阅读说明：本技术 一种利用秸秆废弃物制备禾谷镰刀菌抑制剂的方法及应用 (Method for preparing fusarium graminearum inhibitor by using straw waste and application ) 是由 高弢 徐剑宏 史建荣 刘馨 于 2019-10-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种利用秸秆废弃物制备禾谷镰刀菌抑制剂的方法,在氮气气氛中、350-550℃下密闭裂解,冷凝在裂解过程中产生的挥发份气体,并收集冷凝液,同时控制冷凝液的收率为秸秆总重量的20％～30％,即得一种禾谷镰刀菌抑制剂的原液；将所述原液稀释200-500倍,于小麦扬花期前直接喷施于麦穗和植株上,具有显著的抑制小麦禾谷镰刀菌生长的效果,可有效预防小麦赤霉病。本发明禾谷镰刀菌抑制剂的原液制备方法简单、成本低廉,无化学物质的添加,所制得的禾谷镰刀菌抑制剂使用方法简单,是一种绿色、环境友好的化学农药替代物；本发明产生的剩余固体产物还可以作为肥料施用于农田,无毒害物质产生,安全环保。(The invention relates to a method for preparing a fusarium graminearum inhibitor by utilizing straw wastes, which comprises the steps of hermetically cracking the fusarium graminearum inhibitor at 550 ℃ in a nitrogen atmosphere, condensing volatile gas generated in the cracking process, collecting condensate, and controlling the yield of the condensate to be 20-30% of the total weight of straws to obtain a stock solution of the fusarium graminearum inhibitor; the stock solution is diluted by 200-fold and is directly sprayed on wheat ears and plants before the wheat flowering period, so that the growth effect of fusarium graminearum is remarkably inhibited, and wheat scab can be effectively prevented. The stock solution of the fusarium graminearum inhibitor is simple in preparation method, low in cost and free of addition of chemical substances, and the prepared fusarium graminearum inhibitor is simple in use method and is a green and environment-friendly chemical pesticide substitute; the residual solid product produced by the invention can also be used as a fertilizer to be applied to farmlands, has no toxic and harmful substances, and is safe and environment-friendly.)

一种利用秸秆废弃物制备禾谷镰刀菌抑制剂的方法及应用

技术领域

本发明涉及一种利用秸秆废弃物制备禾谷镰刀菌抑制剂的方法及应用。

背景技术

小麦是世界上种植面积最大，产量最多的粮食作物之一，其种植与病害防治问题关乎全球粮食供给与安全。小麦赤霉病是一种流行性病害，在世界范围内均会发生，该病害在多雨、气候潮湿的地区发生较多，在小麦生长的穗期容易流行。根据相关报道，我国的小麦赤霉病已经成为小麦生产中最重要的病害之一。小麦赤霉病发病之后引起小麦减产，严重时颗粒无收。我国引起小麦赤霉病的病原菌有很多，其中禾谷镰刀菌F.graminearum和黄色镰孢菌F.culmorum最为常见。在气候比较温暖的地域，小麦赤霉病的优势病原菌为禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schw.)。近年来，由于秸秆还田免耕等保护性耕作技术的推广和全球气候变暖等因素的共同影响，小麦赤霉病在世界范围内持续扩张和流行，在我国华北和西北麦区开始流行并有加重趋势，严重影响小麦的生产与安全。据估计，我国小麦受害面积约为750万公顷，占栽培面积的1/4，小麦产量损失巨大。赤霉病是由镰刀菌属真菌引起，会产生以脱氧雪腐镰刀菌烯醇(即呕吐毒素DON)为主的真菌毒素，对人畜都有较大的危害，食用病麦会引起眩晕、发烧、恶心、腹泻等急性中毒症状，严重时会引起出血，影响免疫力和生育力等，直接对人畜健康和生命安全构成威胁，因此，小麦中病麦率含量达到4％以上时即不能食用，同时说明小麦已失去商品价值。

自20世纪70年代以来，生产上一直使用多菌灵及其复配剂来防治禾谷镰刀菌的危害。然而，由于镰刀菌逐渐形成了对多种杀菌剂的耐药性，以致绝大多数杀菌剂及麦类赤霉病的防治效果并不理想，并且杀菌剂的用量逐渐增加，加大了食品和环境中农药的残留，危及人类和生态系统健康。随着人们对环境和健康问题的日益重视，急需大力推进绿色防控控制病害从而减少化学农药施用的技术。

植物源杀菌剂是指用植物的某些活性部分或提取其有效成分，以及分离纯化的单体物质加工而成的用于防治植物病害的药剂，包括植物源杀真菌剂、杀细菌剂、病毒抑制剂和杀线虫剂。据报道，约1389种植物有可能作为杀菌剂，研究结果显示，全世界抑菌杀菌植物资源极其丰富，然而大部分集中在菊科(Compositae)、豆科(Leguminosae)、百合科(Liliaceae)、姜科(Zingiberaceae)、唇形科(Labiatae)、芸香科(Rutaceae)、桃金娘科(Myrtaceae)、禾本科(Poaceae)和樟科(Lauraceae)等植物中。此外，植物源农药对来源植物种类要求相对较高，且提取工艺复杂，活性成分易分解。

而农作物秸秆已经成为农村面源污染的新源头。每年夏收和秋冬之际，总有大量的小麦、玉米等秸秆在田间焚烧，产生了大量浓重的烟雾，不仅成为农村环境保护的瓶颈问题，甚至成为殃及城市环境的罪魁祸首。据统计，我国作为农业大国，每年可生成7亿多吨秸秆，成为“用处不大”但必须处理掉的“废弃物”。由此，如何提高农作物秸秆的综合开发利用及其利用率是问题的关键。

现有技术报道了：公开号CN107173398A，名称为防治小麦赤霉病的植物源杀菌剂，公开了利用苦豆子粉和牛心朴子粉的乙醇提取物制备小麦赤霉杀菌剂。公开号为CN105309522A，名称为一种用于赤霉病的植物源杀菌剂，公开了一种利用铜陵凤丹皮提取物、三七茎叶提取物、山楂叶提取物、广藿香精油、岩兰草精油、商枝、续断、绥草、缘豆等植物提取的杀菌成分。上述类似熬中药的方法虽然技术门槛高但也可能不适合中国广袤的农业需求。因此，如何将我国大量秸秆废弃物资源化利用，特别是携带病原菌的小麦秸秆转变为可利用的植物源禾谷镰刀菌的抑制剂是一项具有挑战和创新的研究工作。

还有报道发现利用玉米秸秆废弃物制备的木醋液对水果蔬菜如西红柿和樱桃具有保鲜作用(公开号为CN 108576203A)，能够抑制常见腐烂真菌、细菌，例如金黄色葡萄球菌、青霉菌、沙门氏菌等。有关木醋液的抑菌机理，有学者认为主要是木醋液中的酸性物质刺激植物而启动防御机制产生防御物质，提高抗性；再通过促进根际和植物表面有益微生物的生长繁殖来抑制有害微生物，调节和改善植物的微生物环境(参见倪维龙博士论文《木醋液抑菌作用及对寒公主桃保鲜效果的研究》)。

发明内容

针对小麦禾谷镰刀菌引起的赤霉病害防治问题及如何将秸秆废弃物资源化利用，本发明的目的在于将这两项问题有机结合，而提供了一种利用秸秆废弃物制备禾谷镰刀菌抑制剂的方法及应用。

一种利用秸秆废弃物制备禾谷镰刀菌抑制剂的方法：通过将秸秆废弃物在0.1-0.5m³/min流速的氮气气氛中、以5-20℃/min的升温速率加热至350-500℃下密闭裂解，冷凝在裂解过程中产生的挥发份气体并收集冷凝液，同时控制冷凝液的收率为秸秆总重量的20％～30％，所得冷凝液即为禾谷镰刀菌抑制剂的原液。

所述升温速率太快产生的冷凝液中有效抑制剂组分较少，大部分为焦油，且杀菌效果差。氮气流速主要影响挥发份的流出与冷凝速度，控制其流速如果较慢则容易使罐体压力增大，如果较快则容易使挥发份流出速度太快导致冷凝液收率较低且收集的冷凝液杀菌效果差，并且浪费氮气，增加成本；此区间流速适中。上述裂解过程类似于生物质气化过程，但是产生的并不是如常规生物质气化所产生的可燃气(生物质气化需要高于500℃以上的较高温度，产生如一氧化碳、氢气等可燃气)，而是小分子有机物挥发份(如酸类、醇类、酚类、酮类、烷烃等)，在合适的升温速率下将温度加热至350-500℃中低温下、控制较慢氮气流速及裂解时间，使氮气持续保护和带出挥发份，然后冷凝才能得到20％～30％秸秆总重量的冷凝液；如果得到的冷凝液超过30％秸秆总重量说明裂解条件没控制好发生了生物质的气化，如果得到的冷凝液小于20％秸秆总重量，说明升温速率太快且转化率低，不仅增加成本，得到的原液抑菌效果不佳。

进一步地，所述秸秆废弃物为小麦、玉米、水稻、棉花、大豆中的一种或几种。

进一步地，所述秸秆废弃物须控制其水分含量低于25％，并粉碎至直径小于1厘米小段。秸秆废弃物粉碎后的直径越小，在发生热裂解时产生的挥发份就越充分，若是不粉碎或是直径较大则会发生秸秆废弃物受热不均匀，所产生的挥发份经冷凝后的产物性质不稳定。

进一步地，在所述裂解过程中须在350-550℃温度下保持1-2h再进行冷凝。

进一步地，所述禾谷镰刀菌抑制剂的制备方法还包括将所得的原液进行静置并过滤残渣的步骤。目的使原液进一步纯化。

本发明另一目的是提供利用上述方法制得禾谷镰刀菌抑制剂在小麦赤霉病上的应用。

进一步地，所述应用，须将禾谷镰刀菌抑制剂的原液稀释200-500倍，于小麦扬花期前直接喷施于麦穗和植株上，可有效预防禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病。若不稀释，过高的原液浓度对植物有伤害，而稀释一定倍数后不仅具有显著的杀菌效果还对植物无害。

进一步地，上述应用，所述喷施的方法为20-50公斤/亩/次的喷施量，隔5～7天喷施一次，喷施次数为2-5次，避开阴雨天施用。

有益技术效果：本发明涉及一种利用秸秆废弃物制备禾谷镰刀菌抑制剂的方法，在氮气气氛中、350-550℃下密闭裂解，冷凝在裂解过程中产生的挥发份气体，并收集冷凝液，同时控制冷凝液的收率为秸秆总重量的20％～30％，即得一种禾谷镰刀菌抑制剂的原液；将所述原液稀释200-500倍，于小麦扬花期前直接喷施于麦穗和植株上，具有显著的抑制小麦禾谷镰刀菌生长的效果，可有效预防小麦赤霉病。本发明禾谷镰刀菌抑制剂的原液制备方法简单、成本低廉，无化学物质的添加，所制得的禾谷镰刀菌抑制剂使用方法简单，是一种绿色、环境友好的化学农药替代物；不同于现有的许多需要利用中草药或松木等高值资源，本发明使用的原料来源于农作物的秸秆废弃物，即源于农业又反哺农业，有利于农业农村环境的治理和生物质废弃资源的循环利用；最后本发明产生的剩余固体产物还可以作为肥料施用于农田，无毒害物质产生，安全环保。

附图说明

图1为实施案例1中本发明制备的不同浓度抑制剂对禾谷镰刀菌菌丝生长的影响。

图2为实施例1中本发明制备的不同浓度抑制剂对禾谷镰刀菌菌丝的电导率影响图。

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例进一步描述本发明，但不限制本发明范围。

实施例1

禾谷镰刀菌抑制剂的制备：采集小麦秸秆，晾干至水分含量为20％并粉碎，过1厘米筛，称取1公斤粉碎后小麦秸秆置于马弗炉中以0.1m³/min速率通入氮气，采用10℃/min的升温速率将温度升高至400℃，并在此温度保持1.5小时，然后冷凝在裂解过程中产生的挥发份气体并收集冷凝液，同时控制冷凝液的收率，制得218克冷凝液，即为禾谷镰刀菌抑制剂的原液。

将所得上述原液静置2个月后，过0.22μm孔径细菌过滤器，备用。

对本实施例过滤后的原液进行干燥处理并进行GC-MS检测产物成分及含量，具体见表1。

表1过滤后原液的成分及相对含量

由表1可知，过滤并干燥后的原液中，酚类占大部分，还包括酸类、酮类、醛类、酯类和醇类，剩余为杂质。

实施例2

禾谷镰刀菌抑制剂的制备：采集小麦秸秆、水稻秸秆，晾干至水分含量为25％并粉碎，过1厘米筛，称取1公斤粉碎后小麦秸秆置于马弗炉中以0.5m³/min速率通入氮气，采用20℃/min的升温速率将温度升高至500℃，并在此温度保持1小时，然后冷凝在裂解过程中产生的挥发份气体并收集冷凝液，同时控制冷凝液的收率，制得234克冷凝液，即为禾谷镰刀菌抑制剂的原液。

将所得上述原液静置2个月后，过0.22μm孔径细菌过滤器，备用。

对本实施例过滤后的原液进行干燥处理并进行GC-MS检测产物成分，酚类相对含量为58.13，酸类相对含量为11.50、酮类相对含量为5.78、醛类相对含量为4.51、酯类相对含量为3.26、醇类相对含量为2.52，剩余为杂质。

实施例3

禾谷镰刀菌抑制剂的制备：采集小麦秸秆、水稻秸秆、棉花秸秆，晾干至水分含量为25％并粉碎，过1厘米筛，称取1公斤粉碎后小麦秸秆置于马弗炉中以0.3m³/min速率通入氮气，采用15℃/min的升温速率将温度升高至450℃，并在此温度保持1.2小时，然后冷凝在裂解过程中产生的挥发份气体并收集冷凝液，同时控制冷凝液的收率，制得287克冷凝液，即为禾谷镰刀菌抑制剂的原液。

将所得上述原液静置2个月后，过0.22μm孔径细菌过滤器，备用。

对本实施例过滤后的原液进行干燥处理并进行GC-MS检测产物成分，酚类相对含量为57.87，酸类相对含量为11.69、酮类相对含量为5.82、醛类相对含量为4.60、酯类相对含量为3.35、醇类相对含量为2.61，剩余为杂质。

对比例1

本对比例与实施例1的制备方法相同，不同点在于：升温速率为25℃/min，氮气流速为0.6m³/min，制得冷凝液113克。

对比例2

本对比例与实施例1的制备方法相同，不同点在于升温速率为3℃/min，氮气流速为0.08m³/min，制得冷凝液536克。

应用例1

(1)、加热PDA固体培养基使其形成液体，将上述实施例1过滤后的禾谷镰刀菌抑制剂的原液与液体PDA培养基均匀混合形成混合液，使禾谷镰刀菌抑制剂的原液最终浓度分别为0、2、4、6、8、10μL/mL，上述混合液分别倒入直径为9cm的灭菌培养皿中制成平板，每皿接种一菌碟的禾谷镰刀菌，菌丝面朝上，每个浓度平板接种3次。25℃培养至对照菌落-禾谷镰刀菌(记为CK，即原液浓度为0μL/mL即不添加原液)布满培养皿三分之二以上时，十字交叉法测量菌落生长直径并计算EC₅₀值，数据见表2。

图1为本应用例的不同浓度下原液对禾谷镰刀菌生长的抑制效果对比图，结果表明，随着原液浓度的增加，禾谷镰刀菌的菌落直径逐渐减小，由此证明由秸秆废弃物制备的禾谷镰刀菌抑制剂具有显著杀灭该菌的效果。

(2)、将上述实施例1过滤后的禾谷镰刀菌抑制剂的原液与绿豆汤培养液均匀混合形成混合液，使禾谷镰刀菌抑制剂的原液在上述混合液中的浓度分别为0、2、4、6、8、10μL/mL，每100mL上述混合液中加入5个菌碟，25℃，180rpm光照摇培5d，使用细胞计数器计算分生孢子产生量，数据见表2。

(3)、将上述实施例1过滤后的禾谷镰刀菌抑制剂的原液与YEPD培养液均匀混合形成混合液，使禾谷镰刀菌抑制剂的原液在上述混合液中的浓度分别为0、2、4、6、8、10μL/mL，每100mL上述混合液中加入1×10⁵个分生孢子，25℃，180rpm光照摇培24小时后计算分生孢子萌发率，数据见表2。

(4)、将1×10⁵个分生孢子接入MS培养液，25℃，180rpm避光摇培24小时后加入上述实施例1过滤后的禾谷镰刀菌抑制剂的原液，使其浓度分别为0、2、4、6、8、10μL/mL，继续摇培7d，测定DON毒素含量，数据见表2。

(5)、将1×10⁵个分生孢子接入YEPD培养液，25℃，180rpm摇培24小时后加入上述实施例1过滤后的禾谷镰刀菌抑制剂的原液，使其终浓度分别为0、2、4、6、8、10μL/mL，继续摇培24h后，测定不同抑制剂浓度下所培养的禾谷镰刀菌菌丝的电导率，如图2所示。

由图2可知，与不加抑制剂对照组(即CK)相比，2、4、6、8、10μL/mL浓度下抑制剂处理的禾谷镰刀菌菌丝溶液的电导率明显高于无抑制剂处理的对照CK菌丝，且随着处理时间的延长和处理抑制剂浓度的升高，电导率逐渐上升。以上结果可能是因为本发明利用秸秆废弃物获得的抑制剂会对禾谷镰刀菌的呼吸作用起到一定的抑制作用，造成禾谷镰刀菌细胞膜的破裂，随着细胞膜的破裂造成禾谷镰刀菌胞内物质外渗，使得胞外溶液的电导率升高，从而引起菌体死亡。

以上(1)、(2)、(3)、(4)步骤在不同稀释倍数下禾谷镰刀菌抑制剂的抑菌效果，如表1数据所示。

表2不同稀释倍数下禾谷镰刀菌抑制剂的抑菌效果

由表2可知，本发明利用秸秆废弃物制备的禾谷镰刀菌抑制剂在2μL/mL这一较低浓度下即表现出较好的抑制禾谷镰刀菌的效果；通过菌丝生长直径计算在不同浓度下原液对禾谷镰刀菌的抑制率，并以此计算禾谷镰刀菌的半致死率EC₅₀，得出抑制剂的浓度为2.54μL/mL；上述证明，原液浓度在2～3μL/mL能够表现出很好的抑制禾谷镰刀菌生长的效果。当稀释浓度达到8μL/mL时禾谷镰刀菌的菌丝已无法生长，并且孢子产生量、孢子萌发率及毒素合成均降至0，表明禾谷镰刀菌全部死亡和失活。

实施例2和实施例3具有与实施例1相同的效果。

将对比例1和对比例2按照(1)步骤进行实验，发现在对比例1和对比例2条件下制备的抑制剂在2μL/mL浓度下对禾谷镰刀菌的没产生抑制效果，需要在达到12μL/mL以上的浓度才能表现出较好的抑制禾谷镰刀菌的效果。

应用例2

为验证本发明获得的禾谷镰刀菌抑制剂原液在田间防治效果，将实施例1、实施例2、实施例3所获得禾谷镰刀菌抑制剂原液混合，采用普通自来水稀释200倍、500倍和1000倍备用。

于小麦杨花期直接喷施于麦穗和植株上，喷施方法为：25公斤/亩/次的喷施量，隔6天喷施一次，喷施次数为3次，避开阴雨天施用。

对比例3

本对比例不喷施用任何农药。

对比例4

本对比例喷施常用的多菌灵杀菌剂，采用市场常用杀菌剂配方50％多菌灵，喷施方法与应用例2相同。

对比应用例2和对比例1～2的田间实际防治禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病效果，发病率及病情指数见表3。

表3不同稀释倍数禾谷镰刀菌抑菌剂对小麦赤霉病的防治效果

由表3可知，本发明制备禾谷镰刀菌抑菌剂可有效预防并降低田间小麦赤霉病的实际发病率，其禾谷镰刀菌抑菌剂稀释500倍后即达到化学杀菌剂(对比例2的50％多菌灵)的预防效果；并且当喷施稀释200倍的禾谷镰刀菌抑制剂后，小麦赤霉病的发病率和病情指数大幅降低，较对比例1分别降低了59.7％和62.8％，具有显著的抑制小麦禾谷镰刀菌的效果；较对比例2分别降低了31.2％和25.6％。结果表明，本发明禾利用秸秆废弃物制得的谷镰刀菌抑制剂在稀释500倍后即可达到化学农药的防治小麦赤霉病的效果，可有效减轻小麦赤霉病给小麦生产带来的威胁。

本发明利用农作物秸秆废弃物，生产过程中清洁、绿色、环保，且制备的植物源禾谷镰刀菌抑制剂对小麦赤霉病的防治效果优于常用的化学农药，可有效替代化学杀菌剂。