阅读说明：本技术 一种基于褐藻胶裂解酶的褐藻胶寡糖测序方法及其应用 (Alginate oligosaccharide sequencing method based on alginate lyase and application thereof ) 是由 李福川 路丹荣 张庆冬 关靖雯 王淑敏 于 2019-10-22 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种基于褐藻胶裂解酶的褐藻胶寡糖测序方法及其应用。本发明首次建立了一种基于褐藻胶裂解酶的褐藻胶寡糖的测序方法,尤其是利用外切型褐藻胶裂解酶AlyPB2在降解多糖及寡糖底物时,是从非还原端逐个切割糖醛酸的特点,利用外切型褐藻胶裂解酶AlyPB2对褐藻胶寡糖进行部分酶切,通过凝胶过滤色谱分离制备不同聚合度的部分酶切寡糖,再利用<Sup>1</Sup>H-NMR技术对酶切产物的还原端和非还原端的糖基结构进行测定,从而简便快速的确定单一组分或聚合度均一多组分褐藻胶寡糖的精确组成和结构,该方法所需样品量较少,且大大简化了后期分析过程,彻底解决了高分子量(DP≥4)褐藻胶寡糖组分的结构鉴定问题。(The invention relates to an alginate oligosaccharide sequencing method based on alginate lyase and application thereof. The invention firstly establishes a sequencing method of alginate oligosaccharides based on alginate lyase, and particularly utilizes the characteristic that when exo-type alginate lyase AlyPB2 is used for degrading polysaccharide and oligosaccharide substrates, uronic acid is cut one by one from a non-reducing end, partial enzyme digestion is carried out on the alginate oligosaccharides by utilizing exo-type alginate lyase AlyPB2, partial enzyme digestion oligosaccharides with different polymerization degrees are prepared by gel filtration chromatography separation, and then partial enzyme digestion oligosaccharides with different polymerization degrees are utilized 1 The H-NMR technology is used for measuring the glycosyl structures of the reducing end and the non-reducing end of the enzyme digestion product, so that the accurate composition and structure of single-component or multi-component alginate-derived oligosaccharide with uniform polymerization degree can be simply, conveniently and quickly determined, the required sample amount is small, the later analysis process is greatly simplified, and the problem of structural identification of the high-molecular-weight (DP is more than or equal to 4) alginate-derived oligosaccharide component is thoroughly solved.)

一种基于褐藻胶裂解酶的褐藻胶寡糖测序方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种基于褐藻胶裂解酶的褐藻胶寡糖测序方法及其应用，属于分析化学技术领域。

背景技术

褐藻胶(alginate)是海带、马尾藻、巨藻等褐藻类植物细胞壁和胞间质中最丰富的碳水化合物，约占褐藻干重的40％。褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸(β-D-Mannuronate,M)及其C5差向异构体α-L-古罗糖醛酸(α-L-Guluronate,G)通过β-1，4糖苷键连接形成的线性阴离子酸性多糖，根据两种糖醛酸排列顺序的不同，分为聚甘露糖醛酸区段(PolyM)、聚古罗糖醛酸区段(PolyG)以及甘露糖醛酸和古罗糖醛酸交替嵌段(PolyMG/GM)。近年来，褐藻胶因高黏性，凝胶性等特点广泛应用于食品，化工，医药、纺织等行业。但褐藻胶存在分子量较大、水溶性差、难以吸收利用等缺陷导致其应用受到了很大的限制。褐藻胶寡糖是褐藻胶经降解得到的功能性寡聚物，因其稳定性强、易于吸收利用、无毒无害等优点受到了极大的关注。越来越多的报道表明褐藻胶寡糖具有多种重要的生物活性，如促进植物生长、抗肿瘤、抗凝血、抗细菌、抗氧化、调节细胞凋亡、神经炎症、血糖血脂等，有着重要的研究价值和开发潜力。

褐藻胶寡糖的制备方法主要有物理降解法、化学降解法和酶解法，酶解法是一种较常用的寡糖制备方法，具有反应条件温和、无污染、产率高、专一性强等优点。褐藻胶裂解酶是一类通过β-消去反应催化褐藻胶分子内糖苷键断裂的多糖降解酶，并在新产生的褐藻胶寡糖的非还原端形成C4＝C5不饱和双键，非还原端的不饱和糖醛酸与M和G糖单元的结构不同，称为Δ单糖。根据褐藻胶裂解酶的降解模式不同，分为内切型裂解酶和外切型裂解酶；根据褐藻胶裂解酶对底物的偏好性，可分为M专一性裂解酶、G专一性裂解酶和双功能裂解酶，不同偏好性的褐藻胶裂解酶降解褐藻胶得到的不饱和寡糖结构不同，有相关报道表明寡糖的结构与其活性有很大的相关性，例如：(1)与古罗糖醛酸寡糖相比，甘露糖醛酸寡糖能够更好地刺激细胞因子产生；另外，以甘露糖醛酸寡糖为原料制备的药物971，可用于治疗阿尔兹海默症；(2)褐藻胶寡糖的抗氧化性与其相对分子质量和M/G比例相关；(3)具有G末端的寡糖可以显著提高角质细胞的生长率。因此，制备功能性褐藻胶寡糖及鉴定其结构对褐藻胶的结构和功能关系的探索具有重要的意义。

目前，糖类结构鉴定主要采用波谱分析如质谱法和核磁共振技术等，其中核磁共振技术设备价格昂贵、所需样品量较大、分析过程复杂等问题增加了糖类结构鉴定的难度。褐藻胶裂解酶的酶解产物结构鉴定较常采用的是¹H和¹³C NMR，褐藻胶不饱和寡糖的还原端和非还原端的糖端基质子在¹H-NMR中具有特征吸收峰，因此，寡糖的还原端和非还原端糖基结构仅通过¹H-NMR即可确定。但当不饱和寡糖的分子量较大时(≥UDP4)，则需要一维和二维核磁共振技术的综合分析才能确定其结构，二维核磁共振技术所需样品量大、且二维谱解析过程对专业化知识要求较高，非核磁共振技术专业的人员解析难度较大，使分子量较大的褐藻胶寡糖的结构鉴定成为难题，对褐藻胶寡糖的构效关系研究和相关生物医药产品的开发形成巨大阻碍。

2019年，中国专利文献(申请号201910705619.5)记载了来自Photobacteriumsp.FC615的外切型褐藻胶裂解酶AlyPB2。外切型褐藻胶裂解酶AlyPB2是一种双功能裂解酶，其对polyM和polyG区段均展现出强的外切酶活性。该专利申请还记载了AlyPB2是从褐藻胶糖链的非还原端逐个切割糖醛酸。基于这些重要特征，本发明建立了一种基于褐藻胶裂解酶的的褐藻胶寡糖测序方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于褐藻胶裂解酶的褐藻胶寡糖测序方法及其应用。该方法利用外切型褐藻胶裂解酶对褐藻胶寡糖进行部分酶切，通过凝胶过滤色谱分离制备不同聚合度的褐藻胶寡糖，再利用¹H-NMR分析鉴定酶切产物的端基寡糖，从而简便快速的确定单一组分及聚合度均一的多组分褐藻胶寡糖的精确组成和结构，该方法不仅节省样品，而且大大降低了褐藻胶寡糖结构的解析难度，彻底解决了高分子量(DP≥4)褐藻胶寡糖组分的结构鉴定问题。

本发明技术方案如下：

一种基于褐藻胶裂解酶的褐藻胶寡糖测序方法，包括以下步骤：

(1)将褐藻胶寡糖用重水(D₂O)溶解，反复冷冻干燥，以完成氢氘置换，然后进行¹H-NMR分析，以确定褐藻胶寡糖还原端及非还原端的糖基结构；

(2)另取与步骤(1)同批的褐藻胶寡糖用外切型褐藻胶裂解酶部分降解，将降解产物经多次收集、分别集中后，得到不同聚合度的中间产物寡糖；所述外切型褐藻胶裂解酶为褐藻胶裂解酶AlyPB2；

(3)步骤(2)得到的中间产物寡糖反复冷冻干燥脱盐后，用重水(D₂O)溶解，反复冷冻干燥，以完成氢氘置换，并进行¹H-NMR分析，以确定各中间产物寡糖的还原端及非还原端的糖基结构，结合步骤(1)中褐藻胶寡糖的¹H-NMR结果，完成褐藻胶寡糖的糖链结构测定。

根据本发明优选的，所述褐藻胶寡糖是由β-D-1,4-甘露糖醛酸(M)和α-L-1,4-古罗糖醛酸(G)混合组成的单一组分或聚合度均一的多组分褐藻胶寡糖。

根据本发明优选的，所述褐藻胶寡糖的聚合度≥4。

本发明中，步骤(2)中所述褐藻胶裂解酶AlyPB2，来源于发光杆菌(Photobacterium sp.)FC615。褐藻胶裂解酶AlyPB2在降解多糖及寡糖底物时，是从非还原端逐个切割糖醛酸。褐藻胶裂解酶AlyPB2记载于专利申请201910705619.5中。

根据本发明优选的，步骤(3)中所述脱盐需反复冷冻干燥3次以上；进一步优选的，所述脱盐需反复冷冻干燥3～6次。

根据本发明优选的，所述氢氘置换需反复冷冻干燥3～5次；进一步优选的，所述氢氘置换需反复冷冻干燥3次。

本发明中，所述基于褐藻胶裂解酶的褐藻胶寡糖测序方法的步骤(1)和步骤(2)次序不限。

上述方法在褐藻胶寡糖的糖链结构测定中的应用。

在本发明优选的技术方案中，将褐藻胶多糖用内切型褐藻胶裂解酶进行彻底降解后，所得到的降解产物包括褐藻胶二糖、褐藻胶三糖、褐藻胶四糖、褐藻胶五糖、褐藻胶六糖，摩尔比为23:52:18.6:4:2.4；将上述酶解产物经¹H-NMR分析、褐藻胶裂解酶AlyPB2部分降解后再次进行¹H-NMR分析，完成褐藻胶寡糖的糖链结构测定；

其中，褐藻胶二糖主要为ΔG非还原性末端的二糖单元，含有少量的ΔM非还原性末端的二糖单元，ΔG非还原性末端的二糖单元和ΔM非还原性末端的二糖单元的摩尔比为：3.4:1；

褐藻胶三糖为含有ΔG、ΔM两种非还原性末端的三糖单元，ΔG非还原性末端的三糖单元与ΔM非还原性末端的三糖单元的摩尔比为：6.7:1；褐藻胶三糖的还原端末端均为G，因此，褐藻胶三糖中含有两种结构ΔGG和ΔMG，摩尔比为：6.7:1；

褐藻胶四糖为含有ΔG、ΔM两种非还原性末端的四糖单元，ΔG非还原性末端的四糖单元与ΔM非还原性末端的四糖单元的摩尔比为：1:3.2；褐藻胶四糖的还原端及最靠近还原端的糖基均为M，因此，褐藻胶四糖中含有两种结构ΔGMM和ΔMMM，摩尔比为：1:3.2；

褐藻胶五糖为含有ΔG、ΔM两种非还原性末端的五糖单元，摩尔比为：3.5:1；褐藻胶五糖糖链中央的糖单元为G和M两种，摩尔比为：1.5:1；褐藻胶五糖的还原端及最靠近还原端的糖基均为M，因此，不饱和五糖中含有四种结构ΔMMMM,ΔMGMM,ΔGMMM和ΔGGMM，摩尔比为：1:1.5:3.5:5.25；

褐藻胶六糖为含有ΔG、ΔM两种非还原性末端的六糖单元，摩尔比为：1.6:1；褐藻胶六糖均为M还原端末端。

本发明的技术特点：

本发明中，褐藻胶寡糖(UDPn，n≥4)经¹H-NMR分析可确定褐藻胶寡糖还原端及非还原端的糖基结构；褐藻胶寡糖(UDPn)经褐藻胶裂解酶AlyPB2部分降解后，得到中间产物寡糖UDP(n-1)、UDP(n-2)······UDP3、UDP2，将上述中间产物寡糖UDP(n-1)、UDP(n-2)······UDP3经¹H-NMR分析可确定中间产物寡糖还原端及非还原端的糖基结构，结合褐藻胶寡糖(UDPn)的¹H-NMR分析结果，可确定褐藻胶寡糖的糖链结构。

有益效果

本发明首次建立了一种基于褐藻胶裂解酶的褐藻胶寡糖的测序方法，尤其是利用外切型褐藻胶裂解酶AlyPB2在降解多糖及寡糖底物时，是从非还原端逐个切割糖醛酸的特点，利用外切型褐藻胶裂解酶AlyPB2对褐藻胶寡糖进行部分酶切，通过凝胶过滤色谱分离制备不同聚合度的部分酶切寡糖，再利用¹H-NMR技术对酶切产物的还原端和非还原端的糖基结构进行测定，从而简便快速的确定单一组分或聚合度均一多组分褐藻胶寡糖的精确组成和结构，该方法所需样品量较少，且大大简化了后期分析过程，彻底解决了高分子量(DP≥4)褐藻胶寡糖组分的结构鉴定问题，对褐藻胶寡糖的结构和功能关系的研究具有重要的意义。

附图说明

图1是基于外切型褐藻胶裂解酶AlyPB2的褐藻胶寡糖测序方法原理示意图；

图2是褐藻胶二糖和褐藻胶三糖的¹H-NMR图谱；图中，UDP2为褐藻胶二糖，UDP3为褐藻胶三糖；

图3是褐藻胶四糖的¹H-NMR图谱；图中，UDP4为褐藻胶四糖；

图4是褐藻胶四糖的AlyPB2降解中间产物寡糖褐藻胶三糖的¹H-NMR图谱；图中，UDP3-UDP4为褐藻胶四糖的中间产物寡糖褐藻胶三糖；

图5是褐藻胶五糖的¹H-NMR图谱；图中，UDP5为褐藻胶五糖；

图6是褐藻胶五糖的AlyPB2降解中间产物寡糖的¹H-NMR图谱；图中，UDP3-UDP5为褐藻胶五糖的中间产物寡糖褐藻胶三糖，UDP4-UDP5为褐藻胶五糖的中间产物寡糖褐藻胶四糖。

具体实施方式

以下实施例的阐述，是为了全面公开本发明如何实施的一些常用技术，而不是为了限制本发明的应用范围。发明人已经尽最大努力确保实施例中各参数的准确性(例如量，温度，等等)，但是一些实验误差和偏差也应该予以考虑。除非另有说明，本发明中分子量是指平均分子量，温度是指摄氏度。

实施例中涉及到的褐藻胶裂解酶AlyPB2是经过目的基因扩增、构建含有目的基因的重组载体、转化基因工程菌、诱导表达后得到的，褐藻胶裂解酶AlyPB2的目的基因源自发光杆菌(Photobacterium sp.)FC615，发光杆菌(Photobacterium sp.)FC615，2018年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.16918。该菌株已经在专利申请201910002912.5中公开过，故本专利申请不涉及微生物保藏。另外褐藻胶裂解酶AlyPB2的基因序列记载于专利申请201910705619.5中。

实施例中涉及的内切型褐藻胶裂解酶可为普通市售产品，而本实施例中使用的内切型褐藻胶裂解酶为褐藻胶裂解酶AlyPB1，记载于专利申请201910705619.5中。

实施例中利用¹H-NMR测定褐藻胶寡糖还原端和非还原端糖基结构时的条件如下：

核磁共振谱仪JNM-ECP600(JEOL,Japan)，600MHz，30℃。

本发明中，基于褐藻胶裂解酶的褐藻胶寡糖的测序方法的原理示意图如图1所示，褐藻胶寡糖(UDPn，n≥4)经¹H-NMR分析可确定褐藻胶寡糖还原端及非还原端的糖基结构；褐藻胶寡糖(UDPn)经褐藻胶裂解酶AlyPB2部分降解后，得到中间产物寡糖UDP(n-1)、UDP(n-2)······UDP3、UDP2，将上述中间产物寡糖UDP(n-1)、UDP(n-2)······UDP3经¹H-NMR分析可确定中间产物寡糖还原端及非还原端的糖基结构，所有中间产物寡糖的¹H-NMR分析结果相互结合可准确测定褐藻胶寡糖UDP(n-1)自非还原端到还原端的糖基结构，再结合褐藻胶寡糖(UDPn)的¹H-NMR分析结果，即可确定褐藻胶寡糖的糖链结构。

实施例1、褐藻胶寡糖的制备

将质量浓度为1％的褐藻胶多糖、150mM pH8.0的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液、内切型褐藻胶裂解酶液以及去离子水按照10:10:3:7(体积比)的比例混合后，在30℃条件下进行彻底降解，样品分批过分子凝胶柱TUBE CPL RK16/100(凝胶填料Superdex^TM 30prepgrade)，并根据出峰时间分别收集褐藻胶二糖(UDP2)，褐藻胶三糖(UDP3)，褐藻胶四糖(UDP4)，褐藻胶五糖(UDP5)和褐藻胶六糖(UDP6)，摩尔比为23:52:18.6:4:2.4。

其中褐藻胶多糖是由β-D-1,4-甘露糖醛酸(M)和α-L-1,4-古罗糖醛酸(G)混合组成的。

上述制备得到的褐藻胶二糖和褐藻胶三糖通过¹H-NMR技术即可分析出其化学结构及特征，将收集的褐藻胶二糖和褐藻胶三糖经过反复冻干三次以上除去碳酸氢铵盐，用重水(D₂O)溶解，反复冷冻干燥，以完成氢氘置换，并进行¹H-NMR分析，最终确定褐藻胶二糖和褐藻胶三糖的化学结构及特征。

褐藻胶二糖和褐藻胶三糖的¹H-NMR图谱如图2所示：

(1)UDP2的¹H-NMR图谱显示，5.71ppm、5.61ppm处有特征性化学位移值，表明褐藻胶二糖(UDP2)的非还原性末端有两种类型：ΔG和ΔM，从峰面积可知ΔG非还原性末端的二糖单元和ΔM非还原性末端的二糖单元的摩尔比为3.4:1；

(2)UDP3的¹H-NMR图谱显示，5.67ppm、5.56ppm处有特征性化学位移值，表明褐藻胶三糖(UDP3)的非还原端有两种类型：ΔG和ΔM，从峰面积可知ΔG非还原性末端的三糖单元与ΔM非还原性末端的三糖单元的摩尔比为6.7:1，另外，UDP3在4.71ppm处的有一个特征双峰，且耦合常数为8.4Hz，表明UDP3的还原端是G，因此UDP3中有两种结构：ΔGG和ΔMG，两者的摩尔比为6.7:1。

除上述褐藻胶二糖和褐藻胶三糖的糖链结构可直接利用¹H-NMR技术，确定褐藻胶寡糖糖链的非还原端和还原端的糖基结构，完成糖链结构的测定，褐藻胶四糖、褐藻胶五糖、褐藻胶六糖除还原端和非还原端的糖基外，糖链中还含有其他糖基，无法应用¹H-NMR技术直接测定。

实施例2、基于褐藻胶裂解酶AlyPB2进行褐藻胶四糖的糖链结构测定

(1)将实施例1制备得到的褐藻胶四糖(UDP4)经过反复冷冻干燥三次以上除去碳酸氢铵盐，用重水(D₂O)溶解，反复冷冻干燥，以完成氢氘置换，然后进行¹H-NMR分析，以确定褐藻胶四糖非还原端和还原端的糖基结构；

褐藻胶四糖的¹H-NMR图谱如图3所示，5.67ppm、5.56ppm处有特征性化学位移值，表明褐藻胶四糖(UDP4)的非还原端有两种类型：ΔG和ΔM，从峰面积可知两者的摩尔比为1:3.2，另外，UDP4在4.71ppm处的有一个特征单峰，表明UDP4的还原端是M，但是UDP4糖链中间位置的糖基结构仍然无法确定，UDP4的结构表示为ΔGXM和ΔMXM；

(2)褐藻胶四糖的部分降解：将质量浓度为1％的UDP4、150mM pH8.0的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液、外切型褐藻胶裂解酶AlyPB2酶液以及去离子水按照10:10:3:7(体积比)的比例混合后，在20℃条件下反应5min，样品分批过分子凝胶柱Superdex Peptide10/300GL(GE公司)，并根据出峰时间将降解产物经多次收集、分别集中后得到UDP4的中间产物寡糖褐藻胶三糖UDP3-UDP4(ΔXM)；

(3)将步骤(2)得到的中间产物寡糖褐藻胶三糖UDP3-UDP4(ΔXM)经过反复冷冻干燥三次以上除去碳酸氢铵盐，用重水(D₂O)溶解，反复冷冻干燥，以完成氢氘置换，并进行¹H-NMR分析，以确定中间产物寡糖褐藻胶三糖UDP3-UDP4(ΔXM)的还原端及非还原端的糖基结构，结合步骤(1)中褐藻胶四糖的¹H-NMR结果，完成褐藻胶四糖的糖链结构测定；

中间产物寡糖褐藻胶三糖UDP3-UDP4(ΔXM)的¹H-NMR图谱如图4所示，5.56ppm处有特征性化学位移值，表明UDP4的中间产物寡糖UDP3-UDP4(ΔXM)的非还原端均为ΔM糖单元，结合UDP4的¹H-NMR结果，UDP4包括两种结构：ΔGMM和ΔMMM，两者的摩尔比为1:3.2。

实施例3、基于褐藻胶裂解酶AlyPB2进行褐藻胶五糖的糖链结构测定

(1)将实施例1制备得到的褐藻胶五糖(UDP5)经过反复冷冻干燥三次以上除去碳酸氢铵盐，用重水(D₂O)溶解，反复冷冻干燥，以完成氢氘置换，然后进行¹H-NMR分析，以确定褐藻胶五糖非还原端和还原端的糖基结构；

褐藻胶五糖的¹H-NMR图谱如图5所示，5.67ppm、5.56ppm处有特征性化学位移值，表明褐藻胶五糖(UDP5)的非还原端有两种类型：ΔG和ΔM，从峰面积可知两者的摩尔比为3.5:1；另外，UDP5在4.71ppm处的有一个特征单峰，表明UDP5的还原端是M，但是UDP5糖链中间位置的两个糖基结构仍然无法确定，UDP5的结构表示为ΔGXXM和ΔMXXM；

(2)褐藻胶五糖的部分降解：将质量浓度为1％的UDP5、150mM pH8.0的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液、外切型褐藻胶裂解酶AlyPB2酶液以及去离子水按照10:10:3:7(体积比)的比例混合后，在20℃条件下反应5min，样品分批过分子凝胶柱Superdex Peptide10/300GL(GE公司)，并根据出峰时间将降解产物经多次收集、分别集中后得到UDP5的中间产物寡糖褐藻胶四糖UDP4-UDP5(ΔXXM)和褐藻胶三糖UDP3-UDP5(ΔXM)；

(3)将步骤(2)得到的中间产物寡糖藻胶四糖UDP4-UDP5(ΔXXM)和褐藻胶三糖UDP3-UDP5(ΔXM)经过反复冷冻干燥三次以上除去碳酸氢铵盐，用重水(D₂O)溶解，反复冷冻干燥，以完成氢氘置换，并进行¹H-NMR分析，以确定中间产物寡糖褐藻胶四糖UDP4-UDP5(ΔXXM)和褐藻胶三糖UDP3-UDP5(ΔXM)的还原端及非还原端的糖基结构，结合步骤(1)中褐藻胶五糖的¹H-NMR结果，完成褐藻胶五糖的糖链结构测定；

中间产物寡糖褐藻胶四糖UDP4-UDP5(ΔXXM)和褐藻胶三糖UDP3-UDP5(ΔXM)的¹H-NMR图谱如图6所示：UDP4-UDP5(ΔXXM)的¹H-NMR图谱显示，5.67ppm、5.56ppm处有特征性化学位移值，表明UDP5的中间产物寡糖UDP4-UDP5(ΔXXM)的非还原端有两种类型：ΔG和ΔM，两者的摩尔比为1.5:1；另外，UDP3-UDP5(ΔXM)的¹H-NMR图谱显示，5.56ppm处有特征性化学位移值，表明UDP5的中间产物寡糖UDP3-UDP5(ΔXM)的非还原端均为ΔM糖单元，结合UDP5的¹H-NMR结果，UDP5包括四种结构：ΔMMMM,ΔMGMM,ΔGMMM和ΔGGMM，摩尔比为1:1.5:3.5:5.25。