阅读说明：本技术 一种3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯在抑制细菌群体感应系统活性中的应用 (Application of methyl 3,4, 5-trihydroxybenzoate in inhibition of activity of bacterial quorum sensing system ) 是由 朱虎 孙世伟 王颖璐 常爱平 李丽 鱼晓丹 于 2019-10-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯在抑制细菌群体感应系统活性中的应用。本发明的目的在于提供一种在不抑制铜绿假单胞菌和紫色杆菌菌体生长的浓度范围内能够显著地降低相关致病因子表达的化合物,由此不会对致病菌产生生存压力,从而减弱其耐药性的产生。(The invention discloses application of methyl 3,4, 5-trihydroxybenzoate in inhibiting activity of a bacterial quorum sensing system. The invention aims to provide a compound which can obviously reduce the expression of related pathogenic factors within a concentration range without inhibiting the growth of pseudomonas aeruginosa and violaceous bacillus, thereby generating no survival pressure on pathogenic bacteria and weakening the generation of drug resistance.)

一种3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯在抑制细菌群体感应系统活性 中的应用

技术领域

本发明属于生物医院技术领域，具体涉及一种3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯在抑制细菌群体感应系统活性中的应用。

背景技术

群体感应(Quorum sensing，QS)是细菌自身通过分泌的自诱导剂(Autoinducer，AI)作为信号分子进行信息交流和自我协调的一个行为，信号分子随着细菌密度增加而增加，积累到一定浓度时，细菌感受到自身的密度，启动菌体中特定基因的表达，改变和协调细胞之间的行为，从而表现出单个细菌无法完成的生理功能和调节机制。细菌通过感知周围环境中的信号分子量来调节自身生长，同时产生信号分子来影响周围其他细菌的活动行为，启动相应的基因表达以适应环境的变化，如生物膜形成、毒力因子的表达等都受群体感应系统控制。因此通过抑制群体感应信号系统，能有效减少细菌毒力因子的分泌，从而减弱细菌的致病性，而且与传统的抗生素的作用机制完全不同，细菌QS抑制因子通过干扰细菌QS系统实现抗感染的目的，在不抑制细菌的生长的情况下，直接抑制细菌相关毒力因子的表达，降低或者失去对宿主的伤害能力。由于对细菌没有生存压力，理论上不会产生细菌耐药性，因此，干扰QS系统是一个很有前景的降低毒力因子产生、抑制生物被膜的形成以及提高药物敏感性的途径，将为治疗细菌感染的药物研制带来启发。

3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯，天然来源主要包括漆树科植物盐肤木、无患子科植物栾树、蔷薇科植物多花蔷薇、大戟科植物南大戟、木麻黄科植物木麻黄等，在微生物代谢产物中也有少量报道。目前报道的主要活性为抗菌作用，对耐酸菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌都具有抑菌活性，并且能抑制真菌生长。目前，尚未有文献报道该化合物在其亚抑菌浓度下能够抑制细菌的群体感应系统，因此，市面上也尚未有与此类似的药物出现。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯在抑制细菌群体感应系统活性中的应用，该活性化合物在不抑制铜绿假单胞菌和紫色杆菌菌体生长的浓度范围内能够显著地降低相关致病因子的表达，对致病菌不产生生存压力，从而减弱其耐药性的产生。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯在抑制细菌群体感应系统活性中的应用。

进一步地，该3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯的化学结构式为：

进一步地，细菌为紫色杆菌或铜绿假单胞菌。

进一步地，3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯的浓度为1～20μg/mL时，能在不影响紫色杆菌和铜绿假单胞菌生长的前提下，抑制其群体感应系统调控的毒力因子的合成。

进一步地，毒力因子为绿脓菌素和紫色素。

上述3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯的方法，包括以下步骤：

(1)将原材料加入至甲醇溶液中，500～600W超声萃取30～60min，再置于25～30℃，150～200rpm摇床震荡提取40～60h，过滤，分别收集提取液和滤渣；所述原材料与甲醇的固液比为1～2:50～100；

(2)再用甲醇溶液按照步骤(1)所述过程对滤渣进行提取2～3次，合并提取得到的所有提取液后，浓缩得浸膏；所述滤渣与甲醇的固液比为0.5～1:20～50；

(3)采用洗脱液对浸膏进行硅胶柱层析，合并洗脱得到的组分，再对其进行减压浓缩即可。

进一步地，步骤(1)中原材料与甲醇的固液比为1:50。

进一步地，步骤(1)中超声功率为560W，摇床培养条件为：25℃，150rpm。

进一步地，步骤(3)中的洗脱过程为：

依次使用石油醚、石油醚:二氯甲烷(V:V＝1:2)、石油醚:二氯甲烷(V:V＝1:1)、二氯甲烷、二氯甲烷:丙酮(V:V＝50:1)、二氯甲烷:丙酮(V:V＝10:1)、二氯甲烷:丙酮(V:V＝1:1)和丙酮冲洗硅胶柱，每次洗脱体积为3个柱体积，然后收集合并石油醚:二氯甲烷(V:V＝1:1)与二氯甲烷洗脱得到的组分即可。

一种用于治疗铜绿假单胞菌引起的感染的药物，包括上述3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯，以及3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯在药学上可接受的辅助成分。

一种用于治疗紫色杆菌引起的感染的药物，包括上述3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯，以及3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯在药学上可接受的辅助成分。

本发明的有益效果为：

本发明涉及的活性化合物3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯具有抑制铜绿假单胞菌和紫色杆菌感染的作用；该化合物在1～20μg/mL浓度范围内不抑制铜绿假单胞菌和紫色杆菌的菌体生长，但能显著地降低绿脓菌素和紫色素的生成，且呈现浓度依赖性。

3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯在多种植物中广泛存在，并且含量较高，此外还可以通过人工合成的方式获得。因此，本发明具有制备原料易获得、制备方法简单、不会产生耐药性作用等优点。

附图说明

图1为粗浸膏细菌群体感应抑制活性筛选；

图2为不同浓度3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯对绿脓菌素产量的影响；

图3为不同浓度3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯对紫色杆菌菌体生长及紫色素产量的影响。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1 3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯提取分离及结构鉴定

1、甲醇粗浸膏制备方法：称取1g五倍子粉末，加入50mL甲醇溶液，于560W超声萃取30分钟，再置于25℃，150rpm摇床震荡提取48小时。过滤得滤液与滤渣。滤渣再用20mL甲醇溶剂依照上述方法提取两遍，共得3次滤液，合并，真空浓缩得粗浸膏。

2、化合物的分离纯化：上述粗浸膏用适量硅胶H拌样后，采用减压硅胶柱层析柱进行分离，使用不同比例的洗脱剂石油醚、石油醚:二氯甲烷(V:V＝1:2)、石油醚:二氯甲烷(V:V＝1:1)、二氯甲烷、二氯甲烷:丙酮(V:V＝50:1)、二氯甲烷:丙酮(V:V＝10:1)、二氯甲烷:丙酮(V:V＝1:1)、丙酮分别冲洗硅胶柱，每个洗脱组分以3个柱体积进行洗脱。收集石油醚:二氯甲烷(V:V＝1:1)与二氯甲烷洗脱的组分，减压浓缩后采用Sephadex LH20凝胶柱层析进行二次分离，甲醇为洗脱液。以紫色杆菌为指示菌株，检测各收集组分的群体感应抑制活性，其结果见图1，再合并活性流分，减压浓缩后用高效液相制备系统以甲醇：水＝50:50比例进行纯化，得到具有QS抑制活性的单体化合物。

3、活性化合物的结构鉴定：综合利用质谱和核磁共振技术对化合物进行结构鉴定。阳离子质谱在185处给出[M+H]⁺峰，207处给出[M+Na]⁺峰，提示化合物的分子量为184。结合一维核磁数据，推测化合物的分子式分别为C₈H₈O₅。查阅文献(J Nat Prod.,1986,49(6):1149-1150)，比对核磁数据发现两者的¹H-NMR、¹³C-NMR谱数据与文献一致，因此确定化合物为3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯。

该化合物结构式如下：

该化合物的核磁数据如表1所示：

表1 3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯的¹H-NMR和¹³C-NMR数据(600MHz and 150MHz,DMSO-d6)

position	δ<sub>C</sub>	δ<sub>H</sub>(J in Hz)
			1	119.8
2	108.9	6.96(1H,s)
			3	146.0
4	138.8	6.96(1H,s)
			5	146.0
6	108.9
			7	166.8
8	52.0	3.75(3H,s)
			3-OH		9.27(1H,brs)
4-OH		8.94(1H,brs)
			5-OH		9.27(1H,brs)

实施例2 3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯抑制铜绿假单胞菌QS活性的分析

绿脓菌素筛选方法：活化培养的铜绿假单胞菌稀释至OD_600nm＝0.1，每瓶10mL；分别加入20μL不同浓度的化合物3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯，DMSO作为对照，37℃震荡培养24小时。培养结束后，分别取2mL上清液加入1mL氯仿震荡萃取，留下层有机相，再加入0.3mL盐酸溶液(0.2M)震荡萃取，取上层水相200μL加入到96孔微孔板中，用酶标仪测520nm的吸光度，以表征绿脓菌素的含量，其结果见图2。

如图2所示，3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯能抑制铜绿假单胞菌绿脓菌素的合成，呈浓度依赖性，在50μg/mL时的抑制率为55％。

实施例3 3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯抑制紫色杆菌QS活性的分析

紫色杆菌筛选模型及其方法：活化培养的紫色杆菌CV026菌液稀释至OD_600nm＝0.1，每瓶10mL；分别加入20μL不同浓度的化合物3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯，50μL信号分子和20μL的卡那霉素，放入摇床28℃、160rmp培养18h；DMSO溶剂做空白对照。

培养结束后，6000rmp离心10min，弃上清，用1mL DMSO重新溶解，再离心(6000rmp，10min)，将上清液分别倒入已标记好的离心管中，依次取200μL上清液加入到96孔微板中，用酶标仪在585nm处测其吸光度，以表征紫色素的产量。

第二次离心获得的沉淀，加入1mL的无菌水重新悬浮菌体，取200μL菌体悬浮液加入到96孔微孔板中，用酶标仪在600nm处测吸光度，以表征菌体生长密度的变化。

如图3所示，3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯在1～20μg/mL浓度范围内对紫色杆菌CV026的生长不产生影响，但是能够显著的降低紫色素的产量，且随着浓度的增加，降低紫色素产量的作用越明显，呈浓度依赖性，当浓度大于20μg/mL时，对紫色杆菌的生长呈现明显的抑制作用，在加入50μg/mL时抑制率达到70％，因而起到杀菌作用。