阅读说明：本技术 一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法 (Breeding method of trichoderma harzianum high-yield strain for preventing and controlling potato root rot ) 是由 王喜刚 郭成瑾 沈瑞清 焦杨 张丽荣 杨波 于 2019-07-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法,该哈茨木霉高产菌株通过出发菌株进行紫外诱变、接种发酵瓶、发酵液过滤、平板培养基的准备、抗性筛选的步骤选育得到,根据菌种选育确定的数量,优先选择对马铃薯根腐病致病菌镰刀菌抑菌圈大的菌株进行分离纯化传代,完成哈茨木霉高产菌株的快速筛选。本发明提供的哈茨木霉高产菌株选育方法,可有效提供菌种选育效率,从而缩短菌种选育周期,以前菌种选育要经过6～8代选育,现在仅需3～4代即可完成,时间缩短一半；本发明提高菌种筛选效率和选育优良菌种的准确性,从而为哈茨木霉发酵提供优良的菌种,在防控马铃薯镰刀菌根腐病方面提供了可靠保证。(The invention discloses a breeding method of a trichoderma harzianum high-yield strain for preventing and controlling potato root rot, the trichoderma harzianum high-yield strain is obtained by breeding through the steps of ultraviolet mutagenesis of an initial strain, inoculation of a fermentation bottle, filtration of fermentation liquor, preparation of a plate culture medium and resistance screening, and according to the number determined by strain breeding, strains with large inhibition zones of fusarium, pathogenic bacteria of potato root rot are preferentially selected for separation, purification and passage so as to complete the rapid screening of the trichoderma harzianum high-yield strain. The method for breeding the trichoderma harzianum high-yield strain can effectively improve the strain breeding efficiency, so that the strain breeding period is shortened, the strain breeding is carried out for 6-8 generations before, and can be completed for only 3-4 generations at present, and the time is shortened by half; the invention improves the strain screening efficiency and the accuracy of breeding excellent strains, thereby providing excellent strains for the fermentation of trichoderma harzianum and providing reliable guarantee in the aspect of preventing and controlling the fusarium root rot of potatoes.)

一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法。

背景技术

木霉菌是广泛存在于自然界中的一种微生物，木霉属于半知菌门，丝孢目，木霉属，常见的木霉有绿色木霉、康宁木霉、棘孢木霉、深绿木霉、哈茨木霉、长枝木霉等。其中哈茨木霉的菌丝纤细无色，具分隔，多分枝，分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，对生或互生，一般有2～3次分枝，着生分生孢子的小梗瓶形或锥形，分生孢子多为球形，孢壁具小疣突，蓝绿色。

哈茨木霉菌作为一种生防菌可以用来预防由腐霉菌、立枯丝核菌、镰刀菌、黑根霉、柱孢霉、核盘菌、齐整小核菌等病原菌引起的植物病害。其中由镰刀菌侵染马铃薯引起的根腐病、干腐病、枯萎病是世界性的土传真菌病害，马铃薯根腐病在育苗期和大田生长期均可发病，由多种镰刀菌引起的马铃薯镰刀菌根腐病近几年对马铃薯的生产危害严重，一般发病地块减产13％～35％，严重的成片死亡甚至绝产。马铃薯根腐病的防治一般采用化学杀菌剂进行处理，用化学药剂处理时往往存在残留问题，同时生产田中的镰刀菌不能除根，来年易复发等，因此使用哈茨木霉进行生物防治根腐病处理，环保安全有效，可进行长期防治。

但通过自然选育的哈茨木霉菌株对马铃薯根腐病的致病菌镰刀菌的抑制效果有限，需要较大剂量才能抑制，而且抑制效果有限，因此需要通过技术手段开发选育能提高哈茨木霉代谢产物的高产菌株，提高对马铃薯根腐病的防控效果，还可降低了生产成本。

发明内容

基于以上现有技术，本发明的目的在于提供一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法，本发明提供的哈茨木霉高产菌株选育方法，可有效提供菌种选育效率，从而缩短菌种选育周期，以前菌种选育要经过6～8代选育，现在仅需3～4代即可完成，时间缩短一半；本发明提高菌种筛选效率和选育优良菌种的准确性，从而为哈茨木霉发酵提供优良的菌种，在防控马铃薯镰刀菌根腐病方面提供了可靠保证。

本发明所用的出发菌株哈茨木霉菌M-17，保藏编号：CCTCC NO：M2018538，拉丁文名称为Trichoderma harzianum M-17，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018 年8月13日，保藏地址为中国武汉武汉大学。

本发明采用的技术方案为：一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法，包括以下步骤：

步骤一，孢子悬浮液制备：将哈茨木霉出发菌株M-17菌种接种到PDA培养基斜面上进行培养，结束后用生理盐水冲洗菌种斜面，经玻璃珠打散，去除菌丝，得到含有孢子的悬浮液；

步骤二，紫外诱变：将步骤一得到的含有孢子的悬浮液置于平底培养皿中，进行紫外诱变；

步骤三，平板分离筛选：接着将步骤二诱变后的悬浮液稀释后涂布于PDA培养基平板，黑暗条件下，25～28℃培养，待长出菌落后，挑选出菌落形态发生变化的菌株，进行单菌落划线分离，经二次分离纯化得到较纯的诱变菌株；

步骤四，接种发酵瓶：将步骤三得到的诱变菌种在无菌室内采用挖块接种法接于发酵瓶，将发酵瓶放入摇床上振摇，培养结束后，将发酵到终点的发酵瓶进行过滤，取其过滤液；

步骤五，平板的培养基的准备：将PDA培养基预热融化，在无菌室内倒入平板内，待培养基凝固后，再倒入内含敏感菌的检定培养基；

步骤六，抗性筛选：用进样器吸取发酵液的过滤液直接点在含敏感菌的检定培养基上，每两个点样之间距离大于20mm，所有样品点完后，将平板培养基放入培养箱中进行培养，黑暗条件下25～28℃培养8～10d；

步骤七，将步骤六培养8～10d的平板从培养箱中取出，对每个抑菌圈进行测量，根据菌种选育确定的数量，优先选择抑菌圈大的菌株进行确认，完成哈茨木霉高产菌株的快速筛选。

为了更好的实现本发明，进一步的，步骤一和步骤三中PDA培养基斜面和平板制作方法为：

1)先按以下配比称取培养基各组分：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml；

2)土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20～30min，用 2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取，滤液补充蒸馏水分到1000ml；

3)把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，待琼脂完全溶解后，进行分装，121℃灭菌25～30min后自然冷却倒斜面和平板，凝固后备用。

为了更好的实现本发明，进一步的，步骤一中斜面培养条件为黑暗条件下，25～28℃培养5～7d后。

为了更好的实现本发明，进一步的，步骤二中紫外诱变条件为孢子在15W紫外灯垂直距离下30cm放置，同时磁力搅拌照射30～180s。

为了更好的实现本发明，进一步的，步骤四中发酵瓶配方为碳源添加量为2％的小麦粉、玉米粉、马铃薯全粉、马铃薯淀粉、可溶性淀粉和麸皮粉中的一种或几种；氮源添加量为2％的黄豆粉、葡萄酒皮渣粉、硝酸铵、尿素、硫酸铵和硝酸钠中的一种或几种；生长促进剂为甘草和板蓝根浸出液中的一种或几种，浓度分别为30％、50％、70％。

为了更好的实现本发明，进一步的，步骤四中发酵瓶培养条件为摇床转速220rpm，培养温度25～28℃，培养时间120～168h。

为了更好的实现本发明，进一步的，步骤五中将PDA培养基预热融化时控制培养基厚度在2～3mm之间。

为了更好的实现本发明，进一步的，步骤五中控制内含敏感菌的检定培养基的厚度在 2～3mm之间。

为了更好的实现本发明，进一步的，步骤五中检定培养基中的敏感菌为尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌、接骨木镰刀菌、茄病镰刀菌、锐顶镰刀菌中的一种或几种。

为了更好的实现本发明，进一步的，发酵瓶配方为碳源添加量为2％的玉米粉和麸皮粉中的一种；氮源添加量为2％的黄豆粉和葡萄酒皮渣粉中的一种；生长促进剂为甘草和板蓝根浸出液中的一种或几种，浓度分别为30％、50％、70％。

有益效果

本发明的有益效果及创新点如下：

1、紫外诱变和抗性筛选一般是用于放线菌的选育方法，使用时单独分开结合传统的自然选育使用，本发明将两种方法结合用于真菌选育，扩展了方法的使用，还提高了选育效率；

2、抗性筛选一般是使用特定的抗生素进行筛选，比如链霉素、青霉素抗性筛选，很少使用活菌进行筛选，本发明创造性的使用敏感菌，即起作用的镰刀菌进行抗性筛选，提高了选育效率；

3、优良菌种的判断，常规选育需要通过菌种再次培养，根据摇瓶结果进行验证，得到高产菌株，本发明直接通过对敏感菌镰刀菌的抑菌圈大小进行判断，方法简单直接，减少工作量，提高效率；

4、菌种筛选时发酵培养基中加入中药提取液，这是一般培养基所不具备的一大特点，可以提高选育菌株产物的产量，增加对致病菌镰刀菌的抗性，从而进一步得到优质高效的菌株。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

PDA培养基斜面和平板制作方法为：

1)先按以下配比称取培养基各组分：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml；

2)土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20～30min，用 2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取，滤液补充蒸馏水分到1000ml；

3)把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，待琼脂完全溶解后，进行分装，121℃灭菌25～30min后自然冷却倒斜面和平板，凝固后备用。

实施例1

本实施例提供一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法，包括以下步骤：

步骤一，孢子悬浮液制备：将哈茨木霉出发菌株M-17菌种接种到PDA培养基斜面上，黑暗条件下，25℃培养7d后，用生理盐水冲洗菌种斜面，经玻璃珠打散，去除菌丝，得到含有孢子的悬浮液；

步骤二，紫外诱变：将步骤一得到的含有孢子的悬浮液置于平底培养皿中，在15W紫外灯垂直距离下30cm放置，同时磁力搅拌照射30s进行紫外诱变；

步骤三，平板分离筛选：接着将步骤二诱变后的悬浮液稀释后涂布于PDA培养基平板，黑暗条件下，25℃培养，待长出菌落后，挑选出菌落形态发生变化的菌株，进行单菌落划线分离，经二次分离纯化得到较纯的诱变菌株；

步骤四，接种发酵瓶：将步骤三得到的诱变菌种在无菌室内采用挖块接种法接于发酵瓶，发酵瓶配方为：碳源添加量为2％的玉米粉，氮源添加量为2％的黄豆粉，生长促进剂为浓度为30％的甘草浸出液；将发酵瓶放入摇床上振摇，摇床转速220rpm，培养温度25℃，培养时间168h，培养结束后，将发酵到终点的发酵液200ml进行过滤，取其过滤液；

步骤五，平板的培养基的准备：将PDA培养基预热融化，在无菌室内倒入平板内，控制培养基厚度在2～3mm之间；待培养基凝固后，再倒入内含敏感菌的检定培养基，厚度在 2～3mm之间；检定培养基中的敏感菌为尖孢镰刀菌，加入量为5％；

步骤六，抗性筛选：用5μl进样器吸取发酵液的过滤液直接点在含敏感菌的检定培养基上，每两个点样之间距离大于20mm，所有样品点完后，将平板培养基放入培养箱中进行培养，黑暗条件下25℃培养10d；

步骤七，将步骤六培养10d的平板从培养箱中取出，用游标卡尺对每个抑菌圈进行测量，根据菌种选育确定的数量，优先选择抑菌圈大的菌株进行确认，完成哈茨木霉高产菌株的快速筛选。

所选育的菌株进行斜面孢子计数，孢子数量为2×10¹⁰个/cm²。

实施例2

本实施例提供一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法，包括以下步骤：

步骤一，孢子悬浮液制备：将哈茨木霉出发菌株M-17菌种接种到PDA培养基斜面上，黑暗条件下，25℃培养6d后，用生理盐水冲洗菌种斜面，经玻璃珠打散，去除菌丝，得到含有孢子的悬浮液；

步骤二，紫外诱变：将步骤一得到的含有孢子的悬浮液置于平底培养皿中，在15W紫外灯垂直距离下30cm放置，同时磁力搅拌照射60s进行紫外诱变；

步骤三，平板分离筛选：接着将步骤二诱变后的悬浮液稀释后涂布于PDA培养基平板，黑暗条件下，25℃培养，待长出菌落后，挑选出菌落形态发生变化的菌株，进行单菌落划线分离，经二次分离纯化得到较纯的诱变菌株；

步骤四，接种发酵瓶：将步骤三得到的诱变菌种在无菌室内采用挖块接种法接于发酵瓶，发酵瓶配方为：碳源添加量为2％的麸皮粉，氮源添加量为2％的葡萄酒皮渣粉，生长促进剂为浓度为50％的板蓝根浸出液；将发酵瓶放入摇床上振摇，摇床转速220rpm，培养温度25℃，培养时间160h，培养结束后，将发酵到终点的发酵液200ml进行过滤，取其过滤液；

步骤五，平板的培养基的准备：将PDA培养基预热融化，在无菌室内倒入平板内，控制培养基厚度在2～3mm之间；待培养基凝固后，再倒入内含敏感菌的检定培养基，厚度在 2～3mm之间；检定培养基中的敏感菌为木贼镰刀菌，添加量为5％；

步骤六，抗性筛选：用5μl进样器吸取发酵液的过滤液直接点在含敏感菌的检定培养基上，每两个点样之间距离大于20mm，所有样品点完后，将平板培养基放入培养箱中进行培养，黑暗条件下25℃培养10d；

步骤七，将步骤六培养10d的平板从培养箱中取出，用游标卡尺对每个抑菌圈进行测量，根据菌种选育确定的数量，优先选择抑菌圈大的菌株进行确认，完成哈茨木霉高产菌株的快速筛选。

所选育的菌株进行斜面孢子计数，孢子数量为3×10¹⁰个/cm²。

实施例3

本实施例提供一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法，包括以下步骤：

步骤一，孢子悬浮液制备：将哈茨木霉出发菌株M-17菌种接种到PDA培养基斜面上，黑暗条件下，26℃培养6d后，用生理盐水冲洗菌种斜面，经玻璃珠打散，去除菌丝，得到含有孢子的悬浮液；

步骤二，紫外诱变：将步骤一得到的含有孢子的悬浮液置于平底培养皿中，在15W紫外灯垂直距离下30cm放置，同时磁力搅拌照射90s进行紫外诱变；

步骤三，平板分离筛选：接着将步骤二诱变后的悬浮液稀释后涂布于PDA培养基平板，黑暗条件下，26℃培养，待长出菌落后，挑选出菌落形态发生变化的菌株，进行单菌落划线分离，经二次分离纯化得到较纯的诱变菌株；

步骤四，接种发酵瓶：将步骤三得到的诱变菌种在无菌室内采用挖块接种法接于发酵瓶，发酵瓶配方为：碳源添加量为2％的玉米粉，氮源添加量为2％的黄豆粉，生长促进剂为浓度为70％的板蓝根浸出液；将发酵瓶放入摇床上振摇，摇床转速220rpm，培养温度26℃，培养时间150h，培养结束后，将发酵到终点的发酵液200ml进行过滤，取其过滤液；

步骤五，平板的培养基的准备：将PDA培养基预热融化，在无菌室内倒入平板内，控制培养基厚度在2～3mm之间；待培养基凝固后，再倒入内含敏感菌的检定培养基，厚度在 2～3mm之间；检定培养基中的敏感菌为接茄病镰刀菌；

步骤六，抗性筛选：用5μl进样器吸取发酵液的过滤液直接点在含敏感菌的检定培养基上，每两个点样之间距离大于20mm，所有样品点完后，将平板培养基放入培养箱中进行培养，黑暗条件下26℃培养9d；

步骤七，将步骤六培养9d的平板从培养箱中取出，用游标卡尺对每个抑菌圈进行测量，根据菌种选育确定的数量，优先选择抑菌圈大的菌株进行确认，完成哈茨木霉高产菌株的快速筛选。

所选育的菌株进行斜面孢子计数，孢子数量为5×10¹⁰个/cm²。

实施例4

本实施例提供一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法，包括以下步骤：

步骤一，孢子悬浮液制备：将哈茨木霉出发菌株M-17菌种接种到PDA培养基斜面上，黑暗条件下，27℃培养5d后，用生理盐水冲洗菌种斜面，经玻璃珠打散，去除菌丝，得到含有孢子的悬浮液；

步骤二，紫外诱变：将步骤一得到的含有孢子的悬浮液置于平底培养皿中，在15W紫外灯垂直距离下30cm放置，同时磁力搅拌照射120s进行紫外诱变；

步骤三，平板分离筛选：接着将步骤二诱变后的悬浮液稀释后涂布于PDA培养基平板，黑暗条件下，27℃培养，待长出菌落后，挑选出菌落形态发生变化的菌株，进行单菌落划线分离，经二次分离纯化得到较纯的诱变菌株；

步骤四，接种发酵瓶：将步骤三得到的诱变菌种在无菌室内采用挖块接种法接于发酵瓶，发酵瓶配方为：碳源添加量为2％的麸皮粉，氮源添加量为2％的葡萄酒皮渣粉，生长促进剂为浓度为50％的甘草浸出液；将发酵瓶放入摇床上振摇，摇床转速220rpm，培养温度27℃，培养时间135h，培养结束后，将发酵到终点的发酵液200ml进行过滤，取其过滤液；

步骤五，平板的培养基的准备：将PDA培养基预热融化，在无菌室内倒入平板内，控制培养基厚度在2～3mm之间；待培养基凝固后，再倒入内含敏感菌的检定培养基，厚度在 2～3mm之间；检定培养基中的敏感菌为尖孢镰刀菌和锐顶镰刀菌，添加量分别为2.5％；

步骤六，抗性筛选：用5μl进样器吸取发酵液的过滤液直接点在含敏感菌的检定培养基上，每两个点样之间距离大于20mm，所有样品点完后，将平板培养基放入培养箱中进行培养，黑暗条件下27℃培养8d；

步骤七，将步骤六培养8d的平板从培养箱中取出，用游标卡尺对每个抑菌圈进行测量，根据菌种选育确定的数量，优先选择抑菌圈大的菌株进行确认，完成哈茨木霉高产菌株的快速筛选。

所选育的菌株进行斜面孢子计数，孢子数量为4×10¹⁰个/cm²。

实施例5

本实施例提供一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法，包括以下步骤：

步骤一，孢子悬浮液制备：将哈茨木霉出发菌株M-17菌种接种到PDA培养基斜面上，黑暗条件下，28℃培养5d后，用生理盐水冲洗菌种斜面，经玻璃珠打散，去除菌丝，得到含有孢子的悬浮液；

步骤二，紫外诱变：将步骤一得到的含有孢子的悬浮液置于平底培养皿中，在15W紫外灯垂直距离下30cm放置，同时磁力搅拌照射180s进行紫外诱变；

步骤三，平板分离筛选：接着将步骤二诱变后的悬浮液稀释后涂布于PDA培养基平板，黑暗条件下，28℃培养，待长出菌落后，挑选出菌落形态发生变化的菌株，进行单菌落划线分离，经二次分离纯化得到较纯的诱变菌株；

步骤四，接种发酵瓶：将步骤三得到的诱变菌种在无菌室内采用挖块接种法接于发酵瓶，发酵瓶配方为：碳源添加量为2％的麸皮粉，氮源添加量为2％的葡萄酒皮渣粉，生长促进剂为浓度为30％的甘草浸出液和50％的板蓝根浸出液；

将发酵瓶放入摇床上振摇，摇床转速220rpm，培养温度28℃，培养时间120h，培养结束后，将发酵到终点的发酵液200ml进行过滤，取其过滤液；

步骤五，平板的培养基的准备：将PDA培养基预热融化，在无菌室内倒入平板内，控制培养基厚度在2～3mm之间；待培养基凝固后，再倒入内含敏感菌的检定培养基，厚度在 2～3mm之间；检定培养基中的敏感菌为木贼镰刀菌和接骨木镰刀菌，添加量分别为2.5％；

步骤六，抗性筛选：用5μl进样器吸取发酵液的过滤液直接点在含敏感菌的检定培养基上，每两个点样之间距离大于20mm，所有样品点完后，将平板培养基放入培养箱中进行培养，黑暗条件下28℃培养8d；

步骤七，将步骤六培养8d的平板从培养箱中取出，对每个抑菌圈进行测量，根据菌种选育确定的数量，优先选择抑菌圈大的菌株进行确认，完成哈茨木霉高产菌株的快速筛选。

所选育的菌株进行斜面孢子计数，孢子数量为5×10¹⁰个/cm²。

上述实施例1至5中提供的一种用于防控马铃薯根腐病的哈茨木霉高产菌株的选育方法选育的高产菌株和病原菌镰刀菌分别转接于PDA固体平板，于25℃黑暗条件下培养5d后，用Φ＝10mm打孔器沿菌落边缘各打菌饼三块，分别放入三个已凝固的PDA固体培养基中线上，两菌饼之间的距离须大于20mm，于25℃黑暗条件下静止培养10d左右，考察各高产菌株与病原菌的拮抗性。考察结果如下表所示：

表1出发菌株M-17对5种马铃薯镰刀菌根腐病病原真菌的抑菌作用

表2实施例1-5选育菌株对5种马铃薯镰刀菌根腐病病原真菌的抑菌作用

从上表可知，本发明选育的哈茨木霉高产菌株均比出发菌株M-17在对5种马铃薯镰刀菌根腐病病原真菌的抑菌作用要有明显的提高。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。