阅读说明：本技术 小鼠IgG印迹聚合物的制备方法 (Preparation method of mouse IgG imprinted polymer ) 是由 孙越 王伟 赵梦元 冯雪薇 于 2019-10-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种小鼠IgG印迹聚合物的制备方法,依次按照如下步骤进行：将0.01~1mol丙烯酰胺和/或N-羟基丙烯酰胺与0.002~0.02mol甲叉双丙烯酰共同溶于20 ml pH=7的PBS溶液中,超声震荡5min,得第一混合溶液；将0.001~0.01mol含溴化合物置入第一混合溶液中；在第一混合溶液中加入0.05~1ml三乙胺、0.002~0.02g小鼠IgG和0.4~4μg荧光标记的小鼠IgG,超声震荡20min,得第二混合溶液,向第二混合溶液中通入氮气10min；将通入氮气的第二混合溶液光照6小时,得到含小鼠IgG的聚合物；洗去含小鼠IgG的聚合物中的小鼠IgG模板。(The invention discloses a preparation method of a mouse IgG imprinted polymer, which comprises the following steps of dissolving 0.01 ~ 1mol of acrylamide and/or N-hydroxyacrylamide and 0.002 ~ 0.02.02 mol of methylene diacryloyl together in 20 ml of PBS solution with the pH =7, carrying out ultrasonic oscillation for 5min to obtain a first mixed solution, putting 0.001 ~ 0.01mol of a bromine-containing compound into the first mixed solution, adding 0.05 ~ 1ml of triethylamine, 0.002 ~ 0.02.02 g of mouse IgG and 0.4 ~ 4 mu g of fluorescence-labeled mouse IgG into the first mixed solution, carrying out ultrasonic oscillation for 20min to obtain a second mixed solution, introducing nitrogen into the second mixed solution for 10min, illuminating the second mixed solution introduced with nitrogen for 6 hours to obtain a polymer containing the mouse IgG, and washing a mouse IgG template in the polymer containing the mouse IgG.)

小鼠IgG印迹聚合物的制备方法

技术领域

本发明涉及一种小鼠IgG印迹聚合物的制备方法，尤其涉及一种无需过渡金属催化剂且在水相中以荧光标记的小鼠IgG进行光诱导ATRP的小鼠IgG印迹聚合物的制备方法。

背景技术

动物进食时，免疫系统会产生特异性抗体IgG，IgG与食物形成免疫复合物，严重时可引起身体组织炎症。因此可以通过对IgG的检测，判断身体是否会对某种食物产生不耐受疾病，为疾病的诊断和预防提供依据。

检测特异性抗体IgG的方法通常为酶联免疫分析法（ELISA法）及分子印迹技术。ELISA法作为一项免疫检测技术，主要是基于抗原与抗体的特异性识别进行的，如果检测抗原，除了要求结合的抗体与抗原要有特异性外，检测抗原还必须有能与抗体相结合的抗原决定簇，若因突变导致某些位点不表达或结合位点因某些原因被封闭或阻断，就会影响抗原和抗体的结合，造成假阴性结果，同时该方法利用的抗原抗体具有生物活性，保存条件困难。分子印迹技术是一种新型高效分离技术，其分离作用来源于分子印迹聚合物（molecularlyimprinted polymers，MIP）所具有的类似天然抗体或酶的分子识别功能，具有适应性强、化学稳定性高、对压力、温度极具耐受性等优点，同时，MIP的制备简单，重复性好。

分子印迹技术的核心是分子印迹聚合物（Molecularly imprinted polymer，MIP）的制备，通常是在合适引发剂的作用下，功能单体、交联剂和某一特定模板分子通过氢键、离子键、范德华力、静电力等作用下形成具有刚性结构的聚合物，然后通过一定的物理或化学方法将模板分子脱除，最终制备出具有选择性识别能力的分子印迹聚合物。能够制备MIP的方法很多。原子转移自由基聚合（Atom Transfer Radical Polymerization，ATRP）是高分子科学中的前沿课题，是大分子设计的常用手段，它以卤化物作为引发剂，低价态过渡金属（如Cu（Ⅰ）、Fe（Ⅱ）等）配合物作为催化剂，通过氧化还原反应，在聚合活性种与休眠种之间建立动态平衡，可以实现对聚合物的端基、组成、结构、分子量等的准确控制。同时ATRP可以应用于多种类型的单体，具有聚合方法简单、实施手段多样等优点，因此特别适合于MIP的制备。然而，如利用传统ATRP方法制备蛋白质MIP，存在如下问题：(1) 低价态过渡金属离子对空气等敏感而不易保存；(2) 低价态过渡金属离子对蛋白质等生物大分子具有一定的毒性；(3) 常见脱除催化剂的后处理工艺复杂，催化剂常有残留且必须加大成本。

无金属可见光诱导的原子转移自由基聚合是一种新兴技术，可以克服传统ATRP的缺点，无需过渡金属配合物作为催化剂即可制备分子印迹聚合物，具有单体聚合速度快、转化率高等优点，但是该方法的聚合发生在乙醇相中，而乙醇相则因易挥发、易燃，而存在着安全性差、成本高等问题。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种无需过渡金属催化剂且在水相中以荧光标记的小鼠IgG进行光诱导ATRP的小鼠IgG印迹聚合物的制备方法。

本发明的技术解决方案是：一种小鼠IgG印迹聚合物的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：

a. 将0.01~1mol丙烯酰胺和/或N-羟基丙烯酰胺与0.002~0.02mol甲叉双丙烯酰共同溶于20 ml pH=7的PBS溶液中，超声震荡5min，得第一混合溶液；

b. 将0.001~0.01mol含溴化合物置入第一混合溶液中；

c. 在第一混合溶液中加入0.05~1ml三乙胺、0.002~0.02g小鼠IgG和0.4~4μg荧光标记的小鼠IgG，超声震荡20min，得第二混合溶液，向第二混合溶液中通入氮气10min；

d. 将通入氮气的第二混合溶液光照6小时，得到含小鼠IgG的聚合物；

e.将含小鼠IgG的聚合物放置于含SDS的CH₃COOH溶液中，施加-0.6 V的

电场2h，用PBS冲洗后氮气吹干，得到小鼠IgG印迹聚合物，所述SDS与CH₃COOH的质量体积比为10%，所述CH₃COOH为体积比为10%的CH₃COOH溶液。

本发明是采用荧光标记的小鼠IgG代替传统的光催化剂，无需另外添加过渡金属催化剂，解决了现有ATRP技术应用于小鼠IgG印迹聚合物制备时所存在的低价态金属催化剂对空气等敏感而不易保存、催化剂对蛋白质等生物大分子具有一定的毒性以及脱除催化剂后处理工艺比较复杂等问题，同时也解决了在乙醇相中聚合所存在的安全性差及成本高问题。本发明所制备的小鼠IgG印迹聚合物具有较好的识别性，并可利用电化学方法对小鼠IgG实现较好的检测。

附图说明

图1是本发明实施例1及不同电极在含有0.1 mol/L KCl+5 mmol/L [Fe(CN)₆]^3-/4-（0.1 mol/L pH 7.0 PBS）电解质溶液中的电化学交流阻抗图。

图2是本发明实施例1及不同电极在含有0.1 mol/L KCl+5 mmol/L [Fe(CN)₆]^3-/4-（0.1 mol/L pH 7.0 PBS）电解质溶液中的循环伏安图。

图3是本发明实施例1所得到的小鼠IgG印迹聚合物修饰电极表面的SEM结

果图。

图4是本发明实施例1的印迹聚合物修饰电极对小鼠IgG、人血清白蛋白、血红蛋白、肌红蛋白的选择性示意图。

图5是本发明实施例1的印迹聚合物修饰电极检测一系列不同浓度小鼠IgG得到DPV曲线示意图。

具体实施方式

实施例1：

a. 将0.01mol丙烯酰胺及0.002mol甲叉双丙烯酰胺共同溶于20 ml PBS溶

液（PH=7）中，超声震荡5min，得第一混合溶液；

b.将0.001mol含溴化合物固定在电极上，再将含溴化合物置入第一混合溶

液中；

c.在第一混合溶液中加入0.05ml三乙胺，0.002g小鼠IgG和0.4μg荧光标

记的小鼠IgG，超声震荡20min，得到第二混合溶液，向第二混合溶液中通入氮气10min；

d．室温下，将通入氮气的第二混合溶液光照6小时，得到含小鼠IgG的聚合物修饰电极；

e. 将含小鼠IgG的聚合物修饰电极放置于含10%（w/v）SDS的10%（v/v）CH₃COOH溶液中，施加-0.6 V的电场2 h，则除去含小鼠IgG的聚合物中的小鼠IgG模板分子，利用PBS冲洗三次后，氮气吹干，得到小鼠IgG印迹聚合物修饰电极。

图1是本发明实施例1及不同电极在含有0.1 mol/L KCl+5 mmol/L [Fe(CN)₆]^3-/4-（0.1 mol/L pH 7.0 PBS）电解质溶液中的电化学交流阻抗图（EIS）。

图1中，曲线1为裸金电极的EIS谱图，图谱显示出非常小的半圆形区域，说明[Fe(CN)₆]^3-/4-探针离子在电极表面的电子传递电阻较小；曲线2为沉积上3D镍金纳米簇后电极的EIS谱图，R _ct变得更小；曲线3为引发剂修饰后的电极EIS谱图，电极的R _ct明显增大；曲线4为聚合物（未除去小鼠IgG）修饰电极EIS谱图，电子传递电阻增大非常明显，这说明聚合物作为惰性电子和传质阻挡层可以阻碍探针向电极表面扩散；曲线5为本发明实施例1小鼠IgG印迹聚合物修饰电极的EIS谱图，R _ct明显减少，聚合物表面出现了印迹空穴，使探针更容易扩散到电极表面。

图2为本发明实施例1及不同电极在含有0.1 mol/L KCl+5 mmol/L [Fe(CN)₆]^3-/4-（0.1mol/L pH 7.0 PBS）电解质溶液中的循环伏安图。

图2中，曲线1为裸金电极CV曲线，曲线1在0.2V附近出现一对可逆的[Fe(CN)₆]^3-/4-探针离子氧化还原峰；曲线2为沉积了3D镍金纳米簇后的修饰电极，导电性能增加，峰电流高于裸金电极；曲线3为自组装引发剂后的修饰电极，峰电流低于修饰电极，说明引发剂已经成功组装到电极表面上；曲线4为含小鼠IgG聚合物修饰的电极，氧化还原峰电流进一步减小，说明聚合物作为惰性电子和传质阻挡层，阻碍[Fe(CN)₆]^3-/4-探针向电极表面扩散；曲线5为本发明实施例1小鼠IgG印迹聚合物修饰电极，电极表面出现了印迹空穴，使探针更容易扩散到电极表面。

图3为本发明实施例1所得到的小鼠IgG印迹聚合物修饰电极表面。左为脱除IgG前的电极表面形貌，右为脱除IgG后即印迹聚合物的表面形貌。从图3可以看出脱除小鼠IgG后，电极表面出现了孔状结构，孔状结构为小鼠IgG从电极表面洗脱后形成的印迹空穴。

图4为本发明实施例1的小鼠IgG印迹聚合物修饰电极对小鼠IgG、人血清白蛋白（HSA，MW 66 KDa）、血红蛋白（Hb，MW 64.5 KDa）、肌红蛋白（Mb，MW 16.7 KDa）的选择性示意图。即本发明实施例1得到的小鼠IgG印迹聚合物修饰电极对相同浓度的小鼠IgG、人血清白蛋白、血红蛋白、肌红蛋白响应的DPV峰电流。通过图4可以看出，本发明实施例1的小鼠IgG印迹聚合物修饰电极检测小鼠IgG时DPV峰电流较高，但是检测另外几种物质时，峰电流很小，表明对小鼠IgG具有很好的识别性。

图5为本发明实施例1的小鼠IgG印迹聚合物修饰电极检测一系列不同浓度小鼠IgG得到DPV曲线示意图。图A，从曲线1至10的小鼠IgG浓度分别是0，1.0×10^-7，1.0×10^-6，1.0×10^-5，1.0×10^-4，1.0×10^-3，1.0×10^-2，1.0×10^-1，1.0×1，1.0×10 mg/L；图B是由此得到的工作曲线。从图5可以看出，随着小鼠IgG浓度增加，DPV峰电流降低，并且峰电流与小鼠IgG的浓度对数成正比。根据结果分析，本发明实施例1的小鼠IgG印迹聚合物修饰电极对小鼠IgG的浓度线性响应范围为1.0×10^-7~10.0 mg/L，线性回归方程为ΔI (μA)=4.04logC (mg/L)+36.67，相关系数为R²=0.996，检测小鼠IgG的检出限为2.2×10^-8 mg/L（S/N=3）。

总之，本发明实施例1制备的小鼠IgG印迹聚合物修饰电极具有较好的识别性，并且可以通过电化学方法对小鼠IgG实现较好的检测。

实施例2：

a.将1molN-羟基丙烯酰胺、丙烯酰胺混合物（两者的质量量之比1：3）与

0.02mol甲叉双丙烯酰胺共同溶于20 ml PBS溶液（PH=7）中，超声震荡5min，得第一混合溶液；

b.将0.01mol含溴化合物置入第一混合溶液中；

c.在第一混合溶液中加入1ml三乙胺，0.02g小鼠IgG和4μg荧光标记的小

鼠IgG，超声震荡20min，得到第二混合溶液，向第二混合溶液中通入氮气10min；

d．室温下，将通入氮气的第二混合溶液光照6小时，得到含小鼠IgG的聚合物；

e. 将含小鼠IgG的聚合物放置于含10%（w/v）SDS的10%（v/v）CH₃COOH溶液中，施加-0.6V的电场2 h，则除去含小鼠IgG的聚合物中的小鼠IgG模板分子，利用PBS冲洗三次后，氮气吹干，得到小鼠IgG印迹聚合物修饰电极。

实施例3：

a.将0.05mol N-羟基丙烯酰胺及0.01mol甲叉双丙烯酰胺共同溶于20 ml

PBS溶液（PH=7）中，超声震荡5min，得第一混合溶液；

b.将0.005mol含溴化合物固定在电极上，再将含溴化合物置入第一混合溶

液中；

c. 在第一混合溶液中加入0.08ml三乙胺，0.008g小鼠IgG和2μg荧光标

记的小鼠IgG，超声震荡20min，得到第二混合溶液，向第二混合溶液中通入氮气10min；

d．室温下，将通入氮气的第二混合溶液光照6小时，得到含小鼠IgG的聚合物修饰电极；

e. 将含小鼠IgG的聚合物修饰电极放置于含10%（w/v）SDS的10%（v/v）CH₃COOH溶液中，施加-0.6 V的电场2 h，则除去含小鼠IgG的聚合物中的小鼠IgG模板分子，利用PBS冲洗三次后，氮气吹干，得到小鼠IgG印迹聚合物修饰电极。

实施例4：

a.将0.07mol丙烯酰胺及0.01mol甲叉双丙烯酰胺共同溶于20 ml PBS溶液

（PH=7）中，超声震荡5min，得第一混合溶液；

b.将0.007mol含溴化合物固定在电极上，再将含溴化合物置入第一混合溶

液中；

c. 在第一混合溶液中加入0.06ml三乙胺，0.005g小鼠IgG和1μg荧光标

记的小鼠IgG，超声震荡20min，得到第二混合溶液，向第二混合溶液中通入氮气10min；

d．室温下，将通入氮气的第二混合溶液光照6小时，得到含小鼠IgG的聚合物修饰电极；

e. 将含小鼠IgG的聚合物修饰电极放置于含10%（w/v）SDS的10%（v/v）CH₃COOH溶液中，施加-0.6 V的电场2 h，则除去含小鼠IgG的聚合物中的小鼠IgG模板分子，利用PBS冲洗三次后，氮气吹干，得到小鼠IgG印迹聚合物修饰电极。

实施例5：

a. 将0.09molN-羟基丙烯酰胺与0.015mol甲叉双丙烯酰胺共同溶于20 ml

PBS溶液（PH=7）中，超声震荡5min，得第一混合溶液；

b.将0.009mol含溴化合物置入第一混合溶液中；

c.在第一混合溶液中加入0.09ml三乙胺，0.009g小鼠IgG和3μg荧光标记

的小鼠IgG，超声震荡20min，得到第二混合溶液，向第二混合溶液中通入氮气10min；

d．室温下，将通入氮气的第二混合溶液光照6小时，得到含小鼠IgG的聚合物；

e. 将含小鼠IgG的聚合物放置于含10%（w/v）SDS的10%（v/v）CH₃COOH溶液中，施加-0.6V的电场2 h，则除去含小鼠IgG的聚合物中的小鼠IgG模板分子，利用PBS冲洗三次后，氮气吹干，得到小鼠IgG印迹聚合物修饰电极。