阅读说明：本技术 双阴性b细胞与调节性b10细胞在制备自身免疫性疾病诊断试剂中的应用 (Application of double negative B cell and regulatory B10 cell in preparation of autoimmune disease diagnostic reagent ) 是由 胡凡磊 栗占国 郑茜 方翔宇 贾园 于 2019-11-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了双阴性B细胞与调节性B10细胞在制备自身免疫性疾病诊断试剂中的应用,该应用中,所述诊断试剂能分别检测病患的双阴性B细胞含量和调节性B10细胞含量。双阴性B细胞：调节性B10细胞比值在正常人和自身免疫病患者中存在明显差别,这种差别能够用于对自身免疫性疾病进行诊断。这两种细胞的检测,只需要通过外周血取样,用流式细胞术即可,判断其比例以及计算比值也十分简单方便；此外,通过设定cut-off值(ROC曲线分析推荐值),可保证较高的准确率,无需结合其他标志物进行综合判断即可确定自身免疫病,对于自身免疫病的诊断和药物治疗效果都能有很好的指示,更有利于临床应用。(The invention discloses application of double negative B cells and regulatory B10 cells in preparation of an autoimmune disease diagnostic reagent, wherein in the application, the diagnostic reagent can be used for respectively detecting the content of double negative B cells and the content of regulatory B10 cells of a patient. Double negative B cells: the regulatory B10 cell ratio is clearly different in normal humans and autoimmune patients, and this difference can be used to diagnose autoimmune diseases. The detection of the two cells only needs to sample peripheral blood and use flow cytometry, and the proportion is judged and the ratio is calculated very simply and conveniently; in addition, by setting a cut-off value (ROC curve analysis recommended value), higher accuracy can be ensured, the autoimmune disease can be determined without being comprehensively judged by combining other markers, good indication can be provided for diagnosis and drug treatment effect of the autoimmune disease, and clinical application is facilitated.)

双阴性B细胞与调节性B10细胞在制备自身免疫性疾病诊断试 剂中的应用

技术领域

本发明涉及疾病诊断技术领域，具体涉及双阴性B细胞与调节性B10细胞在制备自身免疫性疾病诊断试剂中的应用。

背景技术

自身免疫性疾病(AID)是多种因素引起机体免疫功能紊乱，导致机体对自身抗原发生免疫反应使得自身组织损害所引起的疾病。AID具体又可细分为100 多种疾病，目前尚无有效的治愈手段，然而及时、正规的治疗可以明显改善症状、延缓病情进展，因此对该类疾病的诊断至关重要。

AID疾病中最常见的是类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)、干燥综合征(Sjogren syndrome， SS)、硬皮病(scleroderma)、原发性血小板紫癜(Idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP)、自身免疫性溶血性贫血(Autoimmune hemolytic anemia，AIHA) 等，其中类风湿关节炎、系统性红斑狼疮和干燥综合征的患病人群居于前列。

关于上述三种疾病的诊断，仍然存在灵敏度低、特异性不佳的问题，通常一个指标的检测结果需要再结合其他指标的检测结果来共同判断得出结论。

AID疾病是由于机体免疫功能失衡导致产生攻击自身组织的自身抗体引起的，换而言之，是一种自身免疫稳态被打破的病理状态，最大的特点就是免疫失衡。长期以来，AID疾病中免疫失衡的相关研究主要集中在T细胞，例如辅助性Th17细胞、滤泡辅助性T细胞(Tfh)，调节性T细胞(Treg)等。关于B细胞在AID致病过程中的作用研究主要集中在自身抗体产生等病理过程，对于其免疫失衡尚缺乏系统研究。

发明内容

目前对于B细胞与免疫性疾病的关系，多集中在单独的病理过程，并无联合诊断的内容。

申请人在研究过程中发现，双阴性B细胞在类风湿关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)等自身免疫病中明显扩增。更为重要的是，在这些疾病中，双阴性B细胞：调节性B10细胞比值明显增大(与正常人和骨关节炎的双阴性B细胞：调节性B10细胞比值相比)。治疗后，双阴性B细胞：调节性B10细胞比值恢复正常。显示通过检测双阴性B细胞和调节性B10细胞并计算其比值可以作为诊断自身免疫性疾病的有效方法。

基于上述研究结论，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了双阴性B细胞与调节性B10细胞在制备自身免疫性疾病诊断试剂中的应用，所述诊断试剂能分别检测病患的双阴性B细胞含量和调节性B10 细胞含量，从而进一步计算其比值。

通过检测其含量，并且计算双阴性B细胞：调节性B10细胞比值，即可判断是否为自身免疫性疾病，十分方便。

其中，双阴性B细胞是指在进行免疫球蛋白类型转换的B细胞中，同时缺乏IgD和记忆细胞标志物CD27的一群细胞，具有产生自身抗体的潜能。调节性 B10细胞是一群以CD19⁺CD24^hiCD27⁺为标志的细胞，具有免疫调节功能。两者比值失衡与AID发病有直接相关性。所述的比值失衡，是指与正常人的双阴性B 细胞和调节性B10细胞比值相比，例如，可选的cutoff值＝0.8068(大于该值则诊断为阳性)。

可选或优选的，上述应用中，所述自身免疫性疾病为类风湿关节炎、系统性红斑狼疮和干燥综合征中的至少一种。二者比例失衡的结果能够较为准确地判定是上述疾病，但对于上述疾病的具体种类无法再进一步区分。

可选或优选的，上述应用中，所述诊断试剂为能检测双阴性B细胞的抗体和能检测调节性B10细胞的抗体。抗体检测结果能够精确计算比较双阴性B细胞：调节性B10细胞的比值。

可选或优选的，上述应用中，所述诊断试剂的检测对象为人的外周血。对待检测者损伤小。

本发明还提供了一种自身免疫性疾病诊断试剂，包括用于检测双阴性B细胞的抗体和用于检测调节性B细胞的抗体。

可选或优选的，上述诊断试剂中，所述抗体为用于检测双阴性B细胞的荧光标记的：抗人CD19、抗人CD3、抗人CD27和抗人IgD，以及用于检测调节性B10细胞的荧光标记的：抗人CD19、抗人CD3、抗人CD24和抗人CD27；双阴性B细胞的荧光标记与调节性B10细胞的荧光标记搭配以后能够同时区分出双阴性B细胞和调节性B10细胞。

可选或优选的，上述诊断试剂中，所述抗体为用于检测双阴性B细胞的 CD19-APC/Cy7、CD3-PerCP/Cy5.5、CD27-APC和IgD-Pacific Blue，以及用于检测调节性B10细胞的CD19-APC/Cy7、CD3-PerCP/Cy5.5、CD24-FITC和 CD27-APC。

可选或优选的，上述诊断试剂中，还包括正常人双阴性B细胞和调节性B 细胞含量比值参考范围。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

双阴性B细胞：调节性B10细胞比值在正常人和自身免疫病患者中存在明显差别，而且只需要通过外周血取样，用流式细胞术即可判断其比例，计算比值，检测起来十分简单方便；此外，通过设定cut-off值(ROC曲线分析推荐值)，可保证较高的准确率，无需结合其他标志物进行综合判断即可确定自身免疫病，对于自身免疫病的诊断和药物治疗效果都能有很好的指示，更有利于临床应用。

附图说明

图1为实施例中双阴性B细胞和调节性B10细胞的圈门策略；

图2为实施例中正常人(HC)与自身免疫病患者(RA、SLE、SS)及疾病对照骨关节炎(OA)患者外周血中双阴性B细胞和调节性B10细胞的流式结果代表性示意图；

图3为实施例中正常人(HC)与自身免疫病患者(RA、SLE、SS)及疾病对照骨关节炎(OA)患者外周血中双阴性B细胞和调节性B10细胞比值的统计结果散点图；

图4为实施例中RA患者治疗前后外周血中双阴性B细胞和调节性B10细胞及其比值的流式结果代表性示意图及统计结果散点图；

图5为ROC曲线图，RA、SLE、SS归类为疾病组，HC和OA归类为对照组；

上述图中，DNB cells表示双阴性B细胞，B10 cells表示调节性B10细胞。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细地解释和说明，以使本技术领域的人员更好地理解本发明方案。

以下实施例中，除特殊说明外，所使用的生物材料及试剂均为市售商品或可以根据常规技术手段配制，试验方法也均为本领域常规技术。

实施例1

收集医院住院患者外周血样本：用EDTA(乙二胺四乙酸)抗凝的采血管采集2mL静脉血。

取200μL全血于流式管(BD)中，加入以下流式抗体各3μL：CD19-APC/Cy7、 CD3-PerCP/Cy5.5、CD24-FITC、CD27-APC、IgD-Pacific Blue(均购自 eBioscience/Biolegend公司)。振荡混匀后，室温避光孵育15min，振荡混匀，再室温避光孵育15min。

加2mL裂红液，混匀，室温避光孵育10min。裂红液的配制方法如下：1 mL 10×FCMLysing solution(联科生物)加9mL ddH₂O，混匀。

离心1800rpm×5min，弃上清，加2mL PBS重悬细胞。

离心1800rpm×5min，弃上清，加200μL固定液重悬细胞，上流式细胞仪检测。

本实施例共检测77例类风湿关节炎(RA)、12例系统性红斑狼疮(SLE)、 29例干燥综合征(SS)、32例骨关节炎(OA)、56例正常人以及14例生物制剂治疗后的RA外周血中的双阴性B细胞含量、调节性B10细胞含量。并分别计算每个个体的双阴性B细胞与调节性B10细胞的比值。

双阴性B细胞和调节性B10细胞的圈门策略如附图1所示。

与正常人(HC)以及疾病对照骨关节炎(OA)患者相比，双阴性B细胞：调节性B10细胞比值在类风湿关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)等自身免疫病患者中比例明显升高，参见附图2和附图3。

RA患者接受抗TNF-α生物制剂治疗，双阴性B细胞：调节性B10细胞比值降低，恢复至正常水平，如附图4所示。

ROC曲线分析显示，双阴性B细胞：调节性B10细胞比值对自身免疫病具有较好的诊断价值(RA、SS、SLE显示为疾病组，HC和OA显示为对照组)，特异性达到93.18％，如附图5所示。

并且，ROC曲线的曲线下面积(AUC)为0.834，大于0.5，95％置信区间 (CI)为0.779-0.888，说明合理设定Cut-off值具有较好的预测价值。通过ROC 曲线分析推荐Cut-off值0.8068，计算出相应的敏感性和特异性分别为49.15％和 93.18％，阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)分别为90.62％和57.74％，显示了潜在的诊断价值。

本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，例如浆细胞与调节性B10细胞比值在制备自身免疫性疾病诊断试剂中的应用，均应包含在本发明的保护范围之内。