的记忆表型标记水平。通过包含本文所述的可诱导的嵌合细胞激素受体的分离的免疫细胞展示的持久性、细胞毒性、扩增及/或记忆表型标记的改进可在体外或体内。在一些实施例中，分离的免疫细胞选自由如下组成的组：T细胞、树突细胞、杀伤树突细胞、肥大细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞及B细胞。

在一些实施例中，分离的免疫细胞为分离的T细胞。在一些实施例中，本文所提供的分离的T细胞包含本文所公开的一种或多种可诱导的嵌合细胞激素受体。在其它实施例中，本文所提供的分离的T细胞包含(i)本文所公开的一种或多种可诱导的嵌合细胞激素受体及(ii)嵌合抗原受体(CAR)。有利地，相对于不表达可诱导的嵌合细胞激素受体的细胞，本文所提供的分离的T细胞展示在与结合于二聚化域的配体接触后改进的体内持久性。在一些实施例中，相对于不表达可诱导的嵌合细胞激素受体的细胞，本文所提供的分离的T细胞展示在与结合于二聚化域的配体接触后改进的细胞毒性、增加的扩增及/或增加的记忆表型标记水平。这些特征中的一个或多个的改进可在体外或体内。

在一些实施例中，相对于不表达可诱导的嵌合细胞激素受体的分离的免疫细胞，包含本文所公开的一种或多种可诱导的嵌合细胞激素受体的分离的免疫细胞展示在与结合于二聚化域的配体接触后，(i)增加的体内持久性、(ii)增加的STAT活化、(iii)增加的细胞毒性、(iv)增加的记忆表型标记水平、(v)增加的扩增(增殖)、或这些功能特征的组合。在一些实施例中，本文所述的一种或多种功能特征的改进随剂量改变，即，包含可诱导的嵌合细胞激素受体的免疫细胞的功能活性在与剂量递增的结合于二聚化域的配体接触后增加。在一些实施例中，通过可诱导的嵌合细胞激素受体活化的STAT包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6或其组合。STAT的活化包括STAT的募集、STAT的磷酸化及/或STAT的二聚化或STAT的易位。在一些实施例中，通过包含可诱导的嵌合细胞激素受体的免疫细胞增加或维持的记忆表型标记包括干细胞记忆(Tscm)标记及中枢记忆(Tcm)标记。

在一些实施例中，与不表达可诱导的嵌合细胞激素受体的免疫细胞相比，通过包含本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体的免疫细胞所展示的一种或多种功能特征改进至少约2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、125倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、或甚至约500倍，包括其间的值及范围。

在一些实施例中，与不表达可诱导的嵌合细胞激素受体的免疫细胞相比，通过包含本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体的免疫细胞所展示的一种或多种功能特征改进至少约10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、90％、100％、125％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、或甚至约500％，包括其间的值及范围。

在一些实施例中，本发明的分离的免疫细胞(如分离的T细胞)包含显示于表2A中的可诱导的嵌合细胞激素受体。

表2A：示例性的可诱导的嵌合细胞激素受体序列

在一些实施例中，本发明的分离的免疫细胞(如分离的T细胞)包含表2B中所示的可诱导的嵌合细胞激素受体。

表2B：示例性的可诱导的嵌合细胞激素受体序列

本发明涵盖对显示于表2A及2B中的本发明实施例的可诱导的嵌合细胞激素受体的修饰，包括具有不显著影响其性质的修饰的功能等效蛋白质及具有增强或降低的活性及/或亲和力的变异体。多肽的修饰为所属领域中的常规实务及不需要在此详细描述。经修饰的多肽的实例包括具有氨基酸残基的保守取代、氨基酸的一个或多个缺失或新增(其不显著有害地改变功能活性，或其成熟(增强)多肽对其配体的亲和力、或化学类似物的用途)的多肽。

氨基酸序列***包括氨基-及/或羧基端融合，长度范围为一个残基到包含一百个或更多个残基的多肽，及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的实例包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体或融合于表位标签的抗体。

取代变异体在可诱导的嵌合细胞激素受体中缺失至少一个氨基酸残基并在其位置***不同残基。表3中在标题“保守取代”下显示保守取代。如果此类取代导致生物活性改变，那么可引入表3中称为“示例性取代”或如下文参考氨基酸类别进一步描述的更实质性的改变，及筛选产物。

表3：氨基酸取代

在一些实施例中，可诱导的嵌合细胞激素受体可在将编码可诱导的嵌合细胞激素受体的多核苷酸引入到细胞中后在分离的免疫细胞(如CAR-T细胞)中原位合成。或者，可诱导的嵌合细胞激素受体可在细胞外部产生，并且然后引入到细胞中。所属领域中已知用于将多核苷酸构建体引入到细胞中的方法。在一些实施例中，稳定的转型方法可用于将多核苷酸构建体整合于细胞的基因组中。在其它实施例中，短暂转型方法可用于短暂表达多核苷酸构建体，并且所述多核苷酸构建体不整合于细胞的基因组中。在其它实施例中，可使用由病毒介导的方法。可通过任何适宜方法(如重组病毒载体(例如逆转录病毒、腺病毒)、脂质体等)将多核苷酸引入到细胞中。短暂转型方法包括(例如，但不限于)显微注射、电穿孔或粒子轰击。多核苷酸可包括在载体(如质粒载体或病毒载体)中。

在一些实施例中，本发明的分离的免疫细胞(如分离的T细胞)可包含至少一种可诱导的嵌合细胞激素受体及至少一种CAR。在一些实施例中，分离的免疫细胞(如分离的T细胞)可包含至少一个不同可诱导的嵌合细胞激素受体群体及至少一种CAR。例如，存在于分离的免疫细胞中的不同可诱导的嵌合细胞激素受体群体可包括具有相同二聚化域但具有不同酪氨酸激酶活化域及不同酪氨酸效应域的受体、或具有相同二聚化域、相同酪氨酸激酶活化域但具有不同酪氨酸效应域的受体、或具有彼此不同的所有三个域的受体等。在一些实施例中，分离的免疫细胞(如分离的T细胞)可包含至少一种可诱导的嵌合细胞激素受体及CAR群体，每种CAR包含不同胞外配体结合域。

将不同可诱导的嵌合细胞激素受体群体引入到免疫细胞中可允许操纵细胞功能结果及/或表型。例如，存在于分离的免疫细胞中的不同可诱导的嵌合细胞激素受体可活化不同胞内信号传导事件，每个事件均导致特定功能结果并且/或将细胞导引到特定表型。通过操纵引入到细胞中的可诱导的嵌合细胞激素受体群体，可操纵细胞的功能结果及/或表型。例如，可操纵引入到免疫细胞中的可诱导的嵌合细胞激素受体群体以包含更多数量的受体，所述受体为活化一个STAT转录因子而不是其它STAT，由此使细胞的功能结果及/或表型偏向于通过所述STAT控制的受体。

在分离的免疫细胞(例如本文所提供的分离的T细胞)的一些实施例中，CAR可包含胞外配体结合域(例如，单链可变片段(scFv))、跨膜域及胞内信号传导域。在一些实施例中，胞外配体结合域、跨膜域及胞内信号传导域在一个多肽中，即，在单链中。本文还提供多链CAR及多肽。在一些实施例中，多链CAR包含：包含跨膜域及至少一个胞外配体结合域的第一多肽、及包含跨膜域及至少一个胞内信号传导域的第二多肽，其中所述多肽组装在一起形成多链CAR。

CAR的胞外配体结合域特异性结合于所关注的靶标。所关注的靶标可为所关注的任何分子，包括(例如，但不限于)BCMA、EGFRvIII、Flt-3、WT-1、CD20、CD23、CD30、CD38、CD70、CD33、CD133、LeY、NKG2D、CS1、CD44v6、ROR1、CD19、紧密连接蛋白-18.2(紧密连接蛋白-18A2或紧密连接蛋白18同种型2)、DLL3(δ样蛋白3、果蝇δ同源物3、δ3)、Muc17(Mucin17、Muc3、Muc3)、FAPα(成纤维细胞活化蛋白α)、Ly6G6D(淋巴细胞抗原6复合基因座蛋白G6d、c6orf23、G6D、MEGT1、NG25)、RNF43(E3泛素-蛋白连接酶RNF43、RING指蛋白43)。

在一些实施例中，CAR的胞外配体结合域包含scFv，其包含靶抗原特异性单克隆抗体的通过挠性连接符连接的轻链可变(VL)区及重链可变(VH)区。通过使用短连接肽连接轻链及/或重链可变区来制备单链可变区片段(Bird等人，《科学(Science)》242:423-426，1988)。连接肽的一个实例为具有氨基酸序列(GGGGS)3(SEQ ID NO:224的GS连接符，其在一个可变域的羧基端与另一可变域的氨基端之间桥接约3.5nm。已设计并使用其它序列的连接符(Bird等人，1988，同前述)。通常，连接符可为短、挠性多肽，并且优选包含约20个或更少个氨基酸残基。连接符可进一步经修饰以获得额外功能，如附着药物或附着于固体担体。单链变异体可重组或合成产生。就scFv的合成生产来说，可使用自动合成仪。就scFv的重组产生来说，可将包含编码scFv的多核苷酸的适宜质粒引入到适宜宿主细胞(真核细胞(如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞)或原核细胞(如大肠杆菌))中。编码所关注的scFv的多核苷酸可通过例行操纵(如多核苷酸的连接)来制备。可使用所属领域中已知的标准蛋白质纯化技术分离所得的scFv。

根据本发明的CAR的胞内信号传导域负责在使胞外配体结合域结合于靶标后的胞内信号传导，导致免疫细胞的活化及免疫反应。胞内信号传导域具有活化其中表达CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能的能力。例如，T细胞的效应子功能可为细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞激素的分泌。

在一些实施例中，用于CAR中的胞内信号传导域可为例如(但不限于)协同作用以在抗原受体参与后引发信号转导的T细胞受体及辅受体的细胞质序列、以及这些序列的任何衍生物或变异体及具有相同功能能力的任何合成序列。胞内信号传导域包含两个不同类别的细胞质信号传导序列：引发抗原依赖性初级活化的序列、及以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的序列。初级细胞质信号传导序列可包含信号传导模体，其已知为ITAM的基于免疫受体酪氨酸的活化模体。ITAM为明确定义的信号传导模体，其在多种受体的胞质内尾中发现，所述多种受体充当syk/zap70类酪氨酸激酶的结合位点。用于本发明中的ITAM的实例可包括作为非限制性实例的ITAM衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d的ITAM。在一些实施例中，CAR的胞内信号传导域可包含CD3ζ信号传导域。在一些实施例中，本发明的CAR的胞内信号传导域包含共刺激分子的域。

在一些实施例中，本发明的CAR的胞内信号传导域包含选自由41BB(GenBank:AAA53133.)及CD28(NP_006130.1)的片段组成的组的共刺激分子的一部分。

CAR在细胞的表面膜上表达。因此，CAR可包含跨膜域。用于本文所公开的CAR的适宜跨膜域具有如下能力：(a)在细胞(优选免疫细胞，如(例如，但不限于)淋巴细胞或自然杀伤(NK)细胞)的表面处表达，及(b)与配体结合域及胞内信号传导域相互作用，以导引免疫细胞对预定靶细胞的细胞反应。跨膜域可衍生自天然来源或衍生自合成来源。跨膜域可衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。作为非限制性实例，跨膜多肽可为T细胞受体的次单元，如α、β、γ或δ、构成CD3复合体的多肽、IL-2受体p55(a链)、p75(β链)或γ链、Fc受体的次单元链，尤其Fcγ受体III或CD蛋白。或者，跨膜域可为合成的并且可主要包含疏水性残基(如亮氨酸及缬氨酸)。在一些实施例中，所述跨膜域衍生自人类CD8α链(例如，NP_001139345.1)。跨膜域可还包含介于胞外配体结合域与所述跨膜域之间的茎域。茎域可包含至多300个氨基酸，优选10至100个氨基酸并且最优选25至50个氨基酸。茎区可衍生自天然的分子的全部或部分，如衍生自CD8、CD4或CD28的胞外区的全部或部分、或衍生自抗体恒定区的全部或部分。或者，茎域可为对应于天然的茎序列的合成序列，或可为完全合成茎序列。在一些实施例中，所述茎域为人类CD8α链(例如，NP_001139345.1)的一部分。在另一个特定实施例中，所述跨膜及铰链域包含人类CD8α链的一部分。在一些实施例中，本文所公开的CAR可包含特异性结合BCMA、CD8α人铰链及跨膜域的胞外配体结合域、CD3ζ信号传导域及4-1BB信号传导域。在一些实施例中，CAR可通过质粒载体作为转殖基因引入到免疫细胞中。在一些实施例中，质粒载体还可包含(例如)选择标记，其提供针对接收载体的细胞的识别及/或选择。

表4提供可用于本文所公开的CAR中的CAR组分的示例性序列。

表4：CAR组分的示例性序列

在将编码CAR多肽的多核苷酸引入到细胞中后，可在细胞中原位合成CAR多肽。或者，CAR多肽可在细胞外部产生，并且然后引入到细胞中。所属领域中已知用于将多核苷酸构建体引入到细胞中的方法。在一些实施例中，稳定的转型方法可用于将多核苷酸构建体整合于细胞的基因组中。在其它实施例中，短暂转型方法可用于短暂表达多核苷酸构建体，并且所述多核苷酸构建体不整合于细胞的基因组中。在其它实施例中，可使用由病毒介导的方法。可通过任何适宜方法(如重组病毒载体(例如逆转录病毒、腺病毒)、脂质体等)将多核苷酸引入到细胞中。短暂转型方法包括(例如，但不限于)显微注射、电穿孔或粒子轰击。多核苷酸可包括在载体(如质粒载体或病毒载体)中。

本文还提供分离的免疫细胞，其包含本文所述的至少一种可诱导的嵌合细胞激素受体。分离的免疫细胞可还包含嵌合抗原受体(CAR)。如本说明书中提及的经修饰以表达可诱导的嵌合细胞激素受体及/或CAR的分离的免疫细胞也可互换地称为工程化免疫细胞。可根据本文所述方法中的任何一种方法来制备这些分离的免疫细胞。能够表达异源DNA的任何免疫细胞可用于表达可诱导的嵌合细胞激素受体及所关注的CAR的目的。在一些实施例中，分离的免疫细胞为T细胞。在一些实施例中，免疫细胞可衍生自(例如，但不限于)干细胞。所述干细胞可为成体干细胞、非人类胚胎干细胞(更尤其非人类干细胞)、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导型多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞。代表性人类细胞为CD34+细胞。在一些实施例中，分离的免疫细胞可为树突细胞、杀伤树突细胞、肥大细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、B细胞或T细胞。在一些实施例中，分离的免疫细胞可为选自由发炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节T淋巴细胞或辅助T淋巴细胞组成的组的T细胞。在一些实施例中，所述细胞可衍生自由CD4+ T-淋巴细胞及CD8+ T-淋巴细胞组成的组。在一些实施例中，分离的免疫细胞为自体T细胞。在一些实施例中，分离的免疫细胞为同种异体T细胞。

在一些实施例中，本发明的CAR免疫细胞(例如，CAR-T细胞)包含编码***多肽(如RQR8)的多核苷酸。参见，例如，WO2013153391A，其以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，***多肽在细胞的表面上表达。在一些实施例中，***多肽包含在CAR构建体中。在一些实施例中，***多肽不是CAR构建体的部分。

在一些实施例中，本文所公开的CAR中的任何一种的胞外域可包含对单克隆抗体具有特异性(通过单克隆抗体特异性识别)的一个或多个表位。这些表位在本文中也称为mAb特异性表位。示例性mAb特异性表位公开于国际专利公开第WO 2016/120216号中，其以全文引用的方式并入本文中。在这些实施例中，CAR的胞外域包含特异性结合于所关注的标靶的抗原结合域及结合于一个或多个单克隆抗体(mAb)的一个或多个表位。包含mAb特异性表位的CAR可呈单链或多链的。

在本文所述的CAR的胞外域中包含对单克隆抗体具有特异性的表位允许分选及消除表达CAR的工程化免疫细胞。在一些实施例中，允许消除在有害作用的情况下(例如)在给予到个体后提供安全转化。

在增殖及遗传修饰之前，可通过各种非限制性方法从个体获得细胞的来源。细胞可由许多非限制性来源获得，包括外周血液单核细胞、骨髓、***组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织及肿瘤。在一些实施例中，可使用所属领域的技术人员可获得并已知的任何数量的免疫细胞系，如T细胞系。在一些实施例中，细胞可衍生自健康供体，衍生自诊断患有癌症的个体或衍生自诊断患有感染的个体。在一些实施例中，细胞可为呈现不同表型特征的混合细胞群的部分。

本文还提供根据本文所述任何方法从经转型的免疫细胞(如经转型的T细胞)获得的细胞系。在一些实施例中，分离的免疫细胞(如根据本发明的分离的T细胞)包含编码可诱导的嵌合细胞激素受体的多核苷酸。在一些实施例中，根据本发明的分离的免疫细胞包含编码可诱导的嵌合细胞激素受体的多核苷酸及编码CAR的多核苷酸。在一些实施例中，根据本发明的分离的免疫细胞包含编码可诱导的嵌合细胞激素受体的多核苷酸、编码CAR的多核苷酸及编码NK细胞拮抗剂的多核苷酸。

本发明的分离的免疫细胞(如分离的T细胞)可在T细胞的遗传修饰之前或之后，使用如一般描述的方法，例如(但不限于)美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开第20060121005号，来进行活化及增殖。免疫细胞可在体外或体内增殖。通常，本发明的T细胞可增殖，例如，通过与刺激T细胞的表面上的CD3 TCR复合体及共刺激分子的试剂接触，以产生T细胞的活化信号。例如，化学品(如钙离子载体A23187、佛波醇(phorbol)12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)或有丝***凝集素(例如植物血球凝集素(PHA)))可用于产生T细胞的活化信号。

在一些实施例中，可通过与适宜抗体或其抗原结合片段接触来体外刺激免疫细胞群。例如，T细胞群可通过与(例如)抗-CD3抗体或其抗原结合片段、或固定于表面上的抗-CD28抗体、或通过与与钙离子载体结合的蛋白激酶C活化剂(例如，苔藓抑素)接触而体外刺激。为共刺激T细胞的表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，在适于刺激T细胞的增殖的条件下，可使T细胞群与抗-CD3抗体及抗-CD28抗体接触。适于T细胞培养的条件包括适宜培养基(例如，最低要求培养基或RPMI培养基1640、或X-vivo 5(龙沙(Lonza)))，其可包含增殖及活性所必需的因子，包括血清(例如，胎牛或人类血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-2、IL-15、TGFβ及TNF、或熟练技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞的生长的其它添加剂包括(但不限于)表面活性剂、血浆制剂(plasmanate)及还原剂(如N-乙酰基-半胱氨酸及2-巯基乙醇)。培养基可包括RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 1、及X-Vivo 20(Optimizer)，伴随经添加氨基酸、丙酮酸钠及维生素，无血清或补充适量的血清(或血浆)或一组确定的激素、及/或足以使T细胞生长及增殖的量的细胞激素。抗生素(例如青霉素及链霉素)仅包含在实验培养物中，而不包含在待输注到个体中的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所需的条件下，例如，适宜的温度(例如，37℃)及大气(例如，空气加上5％CO₂)。已被暴露于不同刺激时间的T细胞可展示不同特征。

在一些实施例中，可通过与组织或细胞共培养来扩增本发明的细胞。所述细胞也可(例如)在给予细胞到个体中后在个体的血液中体内扩增。

在另一个方面，本发明提供包含任何本发明细胞的组合物(如医药组合物)。在一些实施例中，所述组合物包含分离的T细胞，其包含编码本文所述的任何可诱导的嵌合细胞激素受体的多核苷酸及编码CAR的多核苷酸。

本文进一步描述表达载体、及多核苷酸组合物的给予。

在另一个方面，本发明提供制备本文所述的任何多核苷酸的方法。

与任何此类序列互补的多核苷酸还包括在本发明中。多核苷酸可为单链(编码或反义)或双链的，并且可为(基因组、cDNA或合成性)DNA、或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子(其包含内含子并以一对一方式对应于DNA分子)及mRNA分子(其不包含内含子)。额外的编码或非编码序列可(但不必)存在于本发明的多核苷酸内，及多核苷酸可(但不必)连接于其它分子及/或担体材料。

多核苷酸可包含天然序列(即，编码抗体或其部分的内源序列)或可包含此类序列的变异体。多核苷酸变异体包含一个或多个取代、新增、缺失及/或***，使得经编码的多肽的免疫反应性相对于天然免疫反应性分子不会减少。通常可如本文所述评估对经编码的多肽的免疫反应性的影响。变异体优选展示与编码天然抗体或其一部分的多核苷酸序列至少约70％相同，更优选地，至少约80％相同，又更优选地，至少约90％相同，并且最优选地，至少约95％相同。

如果这两个序列中的核苷酸或氨基酸的序列在如下文所述进行最大对应性比对时是相同的，那么认为两个多核苷酸或多肽序列“相同”。两个序列间的比较通常通过在比较窗口上比较所述序列以鉴定及比较具序列相似性的局部区域来进行。如本文所用的“比较窗口”是指至少约20个连续位置、通常30至约75个、或40至约50个的片段，其中可将某一序列与相同数量的连续位置的参考序列在最佳比对这两个序列后进行比较。

可使用Lasergene生物信息学软件套件(威斯康星州麦迪逊的DNASTAR公司)中的Megalign程式，使用默认参数，进行用于比较的序列的最佳比对。这一程式体现描述于以下参考文献中的几种比对方案：Dayhoff,M.O.，1978，《蛋白质进化变化模型-检测远距关系的矩阵(A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detectingdistant relationships.)》Dayhoff,M.O.(编)《蛋白质序列和结构图集(Atlas ofProtein Sequence and Structure)》，国家生物医学研究基金会(National BiomedicalResearch Foundation)，华盛顿DC第5卷，增刊3，第345-358页；Hein J.，1990，《比对和系统发生联合法(Unified Approach to Alignment and Phylogenes)》第626-645页《酶学方法(Methods in Enzymology)》第183卷，加利福尼亚州圣迭戈的学术出版社公司(AcademicPress,Inc.，San Diego，CA)；Higgins,D.G.及Sharp,P.M.，1989，CABIOS 5:151-153；Myers,E.W.及Muller W.，1988，CABIOS 4:11-17；Robinson,E.D.，1971，《组合理论(Comb.Theor.)》11:105；Santou,N.、Nes,M.，1987，《分子生物学与进化(Mol.Biol.Evol.)》4:406-425；Sneath,P.H.A.及Sokal,R.R.，1973，《数值分类：数值分类的原则与实践(Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy)》，加利福尼亚州旧金山的弗里曼出版社(Freeman Press，San Francisco，CA)；Wilbur,W.J.及Lipman,D.J.，1983，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》USA 80:726-730。

优选地，通过在至少20个位置的比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定“序列同一性百分比”，其中多核苷酸或多肽序列的在比较窗口中的部分可包含与参考序列(不包含新增或缺失)相比20％或更少，通常5％至15％、或10％至12％的新增或缺失(即，缺口)以进行这两个序列的最佳比对。通过确定相同核酸碱基或氨基酸残基在两个序列中出现的位置数以产生匹配位置的数量，将所述匹配位置的数量除以参考序列中的位置总数(即窗口大小)及将所述结果乘以100以产生序列同一性百分比，来计算得百分比。

变异体还可或替代性地与天然基因或其一部分或补体大体上同源。此类多核苷酸变异体能够在中等严格条件下与编码天然抗体(或互补序列)的天然的DNA序列杂交。

适宜的“中等严格条件”包括在5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的溶液中预洗涤；在50℃-65℃5×SSC下杂交过夜；接着在65℃下历时20分钟用含有0.1％SDS的2X、0.5X及0.2X SSC各洗涤两次。

如本文所用，“高严格条件”为如下的条件：(1)洗涤采用低离子强度及高温，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，在50℃下；(2)在杂交中使用变性剂，如甲酰胺，例如，50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)与750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠，在42℃下；或(3)使用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×丹哈德溶液(Denhardt’s solution)、经声波处理的鲑鱼***DNA(50μg/ml)、0.1％SDS及10％聚葡萄糖硫酸盐，在42℃下，并在42℃下于0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)及在55℃下于50％甲酰胺中洗涤，接着在55℃下进行由含有EDTA的0.1×SSC组成的高严格洗涤。熟练技术人员将认识到如何根据需要调整温度、离子强度等以适应如探针长度等的因素。

所属领域的普通技术人员将了解，由于遗传密码的简并性，存在编码如本文所述的多肽的许多核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。尽管如此，本发明尤其涵盖由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸。此外，包含本文所提供的多核苷酸序列的基因的等位基因在本发明范围内。等位基因为内源性基因，其由于一个或多个突变(如核苷酸的缺失、新增及/或取代)而改变。所得的mRNA及蛋白质可(但不必)具有改变的结构或功能。可使用标准技术(如杂交、扩增及/或数据库序列比较)鉴定等位基因。

可使用化学合成、重组方法或PCR获得本发明的多核苷酸。所属领域中熟知化学多核苷酸合成的方法但不需要在此详细描述。所属领域的技术人员可使用本文所提供的序列及商业DNA合成仪以产生所需的DNA序列。

就使用重组方法来制备多核苷酸来说，可将包含所需序列的多核苷酸***于适宜载体中，及进而可将载体引入到适宜宿主细胞中以用于复制及增殖，如本文中进一步论述。可通过所属领域中已知的任何方法将多核苷酸***于宿主细胞中。通过直接摄取、内吞作用、转染、F-交配或电穿孔引入外源多核苷酸来转型细胞。一旦引入，外源多核苷酸可作为非整合载体(例如质粒)保持在胞内或整合到宿主细胞基因组中。经如此扩增的多核苷酸可通过所属领域中熟知的方法从宿主细胞中分离。参见，例如，Sambrook等人，1989。

或者，PCR允许DNA序列的再现。PCR技术是所属领域中熟知的并且描述于美国专利第4,683,195号、第4,800,159号、第4,754,065号及第4,683,202号中，以及《PCR：聚合酶链反应》，Mullis等人编，Birkauswer出版社，波士顿，1994。

通过在适宜载体中使用分离的DNA并将其***于适宜宿主细胞中，可获得RNA。当细胞复制并且DNA被转录成RNA时，那么可使用所属领域的技术人员熟知的方法(如Sambrook等人，1989，同上述所述)来分离RNA。

适宜的克隆载体可根据标准技术构建，或可选自所属领域中可获得的大量克隆载体。虽然所选的克隆载体可根据意图使用的宿主细胞而变化，但有用的克隆载体通常具有自我复制的能力，可具有特定限制性内切核酸酶的单个靶标，并且/或可携带可用于选择包含载体的克隆体的标记的基因。适宜的实例包括质粒及细菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如，pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA及穿梭载体(如pSA3及pAT28)。这些及许多其它克隆载体可从商业供货商(如伯乐(BioRad)、Strategene及英杰(Invitrogen))获得。

表达载体通常为可复制的多核苷酸构建体，其含有根据本发明的多核苷酸。这意指表达载体必须可作为附加体或作为染色体DNA的组成部分在宿主细胞中复制。适宜的表达载体包括(但不限于)质粒、病毒载体，包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、粘质粒及公开于PCT公开第WO 87/04462号中的表达载体。载体组分通常可包括(但不限于)如下中的一种或多种：信号序列；复制起点；一个或多个标记基因；适宜的转录控制组件(如启动子、增强子及终止子)。为达表达(即转译)，通常，还需要一个或多个转译控制组件，如核糖体结合位点、转译起始位点及终止密码子。

包含所关注的多核苷酸的载体可通过许多适宜方法中的任何一种方法引入到宿主细胞中，包括电穿孔、使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-聚葡萄糖或其它物质进行转染；微弹轰击；脂质体转染；和感染(例如，在载体为感染剂，如疫苗病毒的情况下)。引入载体或多核苷酸的选择通常取决于宿主细胞的特征。

编码本文所公开的可诱导的嵌合细胞激素受体或CAR的多核苷酸可呈表达盒或表达载体(例如，用于引入到细菌宿主细胞中的质粒、或病毒载体(如用于转染昆虫宿主细胞的杆状病毒载体)、或质粒或病毒载体(如用于转染哺乳动物宿主细胞的慢病毒))存在。在一些实施例中，使用非病毒载体将编码可诱导的嵌合细胞激素受体及/或CAR的多核苷酸引入到分离的免疫细胞中。可用于本发明的方法中的示例性非病毒载体包括(但不限于)基于转座子的载体，如pigpiggyBac^TM，Frog Prince、Sleeping Beauty(例如，SB100X载体)等。在一些实施例中，将编码可诱导的嵌合细胞激素受体及/或CAR的多核苷酸整合于细胞基因组中。在一些实施例中，所述整合呈定点的。提供定点整合的示例性方法包括使用基因组编辑核酸酶(如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化子样效应子核酸酶(TALEN)、及成簇、规则间隔的短回文重复相关核酸酶(CRISPR)(如Cas9内切核酸酶))的方法。

在一些实施例中，多核苷酸或载体可包括编码核糖体跳跃序列的核酸序列，例如(但不限于)，编码2A肽的序列。在小核糖核酸病毒的***病毒(Aphthovirus)子集中鉴定出的2A肽导致核糖体从一个密码子“跳跃”到下一个密码子而不在通过密码子编码的两个氨基酸之间形成肽键(参见(Donnelly及Elliott 2001；Atkins、Wills等人2007；Doronina、Wu等人2008))。“密码子”意指mRNA上(或DNA分子的义链上)的三个核苷酸，其被核糖体转译成一个氨基酸残基。因此，当多肽被框内的2A寡肽序列分开时，可从imRNA内的单个连续开放阅读框合成两个、三个、四个或更多个多肽。这种核糖体跳跃机制为所属领域中熟知的并已知通过几种载体用于表达通过单个信使RNA编码的几种蛋白质。

为将跨膜多肽导引到宿主细胞的分泌途径中，在一些实施例中，在多核苷酸序列或载体序列中提供分泌信号序列(也称为前导序列、前原序列或前序列)。分泌信号序列可以操作方式连接于跨膜核酸序列，即这两个序列在正确的阅读框架中连接并且定位以将新合成的多肽导引到宿主细胞的分泌途径中。分泌信号序列通常定位于编码所关注的多肽的核酸序列的5'，虽然某些分泌信号序列可定位于所关注的核酸序列的其它位置(参见，例如，Welch等人，美国专利第5,037,743号；Holland等人，美国专利第5,143,830号)。在一些实施例中，信号肽包含以SEQ ID NO:318或329显示的氨基酸序列。所属领域的技术人员将认识到，鉴于遗传密码的简并性，这些多核苷酸分子之间可能存在相当大的序列变异。在一些实施例中，本发明的核酸序列经密码子优化以在哺乳动物细胞中表达，优选在人类细胞中表达。密码子优化是指在所给定物种的高表达基因中通常很少见的密码子的所关注的序列通过通常在这些物种的高表达基因中很常见的密码子(这些密码子编码氨基酸作为交换的密码子)交换。

本文提供制备用于免疫疗法中的免疫细胞的方法。在一些实施例中，所述方法包括将可诱导的嵌合细胞激素受体及CAR引入到免疫细胞中，并且使所述细胞扩增。在一些实施例中，本发明涉及工程化免疫细胞的方法，所述方法包括：提供细胞并表达可诱导的嵌合细胞激素受体，并在细胞的表面处表达至少一种CAR。在一些实施例中，所述方法包括：转染具有编码可诱导的嵌合细胞激素受体的至少一个多核苷酸及编码CAR的至少一个多核苷酸的细胞，并且表达所述细胞中的所述多核苷酸。在一些实施例中，所述方法包括：转染具有编码可诱导的嵌合细胞激素受体的至少一个多核苷酸、编码CAR的至少一个多核苷酸的细胞，并且表达所述细胞中的所述多核苷酸。

在一些实施例中，编码可诱导的嵌合细胞激素受体及CAR的多核苷酸存在于一个或多个表达载体中以达成细胞中的稳定表达。在一些实施例中，所述多核苷酸存在于病毒载体中以达成细胞中的稳定表达。在一些实施例中，所述病毒载体可为(例如)慢病毒载体或腺病毒载体。

在一些实施例中，编码根据本发明的多肽的多核苷酸可为mRNA，其(例如)通过电穿孔直接引入到细胞中。在一些实施例中，cytoPulse技术(如PulseAgile)可用于短暂透化活细胞以将材料递送到细胞中(例如http://cytopulse.com；US 6,078,490；PCT/US2011/000827；和PCT/US2004/005237)。可修改参数以确定针对于高转染效率但死亡率最小的条件。

本文还提供转染免疫细胞(如T细胞)的方法。在一些实施例中，所述方法包括：使免疫细胞与RNA接触并且对免疫细胞应用由如下组成的敏捷脉冲序列：(a)一个电脉冲，其电压范围为每厘米约2250至3000V；(b)脉冲宽度为0.1ms；(c)步骤(a)及(b)的电脉冲之间的脉冲时间间隔为约0.2至10ms；(d)一个电脉冲，其电压范围为约2250至3000V，脉冲宽度为约100ms及步骤(b)的电脉冲与步骤(c)的第一电脉冲之间的脉冲时间间隔为约100ms；和(e)四个电脉冲，电压为约325V并且脉冲宽度为约0.2ms及4个电脉冲中的每一个之间的脉冲间隔为2ms。在一些实施例中，转染免疫细胞的方法包括使所述免疫细胞与RNA接触并且对免疫细胞应用敏捷脉冲序列，所述敏捷脉冲序列包括：(a)一个电脉冲，电压为每厘米约2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000V；(b)脉冲宽度为0.1ms；(c)步骤(a)及(b)的电脉冲之间的脉冲时间间隔为约0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10ms；(d)一个电脉冲，电压范围为约2250、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000V，脉冲宽度为100ms及步骤(b)的电脉冲与步骤(c)的第一电脉冲之间的脉冲时间间隔为100ms；和(e)4个电脉冲，电压为约325V并且脉冲宽度为约0.2ms及4个电脉冲中的每一个之间的脉冲时间间隔为约2ms。包含在上述值范围中的任何值均公开于本申请中。电穿孔介质可为所属领域中已知的任何适宜介质。在一些实施例中，电穿孔介质的电导率在跨约0.01至约1.0毫西门子(milliSiemens)的范围内。

在一些实施例中，所述方法可进一步包括通过灭活至少一种基因表达(例如(但不限于)TCR的组分、免疫抑制剂的靶标、HLA基因及/或免疫检查点蛋白质(如PDCD1或CTLA-4))来遗传修饰细胞的步骤。通过灭活基因，其意图使所关注的基因不以功能性蛋白质形式表达。在一些实施例中，待灭活的基因选自由例如(但不限于)TCRα、TCRβ、CD52、GR、脱氧胞苷激酶(DCK)、PD-1及CTLA-4组成的组。在一些实施例中，所述方法包括通过将可通过选择性DNA裂解选择性灭活基因的稀切核酸内切酶引入到细胞中来灭活一个或多个基因。在一些实施例中，所述稀切内切核酸酶可为(例如)转录活化子样效应子核酸酶(TALE-核酸酶)或Cas9内切核酸酶。

在另一个方面，遗传修饰细胞的步骤可包括：通过灭活表达免疫抑制剂的靶标的至少一个基因来修饰免疫细胞；并任选地在免疫抑制剂的存在下使所述细胞增殖。免疫抑制剂为通过几种作用机制中的一种作用机制抑制免疫功能的药剂。免疫抑制剂可减少免疫反应的程度及/或涡度(voracity)。免疫抑制剂的非限制性实例包括钙调神经磷酸酶抑制剂、雷帕霉素的标靶、白介素-2α-链阻断剂、肌苷单磷酸脱氢酶的抑制剂、二氢叶酸还原酶的抑制剂、皮质类固醇及免疫抑制抗代谢物。一些细胞毒性免疫抑制剂通过抑制DNA合成来起作用。其它可通过T细胞的活化或通过抑制辅助细胞的活化来起作用。根据本发明的方法允许通过灭活T细胞中免疫抑制剂的靶标而赋予T细胞免疫抑制抗性以用于免疫疗法。作为非限制性实例，免疫抑制剂的靶标可为免疫抑制剂的受体，如(例如，但不限于)CD52、糖皮质激素受体(GR)、FKBP家族基因成员及亲环素家族基因成员。

治疗方法

可将通过上述方法获得的分离的免疫细胞或衍生自此类分离的免疫细胞的细胞系给予有需要的个体并用作药物。在一些实施例中，分离的免疫细胞为T细胞。在一些实施例中，此类药物可用于治疗病症，如病毒性疾病、细菌性疾病、癌症、发炎性疾病、免疫疾病或衰老相关疾病。在一些实施例中，癌症可选自由如下组成的组：胃癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、头颈癌、胸腺癌、上皮癌、唾液腺癌、肝癌、胃癌、甲状腺癌、肺癌、卵巢癌、乳癌、***癌、食道癌、胰腺癌、胶质瘤、白血病、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、膀胱癌、***、绒毛膜癌、结肠癌、口腔癌、皮肤癌及黑色素瘤。在一些实施例中，个体为先前治疗过的成人个体，其患有局部晚期或转移性黑色素瘤、鳞状细胞头颈癌(SCHNC)、卵巢癌、肉瘤或复发或难治性典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)。

在一些实施例中，分离的免疫细胞(如根据本发明的分离的T细胞或衍生自分离的免疫细胞的细胞系)可用于制造用于治疗有需要的个体的病症的药物。在一些实施例中，所述病症可为(例如)癌症、自体免疫病症或感染。

本文还提供用于治疗个体的方法。在一些实施例中，所述方法包括对有需要的个体提供包含本发明的可诱导的嵌合细胞激素受体的分离的免疫细胞。在一些实施例中，所述方法包括将本发明的分离的免疫细胞给予有需要的个体的步骤。在一个示例性实施例中，所述方法包括对有需要的个体提供包含本发明的可诱导的嵌合细胞激素受体的分离的T细胞。在一些实施例中，所述方法包括对有需要的个体给予本发明的分离的T细胞的步骤。

在一些实施例中，本发明的分离的免疫细胞可经历稳健体内细胞增殖并且可持续一段延长的时间。

所述方法可进一步包括在给予携带CAR及本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体的工程化免疫细胞之前对个体给予一种或多种治疗剂。在某些实施例中，所述药剂为淋巴清除(预处理)方案。例如，对需要此类疗法的个体进行淋巴清除的方法包括对个体给予指定有益剂量的环磷酰胺(200mg/m²/天至2000mg/m²/天、约100mg/m²/天至2000mg/m²/天；例如，约100mg/m²/天、约200mg/m²/天、约300mg/m²/天、约400mg/m²/天、约500mg/m²/天、约600mg/m²/天、约700mg/m²/天、约800mg/m²/天、约900mg/m²/天、约1000mg/m²/天、约1500mg/m²/天或约2000mg/m²/天)及指定剂量的氟达拉滨(fludarabine)(20mg/m²/天至900mg/m²/天、约10mg/m²/天至约900mg/m²/天；例如，约10mg/m²/天、约20mg/m²/天、约30mg/m²/天、约40mg/m²/天、约40mg/m²/天、约50mg/m²/天、约60mg/m²/天、约70mg/m²/天、约80mg/m²/天、约90mg/m²/天、约100mg/m²/天、约500mg/m²/天或约900mg/m²/天)。示例性给药方案涉及治疗个体，包括在给予治疗有效量的工程化免疫细胞于患者之前，以组合方式或在给予约30mg/m²/天的氟达拉滨之前或之后每天对患者给予约300mg/m²/天的环磷酰胺共三天。

在一些实施例中，尤其在本文所提供的工程化细胞已经过基因编辑以消除或最小化CD52的表面表达时，淋巴细胞清除进一步包括给予抗-CD52抗体，如阿来组单抗(alemtuzumab)。在一些实施例中，CD52抗体以约1-20mg/天IV(例如，约13mg/天IV)的剂量给予1、2、3天或更多天。所述抗体可以与淋巴细胞清除方案的其它组件(例如，环磷酰胺及/或氟达拉滨)组合的方式、在给予所述其它组件之前或之后给予。

在某些实施例中，包含本文所公开的CAR-表达免疫效应子细胞的组合物可以与任何数量的化疗剂联合的方式给予。

本发明的治疗的方法可呈改善、治疗或预防。本发明的方法可为自体免疫疗法的部分或同种异体免疫疗法治疗的部分。本发明尤其适用于同种异体免疫疗法。在一个示例性实施例中，可使用标准方案将来自供体的T细胞转型为非同种异体反应性细胞并且根据需要再生，由此产生可给予一个或多个个体的CAR-T细胞。这种CAR-T细胞疗法可以“现成”治疗产品获得。

在另一个方面，本发明提供一种抑制患有肿瘤的个体的肿瘤生长或进展的方法，所述方法包括对个体给予有效量的如本文所述的分离的免疫细胞。在另一个方面，本发明提供一种抑制或预防个体的癌细胞的转移的方法，所述方法包括对有需要的个体给予有效量的如本文所述的分离的免疫细胞。在另一个方面，本发明提供一种诱导患有肿瘤的个体的肿瘤消退的方法，所述方法包括对个体给予有效量的如本文所述的分离的免疫细胞。在一个示例性实施例中，分离的免疫细胞为T细胞。

在一些实施例中，分离的免疫细胞可于个体中以肠胃外方式给予。在一些实施例中，所述个体为人类。

还提供一种本文所提供的任何分离的免疫细胞于制造用于治疗癌症或用于抑制有需要的个体的肿瘤生长或进展的药物中的用途。在一个示例性实施例中，分离的免疫细胞为T细胞。

在一些实施例中，可将治疗给予经历免疫抑制治疗的个体中。实际上，本发明优选依赖于细胞或细胞群，由于编码这种免疫抑制剂的受体的基因的失活，所述细胞或细胞群已经对至少一种免疫抑制剂产生抗性。在这一方面，免疫抑制性治疗应有助于在个体体内选择及增殖根据本发明的免疫细胞。根据本发明的细胞或细胞群的给予可以任何简便方式进行，包括通过气溶胶吸入、注射、摄取、输血、植入或移植。本文所述的组合物可经皮下、皮内、肿瘤内、结内、髓内、肌肉内、通过静脉内或淋巴内注射或经腹膜内给予个体。在一些实施例中，本发明的细胞组合物优选通过静脉内注射给予。

在一些实施例中，给予细胞或细胞群可包括每kg体重给予(例如)约10⁴至约10⁹个细胞，包括在所述范围内的所有整数细胞数值。在一些实施例中，给予细胞或细胞群可包括每kg体重给予约10⁵至10⁶个细胞，包括在所述范围内的所有整数细胞数值。所述细胞或细胞群可以一剂或多剂给予。在一些实施例中，所述有效量的细胞可以单剂量给予。在一些实施例中，所述有效量的细胞可在一段时间内以多于一剂给予。投药时间在管理医师的判断范围内并且取决于个体的临床状况。所述细胞或细胞群可从任何来源(例如血库或供体)获得。虽然个体需求改变，但针对于在所属领域技艺范围内的特定疾病或病症确定所给定细胞类型的有效量的最佳范围。有效量意指提供治疗性或预防性益处的量。所给予的剂量将取决于接受者的年龄、健康状况及体重、合并治疗类型(如果有的话)、治疗的频率及所需作用的本质。在一些实施例中，以肠胃外方式给予有效量的细胞或包含所述细胞的组合物。在一些实施例中，投药可静脉内给予。在一些实施例中，投药可通过在肿瘤内注射直接进行。

试剂盒

本发明还提供用于本发明方法中的试剂盒。本发明的试剂盒包括一个或多个容器，其包含分离的免疫细胞，所述分离的免疫细胞包含编码可诱导的嵌合细胞激素受体及如本文所述的CAR的一个或多个多核苷酸、及根据本文所述的本发明任何方法使用的说明书。通常，这些说明书包括针对于上述治疗性治疗给予分离的免疫细胞的描述。在一个示例性实施例中，试剂盒可包含分离的T细胞。

与如本文所述的分离的免疫细胞的使用有关的说明书通常包括关于所欲治疗的剂量、给药方案及投药途径的信息。所述容器可呈单元剂量、批量包装(例如，多剂量包装)或子单元剂量。提供于本发明的试剂盒中的说明书通常在标签或包装插页(例如，包括于所述试剂盒中的纸片)上的书面说明书，但机器可读指令(例如，携带于磁性或光学储存碟上的说明书)也为可接受的。

本发明的试剂盒处于适宜的包装中。适宜的包装包括(但不限于)小瓶、瓶、广口瓶、软包装(例如，密封的Mylar或塑料袋)等。还考虑与特定装置(如吸入器、鼻给予装置(例如，雾化器)或输注装置(例如，微型泵))组合使用的包装。试剂盒可具有无菌进入口(例如，所述容器可呈静脉内溶液袋或具有可以皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。所述容器还可具有无菌进入口(例如，所述容器可呈静脉内注射溶液袋或具有可以皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂为分离的免疫细胞，其包含可诱导的嵌合细胞激素受体及CAR。所述容器可还包含第二医药活性剂。

试剂盒可任选地提供额外组分，如缓冲液及解释性信息。通常，所述试剂盒包括容器及在所述容器上或与所述容器相关联的标签或包装插页。

提供以下实例仅用于说明目的，并且并不意图以任何方式限制本发明的范围。实际上，除了本文所显示及所描述的那些之外，本发明的各种修改对于所属领域的技术人员来说从前面的描述将变得显而易见并且落在随附权利要求书的范围内。

编号实施例

可参考以下编号的示例性实施例来定义本文所公开的本发明。

实施例1.一种可诱导的嵌合细胞激素受体，其包含：

二聚化域；

酪氨酸激酶活化域；和

酪氨酸效应域。

实施例2.如实施例1的可诱导的嵌合细胞激素受体，其中所述二聚化域结合小分子。

实施例3.如实施例1或2的可诱导的嵌合细胞激素受体，其中所述二聚化域结合于二聚配体AP1903、AP20187、二聚FK506或二聚FK506样类似物。

实施例4.如实施例1至3中任一项的可诱导的嵌合细胞激素受体，其中所述二聚化域包含FKBP12多肽。

实施例5.如实施例4的可诱导的嵌合细胞激素受体，其中所述FKBP12多肽包含氨基酸取代F36V。

实施例6.如实施例1的可诱导的嵌合细胞激素受体，其中所述二聚化域结合蛋白质。

实施例7.如实施例1的可诱导的嵌合细胞激素受体，其中所述二聚化域包含蛋白质的多肽，所述蛋白质选自由如下组成的组：FKBP、亲环素、类固醇结合蛋白、***结合蛋白、糖皮质激素结合蛋白、维生素D结合蛋白、四环素结合蛋白、细胞激素受体的胞外域、受体酪氨酸激酶、TNFR家族受体及免疫辅受体。

实施例8.如实施例7的可诱导的嵌合细胞激素受体，其中所述免疫辅受体选自由如下组成的组：红血球生成素受体、催乳素受体、生长激素受体、血小板生成素受体、粒细胞群落刺激因子受体、GP130、共同γ链受体、共同β链受体、IFNα受体、IFNγ受体、IFNλ受体、IL2/IL15受体、IL3受体、IL4受体、IL5受体、IL7受体、IL9受体、IL10受体、IL12受体、IL13受体、IL20受体、IL21受体、IL22受体、IL23受体、IL27受体、TSLP受体、G-CSF受体、GM-CSF受体、CNTF受体、OSM受体、LIF受体、CT-1受体、TGFBR1/ALKL5、TGFBR2、EGFR/HER1、ERBB2/HER2、ERBB3/HER3、ERRB4/HER4、INSR、IGF-1R、IRR、PDGFRA、PDGFRB、CSF-1R、KIT/SCFR、FLK2/FLT3、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3、FGFR-4、CCK4、TRKA、TRKB、TRKC、MET、RON、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、AXL、MER、TYRO3、TIE、TEK、RYK、DDR1、DDR2、RET、ROS、LTK、ALK、ROR1、ROR2、MUSK、AATYK、AATYK2、AATYK3、RTK106、TNFR1、Fas、TRAILR1、TRAILR2、NGFR、DR3、DR6、EDAR、TNFR2、LTbR、OX40、CD40、CD27、CD30、4-1BB、RANK、Fn14、TACI、BAFFR、HVEM、BCMA、GITR、TROY、RELT、XEDAR、TRAILR3、TRAILR4、OPG、DcR3、PD-1、CD80、CD86、ICOS-L、ICOS、CTLA-4、BTLA、CD160、LAG3及TIM3。

实施例9.如实施例1至8中任一项的可诱导的嵌合细胞激素受体，其中所述酪氨酸激酶活化域衍生自或包含蛋白质的多肽，所述蛋白质选自由如下组成的组：共同γ链受体、共同β链受体、IFNα受体、IFNγ受体、IFNλ受体、IL2/IL15受体、IL3受体、IL4受体、IL5受体、IL7受体、IL9受体、IL10受体、IL12受体、IL13受体、IL20受体、IL21受体、IL22受体、IL23受体、IL27受体、TSLP受体、G-CSF受体、GM-CSF受体、CNTF受体、OSM受体、LIF受体、CT-1受体、EGFR/HER1、ERBB2/HER2、ERBB3/HER3、ERRB4/HER4、INSR、IGF-1R、IRR、PDGFRA、PDGFRB、CSF-1R、KIT/SCFR、FLK2/FLT3、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3、FGFR-4、CCK4、TRKA、TRKB、TRKC、MET、RON、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、AXL、MER、TYRO3、TIE、TEK、RYK、DDR1、DDR2、RET、ROS、LTK、ALK、ROR1、ROR2、MUSK、AATYK、AATYK2、AATYK3及RTK106受体。

实施例10.如实施例1至9中任一项的可诱导的嵌合细胞激素受体，其中所述酪氨酸效应域衍生自或包含蛋白质的多肽，所述蛋白质选自由如下组成的组：共同γ链受体、共同β链受体、IFNα受体、IFNγ受体、IFNλ受体、IL2/IL15受体、IL3受体、IL4受体、IL5受体、IL7受体、IL9受体、IL10受体、IL12受体、IL13受体、IL20受体、IL21受体、IL22受体、IL23受体、IL27受体、TSLP受体、G-CSF受体、GM-CSF受体、CNTF受体、OSM受体、LIF受体、CT-1受体、EGFR/HER1、ERBB2/HER2、ERBB3/HER3、ERRB4/HER4、INSR、IGF-1R、IRR、PDGFRA、PDGFRB、CSF-1R、KIT/SCFR、FLK2/FLT3、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3、FGFR-4、CCK4、TRKA、TRKB、TRKC、MET、RON、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、AXL、MER、TYRO3、TIE、TEK、RYK、DDR1、DDR2、RET、ROS、LTK、ALK、ROR1、ROR2、MUSK、AATYK、AATYK2、AATYK3、RTK106、ALX、BLNK、Grb7、Nsp、SLP-76、SOCS、TSAd、APS、Bam32、Crk、Gads、Grb2、Nck、SLAP、Shc、FRS2、Dab、Dok、IRS、eps8、AFAP110、Gab、ADAP、Carma1、Cas、CIN85、Cortactin、E3B1、Vinexin、SKAP-55、BANK、BCAP、Dof、Paxillin、LAT、LAX、LIME、NTAL、PAG、SIT及TRIM。

实施例11.如实施例1至10中任一项的可诱导的嵌合细胞激素受体，其中所述二聚化域位于所述可诱导的嵌合细胞激素受体的N端处。

实施例12.如实施例1至10中任一项的可诱导的嵌合细胞激素受体，其中所述二聚化域位于所述可诱导的嵌合细胞激素受体的C端处。

实施例13.如实施例1至12中任一项的可诱导的嵌合细胞激素受体，其中所述可诱导的嵌合细胞激素受体包含跨膜域。

实施例14.如实施例1至13中任一项的可诱导的嵌合细胞激素受体，其中所述可诱导的嵌合细胞激素受体包含膜靶向模体。

实施例15.如实施例14的可诱导的嵌合细胞激素受体，其中所述膜靶向模体包含CD8信号序列或肉豆蔻酰基。

实施例16.如实施例1至15中任一项的可诱导的嵌合细胞激素受体，其中所述受体经肉豆蔻酰基化。

实施例17.如实施例1的可诱导的嵌合细胞激素受体，其中所述二聚化域包含FKBP多肽，所述酪氨酸激酶活化域包含EpoR或TpoR多肽，及所述酪氨酸效应域包含IL7受体(IL7R)多肽。

实施例18.如实施例17的可诱导的嵌合细胞激素受体，其中所述酪氨酸效应域还包含EGFR多肽。

实施例19.如实施例17的可诱导的嵌合细胞激素受体，其中所述酪氨酸效应域包含IL7R(316-459)、IL12Rb2(775-825)及/或EGFR(1122-1165)。

实施例20.一种多核苷酸，其包含编码如实施例1至19中任一项的可诱导的嵌合细胞激素受体的核酸序列。

实施例21.一种表达载体，其包含如实施例20的多核苷酸。

实施例22.一种工程化免疫细胞，其包含如实施例1至19中任一项的可诱导的嵌合细胞激素受体或如实施例20的多核苷酸。

实施例23.如实施例22的工程化免疫细胞，其中所述细胞还包含嵌合抗原受体(CAR)或编码CAR的多核苷酸。

实施例24.如实施例22或23的工程化免疫细胞，其中所述免疫细胞为T细胞。

实施例25.一种调节个体的工程化免疫细胞的方法，所述方法包括对先前已给予如实施例22至24中任一项的工程化免疫细胞的个体给予二聚配体，其中所述二聚配体结合于所述可诱导的嵌合细胞激素受体的二聚化域。

实施例26.如实施例25的方法，其中所述配体为AP1903。

实施例27.一种制备工程化免疫细胞的方法，所述方法包括将如实施例20的多核苷酸或如实施例21的表达载体引入到所述免疫细胞中。

实施例28.一种分离的T细胞，其包含

(i)可诱导的嵌合细胞激素受体，其包含细胞激素受体的二聚化域、酪氨酸激酶活化域及酪氨酸效应域；和

(ii)嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外配体结合域、跨膜域及胞内信号传导域。

实施例29.如实施例28的分离的T细胞，其中所述可诱导的嵌合细胞激素受体为如实施例1至19中任一项的可诱导的嵌合细胞激素受体。

实施例30.如实施例28或29的分离的T细胞，其中所述分离的T细胞展示相对于第二分离的T细胞的体内持久性改进的体内持久性，其中所述第二分离的T细胞包含所述分离的T细胞的所有组分，但其不包含所述可诱导的嵌合细胞激素受体。

实施例31.一种产生分离的T细胞的方法，其中所述方法包括如下的步骤：

(a)提供T细胞；

(b)修饰所述T细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外配体结合域、跨膜域及胞内信号传导域；和

(c)修饰所述T细胞以表达可诱导的嵌合细胞激素受体。

实施例32.如实施例31的方法，其中步骤c)包括将可诱导的嵌合细胞激素受体稳定地引入到所述细胞中。

实施例33.如实施例31或32的方法，其中步骤c)包括通过转座子/转座酶系统、基于病毒的基因转移系统或电穿孔将编码所述可诱导的嵌合细胞激素受体的多核苷酸引入到所述细胞中。

实施例34.如实施例31至33中任一项的方法，其中步骤b)包括通过转座子/转座酶系统或基于病毒的基因转移系统将编码所述嵌合抗原受体的多核苷酸引入到细胞。

实施例35.如实施例34的方法，其中所述基于病毒的基因转移系统包含重组逆转录病毒或慢病毒。

实施例36.如实施例31至35中任一项的方法，其中步骤(b)在步骤(c)之前发生。

实施例37.如实施例31至35中任一项的方法，其中步骤(c)在步骤(b)之前发生。

实施例38.一种医药组合物，其包含如实施例28至30中任一项的分离的T细胞，所述医药组合物用于治疗病症。

实施例39.如实施例38的医药组合物，其中所述疾病为癌症、自体免疫疾病或感染。

实施例40.如实施例38或39的医药组合物，其中将提供所述细胞不止一次。

实施例41.如实施例40的医药组合物，其中所述细胞将相隔至少约1、2、3、4、5、6、7天或更多天提供给所述个体。

实施例42.如实施例41的医药组合物，其中所述病症为病毒性疾病、细菌性疾病、癌症、发炎性疾病、免疫疾病或老化相关疾病。

实施例43.一种用于治疗个体的病症的方法，其中所述方法包括将如实施例28至30中任一项的分离的T细胞给予所述个体。

实施例44.如43的方法，其中将细胞提供给所述个体不止一次。

实施例45.如实施例43或44的方法，其中所述个体在给予分离的T细胞之前已先前经治疗剂治疗。

实施例46.如实施例45的方法，其中所述治疗剂为抗体或化疗剂。

实施例47.如实施例43至46中任一项的方法，其中所述病症为病毒性疾病、细菌性疾病、癌症、发炎性疾病、免疫疾病或老化相关疾病。

实施例48.如实施例47的方法，其中所述癌症为恶性血液病或实体癌症。

实施例49.如实施例48的方法，其中所述恶性血液病选自急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性嗜酸性粒细胞白血病(CEL)、骨髓发育不良综合征(MDS)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)或多发性骨髓瘤(MM)。

实施例50.如实施例49的方法，其中所述实体癌症选自胆管癌、膀胱癌、骨及软组织癌、脑肿瘤、乳癌、***、结肠癌、结肠直肠腺癌、结肠直肠癌、硬纤维瘤、胚胎癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、胃腺癌、多形性成胶质细胞瘤、妇科肿瘤、头颈鳞状细胞癌、肝癌、肺癌、恶性黑色素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰管腺癌、原发性星形细胞瘤、原发性甲状腺癌、***癌、肾癌、肾细胞癌、横纹肌肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、尿路上皮细胞癌、子宫肉瘤或子宫癌。

实例

实例1A：可诱导的嵌合细胞激素受体

已知可增强T细胞持久性及功能的细胞激素(如IL-2、IL-7及IL-15)经天然异二聚细胞激素受体进行信号传导，所述天然异二聚细胞激素受体继而活化JAK1及JAK3激酶(JAK激酶的示例性活化示于图1中)。可诱导的嵌合细胞激素受体(图1)经设计并且证实在调节CAR-T细胞中的细胞激素信号传导方面是有效的(下文实例)。AP1903可诱导的嵌合细胞激素受体为AP1903反应性FKBP^F36V融合蛋白。内源性FKBP结合雷帕霉素以抑制mTOR(图2A)。FKBP^F36V结合于雷帕霉素样化合物(雷帕霉素类似物(Rapalogs))(图2B)。AP1903为临床安全的雷帕霉素类似物二聚物，其使FKBP^F36V二聚化(图2C)。

在超过四十个已知细胞激素受体中，存在五种同源二聚物。这五种同源二聚体偶联于JAK2。JAK2作为同源二聚物活化。本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体的一个示例性实施例示于图3。

为利用具有多个不同受体的AP1903，将异二聚细胞激素受体转化为同源二聚物。

在一些实施例中，FKBP位于可诱导的嵌合细胞激素受体的N端处。在其它实施例中，FKBP位于可诱导的嵌合细胞激素受体的C端处。在一些实施例中，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体具有跨膜域。在其它实施例中，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体缺少跨膜域。在一些实施例中，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体经肉豆蔻酰基化。在其它实施例中，本文所提供的可诱导的嵌合细胞激素受体未经肉豆蔻酰基化。

实例2：小分子可诱导的Epo受体的比较

本实例说明本文所提供的各种可诱导的嵌合细胞激素受体的功效。

在本研究中，测试以下可诱导的嵌合细胞激素受体的活性：

a.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-508；L241G、L242P)-V5(SEQ ID NO:1)

b.V5-EpoR(273-508)

c.V5-EpoR(273-508)-FKBP(F36V)

d.V5-EpoR(273-508)-FKBP(E31G,F36V,R71G,K105E)

e.肉豆蔻酰基-V5-EpoR(273-508)-FKBP(F36V)

f.肉豆蔻酰基-V5-EpoR(273-508)-FKBP(E31G,F36V,R71G,K105E)

g.V5-EpoR(273-508)-FKBP(F36V)-FKBP(F36V)(SEQ ID NO2)

h.V5-EpoR(273-508)-FKBP(E31G,F36V,R71G,K105E)-FKBP(E31G,F36V,R71G,K105E)(SEQ ID NO:3)

i.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-CD8(138-206)-EpoR(273-508)-V5

j.FKBP(F36V,L106P)-FKBP(F36V,L106P)-EpoR(273-508)-V5

k.FKBP(F36V,L106P)-EpoR(273-508)-V5

l.FKBP(F36V)-EpoR(273-508)-V5

m.FKBP(F36V)-FKBP(F36V)-EpoR(273-508)-V5

根据构建体名称，受体包含膜靶向模体(CD8信号序列(CD8 SS)或肉豆蔻酰基)、二聚化域(FKBP(F36V)或其突变体)、包含跨膜(EpoR(237-272))的EpoR的一部分、JAK2结合模体(EpoR(273-338))及/或酪氨酸效应域(EpoR(339-508))。构建体也可包含表位标签(Myc或V5)以进行蛋白质印迹法或流动分析。

将编码可诱导的嵌合细胞激素受体的载体与STAT5转录因子(Promega E4651)的荧光素酶报告子一起转染到HEK293T细胞中。报告子载体由在STAT5反应性DNA组件的控制下表达的萤火虫荧光素酶组成。于加入红血球生成素(Epo)后，红血球生成素受体(EpoR)活化JAK2激酶，然后所述JAK2激酶使EpoR细胞尾的酪氨酸磷酸化以产生STAT5的结合位点。然后，将所结合的STAT5磷酸化，活化STAT5以接合DNA模体并且促进转录。将Epo加入到具有经EpoR转染的细胞的样品，及将AP1903加入到具有通过使EpoR融合于FKBP而转染的细胞的样品。没有将Epo或AP1903加入到样品以评估基线信号传导。STAT5分析的结果概述于图4。在图4中，“配体”为Epo或AP1903中任一种。

CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-508；L241G、L242P)-V5的信号传导最接近EpoR(1-508)阳性对照(图4)。

这些结果证实某些AP1903可诱导的嵌合细胞激素受体可在通过AP1903二聚化后有效地传导信号以活化报告子。AP1903可诱导的嵌合细胞激素受体构建体CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-508；L241G、L242P)-V5证实强烈的活性。

实例3A：可产生IL2、IL7、IL12、IL21及IFNa/b信号的嵌合小分子可诱导的Epo受体

通过改变嵌合细胞激素受体(例如CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-细胞尾XYZ)的酪氨酸效应域(细胞尾)，可将受体再导引到所选择的信号传导。所测试的可诱导的嵌合细胞激素受体利用CD8 SS膜靶向模体、FKBP(F36V)二聚化域、EpoR(237-338；L241G、L242P)酪氨酸激酶活化域、及来自EpoR、GHR、IL2Rb、IL7R、IL12Rb2、IL21R、IFNAR2或IFNLR1受体中任一种的酪氨酸效应域。缺少JAK2结合模体及酪氨酸效应子尾的阴性对照包括CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-282；L241G、L242P)。在本研究中测试以下可诱导的嵌合细胞激素受体：

a.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-EpoR(339-508)-V5(SEQ ID NO 1)

b.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-GHR(353-638)(SEQ IDNO 4)

c.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IL2Rb(333-551)(SEQID NO 5)

d.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IL7R(316-459)(SEQID NO 6)

e.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IL12Rb2(714-862)(SEQ ID NO 7)

f.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IL12Rb2(775-825)(SEQ ID NO 8)

g.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IL21R(322-538)(SEQID NO 9)

h.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IFNAR2(310-515)(SEQID NO 410)

i.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IFNLR1(300-520)(SEQID NO 11)

用编码以上可诱导的嵌合细胞激素受体的构建体短暂转染HEK293细胞，并且用针对于所示途径的荧光素酶报告子转染。用配体处理细胞24小时。结果概述于图5A中。在本研究中，“对照二聚物”为无尾构建体。

在图5A中，黑箱诱导倍率>5。所有STAT4实验均通过共转染STAT4来完成。

实例3B：细胞尾域中的完整JAK结合域及可磷酸化的酪氨酸为信号传导所必需

为识别可诱导的嵌合细胞激素受体信号传导所必需的组分，产生FKBP转换，其缺少细胞尾域中的JAK结合域或酪氨酸残基中的任一个。具体来说，来自TpoR(478-582)的任何一个或两个JAK结合模体经甘氨酸连接符置换，或IL7R(316-459)细胞尾中的全部或单个(即Y449)酪氨酸残基经突变为苯丙氨酸。术语“转换”如实例部分中所用是指可诱导的嵌合细胞激素受体。例如，如本文所用“FKBP转换”为可诱导的嵌合细胞激素受体，其包含作为二聚化域的FKBP。

使用HEK293T细胞报告子分析来测试这些域中的每一个如何影响细胞激素信号传导。简单地说，将20,000个HEK293T细胞接种于涂覆聚-L-赖氨酸的96孔平底板的每个孔中并且允许黏附过夜。将驱动萤火虫荧光素酶(100ng；普洛麦格(Promega))及海肾荧光素酶对照报告子载体(1ng；普洛麦格)的嵌合细胞激素受体(2.5ng)以最终体积5μL混合于Opti-MEM(Gibco)中(“DNA混合物”)。在室温下培养含在5μL Opti-MEM中的0.3μL脂质转染胺2000(英杰)5分钟并且然后加入到DNA混合物。在室温下培养所述混合物20分钟并将总体积10μL加入到包含HEK-293T的每个孔。在转染后24小时，将细胞保持未处理，或用在无血清培养基中稀释的指定浓度的AP1903(Apex Bio)处理，并且使用Dual-Glo荧光素酶分析系统(普洛麦格)处理后5小时确定Stat报告子活性。具有来自TpoR(478-582)的两个完整JAK结合模体及未突变的IL7R(316-459)的FKBP转换用作阳性对照。作为阴性对照(即模拟转染)，除嵌合细胞激素受体外，用所有组分转染细胞。将Stat报告子活性的诱导倍率归一化到经除了可诱导的细胞激素受体的外并且保持未处理的所有载体转染的HEK293T细胞的诱导倍率。每种条件以一式三份设置孔。

图5B显示在AP1903处理后缺少指定域的FKBP转换的STAT5报告子活性。与阳性对照相比，去除一个(即无JAK 2；IL7)或两个(即无JAK 1,2；IL7)JAK结合模体消除AP1903诱导的Stat5报告子活性。类似地，IL7R(317-459)细胞尾中所有3个酪氨酸残基突变为苯丙氨酸消除AP1903诱导的Stat5报告子活性。在本实例中，IL7R(317-459)细胞尾中的Y499经识别为介导Stat5活化的关键酪氨酸残基。

实例4：用于同基因研究的小鼠受体

产生工程化可诱导的受体的小鼠形式。由于FKBP高度保守，FKBP(F36V)序列未发生变化。然而，使用小鼠EpoR的跨膜及JAK2结合部分、及小鼠IL2Rb及IL7R受体的酪氨酸效应域。在本研究中测试以下可诱导的嵌合细胞激素受体：

a.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-muEpoR(236-337；L264G、L265P)-muIL2Rb(337-539)(SEQ ID NO 12)

b.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-muEpoR(236-337；L264G、L265P)-muIL7R(316-459)(SEQ ID NO 13)

将编码可诱导的嵌合细胞激素受体的载体与STAT5的荧光素酶报告子一起转染到HEK293T细胞中，并且加入用于指定途径的二聚化物。结果概述于图6。

小鼠构建体能够传导信号(经短暂转染的HEK293细胞上的配体传导信号6小时)(图6)。

实例5A：具有改进的信号传导的可诱导的嵌合细胞激素受体

在另一个研究中，先前设计的EpoR部分(FKBP-EpoRm TM-EpoR JAK盒式细胞尾)经其它同源二聚体细胞激素受体的相当域置换。为识别展示更强并且/或更快的信号传导的跨膜域，选择EpoR二聚物传导信号差的早期时间点(6-8小时，右图)。

就本研究来说，使用其它方面相同的可诱导的细胞激素受体设计比较几种酪氨酸激酶活化域。酪氨酸效应域由来自IL7R的STAT5活化序列融合于来自IL12Rb2的STAT4活化序列而组成。每个构建体包含膜靶向模体(CD8 SS)、二聚化域(FKBP(F36V))、衍生自EpoR、GP130、PrlR、GHR、GCSFR或TPOR/MPLR受体中任一种的酪氨酸激酶活化域、及由融合于IL12Rb2(775-825)肽的IL7R(316-459)细胞尾组成的酪氨酸效应域。嵌合细胞激素受体还包括用于检测的表位标签(Myc)。在本研究中测试以下可诱导的嵌合细胞激素受体：

a.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IL7R(316-459)-IL12Rb2(775-825)(SEQ ID NO 14)

b.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-GP130(609-700)-IL7R(316-459)-IL12Rb2(775-825)(SEQ ID NO 15)

c.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-PrlR(221-319)-IL7R(316-459)-IL12Rb2(775-825)(SEQ ID NO 16)

d.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-GHR(251-352)-IL7R(316-459)-IL12Rb2(775-825)(SEQ ID NO 17)

e.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-GCSFR(614-710)-IL7R(316-459)-IL12Rb2(775-825)(SEQ ID NO 18)

f.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-TPOR/MPLR(478-582)-IL7R(316-459)-IL12Rb2(775-825)(SEQ ID NO 19)

用编码以上可诱导的嵌合细胞激素受体的构建体及STAT4或STAT5中任一种的荧光素酶报告子转染HEK293细胞。荧光素酶报告子(普洛麦格)在STAT4或STAT5反应性组件中任一种的控制下编码荧光素酶。由于HEK293细胞缺失STAT4，在经STAT4报告子转染的孔中，转染编码连续表达的STAT4的质粒。经转染的EpoR、GHR及IL12Rb1+IL12Rb2(IL12受体)用作阳性对照。结果概述于图7、8、9及10A中。加入到可诱导的嵌合细胞激素受体的配体为AP1903。将Epo加入到经EpoR转染的细胞，将生长激素加入到经GHR转染的细胞，及将IL-12加入到经IL12受体转染的细胞。

具有EpoR组分的酪氨酸激酶活化域为最弱的信号传导构建体(图7)。STAT5及STAT4二者的最大诱导倍率通过基于TPOR/MPLR的二聚化物来达成：CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-TPOR/MPLR(478-582)-IL7R(316-459)-IL12Rb2(775-825)(SEQ ID NO 19)(FIG.7)。

基于EpoR的细胞激素受体(CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IL7R(316-459)-IL12Rb2(775-825)(SEQ ID NO 14))证实最低基础信号传导(基本上相当于单独的报告子)。GCSFR构建体(CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-GCSFR(614-710)-IL7R(316-459)-IL12Rb2(775-825)(SEQ ID NO 18))具有针对于STAT4的最强信号传导(图9)但具有基础信号传导。

实例5B：通过调节胞外域亲和力来优化信号传导输出的效力

为确定可诱导的嵌合细胞激素受体的无反应性/敏感性是否可通过调节胞外域对其配体的亲和力来调谐，产生通过相同JAK结合域及细胞尾传导信号但具有具有减少的对AP1903的亲和力的FKBP胞外域变异体的FKBP转换。

使用HEK293T细胞报告子分析来测试胞外域亲和力如何影响细胞激素信号传导的无反应性。简单地说，将20,000个HEK293T细胞接种于涂覆聚-L-赖氨酸的96孔平底板的每个孔中并且允许黏附过夜。将驱动萤火虫荧光素酶(100ng；普洛麦格)及海肾荧光素酶对照报告子载体(1ng；普洛麦格)的嵌合细胞激素受体(2.5ng)以最终体积5μL混合于Opti-MEM(Gibco)中(“DNA混合物”)。在室温下培养含在5μL Opti-MEM中的0.3μL脂质转染胺2000(英杰)5分钟并且然后加入到DNA混合物。在室温下培养所述混合物20分钟并将总体积10μL加入到包含HEK-293T的每个孔。在转染后24小时，将细胞保持未处理，或用在无血清培养基中稀释的指定浓度的AP1903(Apex Bio)处理，并且使用Dual-Glo荧光素酶分析系统(普洛麦格)处理后5小时确定Stat报告子活性。将Stat报告子活性的诱导倍率归一化到经除了可诱导的细胞激素受体的外并且保持未处理的所有载体转染的HEK293T细胞的诱导倍率。每种条件以一式三份设置孔。

图10B显示响应于AP1903的FKBP转换胞外域变异体的STAT5报告子活性。与高亲和力FKBP(F36V)突变体相比，削弱FKBP对AP1903的亲和力的其它FKBP变异体也增加Stat5诱导的EC50。

实例5C：一种用于工程化具有改进的信号传导能力的嵌合细胞激素受体的替代方 法

设计嵌合细胞激素受体的传统方法涉及将一个受体的胞外配体结合域融合于第二受体的跨膜及胞内信号传导域(《分子治疗(Mol Ther.)》2014年6月；22(6):1211-1220；《分子治疗》2017年1月4日；25(1):249–258；《自然通讯(Nat Commun.)》2018年5月23日；9(1):2034.)。设计一种替代方法，其中利用衍生自某些细胞激素受体的跨膜及JAK结合域，所述细胞激素受体(i)以其天然形式作为同源二聚物传导信号，及(ii)当偶联于一个不同胞外域(即描述于图7中的胞外域)时保持作为嵌合体良好传导信号的能力。在本发明方法中，一个受体的跨膜及胞内JAK结合域融合于第二受体的“细胞尾”(即在JAK结合域之后的区域)。

在图7中，TpoR TM及JAK结合域产生最强的信杂比输出。因此，使用传统方法通过将TpoR的胞外域(TpoR/MPLR(1-478))融合于不同细胞激素受体的跨膜及胞内域来产生基于TpoR的细胞激素受体嵌合体。还使用本发明方法通过在与不同细胞激素受体的细胞尾融合之前融合包含TpoR跨膜及JAK2结合域的区域(即TpoR(478-582))来产生类似嵌合体。作为阳性对照，使用编码全长(FL)TpoR的载体。

HEK293T细胞报告子分析法用于测试细胞激素信号传导的可诱导性及程度。简单地说，将20,000个HEK293T细胞接种于涂覆聚-L-赖氨酸的96孔平底板的每个孔中并且允许黏附过夜。将驱动萤火虫荧光素酶(100ng；普洛麦格)及海肾荧光素酶对照报告子载体(1ng；普洛麦格)的嵌合细胞激素受体(2.5ng)以最终体积5μL混合于Opti-MEM(Gibco)中(“DNA混合物”)。在室温下培养含在5μL Opti-MEM中的0.3μL脂质转染胺2000(英杰)5分钟并且然后加入到DNA混合物。在室温下培养所述混合物20分钟并将总体积10μL加入到包含HEK-293T的每个孔。在转染后24小时，将细胞保持未处理，用100ng/ml TPO、或用在无血清培养基中稀释的10μg/mL AP1903(Apex Bio)处理。将Stat报告子活性的诱导倍率归一化到经除了可诱导的细胞激素受体的外并且保持未处理的所有载体转染的HEK293T细胞的诱导倍率。每种条件以一式三份设置孔。

图10C及10D显示嵌合细胞激素受体工程化的传统方法与本发明方法比较及对比的示意图。虽然传统方法(图10C)仅将受体A的胞外域融合于跨膜域、JAK结合域及受体B的细胞尾，但本发明方法(图10D)将受体A的胞外域、跨膜域及JAK结合域融合于受体B的细胞尾。

图10E显示在图10F中测试的嵌合受体的示意图。

图10F显示概述Stat报告子分析的结果的热图。每行代表各别的融合搭配物；每列代表各别的Stat反应性萤火虫荧光素酶报告子。每个框均描绘诱导倍率，每列经归一化到各别的Stat报告子的最高诱导倍率：STAT1为2.75倍，STAT1/2为13.5倍，STAT3为354倍，STAT4为38倍，STAT5为173倍，及STAT6为10.5倍。与基于传统设计的嵌合细胞激素受体相比，使用本发明方法工程化的那些受体显示响应于诱导物AP1903的更大量的下游信号传导。

实例6：可诱导的嵌合细胞激素受体

本实例说明具有改进并且特定的功能的可诱导的嵌合细胞激素受体。

在一些实施例中，细胞激素尾可串联连接以刺激多种途径(例如，促持久性STAT5及促炎症性STAT4的IL7R(316-459)-IL12Rb2(775-825)片段融合)。也就是说，在本实施例中，使用来自至少两种受体的细胞激素尾。在一些其它实施例中，使用来自单个受体的细胞激素尾。

具有STAT5或AP-1输出的最小酪氨酸效应域

就每个细胞尾来说，小酪氨酸肽负责信号传导途径。识别相关模体以开发具有改进的信号传导的显著更小的构建体。例如，当用作酪氨酸效应域(参见实例3及5)时，确定包含Y800的IL12Rb2(775-825)肽足以提供STAT4信号传导。

在本研究中，分析IL2Rb、IL7R及EGFR细胞尾以识别足以用于信号传导的关键方面的酪氨酸。例如，包含STAT5相互作用酪氨酸Y418及Y436的IL2Rb区段可保留STAT5信号传导，但可失去PI3K信号传导，因为这需要IL2Rb细胞尾的Y364。包含IL7R、IL2Rb及IFNAR2尾的可诱导的嵌合细胞激素受体可包含细胞尾内的一个或多个酪氨酸模体。在一些情况中消除尾(例如，IL12Rb2尾)的一个或多个部分导致负调节模体的去除及更强的信号传导。

在本研究中，测试使用基于EpoR的酪氨酸激酶活化域的各种IL7Ra及IL2Rb衍生的片段的信号传导。在本研究中测试以下可诱导的嵌合细胞激素受体：

a.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IL7R(316-459)(SEQID NO 6)

b.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IL7R(376-416)(SEQID NO 20)

c.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IL7R(424-459)(SEQID NO 21)

d.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IL7R(376-416、424-459)(SEQ ID NO 22)

e.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IL7R(424-459；Y456F)(SEQ ID NO 23)

f.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IL7R(376-416、424-459；Y456F)(SEQ ID NO 24)

g.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IL2Rb(333-551)(SEQID NO 5)

h.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IL2Rb(393-433)(SEQID NO 25)

i.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IL2Rb(518-551)(SEQID NO 26)

j.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IL2Rb(339-379、393-433)(SEQ ID NO 27)

k.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IL2Rb(339-379,518-551)(SEQ ID NO 28)

l.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IL2Rb(393-433、518-551)(SEQ ID NO 29)

m.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IL2Rb(339-379、393-433、518-551)(SEQ ID NO 30)

使用CD8 SS膜靶向模体、FKBP(F36V)二聚化域及EpoR(237-339；L241G、L242P)酪氨酸激酶活化域，测试IFNAR2构建体，但未通过短(8小时)AP1903处理引发显著信号。绘制的构建体包括衍生自IL7R及IL2Rb细胞尾的酪氨酸效应域。

通过STAT5的IL7信号传导通过包含Y401及Y449的两个片段完全再建但没有负调节Y456(IL7R(376-416、424-459；Y456F)；SEQ ID NO:24；图11)。通过包含Y364、Y418及Y436的两个片段再建IL2 STAT5信号传导，但利用缺失Y364(IL2Rb(393-433、518-551)；SEQ IDNO:29；图11)的较小构建体观察到更大的信号传导。据报告Y364活化PI3K，PI3K促进T细胞分化及增殖并且重新组织肌动蛋白骨架以促进受体内化。因此，Y364既是STAT5信号传导的负调节模体，也是PI3K/AKT/TORC轴的关键正调节模体。根据所需的功能输出，可包含或排除Y364。

非细胞激素受体

在TCR活化后，Ca+移动导致NFAT的活化及促炎症性标靶(IL2、GzmB等)的上调。许多这些启动子并非仅通过NFAT活化，而是具有AP-1的NFAT的异源三聚物(Fos及Jun的卷曲螺旋)(图12)。过度抗原刺激会发生耗尽，并且认为在经活化的NFAT的量超过AP-1的量导致NFAT同源二聚物及不同启动子的活化时发生。防止耗尽的一种方法是增加AP-1(Fos/Jun)的量(图13)。细胞激素受体(如IL2R及IL7R)活化JNK(Jun激酶)，其磷酸化并且活化c-Jun。然而，单独这一点不足以上调AP-1，因为Fos也必须被上调及磷酸化。平行的MEK/ERK途径导致Fos经Myc/Max上调、以及Fos的直接磷酸化。

AP-1通过经协调的JNK及ERK信号传导诱导。在一些实施例中，本文提供能够活化JNK及/或MEK/ERK的可诱导的嵌合细胞激素受体。在一些实施例中，可诱导的嵌合细胞激素受体可有效诱导AP-1以防止耗尽。

测试编码以下可诱导的嵌合细胞激素受体的构建体的活性。每个构建体包含膜靶向模体(CD8 SS)、二聚化域(FKBP(F36V))、酪氨酸激酶活化域(EpoR(237-338；L241G、L242P))及衍生自RTK EGFR的细胞尾的酪氨酸效应域或细胞激素受体。嵌合细胞激素受体还包括用于检测的表位标签(Myc)：

a.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-EGFR(955-1186)(SEQID NO 31)

b.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-EGFR(955-1044,1058-1186；Y974F)(SEQ ID NO 32)

c.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-EGFR(955-1009；Y974F)(SEQ ID NO 33)

d.

e.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-EGFR(1019-1085)(SEQID NO 34)

f.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-EGFR(1037-1044,1058-1103；Y1068/1101F)(SEQ ID NO 35)

g.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-EGFR(1066-1118；Y1068/1086F)(SEQ ID NO 36)

h.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-EGFR(1122-1165)(SEQID NO 37)

i.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-EGFR(1133-1186；Y1148F)(SEQ ID NO 38)

j.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IL2Rb(333-551)(SEQID NO 5)

k.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IL7R(316-459)(SEQID NO 6)

l.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IL12Rb2(714-862)(SEQ ID NO 7)

m.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IL21R(322-538)(SEQID NO 9)

n.CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IFNAR2(310-515)(SEQID NO 410)

通过上述构建体(用于指定的途径的荧光素酶报告子)短暂转染HEK293细胞。测定STAT5信号传导。结果概述于图14中。所有嵌合抗原受体的配体为AP1903。最深色的盒表示诱导倍率>10。将FLT配体加入到经转染的Flt3受体酪氨酸激酶。经转染的Flt3受体用作对照而不是EGFR，因为HEK293细胞表达内源性EGFR受体。

活化PLC->NFkB的受体

同种异体CAR-T细胞的一个缺点为TCR敲除或敲低(以防止GvHD)导致基础TCR信号传导缺失。基础TCR信号传导增加TCR持久性。虽然细胞激素可通过STAT5增加持久性，这并不完全复制TCR。TCR移动Ca2+以活化PLC，导致NFAT及NFkB。

本文所提供的小分子可诱导的嵌合细胞激素受体已被工程化以移动钙并且活化NFAT及NFkB。

B细胞受体活化Bruton酪氨酸激酶(BTK)，其然后活化PLCy2->PKC->NFAT及NFkB。在这一情况中，BTK通过酪氨酸激酶转接蛋白BLNK上的酪氨酸识别靶标(图15)。

产生包含以酪氨酸激酶活化域取代内源性BLNK-磷酸化激酶BTK的BLNK融合的可诱导的嵌合细胞激素受体(例如“CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-XYZ细胞尾”)(SEQ ID NO:39、40及41)。在一些实施例中，可诱导的嵌合细胞激素受体包含串联酪氨酸效应域，如细胞激素受体细胞尾及酪氨酸激酶转接蛋白。

实例7：与GoCART相比，可诱导的嵌合细胞激素受体的二聚化对CAR-T细胞持久性 的影响

在本研究中，产生慢病毒(pLVX)构建体，其包含SFFV启动子，接着是kozak序列、可诱导的嵌合细胞激素受体、T2A序列及嵌合抗原受体。嵌合抗原受体是针对于表达EGFRvIII的细胞。为比较，使用具有TagBFP或GoCART而非可诱导的嵌合细胞激素受体的慢病毒构建体。GoCART由肉豆蔻酰化序列组成，其后是融合于FKBP(F36V)的两个重复序列的MyD88及CD40的一部分。

从人类周边血液单核细胞中分离CD3+ T细胞并且用IL-2培养。于分离后2天用慢病毒转导T细胞，及3天后通过结合经APC标记的EGFRvIII进行FACS分选。培养经分选的EGFRvIII+细胞培直到分离后14天。

在第14天，将0.5e6个细胞再悬浮于24孔板中，并且在生产后用IL2、AP1903或不处理生长8天。活细胞计数结果概述于图16及图17。

包含AP1903可诱导的受体的几种构建体促进轻微生长(例如CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IL2Rb(333-551)(SEQ ID NO 5)及GoCART(前面报告的多聚化物、肉豆蔻酰基-Myd88-CD40-FKBP(F36V)x2，但仅CD8 SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-338；L241G、L242P)-IL7R(316-469)(SEQ NO 6)促进稳健生长(图16)。与IL2处理(图17)相比，包含受体及GoCART尾的IL7R(316-469)细胞尾保持就AP1903来说更高的活力(图17)。

在用AP1903或IL2生长产生后第8天，将细胞表型化。结果概述于图18及图19的天然的TPOR/MPLR的氨基酸478-582。包含受体的可诱导的IL7R(316-469)证实更多的干细胞记忆，而GoCART证实更少的干细胞记忆及更多的效应子记忆。当用IL2进一步生长时，所有细胞的活力似乎相当；然而，GoCART似乎有点差异化。所述结果证实小分子可诱导的IL7R(316-469)受体促进增殖，同时保持较低分化状态。

在第2天及第8天测定细胞激素。AP1903数据显示于图20及图21的天然的TPOR/MPLR的氨基酸478-582。将所有值归一化到未处理的TagBFP-表达CAR-T细胞。随着GoCART活化NFkB途径，这导致稳健的细胞激素释放，而其它则没有。与IFN相关的尾确实会引起某种程度的细胞激素的释放。

在没有信号传导下，所有构建体提供相当的生长(一周内倍增)，包含具有IFNAR2尾的可诱导的嵌合细胞激素受体的细胞生长较少(图22)。

测定在没有任何处理下在产生后第2天及第8天诱导细胞激素。结果概述于图23及图24的天然的TPOR/MPLR的氨基酸478-582。表达小分子可诱导的IFNAR2(310-515)构建体的CAR-T细胞组成型释放少量IL5，同时表达小分子可诱导的IL2Rb(333-551)构建体的CAR-T细胞释放IL13及一些TNFα(第2天，图23)，到第8天减少(第8天，图24)。GoCART在第2天表达细胞GM-CSF、IL5、IL13、IL22及MIP1a，并且在第8天时间点更多。所述结果证实IFNAR2(310-515)及IL2Rb(333-551)尾轻微自动活化，同时GoCART强烈自动活化。从IL7R(316-459)尾构建体未观察到细胞激素释放，及在不存在小分子活化下观察到所有可诱导的嵌合细胞激素受体构建体的最少细胞激素释放。

图25显示经具有不同尾的可诱导的嵌合细胞激素受体转导的CAR T细胞、GoCART、没有JAK2结合模体或酪氨酸效应域的可诱导的细胞激素受体(CD8SS-Myc-FKBP(F36V)-EpoR(237-282；L241G、L242P)或TagBFP在产生后第5天及第8天的CAR-T细胞数的图。观察到IFNAR2尾的生长最少；从第8天细胞激素测定，观察到这些CAR T细胞不消耗尽可能多的IL-2。

本文所提供的AP1903可诱导的细胞激素受体为用于在CAR-T细胞中发起IFN、IL2、IL7、IL12、IL21、EGFR及其它基于酪氨酸激酶的信号传导的稳健平台。EpoR募集在同源二聚化(JAK2)后活化的激酶并且磷酸化完全依赖于附着的细胞尾的信号传导效应子。取决于CAR-T细胞中的所需的功能，可利用经工程化的细胞尾(例如，与IL12Rb2(775-825)或EGFR细胞尾分融合的IL7细胞尾)来实现所需作用。还可使用不同酪氨酸激酶活化域调节系统的信号强度。例如，可使用包含如本文所述的不同跨膜变异体的酪氨酸激酶活化域来调节信号强度。

IL7(316-450)酪氨酸效应域提供具有最小PI3K的STAT5信号传导，其足以促进生长而不驱动分化或细胞激素释放。此外，IL7尾的内化及降解也呈较少的。

实例8：设计具有多重输出的可诱导的细胞激素受体

HEK293T细胞报告子分析用于测试细胞激素信号传导的可诱导性及程度。简单地说，将20,000个HEK293T细胞接种于涂覆聚-L-赖氨酸的96孔平底板的每个孔中并且允许黏附过夜。将驱动萤火虫荧光素酶(100ng；普洛麦格)及海肾荧光素酶对照报告子载体(1ng；普洛麦格)的可诱导的细胞激素受体(2.5ng)以最终体积5μL混合于Opti-MEM(Gibco)中(“DNA混合物”)。在室温下培养含在5μL Opti-MEM中的0.3μL脂质转染胺2000(英杰)5分钟并且然后加入到DNA混合物。在室温下培养所述混合物20分钟并将总体积10μL加入到包含HEK-293T的每个孔。在转染后24小时，将细胞保持未处理，或用在无血清培养基中稀释的1μg/mL AP1903(Apex Bio)处理。将Stat5报告子活性的诱导倍率归一化到经除了可诱导的细胞激素受体的外并且保持未处理的所有载体转染的HEK293T细胞的诱导倍率。

图26显示具有双重IL-7R及IL-21R输出的可诱导的细胞激素受体的示意性实例。由于细胞激素通常于增强T细胞反应上具有协同作用(例如IL-7与IL-21；IL-2与IL-21)，因此模拟多种细胞激素信号传导输出的能力可能是有益的。为产生多种细胞激素信号传导输出，将两个细胞尾在嵌合受体的胞内C端处串联连接。

当产生多个输出时，单个细胞尾与细胞膜的接近可影响其各自的信号传导输出的强度。下表5显示具有双重输出的可诱导的细胞激素受体的实例，其中每个输出均位于细胞膜的近端或远端。

图27显示HEK293T细胞中Stat报告子活性的荧光素酶分析读数。IL-21R细胞尾的膜远端放置导致更大的Stat5(图27a)及Stat3(图27b)报告子活性。因此，不同细胞尾的最大信号传导强度可另外通过其与细胞膜的相对位置来调节。

为在原代人类CAR T细胞背景下评估这些双重输出可诱导的细胞激素受体，将可诱导的细胞激素受体克隆到编码EGFRvIII-特异性CAR的慢病毒载体(2173scFv；描述于SciTransl Med.2015年2月18日；7(275):275ra22.)中以允许化学计量共同表达。为便于检测经转导的细胞，将v5表位标签(KPIPNPLLGLDST)***scFv与CD8铰链域之间。为制备编码FKBP转换CAR的慢病毒，在第1天，将HEK293T细胞以0.45百万个细胞/mL接种于6孔板每孔中补充10％FBS(Hyclone)的2mL DMEM(Gibco)中。在第0天，通过6孔板每孔在250μL Opti-MEM(Gibco)中将慢病毒包装载体1.5μg psPAX2、0.5μg pMD2G及0.5μg适宜转移CAR载体混合在一起来制备慢病毒(“DNA混合物”)。在室温下培养含在250μL Opti-MEM中的10μL脂质转染胺2000(英杰)5分钟并且然后加入到DNA混合物。将所述混合物在室温下培养20分钟并将总体积500μL缓慢加入到包含HEK293T的孔的侧面。在第0天，在Grex-24板(Wilson Wolf，目录号80192M)中在补充100IU/mL人类IL-2(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec))、10％FBS(Hyclone)及人类T TransAct(美天旎生物技术公司，目录号130-111-160，1:100稀释液)的X-Vivo-15培养基(龙沙)中活化经纯化的T细胞。在第1天，通过2mL/孔的T细胞转导培养基(即补充10％FBS的X-Vivo-15)置换来自6孔板中HEK293T细胞的每个孔的培养基。在第2天，将T细胞以0.5百万个细胞/mL再悬浮于Grex-24板的每孔1mL T细胞转导培养基中。收获来自HEK293T细胞的慢病毒上清液并且通过0.45微米过滤器(EMD Millipore)以除去细胞碎片，并且接着与100IU/mL人类IL-2一起加入到T细胞。在第5天，将4.5mL T细胞扩增培养基(即补充5％人类AB血清(Gemini Bio)及100IU/mL人类IL-2的X-Vivo-15)加入到Grex-24板的每个孔。使用T细胞扩增培养基根据需要将细胞扩增成更大的G-Rex血管(WilsonWolf)。在第13天或第14天，通过使用流动式细胞测量术检测结合FITC结合的v5标签单克隆抗体(赛默飞世尔(Thermo Fisher))的T细胞的百分比来确定转导效率。在第14天或第15天，将CAR-T细胞产物冷冻保存并且根据需要解冻以用于进一步分析。

为确定经成功转导的T细胞的百分比，首先将T细胞与FITC结合的v5标签单克隆抗体(赛默飞世尔)在PBS+1％BSA中于4℃培养20分钟。然后用PBS+1％BSA洗涤细胞，并且使用流动式细胞测量术分析。

图28A显示包含图28B及28C中所示细胞尾的FKBP转换CAR载体的示意图。

图28B显示如通过v5标签染色确定的FKBP转换CAR T细胞的转导效率。

为确定FKBP转换CAR T细胞中细胞激素信号传导的可诱导性及程度，将解冻的CART细胞产物在100μL无血清RPMI(康宁(Corning))中于37℃、5％CO₂下在潮湿培养箱中血清饥饿4小时，然后用1μg/ml AP1903处理1小时。进入AP1903处理40分钟后，将包含BUV395结合的抗人类CD3(Biolegend)及FITC结合的v5标签单克隆抗体(赛默飞世尔)的抗体混合物加入到细胞并且允许培养最后20分钟。在AP1903处理1小时后，通过将35μL 16％多聚甲醛加入到每个100μL样品来固定细胞并且使其在37℃下培养15分钟。然后用PBS洗涤细胞三次，并且在-20℃下在100％冷甲醇中透化1或2夜。在FACS分析当天，用PBS洗涤细胞三次，Fc阻断，并且用在PBS+1％BSA中稀释的AlexaFluor647结合的抗小鼠/人类Stat5(pY694)(碧迪生科(BD Biosciences))染色。在室温下在黑暗中培养1小时后，在FACS分析之前将细胞洗涤三次。

图28C左下图显示通过FACS分析的AP1903诱导的pStat5染色。与HEK293T报告子分析一致，原代人类CAR T细胞的结果显示膜远端IL-21R细胞尾导致更大的pStat5诱导。

表5：具有双重输出的可诱导的细胞激素受体的实例

实例9：FKBP转换允许CAR T细胞中可调节的细胞激素信号传导

为确定回应于AP1903的FKBP转换CAR T细胞中细胞激素信号传导的可调性，将携带IL-7R(316-459)细胞尾的FKBP转换CAR T细胞在100μL无血清RPMI(康宁)中在潮湿培养箱中于37℃、5％CO₂下血清饥饿4小时，然后用所指定工作浓度的AP1903处理1小时。进入AP1903处理40分钟后，将包含BUV395结合的抗人类CD3(Biolegend)及FITC结合的v5标签单克隆抗体(赛默飞世尔)的抗体混合物加入到细胞并且允许培养最后20分钟。在AP1903处理1小时后，通过将35μL 16％多聚甲醛加入到每个100μL样品来固定细胞并且使其在37℃下培养15分钟。然后用PBS洗涤细胞三次，并且在-20℃下在100％冷甲醇中透化1或2夜。在FACS分析当天，用PBS洗涤细胞三次，Fc阻断，并且用在PBS+1％BSA中稀释的AlexaFluor647结合的抗小鼠/人类Stat5(pY694)(碧迪生科)染色。在室温下在黑暗中培养1小时后，在FACS分析之前将细胞洗涤三次。

图29显示FKBP转换CAR+ T细胞中的Stat5活化随着AP1903以剂量依赖性方式增加。此外，细胞激素信号传导呈FKBP转换CAR+ T细胞特异性的，因为pStat5在FKBP转换CAR+T细胞中(而不在相同培养物中的CAR-T细胞中)特异性地诱导。这表明FKBP转换特异性地递送细胞激素信号到治疗性CAR+ T细胞，同时(i)防止旁观者免疫活化，其将加速同种异体CAR T细胞排斥及(ii)避免与全身性细胞激素给予相关的毒性。

实例10：FKBP转换的AP1903诱导的活化增强CAR T细胞的抗肿瘤活性

WM266.4及DMS 273细胞为购自Sigma的DLL3+靶细胞系。为通过IncuCyte活细胞分析成像系统促进靶细胞成像，通过用IncuCyte NucLight Green慢病毒试剂(Sartorius)慢病毒转导以核GFP稳定地标记WM266.4及DMS 273细胞以分别产生WM266.4-nucGFP及DMS273-nucGFP。将FKBP转换克隆到DLL3 CAR(26C8 scFv)中以允许化学计量的共同表达。

为测试FKBP转换CAR T细胞是否在AP1903的存在下反复暴露于靶细胞后显示增强的靶细胞裂解及效力，利用体外连续杀死分析，其中将少量的CAR-T细胞与过量的标靶共培养。这些苛刻的条件使得单个CAR-T细胞连续裂解多个靶细胞；反过来，CAR-T细胞将经历增殖并且最终分化及衰竭。接种5,000个WM266.4-nucGFP靶细胞并且允许在具有黑色壁及平坦透明底部的96孔板中于包含10％FBS(Hyclone)、非必需氨基酸、丙酮酸钠及20-25mMHEPES的50μL RPMI中附着。将携带FKBP转换的DLL3 CAR T细胞或对照CAR T细胞解冻并且以效应子:标靶(E:T)比为1:9加入到所接种的靶细胞。

图30A显示携带使用的具有双重输出(IL7Ra(316-459)/IL12Rb2(775-825)细胞尾)的FKBP转换的DLL3 CAR的示意图。

图30B及图30C显示DLL3 CAR T细胞对DLL3+靶细胞的体外细胞毒性。虽然缺失FKBP转换的对照CAR T细胞未能以这种低的、次优的E:T比有效地裂解靶细胞(图30B)，但AP1903诱导的FKBP转换的活化显著增强CAR T细胞的细胞毒性(图30C)。因此，AP1903增强FKBP转换CAR T细胞的效力。

CAR T细胞疗法中的挑战为肿瘤靶标的低表达水平，其导致次优的CAR活化及细胞毒性。为测试FKBP转换活化是否增强CAR T细胞对低靶表达细胞的敏感性，利用具有低DLL3表面表达的DMS 273-nucGFP靶细胞系(400DLL3/细胞)。接种5,000个DMS 273-nucGFP靶细胞并且允许在具有黑色壁及平坦透明底部的96孔板中于包含10％FBS(Hyclone)、非必需氨基酸、丙酮酸钠及20-25mM HEPES的50μL RPMI中附着。将携带FKBP转换的DLL3 CAR T细胞或对照CAR T细胞解冻并且以效应子:标靶(E:T)比为1:1加入到所接种的靶细胞。

图30D及图30E显示DLL3 CAR T细胞对表达低水平的DLL3的靶细胞的体外细胞毒性。图30D显示即使在1:1的较高E:T比下，对照CAR T细胞也为无效的。相反，图30E显示FKBP转换活化增强CAR T细胞的细胞毒性并且增加其对低靶表达细胞的敏感性。

接下来，使用人类肿瘤异种移植模型在体内询问FKBP转换CAR T细胞的活性。通过用全长人类EGFRvIII稳定转导，由人类神经成胶质细胞瘤细胞系LN229(ATCC)衍生得到LN229-EGFRvIII。将200μL无血清RPMI中的300万个LN229-EGFRvIII细胞经皮下植入到NSG小鼠中。从植入后第21天开始，使用数字测径规通过测径规测量监测肿瘤生长。使用公式肿瘤体积＝(宽度^2×长度/2)计算得肿瘤大小。在植入后第24天，基于肿瘤体积，将小鼠随机分成8组，及每组的平均肿瘤体积为200mm³。在植入后第25天，将未转导的T细胞(NTD)、对照CAR T细胞及携带IL7Ra(316-459)/IL12Rb2(775-825)细胞尾的FKBP转换CAR-T细胞解冻并且根据标准程序计数。将细胞再悬浮于无血清RPMI中并且以100μL/小鼠的体积经静脉内注射300万个CAR+细胞/小鼠。T细胞输注后第二天及此后，每组还每周接受腹膜内输注5mg/kgAP1903或媒剂对照(每组n＝8)。然后每3-4天监测肿瘤直到研究结束。

图31A-31H显示每组处理小鼠的肿瘤进展及总存活期。与对照CAR T细胞及与经与媒剂对照共同给予的FKBP转换CAR T细胞相比，通过AP1903活化FKBP转换导致显著增强的肿瘤控制(图31A)，允许更持久并且完全的抗肿瘤反应(图31B-31G)及延长的总存活期(图31H)。

实例11：FKBP转换的AP1903诱导的活化增强CAR T细胞的增殖及移植

临床试验显示患者对CD19 CAR T细胞疗法的反应与高血清稳态细胞激素(例如IL-15)水平相关，这对于驱动CAR T细胞增殖及移植的初始爆发至关重要(临床肿瘤学杂志《(J Clin Oncol.)》2017年6月1日；35(16):1803-1813.)。此外，不像在血液性恶性病中，其中循环中的靶细胞易于被CAR T细胞接近，实体肿瘤的治疗可能需要CAR T细胞在渗出及渗透实体肿瘤之前在循环中花更长的时间；因此，靶依赖性、细胞激素支持的CAR T细胞增殖及存活尤其重要。因此，研究单独的AP1903是否足以驱动标靶独立的CAR T细胞增殖及持久性。

用指定浓度的AP1903并且于不存在外源细胞激素(除非在阳性对照的情况下指定)或靶细胞下培养携带IL7R(316-459)/IL12Rb2(775-825)细胞尾的对照CAR T细胞或FKBP转换2周。作为阳性对照，CAR T细胞可替代地补充外源性重组IL-7(10ng/mL；美天旎)及IL-12p70(10ng/mL；Biolegend)以模拟通过FKBP转换活化传递的双重IL-7R/IL12Rb2输出。在2周培养结束时，测定存活的CAR T细胞的数量及质量。简单地说，收获来自每种培养条件细胞的一式两份样品并且使用Zombie NIR可确定的存活率试剂盒(Biolegend)染色。用PBS洗涤样品，Fc阻断，然后用在PBS+1％BSA中稀释的以下抗体混合物染色：BUV395结合的抗人类CD3、BV510结合的抗人类CD8、BV605结合人类CD4及FITC结合的v5标签(用于CAR检测)、PE/Cy7结合的抗人类CD62L(Biolegend)及BV785结合的抗人类CD45RO(Biolegend)。最后，在PBS中洗涤样品并在FACS分析之前将细胞沉淀再悬浮于包含123count eBeads计数珠(赛默飞世尔)的130μL PBS+1％BSA(10μL计数珠含在120μL PBS+1％BSA中)中。

图32A显示AP1903驱动的CAR T细胞的增殖；虚线表示补充外源IL7及IL12p70的CAR T细胞的增殖倍率。与缺失FKBP转换的衰减的对照CAR T细胞相反，经AP1903处理的FKBP转换CAR T细胞有效地增殖。值得注意地，低为1ng/ml的AP1903足以达到通过外源细胞激素补充所达到的增殖水平。

图32B显示在2周培养结束时存活的CAR T细胞的绝对数量及记忆T细胞表型。除了增加CAR T细胞的数量外，FKBP转换的活化也改进CAR T细胞的质量，这通过维持及增殖干细胞记忆(Tscm)及中枢记忆(Tcm)CAR+ T细胞(其为介导持久的抗肿瘤保护的长寿、自我更新的群体)来证明。

实例12：工程化基础信号传导减少的可诱导的细胞激素受体

在配体的存在下，呈天然形式的同源二聚体细胞激素/生长因子受体(例如EpoR及TpoR)依赖于JAK2活化的两个要求：(i)受体同源二聚化及(ii)由跨膜区介导的受体旋转，所述跨膜区使两个JAK2足够接近以进行反式磷酸化及活化。已显示，即使在配体的存在下，通过突变跨膜区中的关键氨基酸残基来消除受体旋转也会消除受体信号传导。真正可诱导的受体在不存在诱导物的情况下需要干净的OFF(无基础活性)，并且需要宽动态范围的配体诱导的ON以获得最大可调性。来自同源二聚体细胞激素/生长因子受体的酪氨酸活化域证实不同程度的基础信号传导(图9)。已显示EpoR及TpoR在不存在配体的情况下以单体形式与同源二聚体形式间的某一平衡存在，并且发现这一自发性同源二聚化通过其跨膜域介导；因此，假设在本发明未经处理的嵌合细胞激素受体中所观察到的渗漏归因于通过其跨膜域介导的自发性配体非依赖性同源二聚化。

为减少本发明嵌合细胞激素受体中的基础信号传导，将EpoR/TpoR的跨膜区以PD-1的跨膜区置换，PD-1呈单体天然存在。HEK293T细胞报告子分析用于评估在不存在AP1903的情况下的基础信号传导、以及在存在AP1903的情况下细胞激素信号传导的诱导性及大小。简单地说，将20,000个HEK293T细胞接种于涂覆聚-L-赖氨酸的96孔平底板的每个孔中并且允许黏附过夜。将驱动萤火虫荧光素酶(100ng；普洛麦格)及海肾荧光素酶对照报告子载体(1ng；普洛麦格)的可诱导的细胞激素受体(2.5ng)以最终体积5μL混合于Opti-MEM(Gibco)中(“DNA混合物”)。在室温下培养含在5μL Opti-MEM中的0.3μL脂质转染胺2000(英杰)5分钟并且然后加入到DNA混合物。在室温下培养所述混合物20分钟并将总体积10μL加入到包含HEK-293T的每个孔。转染后24小时，不处理细胞以评估AP1903非依赖性基础信号传导，或用在无血清培养基中稀释的指定浓度的AP1903(Apex Bio)处理。将Stat5报告子活性的诱导倍率归一化到经除了可诱导的细胞激素受体的外并且保持未处理的所有载体转染的HEK293T细胞的诱导倍率。

图33A及图33B分别显示每个嵌合受体在不存在AP1903的情况下的基础信号传导，如通过Stat5及Stat4报告子活性测定。与携带在不存在AP1903的情况下显示显著基础Stat活性的TpoR跨膜区的嵌合受体相比，用PD-1跨膜区取代消除基础Stat活性到与仅包含FKBP胞外域并且缺失任何JAK活化域及细胞尾的构建体相当的水平。在一些实施例中，可使用跨膜域的***及/或缺失突变进一步优化可诱导的嵌合细胞激素受体的基础信号传导，如图38C中所示。

图33C及图33D分别显示每个嵌合受体对指定浓度的AP1903的反应，如通过Stat5及Stat4报告子活性测定。与具有TpoR跨膜域的对应物相比，携带PD1跨膜区的FKBP转换变异体数量上相当地响应于AP1903处理。尽管跨膜域也被认为对于受体的旋转活化为关键的，但用TpoR跨膜区取代PD-1的跨膜区保留AP1903诱导的Stat活化。总之，证实PD-1跨膜区可与来自同源二聚体细胞激素/生长因子受体的酪氨酸活化域组合使用以减少基础信号传导同时保留配体诱导的受体活化。

为测试通过PD1跨膜区取代是否保留嵌合受体的细胞毒性活性，比较共同表达任一受体变异体的CAR T细胞的细胞毒性活性及AP1903驱动的增殖。就体外细胞毒性分析来说，接种5,000个U87KO-EGFRvIII-nucGFP靶细胞并且允许在具有黑色壁及平坦透明底部的96孔板中于包含10％FBS(Hyclone)、非必需氨基酸、丙酮酸钠及20-25mM HEPES的50μLRPMI中附着。U87KO-EGFRvIII为来自Cellectis SA(法国巴黎)的一种产品。U87KO-EGFRvIII衍生自亲本细胞系U87MG(ATCC)，通过首先使用转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)敲除内源野生型EGFR，然后通过慢病毒转导稳定地过度表达全长人类EGFRvIII。为通过IncuCyte活细胞分析成像系统促进靶细胞成像，通过用IncuCyte NucLight Green慢病毒试剂(Sartorius)进行第二次慢病毒转导，由U87KO-EGFRvIII衍生得到U87KO-EGFRvIII-nucGFP靶细胞。将携带具有TpoR或PD1 TM的FKBP转换的EGFRvIII CAR(2173scFv)T细胞解冻并且以1:4的效应子:标靶(E:T)比加入到所接种的靶细胞。将指定浓度的AP1903加入到每个孔。每种条件以一式两份设置孔。

图34A显示携带IL7R(316-459)/IL12Rb2(775-825)细胞尾的具有TpoR TM域或PD1TM域的FKBP转换CAR的示意图；共同表达FKBP胞外域(FKBP仅控制CAR)并且不含任何JAK活化域及细胞尾的CAR T细胞用作对照。

图34B-34D显示虽然对照CAR T细胞未通过AP1903处理增强，但携带TpoR TM域或PD1 TM域的FKBP转换在AP1903的存在下相当地增强。因此，通过PD1 TM域取代可减少基础FKBP转换活性，同时保留AP1903可诱导的转换受体活化及信号传导。

接下来，测试通过PD1跨膜区取代是否保留AP1903驱动的嵌合受体的增殖。用指定浓度的AP1903并且于不存在外源细胞激素(除非在阳性对照的情况下指定)或靶细胞下培养携带任一种跨膜变异体的对照CAR T细胞或FKBP转换2周。作为阳性对照，CAR T细胞可替代地补充外源性重组IL-7(10ng/mL；美天旎)及IL-12p70(10ng/mL；Biolegend)以模拟通过FKBP转换活化传递的双重IL-7R/IL12Rb2输出。在2周培养结束时，测定存活的CAR T细胞的数量及质量。简单地说，收获来自每种培养条件细胞的一式两份样品并且使用Zombie NIRFixable Viability试剂盒(Biolegend)染色。用PBS洗涤样品，Fc阻断，然后用在PBS+1％BSA中稀释的以下抗体混合物染色：BUV395结合的抗人类CD3、BV510结合的抗人类CD8、BV605结合人类CD4及FITC结合的v5标签(用于CAR检测)、PE/Cy7结合的抗人类CD62L(Biolegend)及BV785结合的抗人类CD45RO(Biolegend)。最后，在PBS中洗涤样品并在FACS分析之前将细胞沉淀再悬浮于包含123count eBeads计数珠(赛默飞世尔)的130μL PBS+1％BSA(10μL计数珠含在120μL PBS+1％BSA中)中。

图34E显示在指定浓度的AP1903或在经外源补充的IL-7及IL-12p70中培养2周后的活CAR+ T细胞的数量。如所预期，AP1903不支持增殖及存活对照CAR T细胞，而外源IL7及IL12p70支持对照及FKBP转换CAR T细胞的增殖及存活。在存在AP1903的情况下，具有PD1跨膜域的FKBP转换CAR T细胞与其的携带TpoR跨膜区的对应物相比同等或更好地增殖。

图34F显示每个记忆隔室中CAR+ T细胞的数量。与携带TpoR跨膜区的对应物相比，具有PD1跨膜域的FKBP转换CAR T细胞在维持Tscm及Tcm CAR+细胞回应于AP1903时相等或更好。这些发现证实具有减少的基础信号传导的PD1跨膜变异体在原代人类CAR T细胞的背景下保留转换受体的可诱导性及功能性。

实例13：通过AP1903驱动的CAR T细胞增殖改进CAR T细胞生产

虽然慢病毒能够提供相对较大的货物，但增加有效负载-如通过共同表达FKBP转换——不可避免地降低病毒滴度及随后的转导效率。CAR T细胞生产的常规方法需要在高剂量的经补充的细胞激素(例如IL-2、IL-7及/或IL-15)的存在下增殖经转导的T细胞，所述高剂量的经补充的细胞激素将增殖相同培养物中的经转导的(CAR+)及未转导的(CAR-)T细胞。由于FKBP转换的活化可传递能够驱动CAR T细胞增殖及浓化的细胞激素信号，利用这点并假设用AP1903取代经补充的细胞激素可克服FKBP转换CAR T细胞生产期间的低转导效率。

在第0天，在Grex-24板(Wilson Wolf，目录号80192M)中在补充100IU/mL人类IL-2(美天旎生物技术公司)、10％FBS(Hyclone)及人类T TransAct(美天旎生物技术公司，目录号130-111-160，1:100稀释液)的X-Vivo-15培养基(龙沙)中活化经纯化的T细胞。在第2天，将T细胞以0.5百万个细胞/mL再悬浮于Grex-24板(Wilson Wolf，目录号80192M)的每孔1mLT细胞转导培养基中。如以上所述制备慢病毒上清液并在第2天进行转导。在第5天，当转导完成时，洗涤细胞以除去残留的人类IL-2，再悬浮于新鲜的T细胞扩增培养基(即补充5％人类AB血清(Gemini Bio)的X-Vivo-15)中，并且在Grex-24孔板中于20ng/ml人类IL-2或指定浓度的AP1903中扩增。使用T细胞扩增培养基根据需要将细胞扩增成更大的G-Rex血管(Wilson Wolf)。在第5天、第9天及第15天，通过使用流动式细胞测量术检测结合FITC结合的v5标签单克隆抗体(赛默飞世尔)的T细胞的百分比来确定CAR+ T的浓化。

图35A显示使用各种细胞尾的对照BFP CAR及FKBP转换CAR的示意图。图35B-E显示在IL-2或AP1903中扩增的CAR+ T细胞的百分比，如通过指定天数的FACS分析测定。如所预期，由于培养物中CAR+及CAR-T细胞群的等效增殖，在20ng/ml人类IL-2中的增殖维持稳定百分比的CAR+ T细胞。另一方面，尽管AP1903不浓化BFP CAR T细胞(图35B)，但在第5天与第14天之间使用AP1903代替IL-2以剂量依赖性方式逐渐浓化FKBP转换CAR T细胞(图35C-E)；此外，FKBP转换通过IL7Ra(316-459)/IL12Rb2(775-825)(图35C)、IL2Rb(393-433、518-551)/IL21R(322)、IL2Rb(393-433、518-551)/IL21R(322-538)(图35D)及IL7Ra(316-459)/IL21R(322-538)(图35E)传递各种信号传导输出，可达成有效的CAR T细胞浓化。

实例14：响应于抗体及其它多聚化配体/诱导物诱导细胞激素信号传导

由于二聚化可活化可诱导的嵌合细胞激素受体，合理地，通过恰当的胞外域，抗体(或抗体衍生的分子)及多聚化配体/诱导物也将活化信号传导。

为评估被抗体活化，生成携带人类OX40(1-214)胞外域的嵌合细胞激素受体并且测试其在基于HEK293T细胞的Stat报告子分析中回应于临床抗-OX40抗体(GSK109)传导信号的能力。简单地说，将20,000个HEK293T细胞接种于涂覆聚-L-赖氨酸的96孔平底板的每个孔中并且允许黏附过夜。将驱动萤火虫荧光素酶(100ng；普洛麦格)及海肾荧光素酶对照报告子载体(1ng；普洛麦格)的OX40胞外域细胞激素受体(2.5ng)以最终体积5μL混合于Opti-MEM(Gibco)中(“DNA混合物”)。在室温下培养含在5μL Opti-MEM中的0.3μL脂质转染胺2000(英杰)5分钟并且然后加入到DNA混合物。在室温下培养所述混合物20分钟并将总体积10μL加入到包含HEK-293T的每个孔。在转染后24小时，将细胞保持未处理，或用在无血清培养基中稀释的抗-OX40抗体GSK109处理，并且使用Dual-Glo荧光素酶分析系统(普洛麦格)处理后5小时确定Stat报告子活性。将Stat报告子活性的诱导倍率归一化到经除了OX40胞外域细胞激素受体的外并且保持未处理的所有载体转染的HEK293T细胞的诱导倍率。每种条件设置四个孔。

图36A显示携带OX40胞外域的嵌合细胞激素受体的示意图。图36B-36C显示响应于抗体的细胞激素信号传导的活化。图36B-36C显示在不存在及存在抗-OX40抗体GSK109的情况下的STAT5(36B)及Stat4(36C)报告子活性。OX40胞外域的抗体介导的二聚化诱导下游细胞激素信号传导，如通过Stat5及Stat4报告子活性的增加所反映。

为测试配体诱导物及胞外域组是否可进一步延伸超过AP1903-FKBP(F36V)配对，测试响应于其它多聚体配体诱导物的信号传导。由于配体的肿瘤坏死家族(TNF)超家族为三聚体，其以多聚体方式接合其各自的受体。因此，将衍生自TNFR2超家族受体的胞外域(如BCMA(1-54)、TACI(1-165)及BAFFR(1-78))融合于本发明嵌合细胞激素受体的跨膜及信号传导域，并且测试响应于可溶性三聚体配体的信号传导。简单地说，将20,000个HEK293T细胞接种于涂覆聚-L-赖氨酸的96孔平底板的每个孔中并且允许黏附过夜。将驱动萤火虫荧光素酶(100ng；普洛麦格)及海肾荧光素酶对照报告子载体(1ng；普洛麦格)的嵌合细胞激素受体(2.5ng)以最终体积5μL混合于Opti-MEM(Gibco)中(“DNA混合物”)。在室温下培养含在5μL Opti-MEM中的0.3μL脂质转染胺2000(英杰)5分钟并且然后加入到DNA混合物。在室温下培养所述混合物20分钟并将总体积10μL加入到包含HEK-293T的每个孔。在转染后24小时，将细胞保持未处理，或用在无血清培养基中稀释的可溶性BAFF或APRIL三聚物处理，并且使用Dual-Glo荧光素酶分析系统(普洛麦格)处理后5小时确定Stat报告子活性。将Stat报告子活性的诱导倍率归一化到经除了OX40胞外域细胞激素受体的外并且保持未处理的所有载体转染的HEK293T细胞的诱导倍率。每种条件设置4个孔。

图37A显示衍生自所测试的TNFR2超家族的各种胞外域的示意图。图37B为受体BCMA、TACI及BAFFR与其配体BAFF及APRIL间的相互作用(《药物设计、开发及疗法(Drug DesDevel Ther.)》2015年1月7日；9:333-47.)的示意图。图37C-37D显示响应于多聚体配体诱导物的细胞激素信号传导的活化。图37C-37D显示响应于可溶性BAFF及APRIL三聚物的STAT5(37C)及Stat4(37D)报告子活性。通过可溶性BAFF三聚物多聚化各自的嵌合细胞激素受体诱导Stat5及Stat4活化，及通过可溶性APRIL三聚物多聚化BCMA胞外域细胞激素受体诱导下游Stat活化。

实例15：通过修改TPOR TM螺旋来优化FKBP转换的信号传导强度及灵敏度

已确认TpoR的螺旋跨膜(TM)区通过控制JAK2活化对于配体诱导的受体信号传导来说至关重要。假设在嵌合细胞激素转换中，其中不同胞外域(例如FKBP)与TpoR TM/JAK2活化域融合，可扰乱受体活化的最佳结构构形。利用TM区在TpoR活性中的重要性，试图通过修改TpoR TM区来增加FKBP转换的反应性。为此，在TpoR TM区中产生具有缺失或***的FKBP转换变异体并在HEK293T细胞报告子分析中测试其。

简单地说，将20,000个HEK293T细胞接种于涂覆聚-L-赖氨酸的96孔平底板的每个孔中并且允许黏附过夜。将FKBP转换(2.5ng)(驱动萤火虫荧光素酶(100ng；普洛麦格)及海肾荧光素酶对照报告子载体(1ng；普洛麦格)的STAT5反应组件)以最终体积5μL混合于Opti-MEM(Gibco)中(“DNA混合物”)。携带野生型TpoR跨膜域的FKBP转换用作比较子。在室温下培养含在5μL Opti-MEM中的0.3μL脂质转染胺2000(英杰)5分钟并且然后加入到DNA混合物。在室温下培养所述混合物20分钟并将总体积10μL加入到包含HEK-293T的每个孔。在转染24后小时，将细胞保持未处理，或用在无血清培养基中稀释的指定浓度的AP1903(APEXBio)处理。在处理后24小时，使用Dual-Glo荧光素酶分析系统(普洛麦格)评估Stat5报告子活性。将Stat5报告子活性的诱导倍率归一化到经除了转换受体的外并且保持未处理的所有载体转染的HEK293T细胞的诱导倍率。

图38A-38C显示TpoR跨膜域修饰对FKBP转换的信号传导的强度及灵敏度的影响。

图38A-38B显示野生型TpoR及各种TM缺失(图38A)或***(图38B)变异体的氨基酸序列。

图38C显示在不存在或存在AP1903的情况下携带TpoR TM缺失(图38A)及***(图38B)的FKBP转换变异体的反应。用矩形框突出显示的为携带野生型TpoR TM域的FKBP转换，TM变异体衍生自所述野生型TpoR TM域。与携带野生型TpoR TM域的FKBP转换(即FKBP转换)相比，TpoR TM缺失变异体(如TpoR(478-582；N-3)、TpoR(478-582；N-5)、TpoR(478-582)；N-6)及TpoR(478-582；N-7))增加AP1903诱导的Stat5活性的强度。此外，几种TpoR TM变异体还增加回应于极低浓度的AP1903(即1ng/ml或0.1ng/ml)的敏感性，并且TpoR(478-582；N-7)及TpoR(478-582；N)-9)是最敏感的。这些证实调节TpoR TM区增强FKBP转换对AP1903的反应性及灵敏度。

实例16：通过不同及组合细胞尾信号输出控制CAR T细胞分化

A.将细胞尾组合以活化添加剂信号传导途径

在TCR活化后，Ca+移动导致NFAT的活化及促炎症性标靶(IL2、GzmB等)的上调。许多这些启动子并非仅通过NFAT活化，而是具有AP-1的NFAT的异源三聚物(Fos及Jun的卷曲螺旋)。过度抗原刺激会发生耗尽，并且认为在经活化的NFAT的量超过AP-1的量导致NFAT同源二聚物及不同启动子的活化时发生。防止耗尽的一种方法是增加AP-1(Fos/Jun)的量。细胞激素受体(如IL2R及IL7R)活化JNK(Jun激酶)，其磷酸化并且活化c-Jun。然而，单独这一点不足以上调AP-1，因为Fos也必须被上调及磷酸化。平行的MEK/ERK途径导致Fos经Myc/Max上调、以及Fos的直接磷酸化。因此，活化JNK及MEK/ERK的假定受体将导致更多的AP-1。EGF受体(EGFR)为熟知活化MEK/ERK信号传导途径的受体酪氨酸激酶的一。通过使用EGFR细胞尾，证实稳健地活化Myc/Max并且因此活化Fos的能力。通过将EGFR及IL7R细胞尾组合，证实成功诱导AP-1及Myc/Max信号传导途径，其阻止CAR T细胞的最终分化及耗尽。

为测试通过不同细胞尾活化的信号传导途径，使用HEK293T细胞报告子分析。简单地说，将20,000个HEK293T细胞接种于涂覆聚-L-赖氨酸的96孔平底板的每个孔中并且允许黏附过夜。将可诱导的细胞激素受体(2.5ng)(驱动萤火虫荧光素酶(100ng；普洛麦格)及海肾荧光素酶对照报告子载体(1ng；普洛麦格)的各自的转录因子组件)以最终体积5μL混合于Opti-MEM(Gibco)中(“DNA混合物”)。在室温下培养含在5μL Opti-MEM中的0.3μL脂质转染胺2000(英杰)5分钟并且然后加入到DNA混合物。在室温下培养所述混合物20分钟并将总体积10μL加入到包含HEK-293T的每个孔。作为阴性对照，将FKBP胞外域偶联于缺失JAK结合域及细胞尾(即TpoR CTRL)的TpoR(478-528)的跨膜及短胞内区。作为比较，将FKBP胞外域偶联于MyD88/CD40信号传导域(以下称为“FKBP-MyD88-CD40”)。在转染24后小时，将细胞保持未处理，或用在无血清培养基中稀释的1μg/mL AP1903(Apex Bio)处理。在AP1903处理后6小时，使用Dual-Glo荧光素酶分析系统(普洛麦格)测定Stat5报告子活性。将Stat5报告子活性的诱导倍率归一化到经除了可诱导的细胞激素受体的外并且保持未处理的所有载体转染的HEK293T细胞的诱导倍率。

图39A显示所测试的嵌合受体的示意图。

图39B显示使用单个细胞尾及细胞尾的组合的HEK293T细胞中报告子活性的荧光素酶分析读数的结果。每行代表各自的转录因子反应性萤火虫荧光素酶报告子；每列代表携带各自的细胞尾/信号传导域的嵌合受体。每个框描绘诱导倍率，每行经归一化到各自的萤火虫荧光素酶报告子的最高诱导倍率。如所预期，单个细胞尾输出活化所需的信号传导途径，其中IL7R(316-459)活化Stat5，IL12Rb2small(775-825)活化Stat4，及EGFR(1122-1165)活化AP-1及Myc/Max途径。当将其自身活化不同信号传导路径上的个别细胞尾组合时，随之产生加成作用-在AP1903的存在下，IL7R(316-459)/IL12Rb2small(775-825)细胞尾诱导Stat5及Stat4活化，而IL7R(316-459)/EGFR(1122-1165)细胞尾诱导Stat5(尽管程度较低)、AP-1及Myc/Max活化。与FKBP-细胞尾受体的可诱导性相比，FKBP-MyD88-CD40受体在不存在AP1903的情况下显示高的基础信号传导。

B.通过不同细胞尾输出倾斜T细胞细胞毒性效应子活性及记忆分化

熟知IL-12信号传导促进T细胞细胞毒性及效应子分化；另一方面，图Fb表明EGFR信号传导可阻止T细胞衰竭并且促进记忆T细胞的产生。为测试通过不同细胞尾活化的不同信号传导途径是否可控制CAR T细胞效应子功能及记忆分化，共同表达携带相同跨膜及JAK2结合域的(单独地或双重串联地)具有不同细胞尾的FKBP转换。

为测试不同细胞尾输出是否影响CAR T细胞的效应子功能，进行4天的体外细胞毒性分析。简单地说，接种30,000个U87KO-EGFRvIII-nucRFP靶细胞并且允许在具有黑色壁及平坦透明底部的96孔板中于包含10％FBS(Hyclone)、非必需氨基酸、丙酮酸钠及20-25mMHEPES的50μL RPMI中附着。U87KO-EGFRvIII为来自Cellectis SA(法国巴黎)的一种产品。U87KO-EGFRvIII衍生自亲本细胞系U87MG(ATCC)，通过首先使用转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)敲除内源野生型EGFR，然后通过慢病毒转导稳定地过度表达全长人类EGFRvIII。为通过IncuCyte活细胞分析成像系统促进靶细胞成像，通过用IncuCyteNucLight Red慢病毒试剂(Sartorius)进行第二次慢病毒转导，从U87KO-EGFRvIII衍生得U87KO-EGFRvIII-nucRFP靶细胞。将携带具有各自的细胞尾的FKBP转换的EGFRvIII CAR(2173scFv)T细胞解冻并且以1:8的效应子:标靶(E:T)比加入到所接种的靶细胞。作为比较，包括共同表达FKBP-MyD88-CD40的CAR T细胞。将孔保持未处理或用500ng/ml AP1903(ApexBio)处理。通过使用Incucyte活细胞分析成像系统计算得活核RFP+细胞的数量来确定每个时间点的活靶细胞的数量。每种条件以一式两份设置孔。

在4天的细胞毒性分析结束时，旋转平板并且收集上清液以用于分析细胞激素释放，使用MSD分析(Meso Scale Discovery)。

图40A-40F显示在不存在或存在AP1903的情况下，单独地或双重串联地携带不同细胞尾的FKBP转换的体外细胞毒性分析的结果。

图40A-40C显示所测试的干细胞/中枢记忆(Tscm/Tcm)T细胞促进细胞尾(即IL7R(316-459)及EGFR(1122-1165))的细胞毒性活性。在4天的相对短的时间范围内，IL7R(316-459)及EGFR(1122-1165)-单独地或组合地-在AP1903的存在下不增强CAR T细胞细胞毒性。这可能是预期的，因为虽然Tscm/Tcm记忆表型的T细胞长期自我更新并且存活期更长，但还展示执行细胞毒性效应子功能的延迟。

图40D-40E显示IL12Rb2small(775-825)细胞尾的细胞毒性活性，其仿真IL-12信号传导以促进效应子记忆/效应子(Tem/Temra)T细胞分化。IL12Rb2small(775-825)细胞尾-单独或在与IL7R(316-459)组合时-在AP1903的存在下增强CAR T细胞细胞毒性效力。

图40F显示携带FKBP-MyD88-CD40的CAR T细胞的细胞毒性活性。不像图40A-40E中的细胞尾，携带FKBP-MyD88-CD40的CAR T细胞在不存在AP1903的情况下显示增强的杀死活性。此外，AP1903的加入没有进一步增强细胞毒性，表明FKBP-MyD88-CD40受体是具有高基础活性并且缺失可诱导性的受体。

图41A-41B显示在不存在及存在AP1903的情况下，在4天的细胞毒性分析结束时培养物上清液中细胞激素的水平。每行显示在不存在或存在AP1903的情况下各自的细胞尾，每列显示所分析的各别细胞激素。将每列归一化到所分析的各自的细胞激素的最高浓度，将其设定为100％。

图41A显示所有细胞尾(但不包括FKBP-MyD88-CD40受体)的细胞激素的释放。在AP1903的存在下，包含促进效应子的IL12Rbsmall(775-825)细胞尾的FKBP转换释放升高量的促发炎性细胞激素，包括IL-17A/F、IL-21、TNFα及IFNg。有趣地，IL12Rbsmall(775-825)细胞尾还导致IL-10分泌的增加，这可能是响应于强烈炎症性信号通过负反馈机制而产生。

图41B显示所有细胞尾以及FKBP-MyD88-CD40受体的细胞激素的释放。与携带细胞尾的FKBP转换相比，即使在不存在AP1903的情况下，FKBP-MyD88-CD40受体也分泌升高水平的细胞激素，这一结果与其高基础活性一致。

为测试不同细胞尾输出是否影响CAR T细胞的记忆分化及长期存活期，进行AP1903驱动的生长分析。将携带指定的嵌合受体的CAR T细胞解冻并且通过添加未转导的T细胞将CAR+细胞的百分比归一化到具有最低转导效率(即20％CAR+)的样品。将细胞保持未处理，或用500ng/ml的AP1903并在不存在外源细胞激素(除非在阳性对照的情况下指定)或靶细胞的情况下处理2周。作为阳性对照，CAR T细胞可替代地补充外源性重组IL-7或IL-2(各10ng/mL；美天旎)。在AP1903驱动的生长分析的第5天，使用MSD分析(Meso ScaleDiscovery)针对于上清液进行采样以用于分析细胞激素的释放。在2周培养结束时，测定存活的CAR T细胞的记忆及衰竭表型。简单地说，收获来自每种培养条件细胞的一式两份样品并且使用Zombie NIR Fixable Viability试剂盒(Biolegend)染色。用PBS洗涤样品，Fc阻断，然后用在PBS+1％BSA中稀释的以下抗体混合物染色：BUV395结合的抗人类CD3、BV510结合的抗人类CD8、BV605结合人类CD4及FITC结合的v5标签(用于CAR检测)、PE/Cy7结合的抗人类CD62L(Biolegend)、BV785结合的抗人类CD45RO(Biolegend)、APC结合的抗人类PD-1(Biolegend)、BV711结合的抗人类Tim-3(Biolegend)及PerCP/eFluor710结合的抗人类Lag-3(eBioscience)。最后，将样品在PBS中洗涤并将细胞沉淀再悬浮于PBS+1％BSA中以用于FACS分析。

图42A-42B显示在AP1903的存在下AP1903驱动的生长的第5天培养物上清液中细胞激素的水平。每行显示在AP1903的存在下的各别信号传导域，每列显示所分析的各别细胞激素。将每列归一化到所分析的各自的细胞激素的最高浓度，将其设定为100％。

图42A显示所有细胞尾(但不包括FKBP-MyD88-CD40受体)的细胞激素的释放。包含IL12Rbsmall(775-825)的细胞尾分泌升高量的促发炎性细胞激素，包括IL-17A/F、IL-21、TNFα，并且尤其包括IFNg。

图42B显示所有细胞尾以及FKBP-MyD88-CD40受体的细胞激素的释放。与FKBP-MyD88-CD40受体相比，在AP1903驱动的生长期间FKBP-细胞尾嵌合受体的细胞激素的释放总体上较低。

图43显示AP1903驱动的携带细胞尾的CAR T细胞的浓化。虚线表示在分析开始时接种的CAR+细胞的百分比(即20％)。如所预期，用外源性重组IL-7或IL-2处理促进相同培养物中CAR+及CAR-T细胞的增殖及存活，导致CAR+细胞稳定维持在～20％。相反地，用AP1903处理选择并浓化表达FKBP-细胞尾受体的CAR T细胞，表明生长及存活优势具有CAR+T细胞特异性。

图44A-44G显示在AP1903驱动的增殖的第14天CAR T细胞的记忆子集分布。与消除Stat5活性的IL7R(424-459；Y456F)细胞尾相比(图5B)，Stat5感受态IL7R(316-459)细胞尾促进Tscm CAR+ T细胞浓化到等于或优于外源性重组IL-7的程度。此外，与用外源性重组IL-7或IL-2处理相比，AP1903诱导的EGFR(1122-1165)细胞尾的活化-单独地或与IL7R(316-459)组合地-导致Tcm CAR+ T细胞群浓化，表明EGFR(1122-1165)细胞尾信号传导促进Tcm分化。

图45A-45G显示在AP1903驱动的增殖的第14天CAR+ T细胞的耗尽表型。与消除Stat5活性的IL7R(424-459；Y456F)细胞尾相比(图5B)，Stat5感受态IL7R(316-459)细胞尾有效地抑制PD-1、Tim-3及Lag-3的表达到等于或优于外源性重组IL-7的程度。此外，与用外源性重组IL-7或IL-2处理相比，AP1903诱导的EGFR(1122-1165)细胞尾的活化-单独地或与IL7R(316-459)组合地-抑制Tim-3及Lag-3的表达。

总之，长寿命CAR T细胞的浓化可通过并入促进记忆并且防止耗尽的细胞尾(如IL7R(316-459)及/或EGFR(1122-1165))来实现；然而，通过并入促进效应子的细胞尾(如Il12Rb2small(775-825))，可有利于具有有效并且立即的细胞毒性功能的CAR T细胞。

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