阅读说明：本技术 超声辅助透析驱动玉米醇溶蛋白自组装制备纳米颗粒方法 (Method for preparing nano particles by self-assembling zein driven by ultrasonic-assisted dialysis ) 是由 周存山 余筱洁 陈慧琳 张磊 宋晓倩 李墨 于 2019-09-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了超声辅助透析驱动玉米醇溶蛋白自组装制备纳米颗粒方法,属于功能性食品技术领域。本发明使用组合频率超声辅助透析来制备纳米颗粒,前期使用超声辅助透析,后期只使用透析。本发明特点在于：一是使用了无酒精食品中的添加剂丙二醇(GRAS),避免使用酒精,降低了易燃易爆的风险,减少了生产成本。二是在去除溶剂时利用双相物理驱动力(超声与浓度差)促进形成均匀、尺寸较小的纳米颗粒。三是避免使用酸碱溶液,反应过程易于实现自动化生产。最终不同组合频率超声对形成经过超声处理后的纳米颗粒粒径明显减小,并且提高了纳米粒子的储藏稳定性,为生物活性化合物的递送系统提供新方法。(The invention discloses a method for preparing nanoparticles by driving self-assembly of zein through ultrasonic-assisted dialysis, and belongs to the technical field of functional foods. The invention uses the combined frequency ultrasonic auxiliary dialysis to prepare the nano particles, the ultrasonic auxiliary dialysis is used in the early stage, and only the dialysis is used in the later stage. The invention is characterized in that: firstly, the additive propylene Glycol (GRAS) in alcohol-free food is used, alcohol is avoided, the risk of flammability and explosiveness is reduced, and the production cost is reduced. And secondly, the two-phase physical driving force (ultrasound and concentration difference) is utilized to promote the formation of uniform and small-sized nano particles when the solvent is removed. Thirdly, acid-base solution is avoided, and the reaction process is easy to realize automatic production. Finally, the particle size of the nanoparticles after ultrasonic treatment is obviously reduced by ultrasonic treatment with different combined frequencies, the storage stability of the nanoparticles is improved, and a new method is provided for a delivery system of the bioactive compound.)

超声辅助透析驱动玉米醇溶蛋白自组装制备纳米颗粒方法

技术领域

本发明属于功能性食品技术领域，具体涉及利用超声辅助透析来驱动玉米醇溶蛋白自组装形成纳米颗粒的新方法。

背景技术

来源于有机生物聚合物并且粒径达到纳米级别的颗粒称为纳米粒子，纳米粒子粒径小、亲水性高、有较高的环境适应性，并且在胃肠消化中的吸收利用率较高，提高了被包封活性物质的生物利用度，因此纳米粒子被广泛应用在负载亲脂疏水营养素的递送系统中。

玉米醇溶蛋白是玉米胚乳中的主要储存蛋白，是玉米在食品工业生产中的主要副产品。它由不同分子量与溶解度的多肽组成，根据溶解度和氨基酸序列不同可分为四种：α-玉米醇溶蛋白(19和22KD)、β-玉米醇溶蛋白(14KD)、δ-玉米醇溶蛋白(16和27KD)、γ-玉米醇溶蛋白(10KD)。α-玉米醇溶蛋白占比最高，γ-玉米醇溶蛋白次之。玉米醇溶蛋白具有独特的天然理化特性，水溶性差，但能够溶解在高浓度的醇溶液中。利用玉米醇溶蛋白独特溶解性可制备食品级纳米颗粒，并且玉米醇溶蛋白被公认是安全的食品成分(GRAS)。玉米醇溶蛋白亲脂性氨基酸残基占比较高(≥50％)属高疏水性蛋白，因此具有递送非极性生物活性化合物的潜力。

玉米醇溶蛋白纳米粒子对加工环境具有高度敏感性，因此需要添加生物聚合物在其疏水性表面形成保护壳，避免纳米颗粒发生聚集沉淀。此外，添加的生物聚合物对形成的纳米颗粒的核壳结构还具有良好的储存稳定性、被包封物质的抗降解的稳定性和高包封效率。酪蛋白酸钠作为一种小分子表面活性剂，具有两亲性基团，可降低玉米醇溶蛋白的表面疏水性，增加静电引力和空间稳定性，防止玉米醇溶蛋白聚集，可用在反溶剂法、pH循环驱动、超声辅助透析等方法形成的食品级纳米颗粒递送系统中。

超声辅助透析驱动玉米醇溶蛋白纳米颗粒自组装的原理是利用玉米醇溶蛋白在不同极性溶剂中的溶解度不同。玉米醇溶蛋白首先溶解在溶剂中，在超声辅助作用下，玉米醇溶蛋白溶液分散，溶剂在浓度差与超声的驱动力下，与强极性溶剂水进行传质，从而不断降低溶剂的浓度，玉米醇溶蛋白逐渐形成纳米微球，并且在超声机械效应、空化作用下，形成均一稳定、粒径较小的玉米醇溶蛋白纳米颗粒。

制备玉米醇溶蛋白自组装纳米颗粒的方法有反溶剂法、pH循环驱动法等。反溶剂法中通常使用乙醇，乙醇不能应用于无酒精食品，并且易燃，对于工业生产过程十分不利，粒径大小取决于滴加反溶剂的体积，并且去除溶剂旋蒸操作过程较为繁琐，增加生产成本，不利于自动化生产过程。pH循环驱动法避免了使用乙醇，但是需要精确调控pH，使用大量的酸碱溶液，并且调节过程属于动态变化过程，影响因素较多。

为了解决这些问题，本发明使用组合频率超声辅助透析来制备纳米颗粒，一是使用了无酒精食品中的添加剂丙二醇(GRAS)，避免使用酒精，降低了易燃易爆的风险，减少了生产成本。二是在去除溶剂时利用双相物理驱动力(超声与浓度差)促进形成均匀、尺寸较小的纳米颗粒。三是避免使用酸碱溶液，反应过程易于实现自动化生产。最终不同组合频率超声对形成经过超声处理后的纳米颗粒粒径明显减小，并且提高了纳米粒子的储藏稳定性，为生物活性化合物的递送系统提供新方法，并且提高了对于环境耐受力较弱的营养素的生物利用度，扩大了亲脂性生物活性化合物在功能性食品的应用范围。

发明内容

本发明的目的是使用双相物理驱动力(超声与浓度差)形成均匀稳定、粒径较小的玉米醇溶蛋白纳米颗粒，前期使用超声辅助透析，后期只使用透析。并且避免使用乙醇，使用食品级添加剂丙二醇作为溶剂，开拓驱动玉米醇溶蛋白纳米颗粒自组装的新方法。

本发明的技术方案如下：

超声辅助透析驱动玉米醇溶蛋白自组装制备纳米颗粒的方法，按照下述步骤进行：

(1)称取一定质量的玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠溶解在丙二醇水溶液中，储备溶液磁力搅拌均匀目视无明显沉淀，离心去除不溶性的大颗粒，得到玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的二元混合溶液。

(2)将玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的二元混合溶液，装入一定长度的透析袋中，将透析袋密封好放入物料容器中，并加入去离子水；玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的二元混合溶液与去离子水的比例是1:20；

(3)把物料容器放置在超声槽中，设置超声频率、超声功率、超声时间、超声方式以及恒温水浴，超声60min，取出透析袋，重新加入与步骤(2)体积相等的去离子水在室温条件下进行透析。

(4)透析结束后，取出新鲜样品得到的是玉米醇溶蛋白复合纳米粒子胶体分散液。一部分样品4℃冰箱冷藏，另取一部分胶体溶液进行真空冷冻干燥48h。

其中步骤(1)中的玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的质量占比均为2％，丙二醇水溶液的浓度为80％(v/v)，二元混合溶液经5000rpm离心10min去除残留的大颗粒混合溶液的制备在室温下进行。

其中步骤(2)中的透析袋的规格为34mm(宽度)，截留分子量为8000-14000，使用的透析袋经过活化并且使用的长度为45cm。

其中步骤(3)中超声频率为组合频率超声，分别为20KHz、28KHz、40KHz、20KHz+28KHz、28KHz+40KHz、20KHz+40KHz、20KHz+28KHz+40KHz，超声功率为300W，超声方式为连续式超声，恒温水浴的温度为25℃。

与现有技术相比,本发明的优点和技术效果是：

1.本发明使用了双相物理驱动力，有助于玉米醇溶蛋白纳米颗粒的形成。在透析过程中加入了超声辅助处理，超声能够打开玉米醇溶蛋白内部的结构使其变得疏松，暴露出内部的发色基团，反应更加充分，从而与酪蛋白酸钠结合形成更为紧密的结构从而减小复合纳米颗粒的尺寸。并且在透析过程中加入的超声有助于提高传质速率，促进复合纳米颗粒的形成。

2.本发明中避免使用乙醇，从而减少去除乙醇的成本以及有利于无酒精食品的开发，更降低了易燃易爆的风险，并且操作过程中不使用有机试剂，整个过程简单容易操作，有利于包埋生物活性化合物的递送系统的连续化生产。

3.本发明利用超声辅助透析的新方法形成的玉米醇溶蛋白复合纳米颗粒，不仅颗粒的粒径小、均一稳定，并且可以提高复合纳米粒子的储藏稳定性。

4.本发明提高了玉米淀粉副产物的利用率，为生物活性化合物的递送系统提供新方法，并且提高了对于环境耐受力较弱的营养素的生物利用度，扩大了亲脂性生物活性化合物在功能性食品的应用范围。

附图说明

图1是超声辅助透析驱动玉米醇溶蛋白自组装制备纳米颗粒工艺流程图；

图2是不同组合频率超声辅助透析的纳米颗粒的荧光光谱图。

具体实施方式

下面结合具体实例以及数据，来进一步对本发明技术方案进行详细的描述。但这些实例并不对本发明的技术方案有限制作用，只是举例说明。

实施例1

(1)将一定质量的玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠溶解在80％(v/v)丙二醇水溶液中，玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的质量占比均为2％，储备溶液磁力搅拌均匀目视无明显沉淀，二元混合溶液经5000rpm离心10min去除残留的大颗粒，得到玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的二元混合溶液。

(2)量取20mL的玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的二元混合溶液，装入经过活化处理长度为45cm宽为34mm，截留分子量为8000-14000的透析袋中，将透析袋密封好放入物料容器中，并加入400mL的去离子水。

(3)把物料容器放置在室温条件下进行透析12h

(4)透析结束后，取出新鲜样品得到的是玉米醇溶蛋白复合纳米粒子胶体分散液。一部分样品4℃冰箱冷藏，另取一部分胶体溶液进行真空冷冻干燥48h。

(5)浊度测定：取新鲜样品，采用UV-vis紫外可见分光光度计在波长500nm波长下测定样品的吸光度值以表征样品的浊度。在室温条件下测定，每个样品测定三次，结果以平均值表示。

(6)粒径和Zeta电位的测定：在室温条件下采用动态光散射测定玉米醇溶蛋白二元纳米颗粒的粒度、PDI和Zeta电位。通过仪器基于Stokes-Einstein方程计算每个样品的粒径，而基于Smoluchowski模型计算表面电位，在测量之前将纳米颗粒分散体稀释到合适浓度以避免多重散射效应。所有测量一式三份取平均值。

(7)荧光光谱测定：为了选择性的激发色氨酸残基，以280nm为激发波长，扫描范围为290-450nm，扫描速度为1000nm/min，扫描间隔:1nm，激发带宽与发射带宽均设定为10nm。不进行超声处理的新鲜的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径为256.62±6.78nm，PDI为0.13±0.07，电位为-30.78±0.42mv，储存了15天的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径272.45±9.65nm，PDI为0.18±0.07电位为-20.46±2.93mv。在储藏过程中，未经超声处理的二元玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径呈现出粒径增加的趋势，PDI增大但是不显著，电位则是往减小的方向转移。

实施例2

(1)将一定质量的玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠溶解在80％(v/v)丙二醇水溶液中，玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的质量占比均为2％，储备溶液磁力搅拌均匀目视无明显沉淀，二元混合溶液经5000rpm离心10min去除残留的大颗粒，得到玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的二元混合溶液。

(2)量取20mL的玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的二元混合溶液，装入经过活化处理长度为45cm宽为34mm，截留分子量为8000-14000的透析袋中，将透析袋密封好放入物料容器中，并加入400mL的去离子水。

(3)把物料容器放置在超声槽中，设置超声频率为20KHz、超声功率为300w、超声时间60min、超声方式为持续式，恒温水浴温度为25℃，取出透析袋，重新加入400mL的去离子水在室温条件下进行透析11h。

(4)透析结束后，取出新鲜样品得到的是玉米醇溶蛋白复合纳米粒子胶体分散液。一部分样品4℃冰箱冷藏，另取一部分胶体溶液进行真空冷冻干燥48h。

(5)浊度测定：取新鲜样品，采用UV-vis紫外可见分光光度计在波长500nm波长下测定样品的吸光度值以表征样品的浊度。在室温条件下测定，每个样品测定三次，结果以平均值表示。

(6)粒径和Zeta电位的测定：在室温条件下采用动态光散射测定玉米醇溶蛋白二元纳米颗粒的粒度、PDI和Zeta电位。通过仪器基于Stokes-Einstein方程计算每个样品的粒径，而基于Smoluchowski模型计算表面电位，在测量之前将纳米颗粒分散体稀释到合适浓度以避免多重散射效应。所有测量一式三份取平均值。

(7)荧光光谱测定：为了选择性的激发色氨酸残基，以280nm为激发波长，扫描范围为290-450nm，扫描速度为1000nm/min，扫描间隔:1nm，激发带宽与发射带宽均设定为10nm。进行20KHz超声处理的新鲜的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径为239.90±8.57nm，PDI为0.11±0.04，电位为-37.78±0.38mv，储存了15天的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径254.75±12.10nm，PDI为0.16±0.06，电位为-31.44±2.31mv。与实施例1相比较，粒径明显减小，PDI减小，粒径分布较窄，粒度分布均匀，并且电位增加，说明超声促进了均一稳定二元玉米醇溶蛋白纳米颗粒的形成。在储藏过程中，二元玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径呈现出粒径增加的趋势，PDI增大但是不显著，电位则是往减小的方向转移，但是粒径和电位转移的程度均小于未经超声处理的二元玉米醇溶蛋白纳米颗粒，提高了二元纳米复合物的储藏稳定性。

实施例3

(1)将一定质量的玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠溶解在80％(v/v)丙二醇水溶液中，玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的质量占比均为2％，储备溶液磁力搅拌均匀目视无明显沉淀，二元混合溶液经5000rpm离心10min去除残留的大颗粒，得到玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的二元混合溶液。

(2)量取20mL的玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的二元混合溶液，装入经过活化处理长度为45cm宽为34mm，截留分子量为8000-14000的透析袋中，将透析袋密封好放入物料容器中，并加入400mL的去离子水。

(3)把物料容器放置在超声槽中，设置超声频率为28KHz、超声功率为300w、超声时间60min、超声方式为持续式，恒温水浴温度为25℃，取出透析袋，重新加入400mL的去离子水在室温条件下进行透析11h。

(4)透析结束后，取出新鲜样品得到的是玉米醇溶蛋白复合纳米粒子胶体分散液。一部分样品4℃冰箱冷藏，另取一部分胶体溶液进行真空冷冻干燥48h。

(5)浊度测定：取新鲜样品，采用UV-vis紫外可见分光光度计在波长500nm波长下测定样品的吸光度值以表征样品的浊度。在室温条件下测定，每个样品测定三次，结果以平均值表示。

(6)粒径和Zeta电位的测定：在室温条件下采用动态光散射测定玉米醇溶蛋白二元纳米颗粒的粒度、PDI和Zeta电位。通过仪器基于Stokes-Einstein方程计算每个样品的粒径，而基于Smoluchowski模型计算表面电位，在测量之前将纳米颗粒分散体稀释到合适浓度以避免多重散射效应。所有测量一式三份取平均值。

(7)荧光光谱测定：为了选择性的激发色氨酸残基，以280nm为激发波长，扫描范围为290-450nm，扫描速度为1000nm/min，扫描间隔:1nm，激发带宽与发射带宽均设定为10nm。进行28KHz超声处理的新鲜的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径为239.35±2.44nm，PDI为0.14±0.03，电位为-31.13±4.83mv，储存了15天的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径为264.82±2.84nm，PDI为0.15±0.05，电位为-27.77±1.21mv。与实施例1相比较，粒径明显减小，PDI较小，粒径分布较窄，粒度分布均匀，并且电位增加，说明超声促进了均一稳定二元玉米醇溶蛋白纳米颗粒的形成。与实施例2相比较，粒径、PDI数值接近，电位减小。在储藏过程中，28KHz超声处理的二元玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径呈现出粒径增加的趋势，PDI增大但是不显著，电位则是往减小的方向转移，但是粒径和电位转移的程度均小于未经超声处理的二元玉米醇溶蛋白纳米颗粒，提高了二元纳米复合物的储藏稳定性。

实施例4

(1)将一定质量的玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠溶解在80％(v/v)丙二醇水溶液中，玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的质量占比均为2％，储备溶液磁力搅拌均匀目视无明显沉淀，二元混合溶液经5000rpm离心10min去除残留的大颗粒，得到玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的二元混合溶液。

(2)量取20mL的玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的二元混合溶液，装入经过活化处理长度为45cm宽为34mm，截留分子量为8000-14000的透析袋中，将透析袋密封好放入物料容器中，并加入400mL的去离子水。

(3)把物料容器放置在超声槽中，设置超声频率为40KHz、超声功率为300w、超声时间60min、超声方式为持续式，恒温水浴温度为25℃，取出透析袋，重新加入400mL的去离子水在室温条件下进行透析11h。

(4)透析结束后，取出新鲜样品得到的是玉米醇溶蛋白复合纳米粒子胶体分散液。一部分样品4℃冰箱冷藏，另取一部分胶体溶液进行真空冷冻干燥48h。

(5)浊度测定：取新鲜样品，采用UV-vis紫外可见分光光度计在波长500nm波长下测定样品的吸光度值以表征样品的浊度。在室温条件下测定，每个样品测定三次，结果以平均值表示。

(6)粒径和Zeta电位的测定：在室温条件下采用动态光散射测定玉米醇溶蛋白二元纳米颗粒的粒度、PDI和Zeta电位。通过仪器基于Stokes-Einstein方程计算每个样品的粒径，而基于Smoluchowski模型计算表面电位，在测量之前将纳米颗粒分散体稀释到合适浓度以避免多重散射效应。所有测量一式三份取平均值。

(7)荧光光谱测定：为了选择性的激发色氨酸残基，以280nm为激发波长，扫描范围为290-450nm，扫描速度为1000nm/min，扫描间隔:1nm，激发带宽与发射带宽均设定为10nm。进行40KHz超声处理的新鲜的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径为231.20±15.75nm，PDI为0.14±0.01，电位为-32.60±1.32mv，储存了15天的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径为267.93±3.44nm，PDI为0.19±0.03，电位为-26.01±2.08mv。与实施例1相比较，粒径明显减小，PDI较小，粒径分布较窄，粒度分布均匀并且电位增加，说明超声促进了均一稳定二元玉米醇溶蛋白纳米颗粒的形成。与实施例2、3相比，频率增加后得到的纳米颗粒粒径更小。在储藏过程中，40KHz超声处理的二元玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径呈现出粒径增加的趋势，PDI增大但是不显著，电位则是往减小的方向转移，但是粒径和电位转移的程度均小于未经超声处理的二元玉米醇溶蛋白纳米颗粒，提高了二元纳米复合物的储藏稳定性。

实施例5

(1)将一定质量的玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠溶解在80％(v/v)丙二醇水溶液中，玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的质量占比均为2％，储备溶液磁力搅拌均匀目视无明显沉淀，二元混合溶液经5000rpm离心10min去除残留的大颗粒，得到玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的二元混合溶液。

(2)量取20mL的玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的二元混合溶液，装入经过活化处理长度为45cm宽为34mm，截留分子量为8000-14000的透析袋中，将透析袋密封好放入物料容器中，并加入400mL的去离子水。

(3)把物料容器放置在超声槽中，设置超声频率为20KHz+28KHz、超声功率为300w、超声时间60min、超声方式为持续式，恒温水浴温度为25℃，取出透析袋，重新加入400mL的去离子水在室温条件下进行透析11h。

(4)透析结束后，取出新鲜样品得到的是玉米醇溶蛋白复合纳米粒子胶体分散液。一部分样品4℃冰箱冷藏，另取一部分胶体溶液进行真空冷冻干燥48h。

(5)浊度测定：取新鲜样品，采用UV-vis紫外可见分光光度计在波长500nm波长下测定样品的吸光度值以表征样品的浊度。在室温条件下测定，每个样品测定三次，结果以平均值表示。

(6)粒径和Zeta电位的测定：在室温条件下采用动态光散射测定玉米醇溶蛋白二元纳米颗粒的粒度、PDI和Zeta电位。通过仪器基于Stokes-Einstein方程计算每个样品的粒径，而基于Smoluchowski模型计算表面电位，在测量之前将纳米颗粒分散体稀释到合适浓度以避免多重散射效应。所有测量一式三份取平均值。

(7)荧光光谱测定：为了选择性的激发色氨酸残基，以280nm为激发波长，扫描范围为290-450nm，扫描速度为1000nm/min，扫描间隔:1nm，激发带宽与发射带宽均设定为10nm。进行20KHz+28KHz超声处理的新鲜的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径为242.92±1.28nm，PDI为0.13±0.03，电位为-34.84±0.59mv，储存了15天的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径为249.16±2.62nm，PDI为0.11±0.03，电位为-31.65±2.37mv。与实施例1相比较，粒径明显减小，PDI较小，粒径分布较窄，粒度分布均匀，并且电位增加，说明超声促进了均一稳定二元玉米醇溶蛋白纳米颗粒的形成。与实施例1、2、3、4相比，20KHz+28KHz双频处理后得到的纳米颗粒的粒径与电位储藏前后幅度变化小，增强了纳米颗粒的储存稳定性。在储藏过程中，20KHz+28KHz超声处理的二元玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径呈现出粒径增加的趋势，PDI变化不显著，电位则是往减小的方向转移，但是粒径和电位转移的程度均小于未经超声处理的二元玉米醇溶蛋白纳米颗粒，提高了二元纳米复合物的储藏稳定性。

实施例6

(1)将一定质量的玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠溶解在80％(v/v)丙二醇水溶液中，玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的质量占比均为2％，储备溶液磁力搅拌均匀目视无明显沉淀，二元混合溶液经5000rpm离心10min去除残留的大颗粒，得到玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的二元混合溶液。

(2)量取20mL的玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的二元混合溶液，装入经过活化处理长度为45cm宽为34mm，截留分子量为8000-14000的透析袋中，将透析袋密封好放入物料容器中，并加入400mL的去离子水。

(3)把物料容器放置在超声槽中，设置超声频率为28KHz+40KHz、超声功率为300w、超声时间60min、超声方式为持续式，恒温水浴温度为25℃，取出透析袋，重新加入400mL的去离子水在室温条件下进行透析11h。

(4)透析结束后，取出新鲜样品得到的是玉米醇溶蛋白复合纳米粒子胶体分散液。一部分样品4℃冰箱冷藏，另取一部分胶体溶液进行真空冷冻干燥48h。

(5)浊度测定：取新鲜样品，采用UV-vis紫外可见分光光度计在波长500nm波长下测定样品的吸光度值以表征样品的浊度。在室温条件下测定，每个样品测定三次，结果以平均值表示。

(6)粒径和Zeta电位的测定：在室温条件下采用动态光散射测定玉米醇溶蛋白二元纳米颗粒的粒度、PDI和Zeta电位。通过仪器基于Stokes-Einstein方程计算每个样品的粒径，而基于Smoluchowski模型计算表面电位，在测量之前将纳米颗粒分散体稀释到合适浓度以避免多重散射效应。所有测量一式三份取平均值。

(7)荧光光谱测定：为了选择性的激发色氨酸残基，以280nm为激发波长，扫描范围为290-450nm，扫描速度为1000nm/min，扫描间隔:1nm，激发带宽与发射带宽均设定为10nm。

进行28KHz+40KHz超声处理的新鲜的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径为236.62±3.26nm，PDI为0.13±0.02，电位为-33.47±1.38mv，储存了15天的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径为242.61±3.15nm，PDI为0.1±0.06，电位为-32.00±1.01mv。与实施例1相比较，粒径明显减小，PDI较小，粒径分布较窄，粒度分布均匀并且电位增加，说明超声促进了均一稳定二元玉米醇溶蛋白纳米颗粒的形成。与实施例2、3、5相比，28KHz+40KHz双频处理后得到的纳米颗粒粒径更小。与实施例2、3、4、5相比，28KHz+40KHz双频处理后得到的纳米颗粒的粒径与电位储藏前后幅度变化小，增强了纳米颗粒的储存稳定性。在储藏过程中，28KHz+40KHz超声处理二元玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径呈现出粒径增加的趋势，PDI变化不显著，电位则是往减小的方向转移，但是粒径和电位转移的程度均小于未经超声处理的二元玉米醇溶蛋白纳米颗粒，提高了二元纳米复合物的储藏稳定性。

实施例7

(1)将一定质量的玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠溶解在80％(v/v)丙二醇水溶液中，玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的质量占比均为2％，储备溶液磁力搅拌均匀目视无明显沉淀，二元混合溶液经5000rpm离心10min去除残留的大颗粒，得到玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的二元混合溶液。

(2)量取20mL的玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的二元混合溶液，装入经过活化处理长度为45cm宽为34mm，截留分子量为8000-14000的透析袋中，将透析袋密封好放入物料容器中，并加入400mL的去离子水。

(3)把物料容器放置在超声槽中，设置超声频率为20KHz+40KHz、超声功率为300w、超声时间60min、超声方式为持续式，恒温水浴温度为25℃，取出透析袋，重新加入400mL的去离子水在室温条件下进行透析11h。

(4)透析结束后，取出新鲜样品得到的是玉米醇溶蛋白复合纳米粒子胶体分散液。一部分样品4℃冰箱冷藏，另取一部分胶体溶液进行真空冷冻干燥48h。

(5)浊度测定：取新鲜样品，采用UV-vis紫外可见分光光度计在波长500nm波长下测定样品的吸光度值以表征样品的浊度。在室温条件下测定，每个样品测定三次，结果以平均值表示。

(6)粒径和Zeta电位的测定：在室温条件下采用动态光散射测定玉米醇溶蛋白二元纳米颗粒的粒度、PDI和Zeta电位。通过仪器基于Stokes-Einstein方程计算每个样品的粒径，而基于Smoluchowski模型计算表面电位，在测量之前将纳米颗粒分散体稀释到合适浓度以避免多重散射效应。所有测量一式三份取平均值。

(7)荧光光谱测定：为了选择性的激发色氨酸残基，以280nm为激发波长，扫描范围为290-450nm，扫描速度为1000nm/min，扫描间隔:1nm，激发带宽与发射带宽均设定为10nm。进行20KHz+40KHz超声处理的新鲜的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径为225.94±45.84nm，PDI为0.17±0.06，电位为-29.97±1.49mv，储存了15天的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径为226.02±11.28nm，PDI为0.19±0.08，电位为-28.50±0.60mv。与实施例1相比较，粒径明显减小，PDI较小，粒径分布较窄，粒度分布均匀，并且电位增加，说明超声促进了均一稳定二元玉米醇溶蛋白纳米颗粒的形成。与实施例2、3、4、5、6相比，双频超声处理优于但单频超声，双频20KHz+40KHz后得到的纳米颗粒粒径更小。与实施例2、3、4、5、6相比，28KHz+40KHz双频处理后得到的纳米颗粒的粒径与电位储藏前后幅度变化小，增强了纳米颗粒的储存稳定性。在储藏过程中，20KHz+40KHz超声处理二元玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径呈现出粒径增加的趋势，PDI变化不显著，电位则是往减小的方向转移，但是粒径和电位转移的程度均小于未经超声处理的二元玉米醇溶蛋白纳米颗粒，提高了二元纳米复合物的储藏稳定性。

实施例8

(1)将一定质量的玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠溶解在80％(v/v)丙二醇水溶液中，玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的质量占比均为2％，储备溶液磁力搅拌均匀目视无明显沉淀，二元混合溶液经5000rpm离心10min去除残留的大颗粒，得到玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的二元混合溶液。

(2)量取20mL的玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸钠的二元混合溶液，装入经过活化处理长度为45cm宽为34mm，截留分子量为8000-14000的透析袋中，将透析袋密封好放入物料容器中，并加入400mL的去离子水。

(3)把物料容器放置在超声槽中，设置超声频率为20KHz+28KHz+40KHz、超声功率为300w、超声时间60min、超声方式为持续式，恒温水浴温度为25℃，取出透析袋，重新加入400mL的去离子水在室温条件下进行透析11h。

(4)透析结束后，取出新鲜样品得到的是玉米醇溶蛋白复合纳米粒子胶体分散液。一部分样品4℃冰箱冷藏，另取一部分胶体溶液进行真空冷冻干燥48h。

(5)浊度测定：取新鲜样品，采用UV-vis紫外可见分光光度计在波长500nm波长下测定样品的吸光度值以表征样品的浊度。在室温条件下测定，每个样品测定三次，结果以平均值表示。

(6)粒径和Zeta电位的测定：在室温条件下采用动态光散射测定玉米醇溶蛋白二元纳米颗粒的粒度、PDI和Zeta电位。通过仪器基于Stokes-Einstein方程计算每个样品的粒径，而基于Smoluchowski模型计算表面电位，在测量之前将纳米颗粒分散体稀释到合适浓度以避免多重散射效应。所有测量一式三份取平均值。

(7)荧光光谱测定：为了选择性的激发色氨酸残基，以280nm为激发波长，扫描范围为290-450nm，扫描速度为1000nm/min，扫描间隔:1nm，激发带宽与发射带宽均设定为10nm。

进行20KHz+28KHz+40KHz超声处理的新鲜的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径为239.09±3.11nm，PDI为，电位为-34.52±2.62mv，储存了15天的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径为242.48±5.13nm，PDI为，电位为-28.74±5.84mv。与实施例1相比较，粒径明显减小，PDI较小，粒径分布较窄，粒度分布均匀，并且电位增加，说明超声促进了均一稳定的二元玉米醇溶蛋白纳米颗粒的形成。与实施例2、3、5相比，得到的纳米颗粒粒径更小。与实施例2、3、4相比，28KHz+40KHz双频处理后得到的纳米颗粒的粒径与电位储藏前后幅度变化小，增强了纳米颗粒的储存稳定性。在储藏过程中，20KHz+28KHz+40KHz超声处理二元玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径呈现出粒径增加的趋势，PDI变化不显著，电位则是往减小的方向转移，但是粒径和电位转移的程度均小于未经超声处理的二元玉米醇溶蛋白纳米颗粒，提高了二元纳米复合物的储藏稳定性。

表1是不同储存时间的纳米颗粒粒径、PDI、Zeta电位图。

经过超声辅助透析处理后的玉米醇溶蛋白纳米颗粒粒径明显减小，PDI值较小，粒径分布较窄，粒度分布均匀，并且电位增加，形成了均一稳定的纳米颗粒。超声与透析双相物理驱动力打开了玉米醇溶蛋白内部高级结构，使更多蛋白质内部的芳香族氨基酸残基暴露，增加了玉米醇溶蛋白胶体溶液的荧光强度。不同组合频率辅助透析处理的纳米颗粒表现出不同的物理特性，其中20KHz+40KHz超声辅助透析处理玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径为225.94±45.84nm，PDI为0.17±0.06，电位为-29.97±1.49mv，储存了15天的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径为226.02±11.28nm，PDI为0.19±0.08，电位为-28.50±0.60mv，粒径最小，荧光强度最强，为最佳优选辅助频率，并且储藏期间粒径电位变化程度小，储藏稳定性好。

表1不同储存时间的纳米颗粒粒径、PDI、Zeta电位图