一种从山橿中提取银松素的提取方法及其应用
阅读说明：本技术 一种从山橿中提取银松素的提取方法及其应用 (Extraction method for extracting pinosylvin from lindera reflexa hemsl and application of extraction method ) 是由 陈随清 段懿哲 付宇航 孙孝亚 于 2021-07-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及从山橿中提取银松素的提取方法及其应用,可有效解决幽门螺杆菌的治疗用药问题,其解决的技术方案是,提取方法包括以下步骤：1)提取山橿提取物溶液；2)提取山橿总黄酮部位；3)提取银松素；本发明为探索山橿中发挥抑制幽门螺杆菌的有效成分,分离提取得到山橿中主要的化合物,并进行抑菌实验,得到对幽门螺杆菌有较好抑制作用的活性成分银松素,是从山橿中提取银松素的提取方法及其应用上的创新。(The invention relates to an extraction method for extracting pinosylvin from lindera reflexa hemsl and application thereof, which can effectively solve the problem of treatment medication of helicobacter pylori and adopts the technical scheme that the extraction method comprises the following steps: 1) extracting a lindera reflexa hemsl extract solution; 2) extracting total flavone part of lindera reflexa Hemsl; 3) extracting pinosylvin; the invention provides an extraction method for extracting pinosylvin from lindera reflexa Hemsl and innovation on application thereof, which aims to explore effective components in lindera reflexa Hemsl for inhibiting helicobacter pylori, separate and extract main compounds in lindera reflexa Hemsl, and perform an antibacterial experiment to obtain the active component pinosylvin with a good inhibition effect on helicobacter pylori.)
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是一种从山橿中提取银松素的提取方法及其应用。
背景技术
山橿(Lindera reflexa Hemsl.)，系樟科(Lauraceae)山胡椒属植物，落叶灌木或小乔木，常生长于山坡林下或灌丛中，在河南大别山地区、湖北、湖南、安徽、江西、贵州、浙江等地均有分布。山橿在河南民间有悠久的使用历史，常用于治疗慢性胃炎、胃溃疡等胃部疾病，并被收载于《河南省中药材标准》(1993年版)。目前对山橿的研究主要有化学成分的分离提取、有效成分的筛选及药理活性研究等，其中发现了山橿总黄酮是其主要的活性部位，具有镇痛、抗炎、抗氧化等作用。
幽门螺杆菌为革兰氏阴性螺旋状细菌，1982年澳大利亚学者Barry Marshall和Robin Warren首先在人体胃中发现了这种细菌，此后人们对幽门螺杆菌进行了长达几十年的研究，它是目前人类发现在胃中存活的唯一微生物种类，世界卫生组织在1994年把幽门螺杆菌定为Ⅰ类致癌因子，并且在全球内约有50％的人感染了幽门螺杆菌，由于抗生素的滥用，单独的抗生素类药物如克拉霉素、甲硝唑等已不能根除胃中的幽门螺杆菌，荟萃分析结果显示，我国标准三联方案(质子泵抑制剂加两种抗生素)的幽门螺杆菌根除率已低于80％，现常用四联疗法(质子泵抑制剂加两种抗生素和铋剂)来治疗幽门螺杆菌。随着幽门螺杆菌对抗生素耐药性的逐年增加，现寻找新的安全有效的抗幽门螺杆菌药物具有重大意义。
实验发现山橿对幽门螺杆菌有一定的抑制作用，但是仅局限于石油醚部位、水部位、生物碱部位、正丁醇部位等粗分的部位，并未对有效的活性成分进行筛选，所以对发挥抑制作用的成分暂不明确，有待研究的发现，探明山橿发挥疗效的关键成分，以及如何将山橿的药用价值发挥到最大，同时为治疗幽门螺杆菌提供新的治疗方案，是本领域技术人所关心的主要问题。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种从山橿中提取银松素的提取方法及其应用，可有效解决幽门螺杆菌的治疗用药问题。
本发明解决的技术方案是，银松素(反-3,5-二羟基二苯乙烯)的结构式为：
提取方法包括以下步骤：
1)提取山橿提取物溶液
取粉碎的山橿药材，分别以山橿12倍量的体积浓度为70％乙醇超声提取3次，每次1h，合并三次提取液，减压浓缩得浓缩液，浓缩液加水稀释成相当于每1mL含生药0.05mg(0.05mg/mL生药)的山橿提取物溶液，备用；
2)提取山橿总黄酮部位
用体积浓度95％乙醇浸泡大孔吸附树脂过夜，再使用蒸馏水梯度洗脱至无醇味后，湿法装柱，取山橿提取物溶液进行装柱，首先使用蒸馏水洗脱杂质，再使用4倍量大孔吸附树脂体积，浓度70％的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩并干燥得到山橿总黄酮部位；
3)提取银松素
取干燥的山橿总黄酮部位0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100ml，称定重量，超声10min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，续滤液装柱，即得。
所述的装柱色谱条件为：YMC-Pack ODS-A色谱柱(250×20mml.D.S-5μm,12nm)，流动相甲醇(A)-水(B)梯度洗脱(0～35min，80％～85％A；35～45min，85％～100％A；45～55min，100％A；55～60min，100～80％A；60～65min，80％A)，检测波长297nm，流速7mL/min，进样量500μL，收集保留时间为11.535min的色谱峰，减压浓缩、干燥即可得到银松素。
本发明为探索山橿中发挥抑制幽门螺杆菌的有效成分，分离提取得到山橿中主要的化合物，并进行抑菌实验，得到对幽门螺杆菌有较好抑制作用的活性成分银松素，是从山橿中提取银松素的提取方法及其应用上的创新。
附图说明
图1为本发明山橿总黄酮提取物部位液相色谱图。
图2为本发明银松素的1H-NMR(inMeOD 500M)图。
图3为本发明银松素的1C-NMR(inMeOD 500M)图。
图4为本发明的尿素酶活性-吸光度标准曲线图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1
本发明在具体实施时，提取方法包括以下步骤：
1)提取山橿提取物溶液
取粉碎的山橿药材20g，分别以山橿12倍量的体积浓度为70％乙醇超声提取3次，每次1h，合并三次提取液，减压浓缩得浓缩液，浓缩液加水稀释成相当于每1mL含生药0.05mg(0.05mg/mL生药)的山橿提取物溶液，备用；
2)提取山橿总黄酮部位
用体积浓度95％乙醇浸泡大孔吸附树脂过夜，再使用蒸馏水梯度洗脱至无醇味后，湿法装柱，取山橿提取物溶液进行装柱，首先使用蒸馏水洗脱杂质，再使用4倍量大孔吸附树脂体积，浓度70％的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩并干燥得到山橿总黄酮部位；
3)提取银松素
取干燥的山橿总黄酮部位0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100ml，称定重量，超声10min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，续滤液装柱，即得。
本发明分离提取得到山橿中的化合物银松素，经抑菌实验，证明对幽门螺杆菌有较好的抑制作用，相关试验资料如下：
1.银松素的抑菌实验：
1.1.实验材料：
幽门螺杆菌(ATCC 43504)购于广东省微生物菌种保藏中心。脱纤维绵羊血和胎牛血清均购于Solarbio，哥伦比亚琼脂粉和脑心浸液粉均购于OXOID，尿素酶购于上海源叶生物科技有限公司，其余化学试剂均为分析纯。
1.2实验内容：
1.2.1山橿对幽门螺杆菌抑制实验
称取适量哥伦比亚琼脂粉和脑心浸液粉，溶解于双蒸水中，121℃高压灭菌15min，待其自然冷却至45℃左右时，迅速加入适量无菌脱纤维绵羊血，混匀并趁热倒入无菌培养皿，分装。
使用比浊管调节菌浓度为0.5(细菌浓度约为1.5×108/mL)，吸取适量菌液在培养皿表面，并均匀涂布。将用二甲基亚砜(DMSO)溶解的山橿提取物、银松素和克拉霉素药液分别滴加在空白无菌药敏纸片上(直径6mm)，制成含药纸片，将含药纸片贴在已涂布均匀菌液的培养基表面，在37℃，5％O2，15％CO2，80％N2厌氧工作站中培养48～72h。测量抑菌圈直径。
1.2.2山橿对幽门螺杆菌尿素酶活性的影响：
Berthelot显色液的配置：A液：精密称取0.2892g亚硝基铁氰化钠和11.2073g水杨酸钠，溶解于100mL PBS-EDTA缓冲液中，4℃避光保存备用。B液：精密称取18.0003g氢氧化钠，溶解于90mL PBS-EDTA缓冲液中，再加入24mL次氯酸钠混匀，4℃避光保存备用。
巨豆尿素酶活性标准曲线的建立：取5个离心管，分别加入不同浓度的100μL巨豆尿素酶溶液(0.128、0.064、0.032、0.016、0.008U/mL)和100μL尿素溶液(50mM)，震荡混匀，室温避光反应20min，立即依次加入100μL Berthelot显色液A液和100μL Berthelot显色液B液，震荡混匀，室温避光放置10min显色。分别吸取250μL混合液，转移到96孔板中，在635nm波长下检测吸光度。以吸光度为纵坐标，酶活性(U/mL)为横坐标作图，绘制巨豆尿素酶活性的标准曲线。
调节菌液浊度为3～4(细菌浓度约为1×109/mL)，移液枪吸取0.5mL菌液，转移至10mL离心管中，加入4.5mL液体培养基混匀，再分别加入10μL山橿提取物药液、银松素、克拉霉素(阳性对照)和DMSO(空白对照)，得到含有不同药物的菌液培养基，厌氧工作站中培养1h，转移至10mL离心管中，冷冻离心(4℃，5000g，15min)，PBS缓冲液重复洗涤3次后，加入2mL PBS缓冲液，保存于-20℃冰箱中，10h后取出，室温解冻，超声波震荡冰浴3min，冷冻离心(4℃，15000g，10min)，取上清液与等体积的甘油-PBS缓冲液混合均匀，取各离心管100μL的混合液，加入100μL尿素溶液(50mM)混匀，室温避光条件下反应20min，再依次加入100μLBerthelot显色液A液和100μL Berthelot显色液B液，混匀，室温避光放置10min显色，分别吸取250μL混合液，转移到96孔板中，检测635nm波长下混合液的吸光度，通过吸光度代入标准曲线，得到药物作用下的幽门螺杆菌尿素酶活性，对比空白对照和阳性对照。
2.3实验结果
采用药敏纸片法检测不同药物对幽门螺杆菌的抑制作用，抑菌圈直径如表1所示。
表1不同药物对幽门螺杆菌的抑菌圈直径结果(n＝3)
从结果可以看出，银松素对幽门螺杆菌有较好的抑制作用。
绘制尿素酶活性-吸光度(635nm)标准曲线，反应液吸光度(Y)随尿素酶活性(X)增加而增大，表明尿素酶活性与反应液吸光度有一定的线性关系，如图4所示。Y＝6.4809X+0.5645，相关系数r＝0.9931。
尿素酶活性及相对抑制率实验结果，如表2所示。
表2尿素酶活性及相对抑制率
结果表明，以克拉霉素作为对照，山橿总黄酮提取物和银松素对尿素酶活性均有一定的抑制作用。
本发明分离提取得到山橿中化合物银松素对幽门螺杆菌有较好抑制作用，有效将山橿的药用价值发挥到最大，同时为治疗幽门螺杆菌提供了新的治疗方案，是从山橿中提取银松素的提取方法及其应用上的创新，具有良好的经济和社会效益。
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