针对家禽坏死性肠炎的疫苗
阅读说明：本技术 针对家禽坏死性肠炎的疫苗 (Vaccine against necrotic enteritis in poultry ) 是由 龚建华 D·莱普 于 2018-05-31 设计创作，主要内容包括：一种免疫原性多肽适用于制备供治疗或预防家禽小肠坏死用的疫苗,所述免疫原性多肽选自经分离的产气荚膜梭菌菌毛多肽、所述菌毛多肽的变异体；所述菌毛多肽的片段；和所述变异体的片段。所述经分离的产气荚膜梭菌菌毛多肽包括组装的菌毛或菌毛亚单元CnaA、FimA和/或FimB。(An immunogenic polypeptide selected from the group consisting of an isolated clostridium perfringens pilus polypeptide, a variant of said pilus polypeptide, a variant of a clostridium perfringens pilus polypeptide, suitable for use in the preparation of a vaccine for the treatment or prevention of small intestine necrosis in poultry; a fragment of said pilus polypeptide; and fragments of said variants. The isolated clostridium perfringens pilus polypeptides include assembled pili or pilus subunits CnaA, FimA, and/or FimB.)
背景技术
本申请案涉及适用于制备针对家禽坏死性肠炎的疫苗的多肽。更具体地说，本申请涉及一种产气荚膜梭菌菌毛多肽，其适用于制备针对与家禽的产气荚膜梭菌感染有关的坏死性肠炎的疫苗。
坏死性肠炎是家禽(例如肉用仔鸡)的一种肠疾病，估计2015年其使家禽产业损失花费$US 60亿。坏死性肠炎主要由产气荚膜梭菌的某些A型菌株引起，所述A型菌株产生NetB成孔毒素，其过度生长且粘附于肠粘膜，最终产生疾病的特征性损伤。产气荚膜梭菌是肠道的正常习居菌，并且典型地，只有携载NetB毒素的那些菌株才能够引起坏死性肠炎。坏死性肠炎主要通过投与饲料内的抗生素来控制，这种做法因抗微生物抗性的潜在扩散而越来越不受欢迎，并且有些国家当前正逐步停止生产饲料内的抗生素。因此，从财务和公共健康的视角来看，重要的是找到控制坏死性肠炎的替代方法，例如疫苗的研发。
最近已通过产气荚膜梭菌粘附基因座与NetB阳性菌株的关系鉴定出产气荚膜梭菌粘附基因座(VR-10B)(乐普D(Lepp D)，龚J(Gong J)，松尔JG(Songer JG)，伯尔宁P(Boerlin P)，帕莱拉VR(Parreira VR)，普瑞斯考JF(Prescott JF.)，2013，携载netB质粒的家禽产气荚膜梭菌分离株中的附属基因组区域的鉴定(Identification of AccessoryGenome Regions in Poultry Clostridium perfringens Isolates Carrying the netBPlasmid)，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)195:1152-1166)。在所检查的54种家禽分离株中，发现87％的netB阳性分离株和42％的netB阴性分离株存在经鉴定的基因座。这种基因座(后来重新命名为胶原蛋白粘附(CA)基因座)后来显示与胶原蛋白结合有关，并且是坏死性肠炎发病机理所必需的(韦德B(Wade B)，凯伯恩AL(Keyburn AL)，哈瑞恩V(Haring V)，福特M(Ford M)，路德JI(Rood JI)，穆尔RJ(Moore RJ)：产气荚膜梭菌菌株的粘附能力是禽类坏死性肠炎发病机理的关键(The adherent abilities of Clostridiumperfringens strains are critical for the pathogenesis of avian necroticenteritis)，兽医微生物学(Vet Microbiol)2016,197:53-61；韦德B，凯伯恩AL，希曼T(Seemann T)，路德JI，穆尔RJ：产气荚膜梭菌对胶原蛋白的结合与引起鸡发生坏死性肠炎的能力相关(Binding of Clostridium perfringens to collagen correlates with theability to cause necrotic enteritis in chickens)，兽医微生物学2015,180:299-303)。
多种产气荚膜梭菌蛋白质此前已作为候选疫苗加以评估。然而，这些蛋白质对坏死性肠炎最多提供部分的防护作用。另外，这些蛋白质中有许多对引起坏死性肠炎的菌株无特异性，并且不知道能否对坏死性肠炎发病机理起作用。因此，希望鉴定出替代的产气荚膜梭菌多肽，其可以作为用于生产针对坏死性肠炎的疫苗的候选物。
发明内容
本发明的一个方面提供一种经分离的产气荚膜梭菌菌毛多肽。在另一个方面中，本发明提供一种免疫原性多肽，其选自经分离的产气荚膜梭菌菌毛多肽、菌毛多肽的变异体；菌毛多肽的片段；和所述变异体的片段，其中菌毛多肽、变异体、多肽的片段和变异体的片段在家禽中具有免疫原性。在至少一个实施例中，菌毛多肽是CnaA多肽。在至少一个实施例中，菌毛多肽是FimA多肽。在至少一个实施例中，菌毛多肽是FimB多肽。在至少一个实施例中，菌毛多肽是组装的菌毛。
本发明的另一方面提供一种多核苷酸，其包含编码如本文所述的经分离的产气荚膜梭菌菌毛多肽或免疫原性多肽的序列。在另一个方面中，本申请提供一种包含多核苷酸的载体，所述多核苷酸具有编码如本文所述的经分离的产气荚膜梭菌菌毛多肽或免疫原性多肽的序列，其中载体被配置成在宿主细胞中表达经分离的产气荚膜梭菌菌毛多肽或免疫原性多肽。
在另一个方面中，本发明提供一种用于治疗或预防家禽坏死性肠炎的疫苗，其中疫苗包含如本文所述的免疫原性多肽。在另一个方面中，本申请提供一种用于治疗或预防家禽的产气荚膜梭菌感染的疫苗，其中疫苗包含如本文所述的免疫原性多肽。
在另一个方面中，本发明提供如本文所述的免疫原性多肽的用途，其用于制备供治疗或预防家禽坏死性肠炎或治疗或预防家禽的产气荚膜梭菌感染的药剂。
在另一个方面中，本发明提供一种治疗或预防家禽坏死性肠炎或治疗或预防家禽的产气荚膜梭菌感染的方法，所述方法包含向家禽投与有效量的如本文所述的免疫原性多肽或其疫苗。
在另一个方面中，本发明提供如本文所述的免疫原性多肽用作疫苗的用途，所述疫苗用于治疗或预防家禽坏死性肠炎或治疗或预防家禽的产气荚膜梭菌感染。
本发明的另一个方面提供一种选择性结合到如本文所述的免疫原性多肽的抗体。在另一个方面中，本发明提供一种检测家禽的产气荚膜梭菌感染的方法，其通过从家禽获得生物样品并且在所述生物样品中检测选择性结合到如本文所述的免疫原性多肽的抗体的存在来进行。本发明的又一个方面提供一种检测如本文所述的免疫原性多肽的方法，包含使所述免疫原性多肽暴露于选择性结合到所述免疫原性多肽的抗体以及检测所述免疫原性多肽对所述抗体的结合。
附图说明
本发明的其它特征将因以下书面描述和附图而变得显而易见，其中：
图1是5.2千碱基对产气荚膜梭菌VR-10B染色体基因座的图示；
图2A是一张照片，其示出了通过库马斯染色(Coomassie staining)目测到十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)使组胺酸标记的重组菌毛亚单元多肽CnaA发生分离；
图2B是一张照片，其示出了通过库马斯染色目测到SDS-PAGE使重组的菌毛亚单元多肽FimA发生分离；
图2C是一张照片，其示出了通过库马斯染色目测到SDS-PAGE使重组的菌毛亚单元多肽FimB发生分离；
图2D是一张照片，其示出了在浓缩和脱盐之后，通过SDS-PAGE和库马斯染色目测到CnaA、FimA和FimB的混合洗脱份；
图3A是一个图形，其示出了在第一疫苗接种试验中，经单独佐剂免疫或经CnaA免疫的鸡的针对CnaA重组多肽的血清IgY抗体反应(405nm吸光度)。每个点表示单一个体并且水平线表示平均值。通过杜凯氏检验(Tukey's test)(杜凯J.(Tukey,J)，“通过方差分析比较个体平均值(Comparing Individual Means in the Analysis of Variance)”，生物测量学(Biometrics)(1949)5(2):99-114)测量时，*表示每组中的免疫前样本(d8)在p<0.05水平时的显著差异；**表示p<0.01水平时的显著差异；并且***表示p<0.001水平时的显著差异；
图3B是一个图形，其示出了在图3A的试验中，经单独佐剂免疫或经FimA免疫的禽鸟的针对FimA重组多肽的血清IgY抗体反应(405nm吸光度)。每个点表示单一个体并且水平线表示平均值。通过杜凯氏检验测量时，*表示每组中的免疫前样本(d8)在p<0.05水平时的显著差异；**表示p<0.01水平时的显著差异；并且***表示p<0.001水平时的显著差异；
图4是一个图形，其示出了在图3A的试验中，经单独佐剂免疫或经CnaA或FimA免疫、随后经饲料内的产气荚膜梭菌菌株CP1激发的各组鸡的坏死性肠炎(NE)损伤分数。每个点表示单一个体并且水平线表示坏死性肠炎损伤平均分；
图5A是一个图形，其示出了在第二疫苗接种试验中，经单独佐剂免疫、经CnaA免疫或经CnaA、FimA与FimB组合(Comb)免疫的鸡的针对CnaA重组多肽的血清IgY抗体反应(405nm吸光度)。每个点表示单一个体并且水平线表示平均值。通过杜凯氏检验测量时，*表示每组中的免疫前样本(d7)在p<0.05水平时的显著差异；**表示p<0.01水平时的显著差异；并且***表示p<0.001水平时的显著差异；
图5B是一个图形，其示出了在图5A的试验中，经单独佐剂免疫或经CnaA、FimA与FimB的组合(Comb)免疫的鸡的针对FimA重组多肽的血清IgY抗体反应(405nm吸光度)。每个点表示单一个体并且水平线表示平均值。通过杜凯氏检验测量时，*表示每组中的免疫前样本(d7)在p<0.05水平时的显著差异；**表示p<0.01水平时的显著差异；并且***表示p<0.001水平时的显著差异；
图5C是一个图形，其示出了在图5A的试验中，经单独佐剂免疫、经FimB免疫或经CnaA、FimA与FimB的组合(Comb)免疫的鸡的针对FimB重组多肽的血清IgY抗体反应(405nm吸光度)。每个点表示单一个体并且水平线表示平均值。通过杜凯氏检验测量时，*表示每组中的免疫前样本(d7)在p<0.05水平时的显著差异；**表示p<0.01水平时的显著差异；并且***表示p<0.001水平时的显著差异；
图6是一个图形，其示出了在图5A的试验中，经单独佐剂免疫、经CnaA、FimB或CnaA、FimA与FimB组合(Comb)免疫、随后经饲料内的产气荚膜梭菌CP1激发的各组鸡的坏死性肠炎(NE)损伤分数。每个点表示单一个体并且水平线表示坏死性肠炎损伤平均分。字母(a、b)表示有显著差异的群组(杜凯氏；p<0.01)；
图7是一个图形，其示出了各组鸡经饲料内的产气荚膜梭菌激发之后的坏死性肠炎(NE)损伤分数，所述产气荚膜梭菌是含有菌毛亚单元基因fimA和fimB的菌株CP1或CP1剔除型突变体(CP1ΔfimA和CP1ΔfimB)。线表示坏死性肠炎损伤平均分；
图8A是一张照片，其示出了通过库马斯染剂目测到SDS-PAGE使表面多肽发生分离，所述多肽是从含有菌毛亚单元cnaA、fimA和fimB中的每一种的基因的产气荚膜梭菌菌株CP1或CP1剔除型突变体(CP1ΔcnaA、CP1ΔfimA和CP1ΔfimB)提取；
图8B是一张照片，其示出了对SDS-PAGE所分离的表面多肽进行的蛋白质印迹分析，所述多肽从含有菌毛亚单元cnaA、fimA和fimB中的每一种的基因的产气荚膜梭菌菌株CP1或CP1剔除型突变体(CP1ΔcnaA、CP1ΔfimA和CP1ΔfimB)提取，SDS-PAGE分离的表面多肽是使用获自鸡血清的抗FimA抗体作为初级抗体检测到；
图8C是一张照片，其示出了对SDS-PAGE所分离的表面多肽进行的蛋白质印迹分析，所述多肽从含有菌毛亚单元cnaA、fimA和fimB中的每一种的基因的产气荚膜梭菌菌株CP1或CP1剔除型突变体(CP1ΔcnaA、CP1ΔfimA和CP1ΔfimB)提取，SDS-PAGE分离的表面多肽是使用兔产生的抗FimA抗体作为初级抗体检测到；
图9A是一张照片，其示出了通过库马斯染剂目测到从多种产气荚膜梭菌菌株提取的表面多肽被SDS-PAGE分离；
图9B是一张照片，其示出了对SDS-PAGE所分离的表面多肽进行的蛋白质印迹分析，使用获自鸡血清的抗FimA抗体作为初级抗体目测到从多种产气荚膜梭菌菌株提取的表面多肽被SDS-PAGE分离；并且
图10是使用兔抗FimA抗体作为初级抗体和6nm免疫金标记的山羊抗兔IgG作为二级抗体、通过透射电子显微镜获得的产气荚膜梭菌菌株CP1或CP1剔除型突变体CP1ΔfimA和经金粒子标记的CP1ΔfimB细胞的一系列照片。
具体实施方式
本申请人已发现，在与家禽坏死性肠炎有关的产气荚膜梭菌菌株中鉴定出的VR-10B基因座(乐普D等人，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)(2013)195:1152-1166)含有已发现编码粘附菌毛的六种推定基因：编码结构菌毛亚单元的三种基因(cnaA、fimA和fimB)，以及编码两种转肽酶和一种可能涉及菌毛组装的信号肽酶的基因。VR-10B基因座的图示显示于图1中。
菌毛是一种毛发样结构，其存在于许多细菌的表面上且常常涉及毒性。这种类型的菌毛是由共价连接的主要和次要多肽亚单元构成，所述亚单元形成长度约1μm的细胞表面结构。已经广泛地研究革兰氏阴性细菌(Gram-negative bacteria)的菌毛，但最近已经表明若干革兰氏阳性菌种(包括白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes))可产生特定类型的菌毛，所述类型的菌毛通过转肽酶组装。这种类型的粘附革兰氏阳性菌毛是在细胞表面处由菌毛蛋白亚单元通过管家和菌毛蛋白特异性转肽酶、通过共价键组装，并且最终共价连接到细胞壁肽聚糖而形成所组装的菌毛。
不受理论束缚，预期本文所述的产气荚膜梭菌菌毛多肽可能是研发针对多个原因所致的坏死性肠炎的疫苗的可行且有希望的目标。所述基因座主要存在于引起坏死性肠炎的产气荚膜梭菌菌株中。因此，由免疫原性菌毛蛋白诱发的免疫反应预期特异性靶向引起疾病的产气荚膜梭菌菌株。此外，菌毛存在于细菌细胞表面上，并且常常与细菌感染的致病期间附接到宿主有关，附接到宿主能够使菌毛暴露于宿主免疫系统。另外，菌毛可能由于其在疾病中的作用和其在细菌细胞表面上的位置，已经成功地用于研发针对多种其它感染性疾病的疫苗。
因此，本申请的一个方面提供一种免疫原性多肽，其选自经分离的产气荚膜梭菌菌毛多肽、菌毛多肽的变异体；菌毛多肽的片段；和所述变异体的片段，其中菌毛多肽、变异体、多肽的片段和变异体的片段在家禽中具有免疫原性。
如本文所用，术语“家禽”用于指农业上为了产品(包括(但不限于)肉类、蛋类和羽毛)而饲养的禽鸟或家禽物种。家禽包括(但不限于)鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸵鸟、雉和农业上相关的其它禽鸟或飞禽。尤其包括易患坏死性肠炎的家禽，所述坏死性肠炎由产气荚膜梭菌感染引起。在至少一个实施例中，家禽是为了肉类生产而饲养的肉鸡或鸡。
如本文所用，术语“多肽”意指含有两个或更多个通过肽键连接在一起的氨基酸残基的化合物。多肽包括(但不限于)寡肽或多肽，其中两个或更多个氨基酸残基依序通过共价肽键连接在一起而形成单一多肽链；和包含两个或更多个多肽链的蛋白质，所述多肽链彼此非共价缔合或彼此通过除肽键之外的共价键(包括(但不限于)二硫键和异肽键)连接。如本文所用，术语“异肽键”意指在一个氨基酸的氨基与第二氨基酸的羧基之间形成的酰胺键，其中氨基和羧基中的至少一个位于相应氨基酸的侧链。
如本文所用，术语“产气荚膜梭菌菌毛多肽”意指一种多肽，其具有菌毛或菌毛亚单元的功能并且由与家禽坏死性肠炎有关的产气荚膜梭菌菌株中所发现的一或多种基因编码。在至少一个实施例中，所述基因是乐普D等人，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)(2013)195:1152-1166中所鉴定的VR-10B基因座中所发现的cnaA基因、fimA基因或fimB基因，如图1中以图解方式所示。
如本文所用，术语“变异体”当结合多肽使用时，意指一种多肽，其氨基酸序列与正和所述变异体对一或多个氨基酸残基作比较的参考多肽的序列不同。变异体序列与参考多肽序列之间的差异可以包括一或多个氨基酸残基被不同氨基酸残基取代、额外氨基酸残基的***或氨基酸残基的缺失。在某些实施例中，变异体能够通过用替换氨基酸残基对一或多个氨基酸残基进行保守性取代而不同于参考多肽，所述替换氨基酸残基可以具有与新残基所替换的氨基酸残基相似的特性，包括(但不限于)电荷、尺寸和亲水性。在某些实施例中，变异体可以完全地或部分地保持参考多肽的一或多种生物学功能，包括(但不限于)免疫原性。在至少一个实施例中，参考多肽是如本文所述的经分离的产气荚膜梭菌菌毛多肽。
在至少一个实施例中，变异体的序列与参考多肽的序列能够具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或至少99.9％一致性。如本文所用，术语“一致性百分比”或“一致性％”当结合多肽或多核苷酸的序列使用时，分别意指序列中的与参考多肽或多核苷酸序列的相应位置的氨基酸或核苷酸残基一致的氨基酸或核苷酸残基总数百分比。在至少一个实施例中，当变异体序列的长度与参考序列的长度不一致时，能够基于变异体序列中的残基总数或基于参考序列中的残基总数计算一致性百分比。一致性百分比能够通过所属领域中众所周知的多种局部或全域序列比对算法(包括(但不限于)史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman algorithm)和尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunschalgorithm))测量。使用这些或其它合适算法的工具包括(但不限于)BLAST(基本局部比对检索工具)和所属领域中众所周知的其它这类工具。
如本文所用，术语“片段”当结合多肽或变异体时，意指所含氨基酸残基比所述多肽或变异体少并且序列与所述多肽或变异体序列的一部分一致的较小多肽。在至少一个实施例中，片段保持多肽或变异体的一或多种生物活性，包括(但不限于)免疫原性。在至少一个实施例中，片段包含多肽或变异体的抗原决定基。在至少一个实施例中，片段具有至少6个氨基酸的长度或至少7个氨基酸的长度，或至少8个氨基酸的长度或至少9个氨基酸的长度或至少10个氨基酸的长度。
如本文所用，术语“免疫原性”意指药剂(包括(但不限于)多肽或多核苷酸或其片段)能够诱导免疫原性药剂所投与的受试者发生免疫保护反应。如本文所用，术语“免疫保护反应”意指预防、减少或消除已感染受试者的一或多种疾病症状的免疫反应。
本发明的免疫原性多肽(包括本发明的经分离的产气荚膜梭菌菌毛多肽、菌毛多肽的变异体、菌毛多肽的片段和变异体的片段)在家禽中具有免疫原性。因此，在至少一个实施例中，经本发明的经分离的产气荚膜梭菌菌毛多肽、菌毛多肽变异体、菌毛多肽片段和变异体片段免疫的家禽对以下中的一或多种的激发将展示免疫保护反应：产气荚膜梭菌细胞、组装的产气荚膜梭菌菌毛、产气荚膜梭菌菌毛多肽、产气荚膜梭菌菌毛多肽的片段，或产气荚膜梭菌细胞的一部分，包括(但不限于)携有经组装的产气荚膜梭菌菌毛、产气荚膜梭菌菌毛多肽或产气荚膜梭菌菌毛多肽片段中的一或多种的细胞膜或其一部分或细胞壁或其一部分。
本申请的另一方面提供一种多核苷酸，其包含编码如本文所述的经分离的产气荚膜梭菌菌毛多肽或免疫原性多肽的序列。在至少一个实施例中，多核苷酸是信使RNA(mRNA)，其具有能够被翻译而生成经分离的产气荚膜梭菌菌毛多肽或免疫原性多肽的序列。在至少一个实施例中，多核苷酸是DNA，其至少一个链能够被转录而产生mRNA，所述mRNA又能够被翻译而生成经分离的产气荚膜梭菌菌毛多肽或免疫原性多肽。在至少一个实施例中，DNA能够被生物化学系统(包括(但不限于)细胞)表达，以产生经分离的产气荚膜梭菌菌毛多肽或免疫原性多肽。在至少一个此类实施例中，DNA能够被并入载体中，所述载体被配置成在宿主细胞中表达DNA，如所属领域中众所周知。
在至少一个实施例中，多核苷酸可以包括变异体多核苷酸序列，所述变异体多核苷酸序列与包含编码如本文所述的经分离的产气荚膜梭菌菌毛多肽或免疫原性多肽的序列的多核苷酸在至少中度严格的条件下杂交。“至少中度严格的杂交条件”意指经选择以促进溶液中的两个互补核酸分子之间发生选择性杂交的条件。杂交可以发生于核酸序列分子的全部或一部分上。杂交部分典型地具有至少15(例如20、25、30、40或50)个核苷酸的长度。所属领域的技术人员将认识到，核酸双螺旋体或杂合体的稳定性是根据解链温度(Tm)确定，在含钠缓冲液中，解链温度是钠离子浓度([Na+])和温度的函数(Tm＝81.5℃-16.6(Log10[Na+])+0.41(％(G+C)-600/l)，其中％G+C是核酸中的胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸的百分比并且l是碱基对中的核酸长度，或类似方程式)。相应地，确定杂合体稳定性的洗涤条件参数是钠离子浓度和温度。为了鉴定与已知核酸分子相似、但不一致的分子，可以假定1％错配引起Tm发生约1℃降低。举例来说，如果寻求具有>95％一致性的核酸分子，则最终洗涤温度可以降低约5℃。基于这些考虑因素，所属领域的技术人员将能够容易地选择适当的杂交条件。
在一些实施例中，选择严格的杂交条件。通过举例，以下条件可以用于实现严格的杂交：基于上述方程式，在Tm-5℃下，在5x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)/5x邓哈特溶液(Denhardt's solution)/1.0％十二烷基硫酸钠(SDS)中进行杂交；随后在60℃下，用0.2xSSC/0.1％SDS洗涤。中度严格的杂交条件包括在42℃下、在3x SSC中进行的洗涤步骤。然而，应理解，可以使用替代缓冲液、盐和温度实现等效的严格性。关于杂交条件的其它指导原则可以见于：现代分子生物学实验技术(Current Protocols in Molecular Biology)，约翰·威利父子公司(John Wiley&Sons)，纽约(N.Y.)，2002；和萨布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:a Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，2001。
在至少一个实施例中，经分离的产气荚膜梭菌菌毛多肽是CnaA多肽。在至少一个实施例中，CnaA多肽具有选自SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在至少一个实施例中，CnaA多肽是由具有选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:7的序列的多核苷酸编码。在至少一个实施例中，CnaA多肽是由在至少中度严格条件下与具有选自SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:7的序列的多核苷酸杂交的多核苷酸编码。在至少一个实施例中，当菌毛多肽是CnaA多肽时，变异体与选自SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.9％序列一致性。
在至少一个实施例中，经分离的产气荚膜梭菌菌毛多肽是FimA多肽。在至少一个实施例中，FimA多肽具有选自SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在至少一个实施例中，FimA多肽是由具有选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8的序列的多核苷酸编码。在至少一个实施例中，FimA多肽是由在至少中度严格条件下与具有选自SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8的序列的多核苷酸杂交的多核苷酸编码。在至少一个实施例中，当菌毛多肽是FimA多肽时，变异体与选自SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.9％序列一致性。
在至少一个实施例中，经分离的产气荚膜梭菌菌毛多肽是FimB多肽。在至少一个实施例中，FimB多肽具有选自SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在至少一个实施例中，FimB多肽由具有选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:9的序列的多核苷酸编码。在至少一个实施例中，FimB多肽由在至少中度严格条件下与具有选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:9的序列的多核苷酸杂交的多核苷酸编码。在至少一个实施例中，当菌毛多肽是FimB多肽时，变异体与选自SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.9％序列一致性。
在至少一个实施例中，经分离的产气荚膜梭菌菌毛多肽是组装的菌毛。在至少一个实施例中，组装的菌毛包含一或多个亚单元，所述亚单元各自独立地选自CnaA多肽、FimA多肽和FimB多肽。在至少一个实施例中，一或多个亚单元彼此共价键结。在至少一个实施例中，组装的菌毛是从产气荚膜梭菌细胞或其一部分(包括(但不限于)细胞膜或其一部分，或细胞壁或其一部分)分离的菌毛。在至少一个实施例中，组装的菌毛是从产气荚膜梭菌细胞或其一部分(包括(但不限于)细胞膜或其一部分，或细胞壁或其一部分)分离的菌***段，其中所述片段包含一或多个亚单元，所述亚单元各自独立地选自CnaA多肽、FimA多肽和FimB多肽。
在至少一个实施例中，经分离的产气荚膜梭菌多肽能够从产气荚膜梭菌的培养物中分离出来。因此，在至少一个实施例中，经分离的产气荚膜梭菌菌毛多肽可以是制剂的一部分，所述制剂含有携带如本文所述的菌毛多肽或其片段的产气荚膜梭菌细胞的一或多个部分，包括(但不限于)细胞膜或其一部分，或细胞壁或其一部分。在至少一个实施例中，通过在适合的宿主细胞中表达载体能够以重组方式产生经分离的产气荚膜梭菌菌毛多肽，所述载体包含具有编码菌毛多肽的序列的多核苷酸。在至少一个实施例中，当菌毛多肽是组装的菌毛时，通过在适合的宿主细胞中表达载体能够以重组方式产生组装的菌毛，所述载体包含具有编码基因的序列的多核苷酸和为了将所组装的菌毛组装而必需的其它核苷酸序列。此外，经分离的产气荚膜梭菌菌毛多肽能够在分离或重组产生之后至少部分地提纯。适合的载体和宿主细胞，包括(但不限于)适于产生重组多肽的原核和真核宿主细胞，以及分离或重组产生此类多肽的方法，包括至少部分地提纯此类多肽的方法，在所属领域中是众所周知的，或熟练的技术人员仅通过常规的实验工作便能够容易地对其加以鉴定和选择。
在另一个方面中，本申请提供一种用于治疗或预防家禽坏死性肠炎或用于治疗或预防家禽的产气荚膜梭菌感染的疫苗，其中所述疫苗包含至少一种如本文所述的免疫原性多肽。如本文所用，术语“疫苗”意指用于预防、治疗或减少产气荚膜梭菌的感染作用的免疫原性制剂。疫苗调配物典型地含有免疫有效量的免疫原性药剂，并且还可以含有佐剂或可以不含佐剂。在本发明疫苗的情况下，免疫原性药剂可以是如本文所述的免疫原性多肽。
如本文所用，术语“佐剂”意指一种药剂，其有效增强接种包含免疫原性药剂的疫苗的受试者的针对免疫原性药剂的免疫反应。适合的佐剂在所属领域中是众所周知的且包括(但不限于)无机化合物，包括(但不限于)明矾、氢氧化铝和其它含铝化合物；皂素，包括(但不限于)Quil-ATM；弗氏完全和不完全佐剂；含有脂质或矿物油的佐剂，包括(但不限于)水包油乳液；多糖佐剂；蛋白质佐剂；免疫调节剂；获自被杀死或减毒的细菌细胞的佐剂；和所属领域中已知的其它合适佐剂。
疫苗能够在一或多种药学上可接受的载剂中调配。如本文所用，术语“药学上可接受的”意指生理学上能耐受并且典型地当投与动物或人时不产生不良反应的分子实体和组合物。优选地，如本文所使用，术语“药学上可接受的”意指得到联邦监管机构或州政府批准或在美国药典或其它公认的药典中列出适用于动物或人。如本文所用，术语“载剂”意指与化合物一起投与的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。适合的载剂在所属领域中是众所周知的并且在至少一个实施例中，描述于E.W.Martin的“雷明顿氏医药科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)”第18版，或其它版本。
疫苗能调配成通过所属领域中已知的任何便利途径投与，包括(但不限于)口服、直肠、鼻、经粘膜、透皮、肠胃外、静脉内、肌肉内、皮下、卵内或其它已知途径。在至少一个实施例中，预期疫苗能够口服投与。不受理论束缚，预期口服疫苗接种能够直接靶向肠道相关的淋巴组织，坏死性肠炎相关的产气荚膜梭菌菌株的感染部位。在至少一个实施例中，预期通过母亲接种疫苗和随后的母亲免疫性转移(包括(但不限于)母亲抗体转移到后代)而能够使后代免疫。
在另一个方面中，本发明提供如本文所述的免疫原性多肽的用途，其用于制备供治疗或预防家禽坏死性肠炎或治疗或预防家禽的产气荚膜梭菌感染的药剂。药剂可以是如本文所述的疫苗。
在另一个方面中，本发明提供一种治疗或预防家禽坏死性肠炎或治疗或预防家禽的产气荚膜梭菌感染的方法，所述方法包含向家禽投与有效量的如本文所述的免疫原性多肽或疫苗。投药可以通过所属领域中众所周知的途径，包括(但不限于)口服、直肠、鼻、肠胃外、静脉内、肌肉内、皮下或其它途径。在至少一个实施例中，投药可以通过皮下注射。在至少一个实施例中，投药可以是口服的。在至少一个实施例中，可以向家禽投与疫苗超过一次以提供初始免疫作用，随后提供一或多次加强免疫，如所属领域中所理解。在至少一个实施例中，家禽中的母亲抗体消失之后，将初始免疫和一或多次加强免疫中的一或多种投与家禽。在至少一个此类实施例中，孵化之后不早于约10天，向家禽投与初始免疫和一或多次加强免疫中的一或多种。
在另一个方面中，本发明提供如本文所述的免疫原性多肽用作疫苗的用途，所述疫苗用于治疗或预防家禽坏死性肠炎或治疗或预防家禽的产气荚膜梭菌感染。
本发明的另一个方面提供一种选择性结合到如本文所述的免疫原性多肽的抗体。在至少一个实施例中，所述抗体是家禽抗体。在至少一个实施例中，抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体或保持选择性结合到如本文所述的免疫原性多肽的特性的抗体片段。如本文所用，术语“抗体片段”希望包括(但不限于)Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚物、微型抗体、双功能抗体，和其多聚体和双特异性抗体片段。能够使用常规技术使抗体片段化。举例来说，通过胃蛋白酶处理抗体能够生成F(ab')2片段。能够处理所得F(ab')2片段以还原二硫桥，从而产生Fab'片段。木瓜蛋白酶消化能够引起Fab片段形成。Fab、Fab'和F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微型抗体、双功能抗体、双特异性抗体片段和其它片段还能够通过重组技术合成。
制备和表征此类抗体和其片段的方法在所属领域中是众所周知的并且熟练的技术人员无需过度的努力便能够容易地执行。举例来说，多克隆抗血清或单克隆抗体能够使用标准方法制得。哺乳动物(例如小鼠、仓鼠或兔)、禽鸟(例如家禽)或其它动物能够用诱导哺乳动物发生抗体反应的本发明免疫原性多肽的免疫原性形式免疫。赋予肽免疫原性的技术包括与载剂结合或所属领域中众所周知的其它技术。举例来说，肽能够在佐剂存在下投予。免疫进展能够通过检测血浆或血清中的抗体效价来监测。标准ELISA或其它免疫分析程序能够与作为抗原的免疫原性药剂一起使用，以评估抗体水平。免疫之后，能够获得抗血清，且必要时，从血清中分离出多克隆抗体。
为了产生单克隆抗体，能够从免疫的动物中收获产生抗体的细胞(淋巴细胞)并且通过标准体细胞融合程序与骨髓瘤细胞融合，从而使这些细胞永生化并且产生融合瘤细胞。此类技术在所属领域中众所周知。可以免疫化学方式筛选融合瘤细胞以产生与如本文所述的免疫原性多肽特异性反应的抗体并且能够分离出单克隆抗体。因此，本公开还涵盖分泌对如本文所述的免疫原性多肽具有特异性的单克隆抗体的融合瘤细胞。
对如本文所述的免疫原性多肽具有反应性的特定抗体或抗体片段还可以通过筛选表达文库来生成，所述表达文库编码细菌中所表达的免疫球蛋白基因或其一部分，所述细菌含有由如本文所述的核酸分子产生的肽。举例来说，完整Fab片段、VH区和FV区能够使用噬菌体表达文库在细菌中表达。
在另一个方面中，本发明提供一种检测与坏死性肠炎有关的产气荚膜梭菌菌株感染家禽的方法，其中所述方法包括从家禽获得生物样品以及检测所述生物样品中的选择性结合到如本文所述的免疫原性多肽的抗体的存在。在至少一个实施例中，生物样品是血液样品。在至少一个实施例中，样品是粪便样品。在至少一个实施例中，检测包括使用所属领域的技术人员众所周知的方法测量存在于生物样品中的抗体的量或浓度。
本发明的又一个方面提供一种检测如本文所述的免疫原性多肽的方法，包含使所述免疫原性多肽暴露于选择性结合到所述免疫原性多肽的抗体以及检测所述免疫原性多肽对所述抗体的结合。在至少一个实施例中，免疫原性多肽可以是如本文所述的经分离的产气荚膜梭菌菌毛多肽。在至少一个实施例中，免疫原性多肽可以是附接到产气荚膜梭菌细菌细胞表面的经组装的菌毛。所述方法的此类实施例能够适用于鉴定和检测能够使家禽产生坏死性肠炎的产气荚膜梭菌菌株。
如本文所用，术语“约”或“大约”当应用于数值或值范围时，意指在测量性质或精度给定的情况下，所述值能够在所测数量的可接受程度的误差范围内改变，使得偏差在所属领域中被视为与所述值等效且提供相同功能或结果。举例来说，如所属领域中所理解，误差程度能够用为了测量而规定的有效数字的个数表示，且包括(但不限于)为了测量而报告的最精密有效数字±1的偏差。典型示范性误差程度在给定值或值范围的百分之20％(％)内，优选在10％内，且更优选在5％内。替代地，且尤其在生物系统中，术语“约”和“大约”可以指数值在一定数量级内，优选在给定值的5倍内，且更优选在给定值的2倍内。除非另外说明，否则本文给出的数值数量是近似值，意味着术语“约”或“大约”能够在未明确陈述时推断出。
如本文所用，术语“基本上”是指作用、特征、特性、状态、结构、条项或结果的完整或几乎完整的范围或程度。举例来说，具有“基本上”相同特性的两种物质将具有完全相同的特性或将具有如此几乎完全相同以致差异无法测量或不显著的特性。相对于绝对完整性的偏差的容许精确程度在一些情况下可能取决于具体情形。然而，一般来说，对完整的接近程度将具有相同的整体结果，如同获得绝对和总体完整一般。“基本上”的使用当在负面涵义中使用时同样适用，是指完全或几乎完全缺乏作用、特征、特性、状态、结构、条项或结果。
实例
本发明的其它特征从以下非限制性实例将变得显而易见，以下非限制性实例通过举例示出了本发明的原理。
实例1：从产气荚膜梭菌产生经提纯的重组菌毛相关多肽
对三种菌毛亚单元(cnaA、fimA和fimB)的编码区进行密码子优化并且截断，以排除所预测的N末端信号肽和C末端细胞壁分类信号LPXTG跨膜域。C末端域是预测在菌毛组装期间去除的疏水区。合成被截断的密码子优化编码区(整合DNA技术(Integrated DNATechnologies)，美国科勒尔维尔(Coralville,USA))，利用In-FusionTM克隆术、根据制造商说明书(美国宝生物工程公司(Takara Bio USA)，美国加利福尼亚山景城(Mountain View,California,USA))克隆到pET28a表达载体(密理博-西格玛(MilliporeSigma)，加拿大安大略省怡陶碧谷区(Etobicoke,Ontario,Canada))中，进行序列验证，并然后转化到大肠杆菌BL21细胞中。转化的菌落在补充有50μg/ml卡那霉素(kanamycin)和1mM IPTG的1L LB培养液中、在37℃下、在振荡下生长18小时。将培养物离心且再悬浮于20ml结合缓冲液(20mMNaPO4、0.5M NaCl、30mM咪唑)中并且在冰上通过声波处理溶解10分钟(10秒脉冲、20秒停顿)。细胞溶解物在
截断序列引起经组氨酸(His)标记的多肽的高水平表达，如通过图2A(CnaA)、2B(FimA)、2C(FimB)和2D(浓缩且脱盐之后，CnaA、FimA和FimB的混合洗脱份)中所示的SDS-PAGE凝胶所证明。这些增强的表达水平可以归因于所得多肽的溶解性增强。
表1显示了全长、密码子优化和截断的基因序列的序列，以及全长亚单元多肽和已表达的截断和His标记的亚单元多肽的序列。
表1：菌毛亚单元基因和多肽的序列
实例2：产气荚膜梭菌菌株CP1菌毛亚单元剔除型突变体的制剂
大体上如此前所述(余Q.(Yu,Q.)，乐普D(Lepp,D.)，梅迪杂德高哈利I.(Mehdizadeh Gohari,I.)，吴T.(Wu,T.)，周H.(Zhou,H.)，殷X.(Yin,X.)，余H.(Yu,H.)，普瑞斯考J.F.(Prescott,J.F.)，聂S.P.(Nie,S.P.)，谢M.Y.(Xie,M.Y.)，龚J.(Gong,J.)，2017，产气荚膜梭菌引起家禽发生坏死性肠炎的发病机理需要Agr样群体感应系统(TheAgr-like quorum sensing system is required for necrotic enteritispathogenesis in poultry caused by Clostridium perfringens)，感染和免疫(Infection and Immunity)85(6):e00975-16)，通过ClosTron突变诱发(西普J.T.(Heap,J.T.)等人，分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)(2010),646:165-182)，以***方式使有毒性的产气荚膜梭菌菌株CP1中的三种菌毛亚单元基因(cnaA、fimA和fimB)各自失活，以生成各种菌毛亚单元基因的CP1剔除型突变体(CP1ΔcnaA、CP1ΔfimA和CP1ΔfimB)。简单地说，使用www.clostron.com实施的佩鲁特卡算法(Perutka algorithm)设计靶向ClosTron内含子的区域，***以下基因位置：cnaA有义链的碱基对(bp)183、fimA有义链的bp 231，和fimB有义链的bp 273。合成靶向内含子的区域且通过DNA 2.0(美国加州门洛帕克(MenloPark,CA,USA)克隆到ClosTron质粒pMTL007C-E2中。如此前所述(有稍微修改)(吉拉斯库娃A，韦泰克L，费维瑞J，伦尔T，布朗尼P.，2005，产气荚膜梭菌电穿孔速成方案(Rapidprotocol for electroporation of Clostridium perfringens)，微生物学方法杂志(JMicrobiol Methods)62:125-127)，所得质体分别电穿孔至CP1中，简单地说，在37℃下在5ml TGY培养液(3％胰蛋白胨、2％葡萄糖、1％酵母萃)中厌氧培养整夜之后，将CP1在50mlTGY中传代培养且生长到指数期(600nm光学密度[OD 600]，0.8)。通过在20℃下以6,000g离心10分钟来收获细胞且用10ml蔗糖电穿孔缓冲液(SEB)(272mM蔗糖、1mM MgCl2、5mMNa2HPO4，pH 7.4)洗涤一次，然后再悬浮于5ml SEB中。在预冷却的比色皿(0.2cm间距)中，将等分试样(0.2ml)与2μg浓缩的质粒DNA混合，并且使用伯乐(Bio-Rad)的GenePulser Xcell装置(伯乐，美国加州赫拉克勒斯(Hercules,CA,USA))，通过电穿孔(1,000V，25F)将质粒DNA引入细胞中。转化之后立即将混合物转移到1ml TGY培养液中且在37℃下厌氧培育3小时，随后在37℃下厌氧接种于含有15μg/ml甲砜霉素(thiamphenicol)的TGY琼脂上整夜以便选择转化体。所得菌落在含有10μg/ml红霉素的TGY琼脂上传代培养以便选择整合体，然后连续10天传代以使穿梭载体固化。选择对红霉素(erythromycin)具有抗性、但对甲砜霉素敏感的那些克隆系进一步分析。
实例3：动物试验
进行两次疫苗接种试验以评估三种经提纯的His标记重组菌毛亚单元防止鸡激发模型发生坏死性肠炎(NE)的能力。将市购一天的雄性白洛克肉用仔鸡(White PlymouthRock broiler chickens)随机分成实验组(n＝15-17)且在隔离单元内圈养。试验设计的概述展示于表2中。另外，评估CP1ΔfimA和CP1ΔfimB突变体在相同模型中的毒性。
表2：疫苗接种试验设计的概述
试验1：
第一试验包括接种单独佐剂对照物、CnaA或FimA的三组18只禽鸟。每只禽鸟在第8和20天在胸肌中肌肉内(i.m.)注射200μl含有Quil-ATM佐剂(50μg)和重组菌毛多肽(50μg)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，且禽鸟在第31天上安乐死。
第8天(免疫之前)，以及第20天和第31天(免疫之后)，收集每组五只禽鸟的血清。通过ELISA(酶联免疫吸附分析)测定针对CnaA和FimA的血清IgY效价。用50mM碳酸盐/碳酸氢盐涂布缓冲液pH 9.6将产气荚膜梭菌重组菌毛多肽稀释到10μg/ml，且添加100μl到96孔MaxiSorpTM免疫培养板(飞世尔科技公司)的每个孔中。各孔在37℃下涂布1小时，随后在4℃涂布整夜，用洗涤缓冲液(含有0.05％Tween 20的PBS)洗涤三次，然后在37℃下用含有1％牛血清白蛋白(BSA)(西格玛(Sigma))的洗涤缓冲液阻断2小时。每个血清样品在含有1％BSA的洗涤缓冲液中稀释的两倍连续稀释液(1/64到1/65,536)在各别孔中在37℃下培育2小时，然后用洗涤缓冲液洗涤三次。将各孔与山羊抗鸡IgY辣根过氧化酶(HRP)结合的多克隆抗体一起培育，在室温下在洗涤缓冲液中1:5,000稀释1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤三次。向每个孔中添加底物溶液(0.2mg/ml2,2'-次偶氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)(西格玛)于1X ABTS缓冲液(西格玛)中)且在室温下培育30分钟。用0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)停止反应之后，用BioTekTM读盘器在405nm测量吸光度。效价是在吸光度大于背景孔吸光度两倍的情况下作为最低血清稀释度的log2值计算，其中使用含有1％BSA的PBS替代血清。在不同疫苗接种群组中，通过单因素ANOVA，随后通过杜凯氏事后检验来确定每种抗原的免疫前与免疫后效价之间的统计学差异。
结果分别显示于图3A和B中。CnaA免疫组在d31时的针对CnaA的平均血清反应显著高于免疫前禽鸟(d8)，然而总体增幅较小。FimA免疫组在免疫之后的针对FimA的平均反应未显著增加。然而，有两只禽鸟截至d31确实展现较高效价。
将含有20％蛋白质的无抗生素仔畜日粮喂给禽鸟，直至实验诱发坏死性肠炎(NE)为止。第27天，禽鸟禁食24小时，然后在第28天和第29天转变为含有产气荚膜梭菌CP1培养物的无抗生素火鸡仔畜日粮(28％蛋白质)，随后在第31天安乐死。每天上午和下午，通过与产气荚膜梭菌CP1培养物按2:1(v/w)比率混合来制备所感染的日粮，所述培养物在37℃下在液体硫代乙醇酸盐(FTG)(Difco)培养基中分别培养15小时或24小时。安乐死之后，总体上检查禽鸟的小肠(十二指肠到回肠)并且利用凯伯恩等人所述的系统，不知情地如下从1到6评分(凯伯恩AL(Keyburn AL)，博伊斯JD(Boyce JD)，瓦兹P(Vaz P)，班兰TL(BannamTL)，福特ME(Ford ME)，派克D(Parker D)，迪鲁伯A(Di Rubbo A)，路德JI(Rood JI)，穆尔RJ(Moore RJ)，2008，NetB：一种与产气荚膜梭菌引起的禽类坏死性肠炎有关的新毒素(NetB,a new toxin that is associated with avian necrotic enteritis caused byClostridium perfringens)，公共科学图书馆·病原体(PLoS Pathog)4:e26)：
0：无眼观损伤；
1：壁薄或脆；
2：病灶性坏死或溃疡(1-5个病灶)；
3：病灶性坏死或溃疡(6-15个病灶)；
4：病灶性坏死或溃疡(16或更多个病灶)；
5：长度2-3cm坏死斑块；
6：现场情况特有的弥漫性坏死。
通过单因素ANOVA(方差分析)，随后通过杜凯氏事后检验来确定各组的坏死性肠炎(NE)分数之间的统计学差异。图4中所示的结果表明所有群组具有同样高的平均损伤分数。单独佐剂对照组、CnaA免疫组和FimA免疫组的平均坏死性肠炎分数分别为3.1、3.0和3.3。
不受理论束缚，预期第8天的免疫接种可能已受到母亲抗体的干扰，并且第20天的免疫接种在产气荚膜梭菌CP1激发之前，可能已没有时间诱发足够的免疫反应。因此，进行第二疫苗接种试验，包括在产气荚膜梭菌CP1激发之前进行额外的免疫接种。
试验2：
第二试验由以下组成：四组18只禽鸟，皮下(s.c.)接种单独佐剂对照物、CnaA、FimB，或CnaA、FimA和FimB的组合。在这个试验中，每只禽鸟在第7、14和19天皮下免疫接种50μg重组多肽与50μg Quil-ATM佐剂的组合，并且在第7、19和29天收集血清以便测量抗体效价。禽鸟在第26和27天用饲料内的产气荚膜梭菌菌株CP1激发，如试验1所述；并且在第29天，使禽鸟安乐死且对肠损伤评分。
相较于免疫前对照组，观察到所有免疫组在第19天和第29天出现显著(p<0.001)的血清抗体(IgY)反应(除了第19天免疫接种FimB的群组之外)，并且反应量级也比试验1大得多。结果显示于图5A(抗CnaA血清反应)、5B(抗FimA血清反应)和5C(抗FimB血清反应)中。
另外，如图6中所见，当如同试验1测量和评分时，相较于佐剂对照组(3.75)，CnaA免疫组和FimB免疫组均具有显著较低的坏死性肠炎分数(分别为2和2.06)，表明这些抗原对坏死性肠炎提供至少部分的防护作用。就FimB抗原而言，患有重度疾病(坏死性肠炎分数>2)的禽鸟的个数占33.3％，相比之下，在对照组中则占93.7％。免疫接种亚单元组合似乎未减小疾病的严重度(平均坏死性肠炎分数＝3.7)，但诱发针对所有三种亚单元的强烈血清反应，如图5A-C中所见。
产气荚膜梭菌菌株CP1菌毛亚单元剔除型突变体激发鸡
试验2中的尚未免疫接种的三组18只禽鸟在第26天和第27天在饲料内用如实例2中所述制备的CP1、CP1ΔfimA或CP1ΔfimB每天激发两次。第29天，使禽鸟安乐死且如实例3中所述对坏死性肠炎病灶评分。如图7中呈现的结果所见，CP1ΔfimA和CP1ΔfimB突变型菌株都没有引起被激发的禽鸟发生疾病，表明功能性菌毛似乎是坏死性肠炎发病机理所必需的。
实例4：产气荚膜梭菌菌毛表面多肽的表征
产气荚膜梭菌菌株CP1和CP1菌毛亚单元突变体：
使用以下文献中的方法，从产气荚膜梭菌菌株CP1和实例3所述的菌毛亚单元突变体CP1ΔcnaA、CP1ΔfimA和CP1ΔfimB中提取表面多肽：常C.(Chang,C.)，黄I.-H.(Huang,I.-H.)，亨德利克A.P.A.(Hendrickx,A.P.A.)，顿-莱特H.(Ton-That,H)，2013，***菌毛的可视化(Visualization of Gram-positive Bacterial Pili)，于：戴尔库H.A.(Delcour,H.A.)(编)，细菌细胞表面：方法和方案(Bacterial Cell Surfaces:Methodsand Protocols)，胡马纳出版社(Humana Press)，新泽西州特图瓦市(Totowa,NJ)，77-95。使菌株在TGY培养基(3％胰蛋白胨、2％葡萄糖、1％酵母萃)中在37℃下以厌氧方式生长整夜，按1:100在10ml TGY培养基中传代培养并且生长到OD600约1。细胞以6,000x g离心5分钟且在SMM缓冲液pH 6.8(0.5M蔗糖、10mM MgCl2、10mM顺丁烯二酸盐)中洗涤一次。将细菌离心块再悬浮于1ml SMM缓冲液中，向其中添加60μl含有5U/μl变溶菌素(西格玛)的胞壁质酶缓冲液(2mM乙酸、48mM乙酸钠)和10μl的0.1M苯基甲基磺酰氟(PMSF)(西格玛)。在37℃下在恒定旋光度下培育至少4小时之后，将原生质体以20,000x g离心5分钟，且除去含有细胞壁蛋白质的上清液洗脱份。通过每毫升添加81μl 100％(w/v)三氯乙酸(TCA)(西格玛)且在4℃培育整夜来使蛋白质沉淀。在4℃以20,000x g离心20分钟之后，蛋白质离心块用丙酮洗涤且在室温下缓慢地再悬浮于50μl负载样品的缓冲液(62.5mM Tris-HCl pH 6.8、2％SDS、20％甘油、4％β-巯基乙醇、3M尿素、0.01％溴酚蓝)中历时至少15分钟。
将表面蛋白提取物(5μl)负载于NovexTM NuPAGETM3-8％Tris-乙酸盐凝胶(飞世尔科技公司)上且在150V电泳1小时。凝胶用Bio-SafeTM库马斯染剂(伯乐)染色，或于1X转移缓冲液(48mM Tris、39mM甘氨酸、20％甲醇、0.1％SDS)中在350V历时1小时转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。使用WesternBreezeTM化学发光试剂盒(生命技术公司)，根据制造商说明书，使用作为初级抗体的鸡抗FimA血清(1:200)和山羊抗鸡IgY碱性磷酸酶(AP)结合的二级抗体(1:2,000)执行化学发光检测。处死来自试验1的FimA免疫鸡，获得用作初级Ab的血清(实例3)，其随后展现较高的抗FimA效价，或在兔中产生针对实例1所述的重组菌毛多肽的多克隆抗体。结果显示于图8A-C中。
已知对SDS-PAGE分离的转肽酶依赖性菌毛进行的蛋白质印迹分析能够产生反映不同聚合物长度的高分子量(HMW)梯样图案，反映出菌毛借以在细胞表面处组装的机制。菌毛蛋白亚单元通过管家和菌毛蛋白特异性转肽酶共价连接，引起异质聚合物结构生长，最终共价连接到细胞壁肽聚糖。组装的终止和因此聚合物长度的终止是可变的，从而当通过蛋白质印迹法目测这些菌毛时，产生特征性高分子量梯样图案。如图8B和C中所见，在从产气荚膜梭菌菌株CP1提取的表面多肽的蛋白质印迹中，而非在从突变型菌株提取的表面多肽的相应蛋白质印迹中，观察到显示菌毛结构的梯样图案，不论是使用获自鸡血清的抗体目测，还是使用兔中所产生的抗体目测。
多种产气荚膜梭菌菌株：
如上文所述，从来源于家禽源(CP1、JGS4141和JGS4120)或非家禽源(菌株13、ATCC13124)的五种产气荚膜梭菌分离株中提取表面多肽。将表面蛋白提取物(5μl)负载于两块NovexTM NuPAGETM3-8％Tris-乙酸盐凝胶(飞世尔科技公司)上且在150V电泳1小时。一块凝胶用于Bio-SafeTM库马斯染剂(伯乐)染色，并且第二块凝胶于1X转移缓冲液(48mMTris、39mM甘氨酸、20％甲醇、0.1％SDS)中在350V历时1小时转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。使用WesternBreezeTM化学发光试剂盒(生命技术公司)，根据制造商说明书，使用作为初级抗体的鸡抗FimA血清(1:200)和山羊抗鸡IgY碱性磷酸酶(AP)结合的二级抗体(1:2,000)执行化学发光检测。处死FimA免疫鸡，获得血清用作初级Ab，其随后展现较高的抗FimA效价。
结果显示于图9A-B中。各种产气荚膜梭菌菌株中的菌毛亚单元基因cnaA、fimA和fimB的基因座(VR-10B(CA)基因座)的存在(+)或不存在(-)此前已经通过微阵列分析和聚合酶链反应(PCR)方法来确定(乐普D(Lepp D)等人，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)(2013)195:1152-1166)。如图9A-B中所见，当通过鸡抗FimA抗体目测蛋白质印迹时，基因组中携载菌毛基因座的菌株(JGS4141和CP1)的所提取表面多肽的菌毛结构展示了特征性梯样图案(图9B中凝胶影像右侧垂线所示)，而基因组中未携载菌毛基因座的其它菌株则没有展示此图案。目测到提取物中的较小分子量色带可能是因为粗制鸡血清中存在无关的抗体。提取物中没有一个展示对应于FimA多肽本身的色带，其预期位置在图9B中用凝胶影像右侧箭头指示。这并不令人惊讶，原因是没有预计到表面相关蛋白质包括FimA单体，FimA单体仅发现于细胞内。
产气荚膜梭菌菌株CP1和CP1菌毛亚单元突变体的免疫金标记：
产气荚膜梭菌菌株CP1或CP1剔除型突变体CP1ΔfimA和CP1ΔfimB的细胞使用免疫金技术经金粒子标记，包括兔抗FimA作为初级抗体和6nm胶体金-AffiniPureTM山羊抗兔IgG(H+L)(min X Hu,Ms,Rat Sr Prot)(Cedarlane)作为二级抗体，并且通过透射电子显微镜检查，大体上如此前所述(常C.(Chang,C.)，黄I.-H.(Huang,I.-H.)，亨德利克A.P.A.(Hendrickx,A.P.A.)，顿莱特H.(Ton-That)，2013，***菌毛的可视化(Visualization of Gram-positive Bacterial Pili)，于：戴尔库H.A.(Delcour,H.A.)(编)，细菌细胞表面：方法和方案(Bacterial Cell Surfaces:Methods and Protocols)，胡马纳出版社(Humana Press)，新泽西州特图瓦市(Totowa,NJ)，77-95)。如图10中所见，原生CP1菌株的细胞展示细胞表面上存在菌毛结构，而CP1ΔfimA和CP1ΔfimB突变体的细胞则缺乏此类结构。
本文所述的实施例旨在说明本发明组合物和方法，而非旨在限制本发明的范围。希望包括与整个说明书一致并且对于所属领域的技术人员来说显而易见的各种修改和变化。所附权利要求书不应受实例中所述的具体实施例限制，而应给予与整个说明书一致的最广泛解释。
序列表
<110> 由加拿大农业与农产品部长代表的加拿大女王陛下(Her Majesty the
Queen in Right of Canada, as represented by the Minister of
Agriculture and Agri-Food)
<120> 针对家禽坏死性肠炎的疫苗
<130> 3688-157
<150> US 62/513,001
<151> 2017-05-31
<160> 15
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 2091
<212> DNA
<213> 产气荚膜梭菌
<400> 1
atgaaaataa ataaaaaaat ttttagcatg ctatttatgg ttattgtact ttttacatgc 60
atatcatcaa atttttctgt ttctgcttct tctattcaaa gaggaagaga tatcagtaat 120
gaggtagtta caagcctagt ggctactcca aatagtataa atgatggtgg aaacgttcag 180
gttcgtttgg aatttaaaga aaatcatcaa agaaatatac aaagtggaga tactataact 240
gtcaaatgga caaattcagg ggaagtattt tttgaaggat atgaaaaaac aattccactt 300
tatataaaag accaaaatgt tggtcaagca gtaatagaga aaacaggtgc aacacttaca 360
tttaatgata aaatagataa attagatgat gttggtggat gggcaacatt tactttgcaa 420
ggaagaaaca ttacctcagg taatcatgaa cacacaggaa tagcatatat tatatctggt 480
tcaaagcggg cagatgtaaa tataaccaaa ccagaatcag gtacaactag tgtattctat 540
tataaaacag gtagtatgta taccaatgat acaaatcatg tcaattggtg gttactggtg 600
aatccaagca aggtatattc tgaaaaaaac gtttatattc aagatgaaat ccaaggcgga 660
caaacattag aacctgattc ttttgaaata gtagtaactt ggtatgatgg ttatgtagaa 720
aagtttaaag gaaaagaagc gataagggaa ttccataata aatatccaaa ttcaaatata 780
tcggtatcag aaaataaaat aacagtaaac atttcacaag aggattccac acaaaagttt 840
attaatattt tttataaaac taagattaca aatccgaaac aaaaagaatt cgttaataat 900
acaaaagcat ggtttaaaga gtataataag ccagctgtaa atggagaatc ctttaaccat 960
agcgtacaaa atattaatgc agatgctgga gttaatggaa ctgtaaaagg cgaattaaaa 1020
atcataaaaa cattaaaaga taaaagtatt ccaattaaag atgttcagtt taagatgaga 1080
agagttgata atacagttat caaagatggt aaaaaagaat tattactaac aactgatgat 1140
aaaggtattg caaatgtaaa aggtcttcct gtaggaaaat atgaagtaaa agagatttca 1200
gctccagaat ggattgcttt taatcctctt attgcaccaa aattggaatt cacaatatca 1260
gatcaggaca cagaaggcaa attgtgggct gttgaaaatg aattaaagac aatttcaatt 1320
ccggttgaaa aggtctgggt aggacaaact agtgaacgag cagaaatcaa gctttttgca 1380
gatggtattg aagtagacaa agtgatttta aatgcagata acaattggaa acacacattt 1440
gaaaataaac ctgaatataa ttcagaaaca aaacagaaaa tcaattattc tgtgtcagag 1500
acaactattt ctggatatga aagcaatatc acaggcgatg ctaagaatgg ttttattgta 1560
accaatacag aacttcctga tttgactatt ggtaaagaag ttataggaga attgggtgac 1620
aagacgaagg tatttaactt tgagcttaca ttaaagcaag cagatggaaa gcctatcaat 1680
ggtaaattta attacattgg tagtgtagat gacaggtaca aaaaagaaag cataaagcct 1740
tctgatggtg agattacttt tatagaagga aaagcaacta taactttatc acatggacaa 1800
gagattacaa tcaaggattt accatatggg gttacatata aagttatgga aaaagaagct 1860
aatgaaaatg gctatttaac tacctataat ggaaataacg aagtcacaac aggtgaattg 1920
aaacaggata caaaagtaca ggtagttaac aacaaagagt ttgttccaac aactggtata 1980
tcaaccacaa cagagcaagg tacaatggtt ggaatggtga ttttttctat aggaatactt 2040
atggtcatga ttgtagttct tttacaattg aataaaggac tgaaaagatg a 2091
<210> 2
<211> 1074
<212> DNA
<213> 产气荚膜梭菌
<400> 2
atgataaaca agaaaaaatt aagtgcatta ttattaagtg gagcaatgtt tatgagtatg 60
aatacaaatg tattcgcatc aaatttacct tctggagggg tagaaggtac agaacagaat 120
cctgcaaaag caacaattac aaagaatttt gaatttccag aaggtattaa tacacctagt 180
gcaacattca agtttacagc agaaaaaata actaatgatg cgccagatgc aacaattgga 240
gatattaatt atacacaagg ggataatgga actttatcaa atggaaaata tagtgtaaag 300
aaaacaactg aaattacttt tggaaatttc ccacatgcag gagaatatga ttataatgta 360
aaagaaacga atgagggagt aggtggtatt acatatgata caaaagaata caaagttcat 420
gtgtatgttg caaatagtaa cgctatggat ggaaaaactt atgtaaaagc cattacatca 480
gaaaatggag gtgaaaaagc tccaattgag tttgttaata catataaaaa ggacacttct 540
ttacttatag aaaagaatgt aataggagat ttagctgact taacaaaaca gtttgagttt 600
cagattaatt taaaaaaatc agcaacatct gacataacaa aattcgaagg aaatattatt 660
agaaaagatg gtaaaataga gcctgtaaca tatacagctg aaaatacaga aacttttaaa 720
ttagcaaatg gagataaact taagtttgaa agtattccag caggaacaaa atatgaagta 780
aaagagatag gtgctagtga tggatataca ccttctataa cagtaattga aaatggaaat 840
gagacttcta ataatcgtac ggtagctgaa aaagatggta tatcatctaa gtcaaattct 900
aatgataact taattggtga aggtgaaaac aaagtaacat ttacaaacac atataatgac 960
aaacctatca caggtattgt tatgaataat attccattta ttctaatgat tagttttgct 1020
gtccttggat ttggtgcttt agctattata aaaagacgta aaactataag ataa 1074
<210> 3
<211> 660
<212> DNA
<213> 产气荚膜梭菌
<400> 3
atggaaacaa agaaaataag aaacaaaatc cttatggcta tcgtagcatt gagctttata 60
ttgcttccaa acactagagt atatgctact gaaaatacag caaatattcc tttgatagtt 120
agacaggaat ttaatgtata tacgaaagat tcaaaagcaa tagacatgat tggaaaatac 180
gagctaaagg caataagtga aaatgcccct atgccagaag aaagtaaaaa tggaagtttt 240
atctttaata tagatggaaa tgataagcag tttactattc cattagctta tacacatggt 300
ggtgtgtata tctatcaaat tcaacagata acgcaatcta aagataatta catatatgat 360
aaaaatagct ataagataac tgtatatgta aaaaatgcag aaaataatca tttaatacca 420
caaattattg tgaaaaatga aaataatgaa aaatgtgaag aaatatgttt ttataacatt 480
tacaaacaaa aaaataaaat taatgagatt tctaaaacac catataagcc aaatggaata 540
aatgttccta aaacaggcga taccacaaac attggatttt atattgtaat acttataatt 600
tcacttggat tacttgtggt attgaaatgg aaagaatata aaaagagaaa aaaagaataa 660
<210> 4
<211> 2088
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的cnaA
<400> 4
atgaagatca acaagaagat cttcagcatg ttatttatgg tcattgtgct gttcacctgt 60
atcagctcta acttcagtgt gagcgcgtca agcatccagc gcggccggga catcagcaac 120
gaggtggtga catcgctcgt agctaccccg aatagcatca acgatggtgg taacgtccaa 180
gtgcgtctgg aatttaaaga gaatcaccag cggaacattc agtccggcga cacgattacg 240
gtcaaatgga ctaactcagg tgaggtcttt tttgaaggct acgaaaaaac catcccgctg 300
tatatcaagg atcagaacgt tggccaggcg gttattgaaa aaaccggtgc aacattaaca 360
ttcaacgata agatcgacaa attagatgat gtcggcggct gggccacatt cacgctccag 420
ggtcgcaata ttacttcagg aaatcatgag catactggta ttgcgtacat tatctcgggt 480
agcaaacgtg cggacgttaa catcacaaaa cctgaatccg gaacaacgtc tgtgttttac 540
tacaagacgg gttcgatgta caccaatgac acaaatcatg tgaattggtg gctgctggtt 600
aacccgagca aagtatactc tgagaaaaat gtctatattc aggatgaaat tcaaggcggt 660
cagaccctgg agccggacag ttttgaaatc gtcgttacat ggtacgatgg ttatgtggaa 720
aaatttaaag gtaaagaagc gatccgggag ttccacaata aatatccgaa tagtaatatc 780
tcggtcagtg aaaataaaat cacggtaaat atttcgcaag aagattccac ccaaaaattc 840
attaacatct tttacaagac taaaatcacc aacccgaagc agaaagaatt tgtaaacaac 900
accaaagcct ggttcaaaga gtacaataag ccggcggtta acggtgaaag ttttaatcac 960
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cgcgtggata ataccgttat taaagacggc aagaaagagc tgctgttgac cacagatgat 1140
aaagggattg caaacgtgaa aggtctgcca gtcgggaaat acgaagtcaa agaaatcagt 1200
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gatcaagaca cagaggggaa attatgggca gtggaaaacg aactcaaaac catctcgatt 1320
ccggtcgaaa aagtctgggt aggtcagacg agtgaacggg cggagatcaa actgtttgcg 1380
gatggaattg aagttgataa ggtgatcctg aacgcggata ataattggaa gcacaccttt 1440
gagaataaac ccgaatataa ctccgagact aaacaaaaaa tcaactatag tgtgagcgaa 1500
actaccatca gtggctatga atcaaatatt actggcgatg cgaaaaacgg atttattgtc 1560
accaacacag aactgcctga tttgacgatc gggaaagagg taatcggcga actcggcgat 1620
aaaaccaagg tattcaactt tgaactgaca cttaagcagg ctgacggaaa gcccattaac 1680
gggaaattta actatattgg ttcggtggat gatcgttata agaaggaatc gattaagcct 1740
agcgatgggg aaattacgtt catcgaggga aaagcaacga ttaccctctc ccacggacaa 1800
gagatcacca ttaaggacct tccgtatggt gtgacctata aagtcatgga aaaagaagcc 1860
aacgagaatg gatatttaac cacttacaac ggaaataacg aagtcaccac cggggagttg 1920
aaacaggata cgaaagtaca agtggttaat aataaagaat tcgtcccgac aaccgggatc 1980
agcaccacca ccgaacaggg aaccatggtc gggatggtga tctttagcat cggtattctc 2040
atggtaatga ttgtcgttct gctgcagctg aataaaggac tgaaacgc 2088
<210> 5
<211> 1086
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的fimA
<400> 5
atgattaata aaaagaaact gtcggcgctg ctcttaagcg gggccatgtt tatgagcatg 60
aacacgaatg tgttcgcgtc taacctccca tcgggtggtg tggagggcac cgaacaaaac 120
ccagcgaaag cgacaatcac gaaaaacttc gagtttccgg aaggtattaa tacacccagc 180
gcgacattca aatttaccgc cgaaaaaatt accaacgatg cgccggatgc tactattggc 240
gacatcaatt atacccaagg tgataatggg acgttaagca atggcaaata cagtgtgaaa 300
aagactaccg agattacctt cgggaacttc ccgcatgctg gtgagtatga ttataacgtc 360
aaagaaacca atgaaggcgt gggtggcatt acttacgata cgaaagaata taaagttcat 420
gtgtatgtgg ccaactcaaa tgcgatggac ggtaagacat atgttaaagc gattactagc 480
gaaaatggcg gggaaaaagc accgatcgaa ttcgttaaca cctataaaaa agatacgtcg 540
ttactgattg aaaaaaatgt aattggcgat ctggcagacc tcaccaaaca gtttgagttt 600
caaatcaact tgaaaaagag cgcgactagt gatattacca agtttgaagg taacattatt 660
cgcaaagacg gtaagattga acccgtgacc tataccgcgg aaaataccga gacctttaag 720
ttagccaacg gagacaagtt aaaattcgag tccatccccg ccggtacaaa atatgaagtc 780
aaggaaatcg gggcgagcga tgggtacacg ccctcaatca ccgttatcga aaatggcaac 840
gaaacctcaa ataaccgcac tgtagccgaa aaagatggaa tctctagcaa aagcaactcg 900
aacgacaatt taatcggcga aggcgaaaat aaagtgacct ttaccaatac gtacaacgat 960
aaaccaatca cgggaatcgt aatgaataat attccgttca ttcttatgat tagctttgcc 1020
gttcttggct tcggtgcatt agcgatcatt aaacgccgca aaaccatccg ccccatcgat 1080
acgcgt 1086
<210> 6
<211> 624
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的fimB
<400> 6
atggctattg ttgctttgtc atttatcctg ctcccgaata cccgggtcta tgcgacggag 60
aacaccgcta atatcccgtt aattgtacgc caagaattta atgtttacac taaagattct 120
aaagccattg acatgatcgg aaaatatgaa ttaaaagcca tttctgagaa cgctcccatg 180
ccggaggaat caaaaaatgg tagctttatt tttaacatcg acggtaatga taaacagttt 240
actattccgc tggcgtacac tcacggtggc gtctacatct atcaaatcca gcaaattacc 300
cagagcaagg ataactacat ctacgataaa aacagctata aaatcacggt atatgtcaag 360
aacgcagaaa acaatcatct gatcccgcag attattgtaa aaaatgagaa caatgaaaaa 420
tgtgaagaaa tctgcttcta caatatctac aaacagaaaa acaagatcaa tgagatctct 480
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gaatataaaa aacgtaagaa ggaa 624
<210> 7
<211> 1887
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 截断的cnaA
<400> 7
tcaagcatcc agcgcggccg ggacatcagc aacgaggtgg tgacatcgct cgtagctacc 60
ccgaatagca tcaacgatgg tggtaacgtc caagtgcgtc tggaatttaa agagaatcac 120
cagcggaaca ttcagtccgg cgacacgatt acggtcaaat ggactaactc aggtgaggtc 180
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gcggttattg aaaaaaccgg tgcaacatta acattcaacg ataagatcga caaattagat 300
gatgtcggcg gctgggccac attcacgctc cagggtcgca atattacttc aggaaatcat 360
gagcatactg gtattgcgta cattatctcg ggtagcaaac gtgcggacgt taacatcaca 420
aaacctgaat ccggaacaac gtctgtgttt tactacaaga cgggttcgat gtacaccaat 480
gacacaaatc atgtgaattg gtggctgctg gttaacccga gcaaagtata ctctgagaaa 540
aatgtctata ttcaggatga aattcaaggc ggtcagaccc tggagccgga cagttttgaa 600
atcgtcgtta catggtacga tggttatgtg gaaaaattta aaggtaaaga agcgatccgg 660
gagttccaca ataaatatcc gaatagtaat atctcggtca gtgaaaataa aatcacggta 720
aatatttcgc aagaagattc cacccaaaaa ttcattaaca tcttttacaa gactaaaatc 780
accaacccga agcagaaaga atttgtaaac aacaccaaag cctggttcaa agagtacaat 840
aagccggcgg ttaacggtga aagttttaat cacagtgtgc agaatatcaa cgcagatgcc 900
ggggtaaatg gtactgttaa aggtgaattg aaaattatca aaaccctgaa agataaaagt 960
attccgatca aggatgtgca gtttaagatg cgccgcgtgg ataataccgt tattaaagac 1020
ggcaagaaag agctgctgtt gaccacagat gataaaggga ttgcaaacgt gaaaggtctg 1080
ccagtcggga aatacgaagt caaagaaatc agtgcgcctg agtggatcgc cttcaatcca 1140
ctgattgcgc ccaaacttga atttacgatc agcgatcaag acacagaggg gaaattatgg 1200
gcagtggaaa acgaactcaa aaccatctcg attccggtcg aaaaagtctg ggtaggtcag 1260
acgagtgaac gggcggagat caaactgttt gcggatggaa ttgaagttga taaggtgatc 1320
ctgaacgcgg ataataattg gaagcacacc tttgagaata aacccgaata taactccgag 1380
actaaacaaa aaatcaacta tagtgtgagc gaaactacca tcagtggcta tgaatcaaat 1440
attactggcg atgcgaaaaa cggatttatt gtcaccaaca cagaactgcc tgatttgacg 1500
atcgggaaag aggtaatcgg cgaactcggc gataaaacca aggtattcaa ctttgaactg 1560
acacttaagc aggctgacgg aaagcccatt aacgggaaat ttaactatat tggttcggtg 1620
gatgatcgtt ataagaagga atcgattaag cctagcgatg gggaaattac gttcatcgag 1680
ggaaaagcaa cgattaccct ctcccacgga caagagatca ccattaagga ccttccgtat 1740
ggtgtgacct ataaagtcat ggaaaaagaa gccaacgaga atggatattt aaccacttac 1800
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aataataaag aattcgtccc gacaacc 1887
<210> 8
<211> 894
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 截断的fimA
<400> 8
tctaacctcc catcgggtgg tgtggagggc accgaacaaa acccagcgaa agcgacaatc 60
acgaaaaact tcgagtttcc ggaaggtatt aatacaccca gcgcgacatt caaatttacc 120
gccgaaaaaa ttaccaacga tgcgccggat gctactattg gcgacatcaa ttatacccaa 180
ggtgataatg ggacgttaag caatggcaaa tacagtgtga aaaagactac cgagattacc 240
ttcgggaact tcccgcatgc tggtgagtat gattataacg tcaaagaaac caatgaaggc 300
gtgggtggca ttacttacga tacgaaagaa tataaagttc atgtgtatgt ggccaactca 360
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gcaccgatcg aattcgttaa cacctataaa aaagatacgt cgttactgat tgaaaaaaat 480
gtaattggcg atctggcaga cctcaccaaa cagtttgagt ttcaaatcaa cttgaaaaag 540
agcgcgacta gtgatattac caagtttgaa ggtaacatta ttcgcaaaga cggtaagatt 600
gaacccgtga cctataccgc ggaaaatacc gagaccttta agttagccaa cggagacaag 660
ttaaaattcg agtccatccc cgccggtaca aaatatgaag tcaaggaaat cggggcgagc 720
gatgggtaca cgccctcaat caccgttatc gaaaatggca acgaaacctc aaataaccgc 780
actgtagccg aaaaagatgg aatctctagc aaaagcaact cgaacgacaa tttaatcggc 840
gaaggcgaaa ataaagtgac ctttaccaat acgtacaacg ataaaccaat cacg 894
<210> 9
<211> 468
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 截断的fimB
<400> 9
acggagaaca ccgctaatat cccgttaatt gtacgccaag aatttaatgt ttacactaaa 60
gattctaaag ccattgacat gatcggaaaa tatgaattaa aagccatttc tgagaacgct 120
cccatgccgg aggaatcaaa aaatggtagc tttattttta acatcgacgg taatgataaa 180
cagtttacta ttccgctggc gtacactcac ggtggcgtct acatctatca aatccagcaa 240
attacccaga gcaaggataa ctacatctac gataaaaaca gctataaaat cacggtatat 300
gtcaagaacg cagaaaacaa tcatctgatc ccgcagatta ttgtaaaaaa tgagaacaat 360
gaaaaatgtg aagaaatctg cttctacaat atctacaaac agaaaaacaa gatcaatgag 420
atctctaaaa ccccctataa gccgaatggt attaatgtcc cgaaaacg 468
<210> 10
<211> 696
<212> PRT
<213> 产气荚膜梭菌
<400> 10
Met Lys Ile Asn Lys Lys Ile Phe Ser Met Leu Phe Met Val Ile Val
1 5 10 15
Leu Phe Thr Cys Ile Ser Ser Asn Phe Ser Val Ser Ala Ser Ser Ile
20 25 30
Gln Arg Gly Arg Asp Ile Ser Asn Glu Val Val Thr Ser Leu Val Ala
35 40 45
Thr Pro Asn Ser Ile Asn Asp Gly Gly Asn Val Gln Val Arg Leu Glu
50 55 60
Phe Lys Glu Asn His Gln Arg Asn Ile Gln Ser Gly Asp Thr Ile Thr
65 70 75 80
Val Lys Trp Thr Asn Ser Gly Glu Val Phe Phe Glu Gly Tyr Glu Lys
85 90 95
Thr Ile Pro Leu Tyr Ile Lys Asp Gln Asn Val Gly Gln Ala Val Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Gly Ala Thr Leu Thr Phe Asn Asp Lys Ile Asp Lys Leu
115 120 125
Asp Asp Val Gly Gly Trp Ala Thr Phe Thr Leu Gln Gly Arg Asn Ile
130 135 140
Thr Ser Gly Asn His Glu His Thr Gly Ile Ala Tyr Ile Ile Ser Gly
145 150 155 160
Ser Lys Arg Ala Asp Val Asn Ile Thr Lys Pro Glu Ser Gly Thr Thr
165 170 175
Ser Val Phe Tyr Tyr Lys Thr Gly Ser Met Tyr Thr Asn Asp Thr Asn
180 185 190
His Val Asn Trp Trp Leu Leu Val Asn Pro Ser Lys Val Tyr Ser Glu
195 200 205
Lys Asn Val Tyr Ile Gln Asp Glu Ile Gln Gly Gly Gln Thr Leu Glu
210 215 220
Pro Asp Ser Phe Glu Ile Val Val Thr Trp Tyr Asp Gly Tyr Val Glu
225 230 235 240
Lys Phe Lys Gly Lys Glu Ala Ile Arg Glu Phe His Asn Lys Tyr Pro
245 250 255
Asn Ser Asn Ile Ser Val Ser Glu Asn Lys Ile Thr Val Asn Ile Ser
260 265 270
Gln Glu Asp Ser Thr Gln Lys Phe Ile Asn Ile Phe Tyr Lys Thr Lys
275 280 285
Ile Thr Asn Pro Lys Gln Lys Glu Phe Val Asn Asn Thr Lys Ala Trp
290 295 300
Phe Lys Glu Tyr Asn Lys Pro Ala Val Asn Gly Glu Ser Phe Asn His
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Ser Val Gln Asn Ile Asn Ala Asp Ala Gly Val Asn Gly Thr Val Lys
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Gly Glu Leu Lys Ile Ile Lys Thr Leu Lys Asp Lys Ser Ile Pro Ile
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Lys Asp Val Gln Phe Lys Met Arg Arg Val Asp Asn Thr Val Ile Lys
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Val Ile Phe Ser Ile Gly Ile Leu Met Val Met Ile Val Val Leu Leu
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<400> 11
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<212> PRT
<213> 产气荚膜梭菌
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195 200 205
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