阅读说明：本技术 一种3d打印木聚糖酶催化剂的方法及其应用 (Method for 3D printing of xylanase catalyst and application thereof ) 是由 江伟 裴蕊 于 2019-10-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种3D打印木聚糖酶催化剂的方法及其应用,属于生物法催化降解难分解化合物技术领域。本发明确定了3D打印木聚糖酶催化剂的材料、3D打印材料对酶活的影响、3D打印的粒径、3D打印木聚糖酶催化剂的酶活及重复利用率、3D打印木聚糖酶催化剂在降解木质纤维素方面的应用。本发明操作方便,在生物催化降解木糖和制备具有空间结构可控的3D打印催化剂方面具有较好的工业应用前景,对于今后生物催化专用3D催化剂的开发及生物大分子的降解的研究具有较为重要的意义。(The invention discloses a method for 3D printing of a xylanase catalyst and application thereof, and belongs to the technical field of catalytic degradation of difficultly-decomposed compounds by a biological method. The invention determines the material of the 3D printing xylanase catalyst, the influence of the 3D printing material on enzyme activity, the grain size of 3D printing, the enzyme activity and the repeated utilization rate of the 3D printing xylanase catalyst and the application of the 3D printing xylanase catalyst in the aspect of degrading lignocellulose. The method is convenient to operate, has good industrial application prospects in the aspects of degrading xylose by biocatalysis and preparing the 3D printing catalyst with controllable spatial structure, and has important significance in the development of special 3D catalysts for biocatalysis and the research of the degradation of biomacromolecules in the future.)

一种3D打印木聚糖酶催化剂的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种3D打印木聚糖酶催化剂的方法及其应用。

背景技术

生物催化剂被广泛的用于手性药物的合成、制备高附加值化学品、降解难降解的生物大分子等领域，使其具有优良的性能和较高的重复利用率具有重要的理论和经济效益。在过去的研究中，对生物催化剂的研究每出现一次大的提升，生物催化的发展就会出现一次大的飞跃。木质纤维素作为巨大的潜在绿色资源是地球上分布最广，含量最丰富的可再生高能聚合物，其主要存在于秸秆和木材中，是农林产业的主要副产物，全球每年约产生1500亿吨木质纤维素。但是，目前对木质纤维素等农林废弃物的利用率却很低，传统的方法会带来巨大的资源浪费和环境污染等。由于木质纤维素的结构较为复杂，是由数以万计葡萄糖分子聚合而成，导致其自然降解速度慢，焚烧等传统方法成本高、利用率低而且污染环境。相比之下，利用生物酶法降解木质纤维素因降解效率高、专一性强、环保、成本较低等优点，使其得到广泛应用，成为木质纤维素开发利用的研究热点。目前的研究表明真菌等微生物是降解木质纤维素的主要生物，但是关于具体的功能酶的研究相对较少。生物酶法降解木质纤维素离不开生物催化剂-酶，因此开发和制备具有良好性能的生物催化剂是解决上述问题的热点和难点。

木聚糖酶(D-xylanxylanohydrolase EC3.2.1.8)属于水解酶类，是一种木聚糖降解酶类。完全降解木聚糖需要木聚糖水解酶系中各种酶之间协同完成，而木聚糖酶(β-1，4-D-xylanase)是其中最关键的水解酶之一。以内切方式木聚糖酶作用于木聚糖主链内部的β-1，4-木糖苷键，其水解产物主要为少量木糖和低聚木糖，该反应为木聚糖利用起着较为重要的作用。木聚糖酶具有较高的应用价值，其在医药、造纸、饲料和食品等领域具有广泛的应用。因此，开发研究木聚糖酶具有重要的商业价值。木聚糖酶主要来源于真菌且大部分木聚糖酶最适反应条件偏于中性，使得其在医药、造纸、饲料和食品等领域工业极端环境中的应用受到了一定的限制。因此，获得性能优良的木聚糖酶并使其具有较高的重复利用率具有极其重要的意义。

3D打印技术是第三次工业革命的重要标志之一，目前已经被应用于骨骼打印等技术领域，为现有的技术带来了较高的技术进步，并且其应用价值也在逐渐增强。3D打印技术是一种利用计算机建立模型、用特殊新材料快速成型的临摹并结合传统的制造工艺的过程。3D打印技术利用计算机设计三维模型可以充分激发人们的想象力，通过模型计算和材料模拟减少了制造的复杂程度、缩短了研发周期，该技术的兴起为科技创新、新产品开发等提供了条件。生物催化剂在使用过程中其重复利用率和催化效率是决定其工业价值的关键，3D打印技术可实现打印模型的空间可控，并且其在宏观上可以打印出实体可以提高微观材料的重复利用率和回收率。因此，将其应用于生物催化剂领域具有重要的意义。

CN201610057210.3一种海藻酸钠-壳聚糖固定木聚糖酶的方法。通过以下步骤完成：原料混合步骤称取一定量的海藻酸钠充分溶解于蒸馏水中形成一胶体溶液，向该胶体溶液中加入适量的木聚糖酶液，调节pH至6.0～7.0，充分搅拌混匀，得到混合液1；分别称取一定量的壳聚糖和氯化钙溶解于蒸馏水中，调节pH至3.0～6.0，充分搅拌混匀，得到混合液2；(2)微球成形及包覆步骤：采用带有针头的蠕动泵将步骤(1)所得混合液1，滴入至步骤(1)所得混合液2中，得到直径2～3mm的光滑微球；(3)低温固化步骤：将步骤(2)中所得光滑微球置于3℃-10℃环境中进行低温固化得到固化微球，其中低温固化时间为1～4h；(4)洗脱过滤步骤：将步骤(3)制备的固化微球以蒸馏水冲洗去除表面残留杂质得到洗脱微球；(5)低温干燥步骤：将洗脱微球置于35～45℃的恒温干燥箱内进行低温干燥得到近似球型颗粒，干燥时间4～8h；(6)颗粒成型：筛选步骤(5)得到的近似球型的固定化酶颗粒。

该发明的缺点在于：(1)固定化酶的步骤较多所需时间长并且需要恒温干燥等会影响酶的活性；(2)微球的大小没有精确控制，不利于对反应的精确调控。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种3D打印木聚糖酶催化剂的方法及其应用，解决了上述背景技术中的问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种3D打印木聚糖酶催化剂的方法，包括如下步骤：

1)：ink制备：(1)按照0.1-0.5：10g/ml的比例称取木聚糖酶粉末和去离子水，使木聚糖酶完全溶于去离子水，离心取上清，得酶溶液；(2)称取海藻酸钠溶于酶溶液中，浓度为0.5-2wt％，使其充分溶解；(3)配置1.5-2.5wt％的氯化钙溶液；

2)：3D打印：(1)使用3D打印机控制，选择0.21-0.41um针头，0.25-0.4Mpa的压力，挤压打印出均匀的粒径为1.5-3.5mm的海藻酸钠-木聚糖酶微球，使微球滴入氯化钙溶液中进行交联固化5-15min；

3)：交联固化后处理：(1)将固化后的微球捞出，(2)使用去离子水冲洗掉表面残留的氯化钙，得到固定化的海藻酸钠-木聚糖酶微球。

优选地，步骤1)为：ink制备：(1)称取200mg木聚糖酶粉末溶于10ml去离子水中，摇晃震荡10min，使木聚糖酶完全溶于去离子水，离心取上清；(2)称取100mg海藻酸钠(1wt％)于酶溶液中，超声，使其充分溶解；(3)同时配置2wt％的氯化钙溶液。

优选地，步骤2)为：3D打印：(1)使用3D打印机控制，选择0.21um针头，0.4Mpa的压力，挤压打印出均匀的粒径为1.5mm的海藻酸钠-木聚糖酶微球，使微球滴入氯化钙溶液中进行交联固化10min。

优选地，步骤3)为：交联固化后处理：(1)将固化后具有机械强度的微球捞出；(2)使用去离子水冲洗掉表面残留的氯化钙，得到固定化的海藻酸钠-木聚糖酶微球，即粒径为1.5mm的3D打印木聚糖酶催化剂。

本发明还提供所述的3D打印木聚糖酶催化剂的方法在降解木聚糖中的应用。

本发明还提供一种3D打印木聚糖催化剂，其根据前述的3D打印木聚糖酶催化剂的方法制备而得。

本发明还提供所述的3D打印木聚糖酶催化剂在催化降解木聚糖等生物质化合物中的应用。

本发明确定了3D打印木聚糖酶催化剂的材料(海藻酸钠)、3D打印材料对酶活的影响、3D打印的粒径(1.5mm、2.5mm和3.5mm)、3D打印木聚糖酶催化剂的酶活及其重复利用率。

本发明所述3D木聚糖酶催化剂可催化降解木聚糖。所述3D木聚糖酶催化剂经过3D打印材料的选取、测定3D打印材料对酶活的影响、3D打印粒径的选取、测定3D木聚糖酶催化剂的酶活及重复利用率，所述的方法和构建的3D木聚糖酶催化剂催化降解木聚糖。

本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

(1)本发明3D打印木聚糖酶催化剂是利用3D打印技术设计的空间及尺度可控的3D催化剂，通过考察3D打印材料的选取、测定3D打印材料对酶活的影响、3D打印粒径的选取、测定3D打印木聚糖酶催化剂的酶活及重复利用率等，优化了其在催化降解木聚糖方面的应用，可催化降解木聚糖且重复使用方法简单，具有降解木聚糖等生物质大分子的潜力；

(2)本发明3D打印木聚糖酶催化剂的方法，具有操作方便、效率高、设备简单、可重复使用、空间结构可控等优点，在生物催化降解木聚糖和制备具有空间结构可控的3D打印催化剂领域具有较好的工业应用前景。

(3)本发明步骤少，时间短，且木聚糖酶可以保持较高的活性；(2)微球的大小可精确控制。

(4)本发明制备的木聚糖酶催化剂具有较好的重复利用率，可以多次使用。

附图说明

图1 3D打印材料对酶活的影响,a为时间的影响，b为温度的影响。

图2不同粒径3D打印木聚糖酶催化剂的酶活及重复利用率分析图。

具体实施方式

实施例1

一、3D打印木聚糖酶催化剂样品的制备：

1：ink制备：(1)称取200mg木聚糖酶粉末溶于10ml去离子水中，摇晃震荡10min，使木聚糖酶完全溶于去离子水，离心取上清；(2)称取100mg海藻酸钠(1wt％)于酶溶液中，超声，使其充分溶解；(3)同时配置2wt％的氯化钙溶液。

2：打印过程：(1)使用3D打印机控制，选择0.21um针头，0.4Mpa的压力，挤压打印出均匀的粒径为1.5mm的海藻酸钠-木聚糖酶微球，使微球滴入氯化钙溶液中进行交联固化10min。

3：交联固化后处理：(1)将固化后具有机械强度的微球捞出，使用去离子水冲洗掉表面残留的氯化钙；(2)得到固定化的海藻酸钠-木聚糖酶微球(粒径为1.5mm的3D打印木聚糖酶催化剂)，进行后续实验。

二、酶活及重复利用率的分析检测：

1：标准曲线的绘制：称取供干至恒重的10mg木糖，配成浓度为1mg/mL的溶液，然后按下表配制木糖不同浓度梯度溶液，加入DNS后沸水洛l0min，定容至1mL，每个梯度做3个平行，取150mL至96孔板，酶标仪测定540nm吸光值。以木糖浓度为横坐标，540nm吸收值为纵坐标绘制木糖标准曲线。

表 绘制标准曲线的木糖溶液

2：木聚糖酶酶活的测定方法：采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定还原糖含量。在碱性条件下3,5-二硝基水杨酸与还原糖加热,3,5-二硝基水杨酸被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，该红色物质可以在540nm下有特异吸收峰能被仪器检测到，同时还原糖则被氧化成糖酸及其他物质。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质深浅程度呈一定的线性关系。反应体系中，先加入90mL缓冲液配制的1％木聚糖底物预热l0min，再加入10μL稀释一定倍数的木聚糖酶，55℃反应5min，然后加入等体积的DNS终止反应，沸水浴l0min，吸取150μL加至96微孔板中，用酶标仪测定540mn的读数，根据木糖的标准曲线计算酶活。

—个单位酵活(Unit)定义为：在上述实验条件下，每min产生1μmol还原糖所需要的酶量定义为一个酶活力单位。

3：重复利用率的分析检测：(1)将木聚糖酶和海藻酸钠混合使其完全溶解，测定木聚糖酶的活性，检测海藻酸钠对木聚糖酶的影响，结果见图1，说明在不同的时间或温度条件下海藻酸钠对木聚糖酶活性的影响较小，木聚糖酶可以保持较高的活性；(2)将3D打印木聚糖酶催化剂用于催化降解木聚糖，检测酶活，并检测3D打印木聚糖酶催化剂的重复使用效果，结果见图2，说明粒径为1.5mm的3D打印木聚糖酶催化剂具有较好的重复利用率，可以多次使用。

实施例2

一、3D打印木聚糖酶催化剂样品的制备：

1：ink制备：(1)称取200mg木聚糖酶粉末溶于10ml去离子水中，摇晃震荡10min，使木聚糖酶完全溶于去离子水，离心取上清；(2)称取100mg海藻酸钠(1wt％)于酶溶液中，超声，使其充分溶解；(3)同时配置2wt％的氯化钙溶液。

2：打印过程：(1)使用3D打印机控制，0.34um针头，0.3Mpa的压力，挤压打印出均匀的粒径为2.5mm的海藻酸钠-木聚糖酶微球，使微球滴入氯化钙溶液中进行交联固化10min。

3：交联固化后处理：(1)将固化后具有机械强度的微球捞出，使用去离子水冲洗掉表面残留的氯化钙；(2)得到固定化的海藻酸钠-木聚糖酶微球(粒径为2.5mm的3D打印木聚糖酶催化剂)，进行后续实验。

二、酶活及重复利用率的分析检测：

1：标准曲线的绘制：称取供干至恒重的10mg木糖，配成浓度为1mg/mL的溶液，然后按下表配制木糖不同浓度梯度溶液，加入DNS后沸水洛l0min，定容至1mL，每个梯度做3个平行，取150mL至96孔板，酶标仪测定540nm吸光值。以木糖浓度为横坐标，540nm吸收值为纵坐标绘制木糖标准曲线。

表 绘制标准曲线的木糖溶液

2：木聚糖酶酶活的测定方法：采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定还原糖含量。在碱性条件下3,5-二硝基水杨酸与还原糖加热,3,5-二硝基水杨酸被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，该红色物质可以在540nm下有特异吸收峰能被仪器检测到，同时还原糖则被氧化成糖酸及其他物质。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质深浅程度呈一定的线性关系。反应体系中，先加入90mL缓冲液配制的1％木聚糖底物预热l0min，再加入10μL稀释一定倍数的木聚糖酶，55℃反应5min，然后加入等体积的DNS终止反应，沸水浴l0min，吸取150μL加至96微孔板中，用酶标仪测定540mn的读数，根据木糖的标准曲线计算酶活。

—个单位酵活(Unit)定义为：在上述实验条件下，每min产生1μmol还原糖所需要的酶量定义为一个酶活力单位。

3：重复利用率的分析检测：(1)将木聚糖酶和海藻酸钠混合使其完全溶解，测定木聚糖酶的活性，检测海藻酸钠对对木聚糖酶的影响，结果表明在不同的时间或温度条件下海藻酸钠对木聚糖酶活性的影响较小，木聚糖酶可以保持较高的活性；(2)将3D打印木聚糖酶催化剂用于催化降解木聚糖，检测酶活，并检测3D打印木聚糖酶催化剂的重复使用效果，结果见图2，说明粒径为2.5mm的3D打印木聚糖酶催化剂具有较好的重复利用率，可以多次使用。

实施例3

一、3D打印木聚糖酶催化剂样品的制备：

1：ink制备：(1)称取200mg木聚糖酶粉末溶于10ml去离子水中，摇晃震荡10min，使木聚糖酶完全溶于去离子水，离心取上清；(2)称取100mg海藻酸钠(1wt％)于酶溶液中，超声，使其充分溶解；(3)同时配置2wt％的氯化钙溶液。

2：打印过程：(1)使用3D打印机控制，0.41um针头，0.25Mpa的压力，打印出均匀的粒径为3.5mm的海藻酸钠-木聚糖酶微球，挤压使微球滴入氯化钙溶液中进行交联固化10min。

3：交联固化后处理：(1)将固化后具有机械强度的微球捞出，使用去离子水冲洗掉表面残留的氯化钙；(2)得到固定化的海藻酸钠-木聚糖酶微球(粒径为3.5mm的3D打印木聚糖酶催化剂)，进行后续实验。

二、酶活及重复利用率的分析检测：

1：标准曲线的绘制：称取供干至恒重的10mg木糖，配成浓度为1mg/mL的溶液，然后按下表配制木糖不同浓度梯度溶液，加入DNS后沸水洛l0min，定容至1mL，每个梯度做3个平行，取150mL至96孔板，酶标仪测定540nm吸光值。以木糖浓度为横坐标，540nm吸收值为纵坐标绘制木糖标准曲线。

表 绘制标准曲线的木糖溶液

2：木聚糖酶酶活的测定方法：采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定还原糖含量。在碱性条件下3,5-二硝基水杨酸与还原糖加热,3,5-二硝基水杨酸被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，该红色物质可以在540nm下有特异吸收峰能被仪器检测到，同时还原糖则被氧化成糖酸及其他物质。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质深浅程度呈一定的线性关系。反应体系中，先加入90mL缓冲液配制的1％木聚糖底物预热l0min，再加入10μL稀释一定倍数的木聚糖酶，55℃反应5min，然后加入等体积的DNS终止反应，沸水浴l0min，吸取150μL加至96微孔板中，用酶标仪测定540mn的读数，根据木糖的标准曲线计算酶活。

—个单位酵活(Unit)定义为：在上述实验条件下，每min产生1μmol还原糖所需要的酶量定义为一个酶活力单位。

3：重复利用率的分析检测：(1)将木聚糖酶和海藻酸钠混合使其完全溶解，测定木聚糖酶的活性，检测海藻酸钠对对木聚糖酶的影响，结果表明在不同的时间或温度条件下海藻酸钠对木聚糖酶活性的影响较小，木聚糖酶可以保持较高的活性；(2)将3D打印木聚糖酶催化剂用于催化降解木聚糖，检测酶活，并检测3D打印木聚糖酶催化剂的重复使用效果，结果见图2，说明粒径为3.5mm的3D打印木聚糖酶催化剂具有较好的重复利用率，可以多次使用。

本领域技术人员可知，当本发明的技术参数在如下范围内变化时，可以预期得到与上述实施例相同或相近的技术效果：

使用3D打印机控制，0.41um针头，0.25Mpa的压力，打印出均匀的粒径为1-3.5mm的3D打印木聚糖酶催化剂。优选1.5mm、2.5mm、3.5mm。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。