阅读说明：本技术 一种对抗体pH依赖结合活性的快速改造及筛选方法 (Rapid modification and screening method for pH-dependent binding activity of antibody ) 是由 徐曼 张丽英 刘娟 根纳季·戈洛洛博夫 李竞 顾继杰 陈智胜 于 2019-09-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种对抗体pH依赖结合活性的改造及筛选的方法,包括步骤：(1)构建野生型抗体scFv质粒模板；(2)对抗体的6个CDR区进行定点突变,用组氨酸替代CDR区域的每个氨基酸；(3)建立Capture-ELISA条件并进行高通量筛选；(4)KD-ELISA和FACS检测：对样品进行梯度稀释后,用不同pH buffer进行KD-ELISA的检测,根据检测数据绘制的曲线,确认目标克隆在抗原表面和细胞表面靶点的pH依赖结合活性。本发明提供的方法能够高通量、高效率、低成本的获得pH依赖结合活性的抗体。(The invention discloses a method for modifying and screening the pH-dependent binding activity of an antibody, which comprises the following steps: (1) constructing a wild type antibody scFv plasmid template; (2) site-directed mutagenesis of 6 CDR regions of an antibody, replacing each amino acid of the CDR regions with histidine; (3) establishing a Capture-ELISA condition and carrying out high-throughput screening; (4) KD-ELISA and FACS detection: after the sample is subjected to gradient dilution, KD-ELISA detection is carried out by using different pH buffers, and the pH-dependent binding activity of the target clone on the antigen surface and the cell surface target spot is confirmed according to a curve drawn by detection data. The method provided by the invention can obtain the antibody with pH-dependent binding activity with high flux, high efficiency and low cost.)

一种对抗体pH依赖结合活性的快速改造及筛选方法

技术领域

本发明涉及抗体的工程改造，具体涉及一种对抗体pH依赖结合活性的快速改造及筛选方法。

背景技术

单克隆抗体广泛用于疾病治疗。传统的抗体与抗原的结合是没有条件依赖的，例如在一定的pH范围内抗体表现相同的抗原结合活性。而通过抗体工程手段引入pH依赖活性有很高的应用价值。不具有pH依赖活性的抗体与抗原结合后，通过“缓冲”作用延长目标抗原的半衰期，不能将抗原从血浆中清除，反而增加了血浆中抗原的浓度。而一些天然的受体不仅能与配体结合，还能在酸性核内体(～pH 5.5)的pH依赖性解离，不断地从血浆中清除配体，随后受体循环到细胞表面再利用。据此可以改造抗体，使其在酸性核内体pH值时亲和力弱，但在中性pH值附近与靶标结合具有较高的亲和力。这样的抗体在细胞核内体内释放抗原走降解通路，抗体可以回收到细胞表面再利用。例如针对IL-6R和PCSK9的抗体，研究者们通过组氨酸突变的方法获得了具有pH敏感性结合的抗体，可以降低抗体的清除，增加体内PK和药效。

另外，为了得到专门针对肿瘤的微酸微环境中特异结合靶标的抗体，则需要改造抗体，使其在微酸环境下结合远远强于在中性pH下的结合，以达到肿瘤特异结合和降低毒性的作用，从而使抗体能在更低剂量下达到与传统抗体相似的疗效。但是，由于肿瘤的微酸环境的pH大约为6.5，与中性pH7.4的差别小于1，常规筛选方法的灵敏度难以达到要求。因此，本领域需要更灵敏的一套方法来做筛选和区分。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种对抗体pH依赖结合活性的改造及筛选的方法，能够高通量高、高效率、低成本的获得pH依赖结合活性的抗体。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种对抗体pH依赖结合活性的改造及筛选的方法，包括步骤：

(1)构建野生型抗体scFv质粒模板：将抗体的重链和轻链可变区通过连接肽连接后，利用限制性内切酶位点接入大肠杆菌表达载体，获得完整的scFv质粒模板，方便对可变区序列的改造；

(2)对抗体的6个CDR区进行定点突变，通过PCR的方法，用组氨酸替代CDR区域的每个氨基酸，然后用限制性内切酶消化质粒模板，获得突变后的PCR产物转化大肠杆菌，用诱导剂诱导后获得可溶性scFv抗体；

(3)建立Capture-ELISA条件并进行高通量筛选：

首先，包被不同浓度的anti-c-Myc抗体，加入诱导后的突变体表达上清，用不同的缓冲溶液调整pH，同时在相应不同的pH条件下进行筛选，孵育，使可溶性scFv抗体片段定量地捕获在ELISA板上；

然后加入不同浓度的带有标签的抗原，用不同pH的缓冲溶液稀释，同时在相应不同的pH条件下进行筛选，再孵育；

然后加入检测抗原标签的二抗，用不同pH的缓冲溶液稀释，同时在不同的pH条件下进行筛选，测得抗原-抗体结合的亲和力信号；

筛选的要求为：保证大肠杆菌表达的未经纯化的抗体在实验中保持pH稳定且不受细菌培养液和分泌物影响；筛选出的条件包括：包被抗体浓度，缓冲液pH和盐浓度，抗原浓度；

要保证抗原抗体的结合发生在预设的pH，为了使诱导后的抗体上清达到一样的pH,，需要筛选不同盐浓度的pH缓冲液，来实现诱导后的培养物上清pH一样。然后用这个缓冲液作为建立筛选条件的缓冲液，最后根据Capture ELISA的结果，选定最后的筛选条件(包被抗体浓度，抗原浓度等)。后续利用选定的筛选条件，对诱导后的突变体上清进行筛选。该Capture ELISA可以实现对诱导后的上清进行相对定量，使检测信号之间具有可比性，而且速度快，2-3天即可检测完所有的点。然后对筛选到的有pH依赖结合活性的突变点进行组合，进行二次筛选，最终获得既具有pH依赖的结合活性，而该抗原-抗体亲和力又没有明显降低的目标克隆；

(4)KD-ELISA和FACS检测：对样品进行梯度稀释后，用不同pH buffer进行KD-ELISA和FACS的检测，根据检测数据绘制的曲线，确认目标克隆在抗原表面和细胞表面靶点的pH依赖结合活性。

具体的，所述步骤(2)中，所述限制性内切酶为DpnI限制性内切酶。

具体的，所述步骤(2)中，所述诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。

具体的，所述步骤(3)中，所述标签为Fc标签。

优选的，所述步骤(3)中，所述标签为mFc或hFc标签。

具体的，所述步骤(3)中，所述大肠杆菌为BL21大肠杆菌。

优选的，所述步骤(3)中，孵育条件为37℃孵育1小时。

优选的，所述步骤(3)中，缓冲溶液为PBS缓冲溶液。

在一种具体的实施方式中，所述方法还包括：后续利用筛选出的条件，对诱导后的突变体上清进行筛选。

在一种具体的实施方式中，所述方法还包括：采用Capture-ELISA对诱导后的突变体表达上清进行相对定量检测。

在一种具体的实施方式中，所述方法还包括：根据筛选出的条件进行标签抗体包被和筛选，获得具有pH依赖结合信号的单点突变克隆；选取对pH敏感的突变点，再进行组合突变，随后利用Capture-ELISA进行再次筛选，获得最终的具有pH依赖结合活性，且抗原-抗体亲和力没有明显降低的克隆。

为了加快研发速度并减少成本，本发明采用了更快速的筛选手段：Capture-ELISA是一种对微量物质(如激素、细胞信号化学物质、抗原和细胞因子等)进行皮克到微克定量的敏感检测方法。通过对单链抗体(single-chain variable fragment,scFv)CDR区单个的氨基酸进行组氨酸突变扫描后，直接用大肠杆菌表达上清，建立了专门针对这种微小pH区别的ELISA方法，在不同pH条件下比较scFv结合活性，不需要预纯化或富集。

因为未经纯化的抗体上清pH不一致，会受大肠杆菌培养条件和分泌物的影响，实验中本发明通过不同的buffer组合去保证实验的稳定性，即使不做任何纯化的情况下也能精确控制上清和周质中抗体所在的pH，保证了实验的通量和稳定性，加快了实验周期；获得了单点组氨酸突变的信息后，本发明组合了一些对pH敏感的突变点，再次建立快速的Capture-ELISA方法进行筛选，每一次都会建立新的Capture-ELISA条件(对包被浓度，抗原量等优化)，保证实验的灵敏度和稳定性。

对抗体进行pH依赖结合活性的改造方法中，现有大部分实验室利用建模分析潜在具有pH依赖活性的位点进行组氨酸突变，细胞转染和纯化后进行pH依赖的结合筛选，存在突变位点通量低，细胞转染和纯化工作量大的缺点。而本发明基于scFv片段进行组氨酸扫描，涵盖了6个CDR区的所有位点，同时结合Capture-ELISA进行快速筛选，3天即可完成筛选，不需要进行样品的表达和纯化，用大肠杆菌诱导的可溶性scFv抗体即可。通量高，成本低。

本发明提供的对抗体pH依赖结合活性的改造及筛选方法，利用组氨酸点扫描和Capture-ELISA的技术可以快速和成功地对scFv抗体进行pH依赖结合活性的改造，能够很好地获得具有pH依赖活性的抗体，可以高灵敏度地区分很小的pH区别，是一个高通量和有效的抗体改造方法，可以被应用到所有的条件依赖抗体(scFv，Fab，VHH等)的改造中去。

本发明提供的一种快速的pH依赖结合活性的改造及筛选方法，相比其他研究者的改造方法有以下优点：

(1)可以直接利用原核表达系统，培养周期短，成本低，易操作。

(2)建立精准Capture-ELISA筛选的方法，省去蛋白纯化，富集的繁琐步骤，减少了成本，增加了通量。

(3)该方法得到了验证，最后获得的克隆在IgG形式仍然保持很好的pH依赖结合活性。

附图说明

图1为对抗体pH依赖结合活性的改造及筛选的方法的流程图。

图2为对scFv抗体pH依赖结合活性的改造示例1的结果图；其中，亲和力在pH 7.4远大于在pH 5.5。

图3为对scFv抗体pH依赖结合活性的改造示例2的结果图；其中，亲和力在pH 6.5远大于在pH 7.4。

图4为单点突变后scFv样品的Capture-ELISA筛选的结果图；其中，样品1～9，11，23，27～29等具有明显的pH依赖结合活性，而野生型样品(WT)不具有pH依赖结合活性。

图5为组合突变后scFv样品的Capture-ELISA筛选的结果图；其中，样品42，43，46，47,48,51～55，58～65等具有明显的pH依赖结合活性。

图6为通过KD-ELISA确认最终克隆具有pH依赖结合活性的结果图；图中只展示部分实验数据，其中，突变体克隆(Lead clone)1～4在KD-ELSIA实验中呈现较好的pH依赖结合活性，而野生型样品(WT)没有呈现pH依赖结合活性。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1.对不具有pH依赖结合活性的scFv进行改造，使其在pH6.5的结合大于在pH7.4

1.首先构建该野生型抗体scFv原核表达质粒模板。

2.抗原抗体结合孵育buffer的确定

为了保证大肠杆菌表达的未经纯化的抗体在实验中保持所要的pH条件，通过筛选了不同的结合buffer，经过不同盐浓度的buffer，不同比例与大肠杆菌表上清混合和pH测定，最终选择了0.2M PB buffer(100ml配方如下)，1:1与上清混合。

PH	0.2mol/L NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>(ml)	0.2mol/L Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>(ml)
			6.0	87.7	12.3
6.5	68.5	31.5
			7.4	19	81

Capture-ELISA，KD-ELISA洗涤缓冲液为1X PBS磷酸盐缓冲液。需要先配制10*PBS缓冲液母液，组分如下表所示：

无机盐组分	分子量	浓度(mg/L)	mM
				磷酸二氢钾(KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>)	136	1440	10.58824
氯化钠(NaCl)	58	90000	1551.724
				磷酸氢二钠(Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>-7H<sub>2</sub>O)	268	7950	29.66418

将母液稀释成1X PBS，用4M Na₂HPO₄调pH值至pH6.5或pH7.4，然后加入TWEEN 20终浓度0.05％。

3.对该野生型scFv抗体的6个CDR区进行定点突变。

通过PCR的方法，用组氨酸替代CDR区域的每个氨基酸，然后用DpnI限制性内切酶消化质粒模板，获得突变后的PCR产物转化BL21大肠杆菌，IPTG诱导后获得可溶性scFv抗体。

4.高灵敏Capture-ELISA条件建立和筛选。首先包被不同浓度anti-cmyc标签抗体，加入诱导后的变体表达上清(用不同的PBS buffer调整pH)，37℃孵育1小时后，加入不同浓度的带有标签的抗原(用不同pH的PBS buffer稀释)，再37℃孵育1小时后，加入检测Fc的二抗(用不同pH的PBS buffer稀释),所有步骤分别在不同的pH条件下同时进行，最后在A450条件下读数。根据ELISA读值，选定最后的筛选条件(包被抗体浓度，缓冲液盐浓度，加入抗原浓度等)，如下表所示。

表4中显示Capture-ELISA条件建立。根据ELISA结果，该抗原与抗体的结合值在包被ant-c-myc抗体浓度为1ug/ml，抗原加入浓度为2ug/ml条件下，在pH6.5和pH7.4条件下ELISA读值在一个合适的区间内(1<A450<3)，可以用该条件进行样品间亲和力相对比较。

5.诱导表达的突变克隆，获得含有可溶性抗体的周质样品，根据建立的条件进行标签抗体包被和筛选，获得具有pH依赖结合信号的单点突变克隆(图4)。图4显示单点突变后scFv样品的Capture-ELISA筛选。其中，样品1～9，11，23，27～29等具有明显的pH依赖结合活性，而野生型样品(WT)不具有pH依赖结合活性。

选取热点，再进行组合突变，随后利用Capture-ELISA进行再次筛选获得最终的具有pH依赖结合活性，且抗原-抗体亲和力没有明显降低的克隆，后续进行pH依赖结合活性的确认(图5)。图5显示组合突变后scFv样品的Capture-ELISA筛选。其中，样品42，43，46，47,48,51～55，58～65等具有明显的pH依赖结合活性。

综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。