一种基于聚苹果酸的贻贝仿生粘合剂及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种基于聚苹果酸的贻贝仿生粘合剂及其制备方法和应用 (Mytilus edulis bionic adhesive based on polymalic acid and preparation method and application thereof ) 是由 吴红 唐友红 杨铁虹 乔友备 余喆 于 2019-10-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于聚苹果酸的贻贝仿生粘合剂及其制备方法应用,属于贻贝仿生高分子生物粘合剂技术领域,本发明公开的贻贝仿生粘合剂以聚苹果酸作为粘合剂的骨架,聚苹果酸分子中含有丰富的悬挂羧基,具有生物降解性好、生物相容性好的优点,加入含有邻苯二酚基团的分子,利用其含有的氨基与聚苹果酸的羧基进行酰胺反应,将具有粘合作用的邻苯二酚结构连接到聚苹果酸上,使制得的贻贝仿生粘合剂具备良好的组织粘合性、生物相容性和可降解性。利用该粘合剂对金属、玻璃、鸡蛋膜这三种不同的材料进行粘性测试,结果表明对这三种材料均有不同的粘合能力。(The invention discloses a mussel bionic adhesive based on polymalic acid and a preparation method and application thereof, belonging to the technical field of mussel bionic high-molecular biological adhesives. The adhesive is used for carrying out adhesion tests on three different materials, namely metal, glass and egg membranes, and the results show that the adhesive has different adhesive capacities on the three materials.)
技术领域
本发明属于生物粘合剂制备技术领域，涉及一种基于聚苹果酸的贻贝仿生粘合剂及其制备方法和应用。
背景技术
医用胶黏剂具有可有效止血、避免针刺对人体组织带来的二次伤害、使用方便、无需拆除等优点，越来越受到人们的关注。在过去的二十年里，利用生物粘附剂、组织密封剂和止血剂来控制失血并促进组织愈合，在临床外科手术中得到了很好的利用。在军事领域中，生物粘合剂可以用于伤口的紧急处理。
纤维蛋白胶以及合成类的氰基丙烯酸酯粘合剂是两类已经受到广泛利用的组织粘合剂。纤维蛋白胶具有快速固化和生物降解性的优点，但具有相对较差的粘附力和拉伸强度，并且可能会产生过敏反应等。氰基丙烯酸酯粘合剂具有强粘附性，快速凝固时间，对组织的瞬时粘附和易于使用的优点。然而，由于氰基丙烯酸酯降解缓慢可能导致机体的排异反应，聚合反应会释放出热量以及降解产物的毒性限制了它的应用。此外，只有应用于干燥的手术领域时，纤维蛋白胶和氰基丙烯酸酯才能发挥最佳效果，这大大限制了其在许多内脏器官手术中的湿润组织粘连和止血领域的应用。此外，只有应用于干燥的手术领域时，纤维蛋白胶和氰基丙烯酸酯才能发挥最佳效果，这大大限制了其在许多内脏器官手术中的湿润组织粘连和止血领域的应用。目前为止，市场上还没有能够同时广泛应用于外部和内部组织粘连与止血的组织粘合剂或密封剂。
贻贝仿生胶黏剂是目前人们对胶黏剂研究中的一个新热点。贻贝能够在水中粘附于各种非特异性的界面，贻贝的强粘附能力在于其足部分泌的粘附蛋白中存在一种叫L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)的含邻苯二酚结构的氨基酸。在氧化或碱性条件下，DOPA上的邻苯二酚羟基被氧化成邻醌促使足部粘合蛋白发生交联反应，随后触发分子间交联，使蛋白质网络具有内聚力和体积弹性的性质。最近的研究表明，氧化态的DOPA也能通过与生物表面上的亲核基团如-NH2,-SH,-OH和-COOH形成共价键，来提升它对生物表面的强粘附力。相比于已投入临床使用的生物粘合剂如纤维蛋白胶(fibrin glue)和氰基丙烯酸酯粘合剂(cyanoacrylate adhesives)存在的粘合力弱以及只能对干燥组织有较好作用等缺陷，Mehdizadeh等人合成的仿贻贝柠檬酸生物粘合剂(injectable citrate-based mussel-inspired bioadhesives,CA-DA-PEG)对湿润的组织有较强的粘合力、促进伤口愈合、并且能够完全降解与吸收，这对改变外科手术技术具有重要意义。此外，文献还报道了将含邻苯二酚结构的物质连接到聚酰胺、聚苯乙烯、聚亚胺酯和聚丙烯酸酯等聚合物的结构中得到了组织粘合水凝胶材料。然而，这些含邻苯二酚聚合物的合成需要经过多个步骤制备和纯化，尽管具有令人欣喜的组织粘附性质，但是目前已合成的类贻贝粘合剂聚合物基本上是不可降解的，且在粘合性能上仍需改进。
为使上述的生物粘合剂拥有更强的粘合能力，考虑应该尽可能地在产物中增加多巴胺的含量。如报道的CA-DA-PEG的反应中，柠檬酸首先与聚乙二醇发生酯化反应，接着多巴胺利用氨基与柠檬酸上的羧基反应，连接到聚乙二醇骨架中去。但是，聚乙二醇仅两端含有可反应的羟基，导致合成的产物中多巴胺的含量较少，限制了它的粘附强度。
聚苹果酸(Polymalic acid，PMLA)是以苹果酸为唯一单体相互通过酯键连接而成的一种脂肪族聚酯，在体内酶的作用下最终降解为水和二氧化碳排出体外，不会有蓄积毒性。其在生理条件下的相对高溶解性、高自发降解速率和免疫惰性使得它成为优于多糖和多肽类生物高分子的新型药物控释载体材料。聚苹果酸主要有α-、β-和γ-三种构型，如下：
其具有多个活性中心(悬挂羧基)，可共价连接多个具有生物学功能的基团，是连接药物、功能基团的高效载体。目前，在生物体内发现的主要是β-聚苹果酸。
当前，还未有任何报道将聚苹果酸与多巴胺及类似的含邻苯二酚结构的分子进行反应制备生物粘合剂。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于聚苹果酸的贻贝仿生粘合剂及其制备方法应用，该贻贝仿生粘合剂具备良好的组织粘合性、生物相容性和可降解性，该制备方法操作简单、反应温和、易于规模化生产。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开的一种基于聚苹果酸的贻贝仿生粘合剂，由聚苹果酸和含有邻苯二酚基团的分子经酰胺反应制得；
其中，聚苹果酸作为贻贝仿生粘合剂的骨架，用于提供酰胺反应所需羧基基团；含有邻苯二酚基团的分子，用于提供酰胺反应所需氨基基团。
优选地，根据聚苹果酸中的羧基数目，调整含有邻苯二酚基团的分子的用量为聚苹果酸所带羧基摩尔数的1～5倍。
优选地，所述聚苹果酸的重均分子量在800～20000之间。
优选地，所述聚苹果酸包括α-聚苹果酸、β-聚苹果酸及γ-聚苹果酸。
优选地，所述含有邻苯二酚基团的分子包括多巴胺、左旋多巴、去甲肾上腺素和3,4-二甲氧基苯甲醛。
本发明还公开了上述的基于聚苹果酸的贻贝仿生粘合剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将聚苹果酸溶于水中，调整pH值至5.5～6.5，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酸亚胺，室温下避光反应，直至羧基基团活化；
2)向步骤1)的反应体系中加入含有邻苯二酚基团的分子，在氮气气氛下，室温反应2～4d，将反应产物经过透析纯化、冻干处理，制得基于聚苹果酸的贻贝仿生粘合剂。
优选地，步骤1)中，采用碱性溶液调整pH值至5.5～6.5之间。
优选地，步骤1)中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酸亚胺的用量为聚苹果酸中羧基的物质的量的1.5倍。
本发明还公开了上述的基于聚苹果酸的贻贝仿生粘合剂作为贻贝仿生高分子生物粘合剂的应用。
优选地，所述基于聚苹果酸的贻贝仿生粘合剂具有非特异性粘合作用，能够作为黏附涂层、组织密封剂、止血剂及药物载体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开的基于聚苹果酸的贻贝仿生粘合剂，以聚苹果酸作为粘合剂的骨架，聚苹果酸分子中含有丰富的悬挂羧基，具有生物降解性好、生物相容性好的优点，加入含有邻苯二酚基团的分子，利用其含有的氨基与聚苹果酸的羧基进行酰胺反应，将具有粘合作用的邻苯二酚结构连接到聚苹果酸上，使制得的贻贝仿生粘合剂具备良好的组织粘合性、生物相容性和可降解性。利用该粘合剂对金属、玻璃、鸡蛋膜这三种不同的材料进行粘性测试，结果表明对这三种材料均有不同的粘合能力。
因此表明，本发明公开的基于聚苹果酸的贻贝仿生粘合剂能够对多种基质如金属、玻璃、鸡蛋膜等具有非特异性粘合作用的生物粘合剂；可作为黏附涂层、组织密封剂、止血剂及药物载体等，因而适用于作为贻贝仿生高分子生物粘合剂被应用于医用胶黏剂中。
本发明还公开了上述的基于聚苹果酸的贻贝仿生粘合剂的制备方法，创新地给出了适合所述贻贝仿生粘合剂的最佳合成路径与条件，该方法操作简单，反应条件温和，对反应设备要求低，适合规模化放大生产。
附图说明
图1为本发明制备基于聚苹果酸的生物粘合剂(PMLA-DA)反应流程图；其中，从左至右为β-PMLA-DA、γ-PMLA-DA的反应流程；
图2为产物(β-PMLA-DA、β-PMLA、γ-PMLA-DA、γ-PMLA)的核磁图谱；
图3为β-PMLA-DA对金属铁、玻璃和鸡蛋膜三种材质的粘合作用的实物照片；其中，(a)为金属铁；(b)为玻璃；(c)为鸡蛋膜；
图4为β-PMLA-DA对金属铁、玻璃和鸡蛋膜(从左至右)三种材质的粘合强度的柱状图；
图5为MTT法对基于聚苹果酸的生物粘合剂β-PMLA-DA的细胞毒性进行检测结果图；
图6为不同组分的PMLA-DA的体外降解曲线。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
本发明公开的一种基于聚苹果酸的贻贝仿生粘合剂，包括聚苹果酸与带有邻苯二酚基团的分子；该粘合剂为贻贝仿生大分子生物粘合剂，具有良好的生物降解性及非特异粘合性。
所述的聚苹果酸为带有羧基的α、β、γ三种构型聚合物。
所述的带有邻苯二酚基团的分子为类多巴胺分子，邻苯二酚基团通过与各种材质间的配位键、共价键或者氢键等机制达到粘合的效果。
参见图1，为本发明制备基于聚苹果酸的生物粘合剂(PMLA-DA)反应流程图，具体的制备方法如下：
1、两种构型的聚苹果酸制备
聚苹果酸的制备采用现有技术公开的方法进行，如下述文献报道的制备方法：
张雨，乔友备，周青，余喆，吴红聚苹果酸合成新方法及其聚苹果酸苄基酯用作药物载体的研究《现代生物医学进展》2018,18(10):1849-1853。
YB Qiao,X Duan,L Fan,W Li,H Wu*,YK Wang.Synthesis of Controlled Molecular Weight Poly(β-Malic Acid)and Conjugation with HCPT as Polymeric DrugCar rier.J Polym Res(2014)21:397-406
制备的β-聚苹果酸产物的平均分子量在1000～20000之间，产率为4.7％；γ-聚苹果酸的平均分子量为750～5000之间，产率为75％。
2、PMLA-DA的制备
分别称取0.20gβ、γ两种不同构型的PMLA，溶于去离子水10ml，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液调整pH值至5.5～6.5之间，按羧基摩尔量的1.5倍量加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)，室温下避光反应2h，活化羧基基团；接着按聚苹果酸羧基摩尔数1.5倍的量加入多巴胺0.40g，抽真空，通N2，室温条件下反应3d，透析、冻干纯化后得到产物PMLA-DA。产率为76.1％，β-PMLA-DA中多巴胺的取代度为13.2％，γ-PMLA-DA中多巴胺取代度为7.9％。
3、PMLA-DA的粘性实验
实施例1
称26.6g L-天冬氨酸经重氮化反应生成溴代丁二酸再经过脱水、酯化、调节PH得到β-苄氧羰基-β-丙内酯，按摩尔比300：1的量加入引发剂苯甲酸四乙基铵再经过聚合、氢化得到β-聚苹果酸0.20g；称取β-PMLA 0.20g，溶于去离子水10ml，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液调整pH值至5.5～6.5之间，按羧基摩尔量的1.5倍量加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)，室温下避光反应2h，活化羧基基团；接着按聚苹果酸羧基摩尔数1.5倍的量加入多巴胺0.40g，抽真空，通N2，室温条件下反应3d，透析、冻干纯化后得到产物β-PMLA-DA。
取β-PMLA-DA 100mg，溶于100μl PBS，配成50wt.％溶液；各取20μlβ-PMLA-DA溶液，分别涂于金属铁、玻璃、鸡蛋膜模具界面上，将另一模具与之重合，静置5h；实物照片如图2所示。接着，利用重力通过挂钩砝码对各组模具的粘合强度进行拉力测试，记录模具分离时所悬挂的砝码与下层模具的总重量；按公式为p＝F/S，p为粘合强度(Pa)，F为模具分离时下层模具与其悬挂的砝码总重量(N)，S代表粘合面的面积(m2)，计算得到结果：粘合剂在金属铁界面的粘合强度为4.54kPa，在玻璃界面的粘合强度为22.83kPa，而在与人体组织类似的鸡蛋膜界面的粘合强度为16.71kPa。具体结果参见表1、图3和图4：
表1β-PMLA-DA对金属铁、玻璃、鸡蛋膜界面的粘性实验
实施例2
称取L-苹果酸6.7g，110℃，真空通氮气条件下反应45h，加30ml四氢呋喃超声溶解，再加入石油醚与***各200ml使溶液产生沉淀，挥发烘干得到产物γ-PMLA 5.02g。称取γ-PMLA 0.20g，溶于去离子水10ml，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液调整pH值至5.5～6.5之间，按羧基摩尔量的1.5倍量加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)，室温下避光反应2h，活化羧基基团；接着按聚苹果酸羧基摩尔数1.5倍的量加入多巴胺0.40g，抽真空，通N2，室温条件下反应3d，透析、冻干纯化后得到产物γ-PMLA-DA。
取γ-PMLA-DA 100mg，溶于100μl PBS，配成50wt.％溶液；各取20μlγ-PMLA-DA溶液，分别涂于金属铁、玻璃、鸡蛋膜模具界面上，将另一模具与之重合，静置5h；接着利用重力通过挂钩砝码对各组模具的粘合强度进行拉力测试，记录模具分离时所悬挂的砝码与下层模具的总重量，计算得到结果：粘合剂在金属铁界面的粘合强度为3.21kPa，在玻璃界面的粘合强度为20.02kPa，而在与人体组织类似的鸡蛋膜界面的粘合强度为17.36kPa。具体结果见下表2：
表2γ-PMLA-DA对金属铁、玻璃、鸡蛋膜界面的粘性实验
实施例3
称取例1制得的β-PMLA 0.20g，溶于去离子水10ml，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液调整pH值至5.5～6.5之间，按羧基摩尔量的1.5倍量加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)，室温下避光反应2h，活化羧基基团；接着按聚苹果酸羧基摩尔数1.5倍的量加入左旋多巴(DOPA)0.51g，抽真空，通N2，室温条件下反应3d，透析、冻干纯化后得到产物β-PMLA-DOPA。
取β-PMLA-DOPA 100mg，溶于100μl PBS，配成50wt.％溶液；各取20μlβ-PMLA-DOPA溶液，分别涂于金属铁、玻璃、鸡蛋膜模具界面上，将另一模具与之重合，静置5h；接着利用重力通过挂钩砝码对各组模具的粘合强度进行拉力测试，记录模具分离时所悬挂的砝码与下层模具的总重量，计算得到结果：粘合剂在金属铁界面的粘合强度为4.74kPa，在玻璃界面的粘合强度为20.80kPa，而在与人体组织类似的鸡蛋膜界面的粘合强度为16.36kPa。具体结果见下表3：
表3β-PMLA-DOPA对金属铁、玻璃、鸡蛋膜界面的粘性实验
对比例
称5.00g PEG1000,1.16g柠檬酸，0.77g多巴胺(摩尔比：1:1.1:1)，抽真空、通氮气，140℃反应3d，透析、冻干纯化后得到产物CA-DA-PEG。
取CA-DA-PEG 100mg，溶于100μl PBS，配成50wt.％溶液；各取20μl CA-DA-PEG溶液，分别涂于金属铁、玻璃、鸡蛋膜模具界面上，将另一模具与之重合，静置5h；接着利用重力通过挂钩砝码对各组模具的粘合强度进行拉力测试，记录模具分离时所悬挂的砝码与下层模具的总重量；按公式为p＝F/S，p为粘合强度(Pa)，F为模具分离时下层模具与其悬挂的砝码总重量(N)，S代表粘合面的面积(m2)，计算得到结果：粘合剂在金属铁界面的粘合强度为1.77kPa，在玻璃界面的粘合强度为14.20kPa，而在与人体组织类似的鸡蛋膜界面的粘合强度为13.32kPa。具体结果见表4：
表4CA-DA-PEG对金属铁、玻璃、鸡蛋膜界面的粘性实验
综合上述表1～表4，可以看出，在测试的三种材料中，基于聚苹果酸的生物粘合剂对金属铁的粘合能力最弱，对玻璃的粘合能力最强，对动物组织鸡蛋膜的粘合能力次之；对于三组粘合剂以及对比例对相同材料的粘合强度的对比，β-PMLA-DA>β-PMLA-DOPA>γ-PMLA-DA>CA-DA-PEG，通过查阅资料得到纤维蛋白胶对动物表皮的粘合强度为15.33kPa。可见本专利合成的三组粘合剂粘合能力均好于对比例CA-DA-PEG，在动物组织上的粘合强度也高于商用的纤维蛋白胶。
根据多巴胺中邻苯二酚的粘合机制，我们认为：该粘合剂对于金属的粘合机制可能是基于金属元素与酚羟基之间形成的螯合作用；而玻璃界面较高的粘性可能与玻璃介质的高表面能、以及粘合剂的酚羟基能够与玻璃的Si形成配合键有关，因此存在着较高的粘合强度；与鸡蛋膜的粘合机制则可能是酚羟基氧化后形成的邻苯醌与鸡蛋膜的氨基通过席夫碱反应或迈克尔加成反应形成的共价键作用。对于三种粘合剂的粘性强弱的不同，可能是由于分子量越大，粘性更强，多巴胺取代度越高，粘性也越大，反之亦然。
4、细胞毒性研究
以培养到对数期的成纤维细胞(L929)为模型细胞，采用噻唑蓝(MTT)法对粘合剂β-PMLA-DA的细胞毒性进行检测。结果如图5所示，结果显示，β-PMLA-DA的浓度增大到2mg/mL，亦没有明显的细胞毒性(P>0.05)，表明其可用于人体组织的粘合。
5、PMLA-DA的体外降解研究
取三组PMLA-DA样品各10mg，使其完全浸没在10mL的PBS缓冲液(pH＝7.4)中。将含有样品的缓冲液的烧杯放在37℃振荡培养箱中。每隔一段时间取出样品，透析、冻干后称重。记录样品质量，重复三次，取其平均值(图6)。从三组不同组分的PMLA-DA的体外降解曲线可以看出，PMLA-DA的质量均随着降解时间的延长而减小。对比三条曲线可以看出，P-D0.25的降解速度最快，第17天降解95％以上；而P-D 0.75和P-D 1.00的降解速率相当，第25天能够完成降解95％以上。这是由于与P-D 0.75和P-D 1.00相比，P-D 0.25中接入的多巴胺量较少，导致体系交联程度也较小，表现为其降解速度最快。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。