阅读说明：本技术 一种生物模板法构筑多级结构硫化铜纳米酶的方法 (Method for constructing multilevel-structure copper sulfide nanoenzyme by biological template method ) 是由 刘燕 靳海佳 郭荣 于 2018-08-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种生物模板法构筑多级结构硫化铜纳米酶的方法,以硫酸铜作为铜源反应物,以硫脲作为硫源反应物,利用生物大分子-蛋白质诱导硫化铜自组装成具有精细结构的微纳米材料。制得的线团状多级结构硫化铜纳米酶兼具类半胱氨酸氧化酶和类过氧化物酶活性；所述方法只需常温常压,反应条件温和,安全性和能耗得到显著改善；生产工艺简单、设备投资少、环境友好、原料价廉易得；所得产物具有无毒、生物相容性较好、类酶催化活性高、稳定性好等特点,可以在食品、环境和生物医学等领域有很好的应用前景。(The invention discloses a method for constructing a copper sulfide nanoenzyme with a multilevel structure by a biological template method. The prepared copper sulfide nanoenzyme with the coil-shaped multilevel structure has the activity of both cysteine-like oxidase and peroxidase-like enzyme; the method only needs normal temperature and normal pressure, the reaction condition is mild, and the safety and the energy consumption are obviously improved; the production process is simple, the equipment investment is low, the environment is friendly, and the raw materials are cheap and easy to obtain; the obtained product has the characteristics of no toxicity, good biocompatibility, high enzyme-like catalytic activity, good stability and the like, and can have good application prospects in the fields of food, environment, biomedicine and the like.)

一种生物模板法构筑多级结构硫化铜纳米酶的方法

技术领域

本发明涉及纳米生物技术领域，具体涉及一种生物模板法构筑多级结构硫化铜的方法。

背景技术

纳米酶是具有类似于蛋白酶催化能力的纳米材料，自2007年阎锡蕴院士课题组首次报道磁性Fe₃O₄纳米粒子具有类似于天然辣根过氧化物酶（HRP）的过氧化物酶活性以来，人们一直致力于开发具有各种天然酶活性的纳米酶。与天然酶相比，纳米酶具有以下优势：1）与对环境条件非常敏感的天然酶不同，纳米酶在比较极端的环境中仍然能保持一定的类酶催化活性，这使得它们具有高稳定性和长使用寿命; 2）与天然酶相比，纳米酶成本相对较低，这使得它们易于大规模生产和使用; 3）纳米酶的催化性能与其组成、结构和尺寸等因素密切相关，可以对纳米酶的性能进行灵活调节; 4）一些纳米酶可以循环使用。鉴于这些特性，近年来纳米酶已经引起了分析、环境和生物等领域越来越多的关注。为进一步拓宽纳米酶在相关领域的应用，制备廉价、生物相容性好、高活性、高稳定性和多种类酶活性的纳米酶具有一定的理论与实际意义。

硫化铜（CuS）由于其储量丰富、低毒而成为一种廉价且环境友好的半导体。硫化铜纳米材料因其独特的光电物理特性而在传感器，催化反应和电池器件等领域倍受关注。由于纳米酶的催化性能与其组成、结构和尺寸等因素密切相关，因此具有特殊微纳米结构的硫化铜在纳米酶领域具有非常重要的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种生物模板法构筑多级结构硫化铜纳米酶的方法，经过该方法得到线团状多级结构硫化铜纳米酶，该纳米酶兼具类半胱氨酸氧化酶和类过氧化物酶活性。

实现本发明目的的技术解决方案是：一种生物模板法构筑多级结构硫化铜纳米酶的方法，以硫酸铜作为铜源反应物，以硫脲作为硫源反应物，利用生物大分子—蛋白质诱导硫化铜自组装成具有精细结构的微纳米材料。具体步骤如下：

1. 蛋白质溶液配制过程中需用0.1～0.5 M氢氧化钠溶液调节体系pH 10.0～12.0，溶解温度为60℃～80℃，不断进行搅拌直至蛋白质完全溶解，待温度降至室温后，放入冰箱保存隔夜待用。

2. 在室温和磁搅拌条件下，将蛋白质溶液缓慢加入到硫酸铜溶液中得到蛋白质-硫酸铜混合溶液，其中硫酸铜浓度为0.05 M，蛋白质浓度为1.0～4.0 mg/mL；然后将上述混合溶液转移至水浴槽内，搅拌速度800～1200 r/min条件下搅拌20～40 min，使蛋白质与铜离子结合形成复合物。

3. 加入硫脲溶液到硫酸铜与蛋白质混合溶液中，保证反应体系中硫酸铜与硫脲的摩尔比比为1:1～ 1:3，升温至75～90℃反应12～24 h。

4. 产物在2000～4000 r/min下离心1～3 min，分别用去离子水和无水乙醇洗涤三次，得到线团状多级结构硫化铜纳米酶。

本制备方法在常温常压下进行，反应条件温和，安全性和能耗得到显著改善；且该方法生产工艺简单、设备投资少、环境友好、原料价廉易得。所制备的材料具有无毒、生物相容性较好、类酶催化活性高、稳定性好等特点，可以在食品、环境和生物医学等领域有很好的应用前景。

附图说明

图1是实施例1中硫酸铜浓度为0.05 M，蛋白质浓度为2 mg/mL，硫脲浓度为0.1 M制得的硫化铜纳米材料的SEM图。

图2是是实施例1中所制备的线团状硫化铜纳米材料的XRD图。

图3是线团状CuS 纳米材料催化H₂O₂氧化TMB显色的紫外-可见光谱图。

图4是线团状CuS纳米材料催化L-半胱氨酸/TA级联反应的荧光光谱图。

具体实施方式

实施例1

生物模板法构筑多级结构硫化铜

第一步：将2.5 mL 1 M 硫酸铜溶液加入到12.5 mL超纯水中；第二步：在温度为10℃，磁力搅拌的条件下，将10 mL 10 mg/mL蛋白质溶液缓慢滴加到硫酸铜溶液中；第三步：转移至85℃水浴槽内，将上述溶液预混30 min，搅拌速度为1000 r/min；第四步：将0.2 M 25 mL硫脲溶液加入到硫酸铜与蛋白质混合液中，搅拌速度调节为600 r/min，反应24 h。第五步：产物在3000 r / min转速下离心2 min，得到线团状CuS纳米材料，用去离子水和无水乙醇各洗涤三次，保存备用，其微观结构和XRD分别如图1和图2所示。

实施例2

生物模板法构筑多级结构硫化铜

第一步：将2.5 mL 1 M 硫酸铜溶液加入到17.5 mL超纯水中；第二步：在温度为10℃，磁力搅拌的条件下，将5 mL 10 mg/mL蛋白质溶液缓慢滴加到硫酸铜溶液中；第三步：转移至85℃水浴槽内，将上述溶液预混30 min，搅拌速度为1000 r/min；第四步：将0.2 M 25 mL硫脲溶液加入到硫酸铜与蛋白质混合液中，搅拌速度调节为600 r/min，反应24 h；第五步：产物在3000 r / min转速下离心2 min，用去离子水和无水乙醇各洗涤三次，得到线团状多级结构硫化铜。

实施例3

生物模板法构筑多级结构硫化铜纳米酶的方法

第一步：将2.5 mL 1 M 硫酸铜溶液加入到12.5 mL超纯水中；第二步：在温度为10℃，磁力搅拌的条件下，将10 mL 10 mg/mL蛋白质溶液缓慢滴加到硫酸铜溶液中；第三步：转移至80℃水浴槽内，将上述溶液预混30 min，搅拌速度为1000 r/min；；第四步：将0.2 M 25mL硫脲溶液加入到硫酸铜与蛋白质混合液中，搅拌速度调节为600 r/min，反应24 h；产物在3000 r / min转速下离心2 min，用去离子水和无水乙醇各洗涤三次，得到线团状多级结构硫化铜。

实施例4

线团状多级结构硫化铜纳米酶类过氧化物酶活性的测定

在一定体积的0.2 M pH = 4.0的醋酸缓冲液中，加入120 μL 15 mM 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)和8 μL制备的线团状硫化铜纳米材料，然后加入双氧水使其浓度为10 mM，最终反应溶液体积为3 mL，在25℃条件下反应15 min，测定体系的紫外-可见光谱，如图3所示，谱图中652 nm处出现的吸收峰表明其具有类过氧化物酶性质。

实施例5

线团状多级结构硫化铜纳米酶类半胱氨酸氧化物酶活性的测定

在2.9875 mL 0.2 M pH = 5.0的PBS缓冲液中，加入0.5 mL 100 mM 对苯二甲酸溶液，再加入12.5 μL制备的线团状硫化铜纳米材料，然后加入半胱氨酸使其浓度为625 μM，在75℃条件下反应15 min，测定体系的稳态荧光光谱，如图4所示，谱图中430 nm处的荧光发射峰表明其具有类半胱氨酸氧化酶性质。