阅读说明：本技术 一种活性提高的纤维小体对接蛋白突变体36741及应用 (Cellulosomal dockerin mutant 36741 with improved activity and application thereof ) 是由 汪俊卿 王子睿 杨翠平 范翰 王瑞明 薛乐 李楠 姜彦君 王大涛 田文卓 于 2020-07-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种活性提高的纤维小体对接蛋白突变体36741及应用,纤维小体对接蛋白突变体36741为一种纤维小体对接蛋白DocA,核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,进行定点突变,获得活性提高的对接蛋白突变体36741,核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；使得对接蛋白能够更高效的与黏连蛋白发生相互结合组装,在微生物的胞外多酶体系的构建过程中有着广泛的应用前景。(The invention relates to a fibrosome docking protein mutant 36741 with improved activity and application, wherein a fibrosome docking protein mutant 36741 is a fibrosome docking protein DocA, the nucleotide sequence is shown as SEQ ID No.3, and the mutant is subjected to site-directed mutagenesis to obtain a docking protein mutant 36741 with improved activity, and the nucleotide sequence is shown as SEQ ID No. 1; the docking protein can be combined and assembled with the mucin more efficiently, and the method has wide application prospect in the construction process of an extracellular multienzyme system of microorganisms.)

一种活性提高的纤维小体对接蛋白突变体36741及应用

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种活性提高的纤维小体对接蛋白突变体36741及应用。

背景技术

纤维小体是厌氧生物存在的一种纤维素酶系，是多种纤维素酶、半纤维素酶依靠锚定-粘附机制形成的一种多酶复合体结构，通过细胞粘附蛋白附着在细菌细胞壁上，分子量2.0x10⁶～2.5x10⁶Da，能高效彻底地降解天然纤维素材料。纤维小体主要由两部分组成：含有酶或其他辅助蛋白的对接蛋白(dockerin，Doc)和含有结构蛋白的粘连蛋白(cohesin，Coh)。纤维小体是一种细胞表面的细胞器，包含多种酶以及相关的辅助因子，这些辅助因子依靠特定的折叠亚单位与酶相连。酶分子依赖于酶亚基上的锚定域和脚手架蛋白上的粘附域，整合在纤维小体上[Lytle B L,Volkman B F,Westler W M,et al.Secondarystructure and calcium-induced folding of the Clostridium thermocellumdockerin domain determined by NMR spectroscopy.Arch Biochem Biophys,2000,379(2):237～244]，从而形成超分子结构的多功能模元。脚手架蛋白的纤维连接域有利于酶与底物的结合[Yague E,Beguin P,Aubert J P.Nucleotide sequence and deletionanalysis of the cellulase-encoding gene CelH of Clostridiumthermocellum.Gene,1990,89:61～67]。纤维小体还可以通过相互之间锚定作用，形成多聚纤维小体，并包裹一层糖蛋白外衣，形成细胞表面的突起结构。

纤维小体组织各种降解酶形成多酶的复合体，从而高效地降解纤维素材料。这种超分子结构的作用方式是理解纤维素降解和利用纤维素资源的关键。纤维小体中蛋白质之间的相互作用，纤维小体组织结构的形态发生等。研究发现，纤维小体可大幅提高纤维素的降解率(高出单纯纤维素酶降解纤维素几倍)，使得纤维素的利用率显著提高。但不同纤维素降解菌所产生的纤维小体差异较大，主要是因自身组装方式不同而导致其结构的差别[罗辉，仇天雷，承磊，等.纤维素厌氧降解的研究进展[J].中国沼气，2008，26(2)：3-9]。

纤维小体通常存在于细胞表面，利用纤维素结合单位与纤维素表面充分接触而起到降解作用。纤维素是目前发现的数量最多的可再生资源，利用价值高，但只有少部分纤维素被人类所开发利用，大多数成为废弃物[吴窈画，彭惠，邵蔚蓝.结晶纤维素降解酶的研究进展[J].安徽农业科学，2007，35(9)：2532-2534]。纤维素极难溶于水，极难降解，由于纤维小体的存在，可高效降解纤维素，使纤维素转化成化工产品和燃料，从而实现环境及生态的绿色可持续发展。虽然目前已有多种纤维小体元件被发现，但研究开发更为高效的胞外自组装体系及其制作方法，对纤维小体及其元件的进一步应用依然是至关重要的。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种活性提高的纤维小体对接蛋白突变体36741及应用。

本发明涉及的技术方案

一种纤维小体对接蛋白突变体36741为一种纤维小体对接蛋白DocA，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，进行定点突变，获得活性提高的对接蛋白突变体36741，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种纤维小体对接蛋白突变体36741为一种纤维小体对接蛋白DocA，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，进行定点突变，获得活性提高的对接蛋白突变体36741，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述对接蛋白DocA来源于热纤梭菌(Clostridium thermocellum)(GenBank:2CCL_B)中，DocA核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，DocA氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

上述氨基酸序列中D₄₀VDKNGSINAAD₅₁突变为D₄₀TSNNGTINAAD₅₁。

上述纤维小体对接蛋白突变体36741的制备方法，包括如下步骤：

以上述对接蛋白中的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，进行定点突变，获得对接蛋白突变体36741，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示为基础，设计定点突变引物，以携带纤维小体对接蛋白基因的pET28a(+)载体为模板，进行PCR，构建重组突变质粒，并将突变质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑选阳性克隆进行发酵，发酵结束后收集菌体，对菌体进行破碎，纯化获得纤维小体对接蛋白突变体。

根据本发明优选的，所述制备方法中，由对接蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，突变为对接蛋白突变体36741，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

根据本发明优选的，上述制备方法中，发酵结束后离心收集菌体，对菌体进行超声破碎，经亲和色谱纯化获得纤维小体对接蛋白突变体。

根据本发明优选的，所述制备方法，对接蛋白突变体36741的PCR扩增引物核苷酸序列如下：

36741-F：TGCCGAT accagcaat AATGGC acc ATTAATGCC SEQ ID NO.7；

36741-R：CATTAAT ggt GCCATT attgctggt ATCGGCACGG SEQ ID NO.8。

所述引物核苷酸序列中的小写字母为突变位点。

进一步优选的，所述制备方法中，PCR反应体系：

质粒载体模板1μL，正向突变引物F 2μL，反向突变引物R 2μL，5×FastAlterationBuffer 10μL，FastAlteration DNA Polymerase 1μL，ddH₂O34μL。

进一步优选的，所述制备方法中，PCR反应条件：

95℃预变性2min；94℃20sec，55℃10sec，68℃3min，18个循环；补充延伸68℃5min。

根据本发明优选的，PCR反应完成后，需要用Dnp I酶对PCR扩增产物中的原有模板进行消化，消化反应体系混匀后，将其于37℃条件下消化1h，获得待转化载体。

进一步优选的，所述消化体系：

PCR扩增产物40μL，Dnp I酶1μL。

进一步优选的，突变载体的转化，将上述待转化载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，将转化子涂布于含有卡那霉素(50μg·mL^-1)的LB固体培养基上，37℃过夜培养后，挑取单菌落，并进行测序验证，筛选阳性突变体，获得重组大肠杆菌36741-BL21。

进一步优选的，突变体的表达、纯化，将上述验证正确的菌种接种于含有卡那霉素(50μg·mL^-1)的液体LB培养基中，37℃过夜培养，然后转接至液体LB培养基中37℃培养至OD₆₀₀≈1时加入1μm·mL^-1的IPTG，于26℃、200rpm条件下诱导8h，收集诱导后的菌体，然后将菌体利用2ⅹPBS缓冲液重悬，利用超声波破碎，10000rpm离心10min，离心后上清中的蛋白使用镍离子亲和柱纯化，并使用PBS-EP+缓冲液透析除盐，获得纯化的纤维小体对接蛋白突变体36741。

上述纤维小体对接蛋白突变体36741在与黏连蛋白相互作用构建蛋白复合体中的应用。

根据本发明优选的，上述应用中，所需钙离子的浓度为10^-4M～10^-2M。

本发明的有益技术效果

DocA是目前报道具有较高对接活性的纤维小体对接蛋白，并已被广泛应用。本发明提供对接蛋白突变体36741在钙离子浓度5×10^-4M时与黏连蛋白CohA的对接活性是DocA的4.12倍，并在钙离子浓度10^-4M～10^-2M的环境中表现出更高的活性，而这种更好的活性将会提高纤维小体的装配效率和整理的强度，因而具有更广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例4对应的纤维小体对接蛋白突变体与黏连蛋白在不同钙离子浓度下结合能力分析折线图

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，但保护范围不限于此。

材料来源

载体DocA-pET28a和CohA-pET28a提取或保存自大肠杆菌DH5α中，由齐鲁工业大学山东省微生物工程重点实验室提供，本领域技术人可以根据现有技术构建，也可由该重点实验室购买获得。

实施例中未注明具体条件的内容，按照常规条件进行；所用试剂或仪器未注明生成厂商的，均为普通市售产品。

实施例1

突变引物设计及突变载体构建

以分别连接在pET28a(+)载体中的对接蛋白DocA(载体为DocA-pET28a，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)为模板，进行对接蛋白突变体的引物设计(表一)。其中对接蛋白DocA来源于热纤梭菌(Clostridium thermocellum)(GenBank:2CCL_B)，并按照大肠杆菌密码子偏好进行了核苷酸序列的优化，DocA核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，DocA氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

表一 突变引物表

注：小写字母为突变位点。

准确按表二中各组分的加入量添加质粒DocA-pET28a、所设计的突变引物、PCR酶和buffer进行PCR反应液的配置，并按照表三中的PCR反应条件进行PCR扩增。

表二 突变的PCR反应体系

表三 突变的PCR反应条件

PCR反应完成后，需要用Dnp I酶对PCR产物中的原有的被大肠杆菌DH5α甲基化的质粒模板进行消化，消化反应体系如表四，体系配置好充分混匀后，将其于37℃条件下消化1h，获得待转化载体。

表四 消化体系

于-80℃中拿取大肠杆菌BL21(DE3)感受态并于4℃冰上快速溶解，用微量移液器吸取适量上述酶切液注入融化后的大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，轻弹管壁混匀，后于42℃准确热激90sec，冰浴2min，冰浴后于超净工作台中加入400μL液体LB培养基(1％蛋白胨、1％酵母浸粉、0.5％NaCl、余量水)，在37℃摇床中复苏1h左右，复苏结束后4000rpm离心5分钟，去除400μL上清后，将剩余的200μL直接涂布至含有卡那霉素(50μg·mL^-1)的固体培养基上(1％蛋白胨、1％酵母浸粉、0.5％NaCl、2％琼脂，余量水)，过夜培养后挑取单菌落培养并进行送测序公司测序验证DocA中氨基酸序列D₄₀VDKNGSINAAD₅₁突变为D₄₀TSNNGTINAAD₅₁；筛选出阳性克隆，获得重组大肠杆菌36741-BL21。

实施例2

突变蛋白的诱导表达和纯化

将验证正确的菌株接种至含有卡那霉素(50μg·mL^-1)的50mL液体LB培养基中37℃过夜培养，后按体积百分比2％量转接至新的50mL液体LB培养基37℃培养，培养至OD₆₀₀≈1时加入至终浓度为1μm·mL^-1的IPTG，分别放入26℃、200rpm摇床中诱导8h，收集诱导后的菌体。将诱导后的菌体用10mL 2ⅹPBS缓冲液重悬，利用超声破碎仪进行破碎，10000rpm离心10min，离心后上清中的蛋白使用镍离子亲和柱纯化，并使用PBS-EP+缓冲液(购自GE公司)透析除盐。获得纯化的纤维小体对接蛋白36741。

实施例3

纤维小体黏连蛋白表达载体构建及诱导表达

以连接有纤维小体黏连蛋白CohA的pET28a(+)载体，按照实施例1中的方式进行CohA-pET28a载体的转化，同理制备DocA-pET28a载体的转化，获得重组大肠杆菌DocA-BL21和CohA-BL21，按照实施例2中的方式进行基因的诱导表达和纯化。获得纯化的纤维小体黏连蛋白CohA，纤维小体对接蛋白DocA。其中纤维小体黏连蛋白CohA来源于热纤梭菌(Clostridium thermocellum)scaf基因(GenBank:MH049738.1)中，CohA核苷酸序列如SEQID NO.5所示，CohA氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

实施例4

纤维小体对接蛋白与黏连蛋白在不同钙离子浓度下结合能力分析

使用生物大分子相互作用仪对不同钙离子浓度纤维小体对接蛋白突变体与黏连蛋白间的结合能力进行分析，选取适宜的CM5芯片作为锚定芯片，根据公式上述公式计算蛋白CohA大致所需浓度，再将不同pH乙酸-乙酸钠缓冲液根据大致蛋白浓度分别做梯度稀释，作为待锚定蛋白，根据锚定情况确定最优锚定浓度和pH，后根据《Biacore小分子应用操作手册》中的进行黏连蛋白CohA锚定。将锚定好的芯片装入分子互作仪内，缓冲液为1×PBS-HP+溶液(购自GE公司)，将对接蛋白及突变体稀释至与蛋白CohA锚定浓度几乎一致，并结合将结合不同浓度的CaCl₂，置于4℃静止30min后上机测定，根据AbsResp值(即结合相互作用强度值)判断结合情况，结果如图1(表五)所示。该结果表明，相对于未突变对接蛋白DocA，对接蛋白突变体36741在钙离子浓度≥10^-4M时与黏连蛋白CohA的结合能力明显增强，其中在钙离子浓度5×10^-4M时与黏连蛋白CohA的AbsResp值对接活性是DocA的4.12倍。

表五 纤维小体对接蛋白突变体与黏连蛋白在不同钙离子浓度下结合能力分析

SEQUENCE LISTING

<110> 齐鲁工业大学

<120> 一种活性提高的纤维小体对接蛋白突变体36741及应用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 261

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggtgctgc tgggtgacgt gaatggtgac ggtaccatta atagcaccga tctgaccatg 60

ctgaaacgtt ctgttctgcg tgccattacc ctgaccgatg atgccaaagc ccgtgccgat 120

accagcaata atggcaccat taatgccgcc gatgttctgc tgctgtctcg ctatctgctg 180

cgtgttattg ataaaggagg aggcggctcg ggaggaggcg gctcgggagg aggcggctcg 240

catcatcatc atcatcatta a 261

<210> 2

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Val Leu Leu Gly Asp Val Asn Gly Asp Gly Thr Ile Asn Ser Thr

1 5 10 15

Asp Leu Thr Met Leu Lys Arg Ser Val Leu Arg Ala Ile Thr Leu Thr

20 25 30

Asp Asp Ala Lys Ala Arg Ala Asp Thr Ser Asn Asn Gly Thr Ile Asn

35 40 45

Ala Ala Asp Val Leu Leu Leu Ser Arg Tyr Leu Leu Arg Val Ile Asp

50 55 60

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

65 70 75 80

His His His His His His

85

<210> 3

<211> 261

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggtgctgc tgggtgacgt gaatggtgac ggtaccatta atagcaccga tctgaccatg 60

ctgaaacgtt ctgttctgcg tgccattacc ctgaccgatg atgccaaagc ccgtgccgat 120

gtggataaaa atggcagcat taatgccgcc gatgttctgc tgctgtctcg ctatctgctg 180

cgtgttattg ataaaggagg aggcggctcg ggaggaggcg gctcgggagg aggcggctcg 240

catcatcatc atcatcatta a 261

<210> 4

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Val Leu Leu Gly Asp Val Asn Gly Asp Gly Thr Ile Asn Ser Thr

1 5 10 15

Asp Leu Thr Met Leu Lys Arg Ser Val Leu Arg Ala Ile Thr Leu Thr

20 25 30

Asp Asp Ala Lys Ala Arg Ala Asp Val Asp Lys Asn Gly Ser Ile Asn

35 40 45

Ala Ala Asp Val Leu Leu Leu Ser Arg Tyr Leu Leu Arg Val Ile Asp

50 55 60

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

65 70 75 80

His His His His His His

85

<210> 5

<211> 516

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgagcgacg gtgtggtggt ggaaattggc aaagtgaccg gtagcgtggg taccaccgtg 60

gaaattccgg tgtactttcg cggtgttccg agcaaaggta tcgccaactg cgattttgtt 120

ttccgctacg atccgaacgt gctggaaatc atcggcatcg atccgggtga catcatcgtg 180

gacccgaatc cgaccaagag cttcgatacc gccatttacc cggaccgcaa aatcattgtg 240

ttcctgttcg cagaggatag cggtaccggt gcctatgcca tcaccaaaga tggcgtgttc 300

gcaaagattc gcgcaaccgt gaaaagtagc gcaccgggct acattacctt tgacgaggtg 360

ggtggctttg ccgataacga tctggtggaa cagaaggtga gcttcattga cggtggcgtt 420

aacgtgggta atgccacacc gaccaagggt ggaggaggcg gctcgggagg aggcggctcg 480

ggaggaggcg gctcgcatca tcatcatcat cattaa 516

<210> 6

<211> 171

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Ser Asp Gly Val Val Val Glu Ile Gly Lys Val Thr Gly Ser Val

1 5 10 15

Gly Thr Thr Val Glu Ile Pro Val Tyr Phe Arg Gly Val Pro Ser Lys

20 25 30

Gly Ile Ala Asn Cys Asp Phe Val Phe Arg Tyr Asp Pro Asn Val Leu

35 40 45

Glu Ile Ile Gly Ile Asp Pro Gly Asp Ile Ile Val Asp Pro Asn Pro

50 55 60

Thr Lys Ser Phe Asp Thr Ala Ile Tyr Pro Asp Arg Lys Ile Ile Val

65 70 75 80

Phe Leu Phe Ala Glu Asp Ser Gly Thr Gly Ala Tyr Ala Ile Thr Lys

85 90 95

Asp Gly Val Phe Ala Lys Ile Arg Ala Thr Val Lys Ser Ser Ala Pro

100 105 110

Gly Tyr Ile Thr Phe Asp Glu Val Gly Gly Phe Ala Asp Asn Asp Leu

115 120 125

Val Glu Gln Lys Val Ser Phe Ile Asp Gly Gly Val Asn Val Gly Asn

130 135 140

Ala Thr Pro Thr Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

145 150 155 160

Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His

165 170

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgccgatacc agcaataatg gcaccattaa tgcc 34

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cattaatggt gccattattg ctggtatcgg cacgg 35

<210> 9

<211> 5528

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

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aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

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