阅读说明：本技术 一种水解氨基酸的制备方法 (Preparation method of hydrolyzed amino acid ) 是由 林金新 郭小雷 黄平 于 2019-10-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术领域,公开了一种水解氨基酸的制备方法。称取试样,放入水解管,向水解管中加入盐酸,密封后,放入110℃保温水解,充分反应后,盐酸使样品中蛋白质的肽键断裂,从而形成氨基酸。取出样品过滤洗涤,经缓冲液稀释,上清液进行保存待测。本发明方法简单,解决了氨基酸分析的前期准备工作设备要求高的问题。(The invention relates to the technical field of biology and discloses a preparation method of hydrolyzed amino acid. Weighing a sample, putting the sample into a hydrolysis tube, adding hydrochloric acid into the hydrolysis tube, sealing, putting the tube into a 110 ℃ thermal insulation hydrolysis tube, and after full reaction, breaking peptide bonds of proteins in the sample by the hydrochloric acid to form amino acid. Taking out the sample, filtering, washing, diluting by buffer solution, and storing supernatant to be tested. The method is simple, and solves the problem of high requirement on equipment for early preparation of amino acid analysis.)

一种水解氨基酸的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为一种水解氨基酸的制备方法。

背景技术

氨基酸，是羧酸碳原子上的氢原子被氨基取代后的化合物，氨基酸分子中含有氨基和羧基两种官能团。与羟基酸类似，氨基酸可按照氨基连在碳链上的不同位置而分为α-，β-，γ-...w-氨基酸，但经蛋白质水解后得到的氨基酸都是α-氨基酸，而且仅有二十几种，他们是构成蛋白质的基本单位。

根据氨基酸组成分析可以对蛋白质及肽进行鉴别，氨基酸分析法可用于确定蛋白质、肽及氨基酸的含量，及测定可能存在于蛋白质及肽中的非典型氨基酸。进行氨基酸分析前，必须将蛋白质及肽水解成单个氨基酸。蛋白质及肽水解后，其氨基酸分析过程与用于其他药物制剂中游离氨基酸的分析过程相同。

现有的实验室水解氨基酸过程中，流程复杂，设备要求高。如CN104419949A，除了酸碱处理，还有电解处理过程,需要电化学设备。一个标准化、设备要求低的氨基酸水解方法可以大大提高适用性。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种水解氨基酸的制备方法，解决了氨基酸分析复杂、设备要求高的问题。

为实现上述的目的，本发明提供如下技术方案：

一种水解氨基酸的制备方法，包括：

S1：称取试样：根据蛋白质样品中含有的氨基酸的含量，准确称取水解样品，使取出的氨基酸含量在10~20mg；

S2：试样放入水解管中，加入盐酸：将称取好的样品放入水解管中，水解管中加入盐酸，密封盖拧好；

S3：密封水解管：先向水解管中充入氮气，再将水解管抽成真空，反复多次，确保水解瓶中彻底没有氧气；

S4：水解氨基酸：将密封后的水解管放置在110℃的恒温烘干箱内，放置24--30小时，水解瓶中的样品与盐酸充分反应，盐酸使样品中蛋白质的肽键断裂，从而形成氨基酸；

S5：开管取液：将水解管从烘干箱内取出，放置在阴凉处，自然冷却，当水解箱冷却完毕后，拧开水解管的密封盖将水解后的样品倾倒出；

S6，过滤洗涤：将水解管中的物质过滤倒入容量瓶中，将样品水解后剩余的杂质去除；将水解管使用离子水洗涤，洗涤后的溶液再经过滤纸过滤后倒入容量瓶中；

S7：蒸干脱酸：将容量瓶内的物料取出，放置到真空脱酸仪上进行脱酸，脱至干燥，底部留有少许固体或痕渍为止；

S8：缓冲溶解：脱酸后的样品加入pH2.2的柠檬酸钠缓冲溶液，对样品进行溶解；

S9：取出上清液：取出样品经缓冲液稀释后的上清液进行保存。

S7步骤中，脱酸时的温度设置为60℃。

称取试样时，需要计算试样氨基酸含量。需注意的是，当样品浓度太低时测量会有一定的误差，当样品浓度太高（通常大于 20nmol/20μL）时会有盐的沉积堵塞反应柱。所以估算样品浓度、选择合适的称样量对于测量结果和仪器正常使用都有重要意义。

蒸干脱酸过程中，将反应后的物料中的含有的高浓度盐酸脱去，避免溶液在上机检测时含有高浓度盐酸对机器进行腐蚀。

与现有技术相比，本发明提供的水解氨基酸的制备方法，具备以下有益效果：

1、方法简单，操作步骤少，使水解氨基酸前期准备变得简洁易操作，不需要电解过程，解决了氨基酸分析的设备要求高的问题。

2、该水解氨基酸的制备方法，通过使用管壁大于0.55mm的水解管，避免了在水解过程中可能会出现的炸管现象，增加了水解过程中的效率和安全性。

3、该水解氨基酸的制备方法，通过将水解后的产物进行脱酸处理，将水解产物中含有的高纯度盐酸脱去，避免了溶液在上机检测时含有高浓度盐酸对机器进行腐蚀。

具体实施方式

对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1，一种水解氨基酸的准备方法，包括：

S1：称取试样：准确称取鱼粉样品50mg。

S101：计算试样氨基酸含量：现今最常用 17 种混标氨基酸光谱进样量的浓度为20nmol/μL，各氨基酸最适宜浓度为0.4~10.0nmol/20μL。当样品是纯蛋白样品时可采取直接估算法，假定平均分子量为 120，每次样品中 20 种氨基酸．则制备浓度5μg/20μL即可；当样品浓度未知时，可采取估算法，取两个试管分别加0.1ml认为浓度适宜的样品，另一个加0.1ml标准品，再分别加入 1ml茚三酮试剂，在 100 ℃ 加热 3 min ，在波长 570 nm处测定吸光度值，进行比较从而得出样品应稀释或浓缩的倍数。需注意的是．当样品浓度太低时测量会有一定的误差，当样品浓度太高（通常大于 20nmol/20μL）时会有盐的沉积堵塞仪器。所以估算样品浓度、选择合适的称样量对于测量结果和仪器正常使用都有重要意义。

S102:称取适量试样：根据S10计算出的试样氨基酸含量，对试样进行称取，使取出的氨基酸含量在10~20mg。

S2：试样放入水解管中：将称取好的样品放入水解管中，水解管是一种长颈玻璃试管，且水解管为一种螺纹口带盖试管，且水解管的壁面厚度大于0.5mm，防止在水解过程中可能出现的炸管现象，将样品放入水解管中时要小心样品附着在水解管壁面上，使得样品水解不充分。

S3：水解管中加入盐酸：向水解管中加入6mol/L的盐酸，且盐酸与样品质量比例为1:1。在水解管中加入盐酸，盐酸与样品接触，充分反应后，盐酸使样品中蛋白质的肽键断裂，从而形成氨基酸。

S4：密封水解管：先向水解管中充入氮气，再将水解管抽成真空，如此循环五次后盖上水解管密封盖，通过氮气对水解管内氧气进行排挤，再密封水解管将水解管中的空气抽走，让水解管内成真空，确保水解瓶中没有氧气，避免了样品水解产生的氨基酸被氧化。

S5：水解氨基酸：将密封后的水接管放置在110℃的恒温烘干箱内，放置24-小时，具体时间根据样品多少进行调节，让样品有充足的时间与盐酸彻底反应，在加热条件下，水解瓶中的样品与盐酸充分反应，盐酸使样品中蛋白质的肽键断裂，从而形成氨基酸。

S6：开管取液：将水解管从烘干箱内取出，放置在阴凉处，自然冷却，当水解箱冷却完毕后，拧开水解管的密封盖将水解后的样品倾倒出；

S7：过滤洗涤：水解管中水解后的样品需要进行过滤，将样品中的在杂质去除，确保得到纯净的氨基酸，同时将水解管内壁进行洗涤，避免水解管内壁附着有残留物。

过滤：将水解管中的物质通过小漏斗和滤纸行过滤倒入容量瓶中，将样品水解后剩余的杂质去除；

洗涤；将水解管用离子水洗涤五次，将水解管内壁可能附着的样品和氨基酸洗出，洗涤后的溶液再经过小漏斗和滤纸进行过滤，过滤后倒入容量瓶中。

S8：蒸干脱酸：将容量瓶内的物料取出，放置到真空脱酸仪上进行脱酸，温度设置为60℃，脱至干燥，底部留有少许固体或痕渍为止，反应后的物料中的含有的高浓度盐酸脱去，避免溶液在上机检测时含有高浓度盐酸对机器进行腐蚀；

S9：缓冲溶解：脱酸后的样品加入pH2.2的柠檬酸钠缓冲溶液，对样品进行溶解，样品进行缓冲溶解对样品进行稀释。

S10：取出上清液待测：取出样品经缓冲液稀释后的上清液进行保存。

实施例2，一种水解氨基酸的准备方法，包括：

S1：称取试样：准确称取水果样品200mg。

S101：计算试样氨基酸含量：现今最常用 17 种混标氨基酸光谱进样量的浓度为20nmol/μL，各氨基酸最适宜浓度为0.4~10.0nmol/20μL。当样品是纯蛋白样品时可采取直接估算法，假定平均分子量为 120，每次样品中 20 种氨基酸．则制备浓度5μg/20μL即可；当样品浓度未知时，可采取估算法，取两个试管分别加0.1ml认为浓度适宜的样品，另一个加0.1ml标准品，再分别加入 1ml茚三酮试剂，在 100 ℃ 加热 3 min ，在波长 570 nm处测定吸光度值，进行比较从而得出样品应稀释或浓缩的倍数。需注意的是．当样品浓度太低时测量会有一定的误差，当样品浓度太高（通常大于 20nmol/20μL）时会有盐的沉积堵塞仪器。所以估算样品浓度、选择合适的称样量对于测量结果和仪器正常使用都有重要意义。

S102:称取适量试样：根据S10计算出的试样氨基酸含量，对试样进行称取，使取出的氨基酸含量在10~20mg。

S2：试样放入水解管中：将称取好的样品放入水解管中，水解管是一种长颈玻璃试管，且水解管为一种螺纹口带盖试管，且水解管的壁面厚度需要大于0.5mm，防止在水解过程中可能出现的炸管现象，将样品放入水解管中时要小心样品附着在水解管壁面上，使得样品水解不充分。

S3：水解管中加入盐酸：向水解管中加入6mol/L的盐酸，且盐酸与样品质量比例为1:1。在水解管中加入盐酸，盐酸与样品接触，充分反应后，盐酸使样品中蛋白质的肽键断裂，从而形成氨基酸。

S4：密封水解管：先向水解管中充入氮气，再将水解管抽成真空，如此循环五次后盖上水解管密封盖，通过氮气对水解管内氧气进行排挤，再密封水解管将水解管中的空气抽走，让水解管内成真空，确保水解瓶中没有氧气，避免了样品水解产生的氨基酸被氧化。

S5：水解氨基酸：将密封后的水接管放置在110℃的恒温烘干箱内，放置30小时，具体时间根据样品多少进行调节，让样品有充足的时间与盐酸彻底反应，在加热条件下，水解瓶中的样品与盐酸充分反应，盐酸使样品中蛋白质的肽键断裂，从而形成氨基酸。

S6：开管取液：将水解管从烘干箱内取出，放置在阴凉处，自然冷却，当水解箱冷却完毕后，拧开水解管的密封盖将水解后的样品倾倒出；

S7：过滤洗涤：水解管中水解后的样品需要进行过滤，将样品中的在杂质去除，确保得到纯净的氨基酸，同时将水解管内壁进行洗涤，避免水解管内壁附着有残留物。

过滤：将水解管中的物质通过小漏斗和滤纸行过滤倒入容量瓶中，将样品水解后剩余的杂质去除；

洗涤；将水解管用离子水洗涤五次，将水解管内壁可能附着的样品和氨基酸洗出，洗涤后的溶液再经过小漏斗和滤纸进行过滤，过滤后倒入容量瓶中。

S8：蒸干脱酸：将容量瓶内的物料取出，放置到真空脱酸仪上进行脱酸，温度设置为60℃，脱至干燥，底部留有少许固体或痕渍为止，反应后的物料中的含有的高浓度盐酸脱去，避免溶液在上机检测时含有高浓度盐酸对机器进行腐蚀；

S9：缓冲溶解：脱酸后的样品加入pH2.2的柠檬酸钠缓冲溶液，对样品进行溶解，样品进行缓冲溶解对样品进行稀释。

S10：取出上清液待测：取出样品经缓冲液稀释后的上清液进行保存待测。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。