阅读说明：本技术 尿苷二磷酸葡萄糖高产菌株及其应用 (Uridine diphosphate glucose high-producing strain and application thereof ) 是由 吴旭日 许韶华 李萌 陈依军 于 2019-10-16 设计创作，主要内容包括：UDPG依赖糖基转移酶(UGTs)可催化多种化合物葡萄糖基化修饰,但价格昂贵且稳定性不佳的糖供体UDPG(尿苷二磷酸葡萄糖)成为限制UGTs的规模化应用的主要因素。鉴于现有解决措施的局限性,本发明采用“开源节流”的策略改造了大肠杆菌中嘧啶合成途径、改变了碳源流量和UDPG的代谢去路,构建了UDPG高产菌株,并验证了其应用的可行性。同时,实现了天然非营养型甜味剂莱鲍迪苷KA的高效生物合成。(UDPG dependent glycosyltransferases (UGTs) can catalyze glucosylation modification of a variety of compounds, but the expensive and poorly stable sugar donor UDPG (uridine diphosphate glucose) becomes a major factor limiting the scale-up of UGTs. In view of the limitation of the existing solving measures, the invention adopts an open source throttling strategy to reform a pyrimidine synthesis way in escherichia coli, change the flow of a carbon source and the metabolic outward route of the UDPG, construct a UDPG high-yield strain and verify the feasibility of the application of the UDPG high-yield strain. Meanwhile, the high-efficiency biosynthesis of the rebaudioside KA of the natural non-nutritive sweetener is realized.)

尿苷二磷酸葡萄糖高产菌株及其应用

技术领域

本发明属于天然产物生物合成和微生物代谢工程以及食品化工技术领域，具体涉及一种提高大肠杆菌内源性UDPG含量的方法，以及使用该方法获得的UDPG高产菌株及其应用。

背景技术

糖基化修饰是改善或改变天然产物物理性质与生物活性的重要手段之一。与化学方法相比，酶法糖基化修饰具有反应条件温和、选择性好及绿色环保等优点，被受学术界和工业界关注。UDP-葡萄糖依赖的糖基转移酶(UDP-glycosyltransferases，UGTs，EC2.4.1.x)是以尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)为糖基供体的一类酶，广泛存在于植物、动物及微生物体内，数量巨大(Bock KW.Biochem Pharmacol,2016,99:11-17)。UGTs可区域选择性和立体选择性地催化天然和非天然化合物的定点糖基化修饰，可作为一种有效的工具酶应用于精细化工、药物开发、食品饮料、日用化工品及农药等众多领域(Lairson LL,et al.AnnuRev Biochem,2007,77:521-555；Bak S,et al.Plant Physiol,2008,148:1295-1308；ChenHY,et al.Plant J 2017,89:195-203)。

大量消耗价格昂贵且稳定性不佳的UDP-葡萄糖(UDPG)是UGTs产业化应用的主要限制因素，致使UGTs目前仅局限于实验室规模的应用。为了解决UGTs糖基供体UDPG的来源问题，降低UGTs催化化合物糖基化修饰的成本，研究人员在大肠杆菌宿主中开展了一系列的尝试。1)构建体外再生体系，减少外源性UDPG的用量。体外一锅法(One-pot)反应体系是最为常用的UDPG再生策略，即将UGTs催化的糖基化修饰反应与蔗糖合酶催化的UDPG合成反应兼容性偶联，实现UDPG的循环供应。Sayaka等将拟南芥的蔗糖合酶AtSUS-1与糖基转移酶CaUGT2偶联一锅法实现了姜黄素的糖基化，糖基化修饰效率提高了7倍，外源性UDPG降低了90％(

K,et al.Biotechnol Adv,2016,34:88-111)。但是，该UDPG再生反应体系仍需要外加少量的UDPG，且稳定性较差。2)UDP-葡萄糖代谢途径改造，增加内源性UDPG合成量。利用代谢工程改造宿主的UDPG生物合成途径，提高内源性含量，并采用全细胞反应与发酵法进行底物的糖基化修饰是近年来广泛使用的糖基化修饰策略之一。在常用宿主大肠杆菌中，UDPG合成相关酶的过表达如UDPG焦磷酸化酶(galU)和磷酸葡萄糖变位酶(pgm)是内源性UDPG合成量提高的常用策略，但效果不够明显。因此，韩国鲜文大学的Sohng课题组自2013年开始在大肠杆菌BL21(DE3)的中先后过表达了galU，敲除了6-磷酸葡萄糖异构酶(pgi)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(zwf)和UDP-葡萄糖水解酶(ushA)基因，构建了工程菌株E.coli MA3F。通过在E.coli MA3F中过表达相关UGT，实现了芹菜素和黄芩素的糖基化修饰，但底物浓度较低，且转化不完全(Thuan NH et al.Process Biochem,2013,48:1744–1748)。3)引入外源UDPG合成途径，提高内源性UDPG含量。费文理等在大肠杆菌中引入蔗糖磷酸化酶(BasP)和两歧双歧杆菌的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(ugpA)基因，并偶联糖基转移酶EUGT11构建了全细胞催化剂实现了莱鲍迪苷D高效合成，但底物浓度有待提高(费理文等.食品与发酵工业,2018,44:1-7)。

莱鲍迪苷KA是来源于甜叶菊(Stevia rebaudiana)的新型四环二萜类化合物，2014年由MA.Ibrahim等分离纯化并鉴定(Ibrahim M A,et al.J Nat Prod,2014,77:1231-1235)。莱鲍迪甘KA的甜度约为蔗糖的300倍，但热值不足蔗糖的1％，甜味纯正且无明显后滞苦味，是一种理想的天然甜味剂。本课题组前期采用Streptomyces antibioticus的UDP-糖基转移酶OleD偶联蔗糖合酶定点糖基化修饰甜茶苷，实现了莱鲍迪苷KA的选择性生物合成(CN107164435A)。但是，反应中仍需要添加大量外源性UDPG，产业化应用成本较高。本发明将以该反应为模型反应，验证UDPG高产大肠杆菌的应用可行性，同时实现莱鲍迪苷KA的高效、低成本的生物合成。

发明内容

本发明的目的在于重构大肠杆菌内源性UDPG代谢途径，在大肠杆菌内源性UDPG代谢流充分解析的基础上，采用“开源-节流”方案对UDPG生物合成和代谢途径进行设计改造，革除UDPG依赖糖基转移酶催化反应中使用外源性UDPG，构建得到UDPG高产的菌株。由于大肠杆菌内源性UDPG的合成与分解为动态变化过程，难以通过测定UDPG含量监测菌株改造的结果，因此本发明以糖基转移酶OleD催化甜茶苷合成莱鲍迪苷KA为模型反应，验证UDPG合成与代谢途径改造的可行性，从而筛选出UDPG高产菌株，并在此基础上规模化制备KA。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案具体如下：

一种尿苷二磷酸葡萄糖高产菌株的构建方法，对合成尿苷二磷酸葡萄糖的菌株进行改造，过表达所述菌株嘧啶合成途径中的相关关键酶。所述嘧啶合成的关键酶选自乳清酸焦磷酸化酶pyrE、乳清酸核苷酸脱羧酶pyrF、尿嘧啶核苷酸激酶pyrH中的一种或几种。可通过游离质粒和/或基因组定点整合的方式单个过表达或多个共表达。pyrE的基因序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，pyrF基因序列如SEQ ID NO:3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。pyrH基因序列如SEQ ID NO:5所示，氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示。

本发明所述的方法还包括碳源流量改造即敲除6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi，避免6-磷酸葡萄糖异构化为6-磷酸果糖，促使6-磷酸葡萄糖进入UDPG合成途径。pgi基因序列如SEQ ID NO:7所示。

本发明所述的方法还进一步包括抑制内源性UDPG代谢途径即敲除的UDPG脱氢酶基因，避免内源性UDPG转化为UDP-葡萄糖酸。ugd基因序列如SEQ ID NO:8所示。

本发明另一目的在于提供一种UDPG高产菌株，采用本发明所述方法获得。

本发明的UDPG高产菌株为上述方法单独或组合使用构建获得，优选改造大肠杆菌内源性UDPG生物合成途径所得大肠杆菌工程菌株。

本发明另一目的在于提供所述尿苷二磷酸葡萄糖高产菌株的应用，在尿苷二磷酸葡萄糖高产菌株中共表达蔗糖合酶和尿苷二磷酸葡萄糖依赖的糖基转移酶或单独表达尿苷二磷酸葡萄糖依赖的糖基转移酶，构建生物催化剂用以化合物的高效葡萄糖基化修饰。

为此本发明以合成莱鲍迪苷KA、罗汉果苷、糖基化黄豆苷元为例进行了说明。

为实现上述目的，本发明采用开展了如下研究内容：

1)采用共表达载体将蔗糖合酶与糖基转移酶OleD进行串联表达，获得工程菌株E.coli C&1～E.coli C&8，通过莱鲍迪甘KA的产率评价8株工程菌的UDPG合成与再生效率。

2)将蔗糖合酶整合至大肠杆菌基因组，利用表达载体导入OleD基因，获得工程菌株株E.coli C&9，评价UDPG合成与再生效率。

3)采用表达载体在大肠杆菌中分别过表达以及共表达乳清酸焦磷酸化酶(pyrE)、脱羧酶(pyrF)以及尿嘧啶核苷酸激酶(pyrH)，导入蔗糖合酶和OleD基因后分别获得工程菌株E.coli CP&1、CP&2、CP&3和CP&4。评价UDPG的合成与再生效率。

4)通过同源重组增加大肠杆菌基因组中pyrE、pyrF以及pyrH基因的拷贝数，分别获得工程菌E.coli C&13～C&15，导入蔗糖合酶和OleD基因，获得工程菌株E.coli CP&5～CP&7。测定UDPG的合成与再生效率。

5)敲除大肠杆菌的6-磷酸葡萄糖异构酶基因(pgi)，获得工程菌株E.coli CP&8和E.coli CP&9，导入蔗糖合酶和OleD基因，构建了E.coli CPM&1和E.coli CPM&2。测定UDPG的合成与再生效率。

6)敲除大肠杆菌的UDPG脱氢酶基因(ugd)，获得工程菌株E.coli CPΔU&1和E.coli CPΔU&2，导入蔗糖合酶和OleD基因，构建了E.coli CPMΔU&1和E.coli CPMΔU&2。测定UDPG的合成与再生效率。

7)优化E.coli CPMΔU&2催化合成莱鲍迪苷KA的反应条件，验证内源性UDPG再生和循环系统的放大可行性，本发明所述的所有的条件优化过程，均无外源性UDPG添加，具体优化如下：考察不同反应温度(25～55℃)，优选40℃；考察不同反应pH值(5.5～10.0)，优选pH为7.5；考察不同蔗糖浓度(500～900g/L)，优选800g/L；考察不同甜茶苷浓度(2.5-25g/L)，优选22.5g/L；考察不同菌体浓度(25～125g/L)，优选100mg/mL。

在优选反应条件下，放大反应体系至0.5L，莱鲍迪苷KA的16小时产率为95.7％，因此本发明采用UDPG高产菌株构建了一条莱鲍迪苷KA生物合成新途径。

8)在UDPG高产菌株的基础上，通过构建糖基转移酶OleD单酶全细胞催化剂、罗汉果苷IIIE糖基化修饰、糖基转移酶YjiC与蔗糖合酶共表达等方式，进一步验证UDPG高产菌株的可靠性和普遍适用性。

基于“开源-节流”策略，本发明通过设计改造大肠杆菌内源性UDPG生物合成和代谢途径，以及反应条件优化，获得UDPG代谢途径重构菌株，该菌株可实现内源性UDPG的高效再生和循环，可用于不同糖基转移酶催化反应的供体UDPG。

此外，在完全避免外源性UDPG使用的情况下，UDPG高产大肠杆菌菌株可实现22.5g/L甜茶苷高效合成莱鲍迪苷KA，甜茶苷的转化率达到95.7％。因此，本发明建立了一条无需外源性UDPG的莱鲍迪苷KA生物合成新工艺，可实现天然甜味剂莱鲍迪苷KA的高效低成本合成，产业化应用前景广阔。

本发明具有如下优点：

1)本发明公开的UDPG高产大肠菌株可增加内源性UDPG的含量，实现内源性UDPG的循环再生，为UDPG依赖糖基转移酶催化的糖基化反应提供UDPG糖供体。

2)与文献报道的UDPG再生体系和菌株相比，本发明公开的UDPG高产大肠菌株可完全避免外源性UDPG的使用，且不影响UDPG依赖糖基转移酶的催化效率。

3)本发明公开的天然甜味剂莱鲍迪苷KA生物制备新工艺，完全革除外源性UDPG的使用，工业化应用前景巨大。

综上所述，本发明公开的UDPG高产大肠菌株可实现内源性UDPG的高效生物合成和循环再生，可为UDPG依赖糖基转移酶催化的糖基化反应提供充足的UDPG糖供体。这为解决UDPG依赖糖基转移酶规模化应用中的UDPG成本难题提供了底盘菌株和解决方案，应用价值巨大。此外，本发明公开的天然甜味剂莱鲍迪苷KA生物合成新工艺，操作简单，成本较低，市场应用前景广阔。

附图说明

图1为E.coli CP&1～CP&4催化合成莱鲍迪苷KA的HPLC分析结果。

图2为0.5L制备体系中莱鲍迪苷KA的HPLC分析结果(反应16小时)。

图3为莱鲍迪苷KA的纯度分析结果。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不局限于实施例范围。

在本发明中使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明，应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1内源性UDPG循环菌株构建

采用pETDuet-1和pACYCDeut-1共表达载体，借助酶切位点Nco I/Hind III和NdeI/Xho I按照***两个多克隆位点顺序的不同，分别构建获得Arabidopsis thaliana和Vigna radiata蔗糖合酶基因(sus)与糖基转移酶OleD基因(oled)的共表达质粒：pEaT-GT、pEGT-aT、pAaT-GT、pAGT-aT、pEvT-GT、pEGT-vT、pAvT-GT、pAGT-vT。将上述共表达质粒分别转化至大肠杆菌BL 21(DE3)获得工程菌株E.coli C&1、E.coli C&2，E.coli C&3和E.coliC&4、E.coli C&5、E.coli C&6，E.coli C&7和E.coli C&8。Arabidopsis thaliana蔗糖合酶基因序列如SEQ ID NO:9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。Vigna radiata蔗糖合酶基因序列如SEQ ID NO:11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。OleD基因序列如SEQ IDNO:13所示，OleD氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。

诱导表达后，SDS-PAGE分析蔗糖合酶和糖基转移酶OleD的蛋白质表达情况。结果显示，8株菌中蔗糖合酶和OleD均能可溶性表达，其占可溶性总蛋白的比例见表1。

表1蔗糖合酶和糖基转移酶OleD的可溶性表达

实施例2蔗糖合酶的活性及莱鲍迪苷KA的产率测定

将实施例1中的工程菌诱导表达后用磷酸钠缓冲液重悬后，低温条件下超声破碎，离心制备相应的粗酶液。采用DNS(3,5-二硝基水杨酸)法测定E.coli C&1～E.coli C&8粗酶液中蔗糖合酶活性。结果显示，E.coli C&1～E.coli C&8粗酶液中的蔗糖合酶活力单位(IU)分别为0.159，0.162，0.145，0.133，0.08，0.11，0.06，0.09。

本发明中莱鲍迪苷KA的产率是衡量内源性UDPG水平的指标。实施例1中的工程菌诱导表达后按照25g/L的比例用M9培养基(pH 7.0)重悬后获得相应的全细胞催化剂。在50mL全细胞催化反应体系中，甜茶苷为2g/L，蔗糖为600g/L，30℃振摇反应18小时。反应结束后，加热除蛋白，再加入等体积甲醇处理，离心过滤获得的滤液进行HPLC分析，检测莱鲍迪苷KA的产率，以判断内源性UDPG的含量和循环再生情况。

HPLC检测条件：HPLC型号：Agilent 1260；色谱柱：YMC-Pack ODS-A(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：A超纯水(含1‰甲酸)，B乙腈(含1‰甲酸)；柱温：35℃；检测波长：210nm；进样量：10μL；分析时间：25min；流速：1mL/min；洗脱梯度：10％B～90％B。

E.coli CP&1～CP&4催化合成莱鲍迪苷KA的HPLC分析结果如图1所示。E.coli C&1～E.coli C&8的催化效率比较结果如表2所示，8株工程菌均能实现内源性UDPG的循环，但由于大肠杆菌中内源性UDPG含量较低，所以莱鲍迪苷KA的产率均低于35％，无法规模化应用。

表2菌株E.coli C&1～E.coli C&8的催化效率比较

实施例3蔗糖合酶的基因组整合

利用λ-Red同源重组方法将Arabidopsis thaliana蔗糖合酶基因整合至E.coliBL21(DE3)的基因组，借助表达载体pET22b(+)导入OleD基因后获得工程菌株E.coli C&9。诱导表达后，按照实施例2构建50ml全细胞催化体系。HPLC检测结果显示，莱鲍迪苷KA的产率仅为17.3％。综合实施例2和3，含游离共表达载体pEaT-GT的E.coli C&1催化效率最优，故选择pEaT-GT评价UDPG代谢途径改造的效果。

实施例4 UDP生物合成途径的改造

在大肠杆菌中，乳清酸焦磷酸化酶(pyrE)可催化5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)与乳清酸合成乳清酸核苷酸，再由脱羧酶(pyrF)催化脱羧形成UMP。UMP在尿嘧啶核苷酸激酶(pyrH)催化下可形成UDP。UDP可在核苷二磷酸激酶催化下形成UTP，并最终形成UDPG。此外，在蔗糖合酶催化作用下UDP可直接利用蔗糖合成UDPG。因此，增加UDP的合成量对提高内源性UDPG的含量至关重要。

利用共表达载体pCDFDeut-1，借助酶切位点Nco I/Hind III和Nde I/Xho I构建了pyrE和pyrF的单酶表达质粒pC-E、pC-F以及双酶共表达质粒pC-E-F。利用酶切位点NdeI/Xho I和pACYCDeut-1构建了pyrH表达质粒pA-H。将pC-E、pC-F和pA-H分别共转化至E.coli BL21获得工程菌株E.coli C&10、C&11和C&12。在此基础上分别导入共表达质粒pEaT-GT，构建工程菌株E.coli CP&1、CP&2和CP&3。pC-E-F、pA-H和pEaT-GT共同导入E.coliBL21获得工程菌E.coli CP&4。

上述工程菌诱导表达后，SDS-PAGE的分析结果显示，E.coli CP&1～CP&4中pyrE、pyrF、pyrH的可溶性表达量均超过了5％。为评价UDP提高对内源性UDPG含量的影响，按照实施例2构建了全细胞催化体系。结果显示，E.coli CP&1～CP&4催化合成莱鲍迪苷KA的效率分别为44.8％、54.5％、42.1％和30.8％。该结果表明，UDP生物合成量的提高，可显著提升内源性UDPG含量，为糖基转移酶提供糖供体。

实施例5 pyrE、pyrF和pyrH的基因组整合

由于pyrE、pyrF和pyrH均为大肠杆菌内源性的酶，故采用λ-Red同源重组方法在E.coli BL21染色体中三种酶编码基因处分别再***pyrE、pyrF和pyrH的编码基因，以增加拷贝数，获得工程菌E.coli C&13～C&15。在此基础上，分别导入共表达质粒pEaT-GT，获得工程菌株E.coli CP&5～CP&7。按照实施例2构建全细胞催化体系，以判断内源性UDPG的含量，莱鲍迪苷KA的产率分别为25.8％、29.0％和21.5％。该结果表明，E.coli CP&5～CP&7中内源性UDPG的含量明显低于E.coli CP&1～CP&4。因此，本发明选择游离质粒改造UDPG生物合成途径。

实施例6 6-磷酸葡萄糖异构酶的敲除

为进一步提高内源性UDPG的含量，本发明在过表达pyrE的E.coli C&10和过表达pyrF的E.coli C&11菌株基础上敲除6-磷酸葡萄糖异构酶基因(pgi)改变大肠杆菌的碳源流量，以避免葡萄糖异构化为6-磷酸果糖。根据E.coli BL21(DE3)的基因组序列(GenBank号：NC_012971.2)选定pgi基因上下游50bp序列作为同源臂，并在3’端加上20bp的扩增引物。上游引物pgi-homo-F:5’-CGCTACAATCTTCCAAAGTCACAATTCTCAAAATCAGAAGAGTATTGCTAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO:15)，下游引物pgi-homo-R:5’-GTTGCCGGATGCGGCGTGAACGCCTTATCCGGCCTACATATCGACGATGAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’(SEQ ID NO:16)。采用λ-Red同源重组方法分别敲除E.coli C&10和E.coli C&11中的pgi基因，获得工程菌株E.coliCP&8和E.coli CP&9，导入共表达质粒pEaT-GT分别构建了E.coli CPM&1和E.coli CPM&2。

按照实施例2构建全细胞催化体系，E.coli CPM&1和E.coli CPM&2催化莱鲍迪苷KA合成的产率分别为60.8％和70.1％。该结果表明，pgi基因敲除后大肠杆菌的内源性UDPG含量显著增加。

实施例7 UDPG脱氢酶基因(ugd)的敲除

实施例1～6均是基于“开源”策略增加大肠杆菌内源性UDPG的生物合成，但UDPG在体内可被UDPG脱氢酶转化为UDP-葡萄糖酸，降低内源性UDPG的含量。因此，本发明在E.coliCP&8和E.coli CP&9的基础上敲除UDPG脱氢酶基因(ugd)，以减少UDPG的消耗。按照实施例6的方法设计并合成ugd敲除引物，(上游引物ugd-homo-F：5’-CGCAAGTAACAAAAGACAATCAGGGCGTAAATAGCCCTGATAACAGGATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO:17)；下游引物ugd-homo-R：5’-GATGCTAAAAACATCATGATTCACAGTTAAGTTAATTCTGAGAGCATGAAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’(SEQ ID NO:18))采用λ-Red同源重组方法分别敲除E.coli CP&8和E.coli CP&9的ugd基因，获得工程菌株E.coli CPΔU&1和E.coli CPΔU&2，导入共表达质粒pEaT-GT分别构建了E.coli CPMΔU&1和E.coli CPMΔU&2。

按照实施例2构建全细胞催化体系，E.coli CPMΔU&1和E.coli CPMΔU&2催化莱鲍迪苷KA合成的产率分别为81％和99.2％。该结果表明，通过“开源节流”策略，大肠杆菌内源性UDPG含量得到有效提高，构建了一株UDPG高产的大肠杆菌菌株E.coli CPΔU&2。在无外源性UDPG的条件下，表达糖基转移酶OleD的E.coli CPMΔU&2可催化2.5g/L甜茶苷转化为莱鲍迪苷KA，底物浓度远高于文献报道。

实施例8 E.coli CPMΔU&2合成莱鲍迪苷KA的最佳温度

作为一个新的全细胞催化剂，本发明考察了E.coli CPMΔU&2催化合成莱鲍迪苷KA的反应条件。反应温度考察：在50mL全细胞催化反应体系中，甜茶苷浓度为10g/L和12.5g/L，蔗糖600g/L，反应温度为25℃～55℃，反应pH为7.0，反应时间18小时。反应结束后HPLC检测莱鲍迪苷KA的产率，HPLC方法见实施例2。结果如表3所示，E.coli CPMΔU&2催化合成莱鲍迪苷KA的最佳温度为40℃，但甜茶苷未能完全转化。

表3温度对莱鲍迪苷KA生物合成影响

实施例9 E.coli CPMΔU&2合成莱鲍迪苷KA的最佳pH

反应pH考察：在50mL全细胞催化反应体系中，甜茶苷浓度为12.5g/L，蔗糖600g/L，反应温度为40℃，反应pH为5.5～9.0，反应时间18小时。反应结束后HPLC检测莱鲍迪苷KA的产率，HPLC方法见实施例2。结果如表4所示，E.coli CPMΔU&2催化合成莱鲍迪苷KA的最佳pH为7.5，产率达到90.1％。

表4 pH对莱鲍迪苷KA生物合成影响

实施例10最佳蔗糖浓度和菌体量

最佳蔗糖浓度考察：在50mL全细胞催化反应体系中，甜茶苷浓度为12.5g/L，蔗糖浓度为500～900g/L，反应温度为40℃，反应pH为7.5，反应时间18小时。反应结束后HPLC检测莱鲍迪苷KA的产率，HPLC方法见实施例2。结果如表5所示，E.coli CPMΔU&2催化合成莱鲍迪苷KA的最佳蔗糖浓度为800g/L，底物基本完全转化。

表5蔗糖浓度对莱鲍迪苷KA生物合成影响

最佳菌体用量考察：在50mL全细胞催化反应体系中，甜茶苷浓度为12.5～25g/L，蔗糖800g/L，反应温度为40℃，反应pH为7.5，菌体浓度25～125g/L，反应时间18小时。反应结束后HPLC检测莱鲍迪苷KA的产率，HPLC方法见实施例2。结果如表6所示，E.coli CPMΔU&2催化合成莱鲍迪苷KA的最佳菌体浓度为100g/L，22.5g/L甜茶苷转化为莱鲍迪苷KA的产率大于95％。

表6菌体量对莱鲍迪苷KA生物合成影响

实施例11莱鲍迪苷KA的制备

在最佳反应条件下，E.coli CPMΔU&2催化甜茶苷合成莱鲍迪苷KA的反应体系被放大至0.5L。HPLC分析结果如图2所示。结果显示，反应16小时后莱鲍迪苷KA的转化率到达平台期，达到95.4％。按照CN107164435A的方法纯化获得纯度大于99.5％的莱鲍迪苷KA(纯度分析结果如图3所示)，回收率为80.2％。该结果进一步验证了UDPG高产菌株的可行性。

实施例12 OleD催化合成莱鲍迪苷KA

利用pET22b(+)将OleD基因转化至E.coli CPΔU&2，获得工程菌株E.coli CPMΔU&3。诱导表后，将按照E.coli CPMΔU&2的最佳催化条件构建全细胞催化体系，但底物浓度降低至1g/L。HPLC检测结果显示，莱鲍迪苷KA的产率为99.6％。

实施例13 UDPG高产菌株的其他应用

由于糖基转移酶OleD可催化罗汉果苷IIIE定点糖基化修饰合成罗汉果苷IIIE-Glu，本发明利用表达OleD的UDPG高产菌株E.coli CPMΔU&2作为全细胞催化剂，在不添加外源性UDPG的条件下合成罗汉果苷IIIE-Glu，反应式如下所示。

50ml反应体系：罗汉果苷IIIE为5g/L,蔗糖800g/L，反应温度为40℃，反应pH为7.5，菌体浓度100g/L，反应18小时。罗汉果苷IIIE-Glu的产率为98.8％，明显高于文献报道的85.6％(李程飞，等.中国药科大学学报，2019，50:222-229)。该结果表明，本发明构建的UDPG高产菌株具有很好的普遍适用性。

实施例14 UDPG高产菌株的其他应用

来源自Bacillus licheniformis的糖基转移酶YjiC可催化黄豆苷元定点糖基化修饰(7位羟基)合成糖基化黄豆苷元(Pandey PR,et al.Mol Cells.2014,37:172-177)。本发明采用pETDuet-1构建YjiC基因与Arabidopsis thaliana的蔗糖合酶基因共表达质粒pE-Y-At，导入E.coli CPΔU&2，获得工程菌株E.coli YAt。以E.coli YAt为全细胞催化剂，在不添加外源性UDPG的条件下考察糖基化黄豆苷元合成情况，反应式如下所示。

5ml反应体系：黄豆苷元为1g/L,蔗糖800g/L，反应温度为40℃，反应pH为7.5，菌体浓度100g/L，DMSO 5％(v/v)，反应18小时。糖基化黄豆苷元的产率为99.0％，明显高于文献报道的62％(底物浓度仅为0.05g/L)(Pandey PR,et al.Mol Cells.2014,37:172-177)。该结果表明，本发明构建的UDPG高产菌株可应用于不同的UDPG依赖的糖基转移酶。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 尿苷二磷酸葡萄糖高产菌株及其应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 642

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 1

atgaaaccat atcagcgcca gtttattgaa tttgcgctta gcaagcaggt gttaaagttt 60

ggcgagttta cgctgaaatc cgggcgcaaa agcccctatt tcttcaacgc cgggctgttt 120

aataccgggc gcgacctggc actgttaggc cgtttttacg ctgaagcatt ggtggattct 180

ggcattgagt tcgatctgct gtttggccct gcttacaaag ggatcccgat tgcgaccact 240

accgccgtgg cgctggcgga gcatcatgac cttgacctgc cgtactgctt taaccgcaaa 300

gaggcaaaag accacggtga aggcggcaat ctggttggta gcgcgttaca aggacgcgta 360

atgctggtag atgatgtgat caccgccgga acggcgattc gcgaatcgat ggagattatt 420

caggctaatg gcgcgacgct tgctggcgta ttgatttcgc ttgatcgtca ggaacggggg 480

cgcggcgaga tttcggcgat tcaggaagtt gagcgtgatt acaactgcaa agtgatctct 540

atcatcaccc tgaaagatct gattgcctat ctggaagaga agccggaaat ggcggaacat 600

ctggcggcgg ttaaggccta tcgcgaagag tttggcgttt aa 642

<210> 3

<211> 213

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 3

Met Lys Pro Tyr Gln Arg Gln Phe Ile Glu Phe Ala Leu Ser Lys Gln

1 5 10 15

Val Leu Lys Phe Gly Glu Phe Thr Leu Lys Ser Gly Arg Lys Ser Pro

20 25 30

Tyr Phe Phe Asn Ala Gly Leu Phe Asn Thr Gly Arg Asp Leu Ala Leu

35 40 45

Leu Gly Arg Phe Tyr Ala Glu Ala Leu Val Asp Ser Gly Ile Glu Phe

50 55 60

Asp Leu Leu Phe Gly Pro Ala Tyr Lys Gly Ile Pro Ile Ala Thr Thr

65 70 75 80

Thr Ala Val Ala Leu Ala Glu His His Asp Leu Asp Leu Pro Tyr Cys

85 90 95

Phe Asn Arg Lys Glu Ala Lys Asp His Gly Glu Gly Gly Asn Leu Val

100 105 110

Gly Ser Ala Leu Gln Gly Arg Val Met Leu Val Asp Asp Val Ile Thr

115 120 125

Ala Gly Thr Ala Ile Arg Glu Ser Met Glu Ile Ile Gln Ala Asn Gly

130 135 140

Ala Thr Leu Ala Gly Val Leu Ile Ser Leu Asp Arg Gln Glu Arg Gly

145 150 155 160

Arg Gly Glu Ile Ser Ala Ile Gln Glu Val Glu Arg Asp Tyr Asn Cys

165 170 175

Lys Val Ile Ser Ile Ile Thr Leu Lys Asp Leu Ile Ala Tyr Leu Glu

180 185 190

Glu Lys Pro Glu Met Ala Glu His Leu Ala Ala Val Lys Ala Tyr Arg

195 200 205

Glu Glu Phe Gly Val

210

<210> 3

<211> 738

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 3

atgacgttaa ctgcttcatc ttcttcccgc gctgttacga attctcctgt ggttgttgcc 60

cttgattatc ataatcgtga tgacgcgctg tcctttgtcg acaagatcga cccacgcgat 120

tgtcgtctga aggtcggcaa agagatgttt acattgtttg ggccacagtt tgtgcgcgaa 180

cttcaacagc gtggttttga tatctttctt gacctgaaat tccacgatat tcctaacact 240

gcagcgcacg ctgtcgctgc tgcagctgac ttaggcgtgt ggatggtgaa tgttcatgcc 300

tctggtgggg cgcgtatgat gaccgcagcg cgtgaggcac tggttccgtt tggcaaagat 360

gcaccgcttt tgattgctgt gacagtgttg accagcatgg aagccagcga cctggtcgat 420

cttggcatga cactgtcacc tgcagattat gcagaacgtc tggcggcact gacgcaaaaa 480

tgtggccttg atggtgtggt gtgttctgct caggaagctg tgcgctttaa acaggtattc 540

ggtcaggagt tcaaactggt tacgccgggc attcgtccgc aggggagtga agctggtgac 600

cagcgccgca ttatgacgcc agaacaggcg ttgtcggctg gtgttgatta tatggtgatt 660

ggtcgcccgg taacgcaatc ggtagatcca gcgcagacgc tgaaagcgat caacgcctct 720

ttacagcgga gtgcatga 738

<210> 4

<211> 245

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 4

Met Thr Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Arg Ala Val Thr Asn Ser Pro

1 5 10 15

Val Val Val Ala Leu Asp Tyr His Asn Arg Asp Asp Ala Leu Ser Phe

20 25 30

Val Asp Lys Ile Asp Pro Arg Asp Cys Arg Leu Lys Val Gly Lys Glu

35 40 45

Met Phe Thr Leu Phe Gly Pro Gln Phe Val Arg Glu Leu Gln Gln Arg

50 55 60

Gly Phe Asp Ile Phe Leu Asp Leu Lys Phe His Asp Ile Pro Asn Thr

65 70 75 80

Ala Ala His Ala Val Ala Ala Ala Ala Asp Leu Gly Val Trp Met Val

85 90 95

Asn Val His Ala Ser Gly Gly Ala Arg Met Met Thr Ala Ala Arg Glu

100 105 110

Ala Leu Val Pro Phe Gly Lys Asp Ala Pro Leu Leu Ile Ala Val Thr

115 120 125

Val Leu Thr Ser Met Glu Ala Ser Asp Leu Val Asp Leu Gly Met Thr

130 135 140

Leu Ser Pro Ala Asp Tyr Ala Glu Arg Leu Ala Ala Leu Thr Gln Lys

145 150 155 160

Cys Gly Leu Asp Gly Val Val Cys Ser Ala Gln Glu Ala Val Arg Phe

165 170 175

Lys Gln Val Phe Gly Gln Glu Phe Lys Leu Val Thr Pro Gly Ile Arg

180 185 190

Pro Gln Gly Ser Glu Ala Gly Asp Gln Arg Arg Ile Met Thr Pro Glu

195 200 205

Gln Ala Leu Ser Ala Gly Val Asp Tyr Met Val Ile Gly Arg Pro Val

210 215 220

Thr Gln Ser Val Asp Pro Ala Gln Thr Leu Lys Ala Ile Asn Ala Ser

225 230 235 240

Leu Gln Arg Ser Ala

245

<210> 5

<211> 726

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 5

atggctacca atgcaaaacc cgtctataaa cgcattctgc ttaagttgag tggcgaagct 60

ctgcagggca ctgaaggctt cggtattgat gcaagcatac tggatcgtat ggctcaggaa 120

atcaaagaac tggttgaact gggtattcag gttggtgtgg tgattggtgg gggtaacctg 180

ttccgtggcg ctggtctggc gaaagcgggt atgaaccgcg ttgtgggcga ccacatgggg 240

atgctggcga ccgtaatgaa cggcctggca atgcgtgatg cactgcaccg cgcctatgtg 300

aacgctcgtc tgatgtccgc tattccattg aatggcgtgt gcgacagcta cagctgggca 360

gaagctatca gcctgttgcg caacaaccgt gtggtgatcc tctccgccgg tacaggtaac 420

ccgttcttta ccaccgactc agcagcttgc ctgcgtggta tcgaaattga agccgatgtg 480

gtgctgaaag caaccaaagt tgacggcgtg tttaccgctg atccggcgaa agatccaacc 540

gcaaccatgt acgagcaact gacttacagc gaagtgctgg aaaaagagct gaaagtcatg 600

gacctggcgg ccttcacgct ggctcgtgac cataaattac cgattcgtgt tttcaatatg 660

aacaaaccgg gtgcgctgcg ccgtgtggta atgggtgaaa aagaagggac tttaatcacg 720

gaataa 726

<210> 6

<211> 241

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 6

Met Ala Thr Asn Ala Lys Pro Val Tyr Lys Arg Ile Leu Leu Lys Leu

1 5 10 15

Ser Gly Glu Ala Leu Gln Gly Thr Glu Gly Phe Gly Ile Asp Ala Ser

20 25 30

Ile Leu Asp Arg Met Ala Gln Glu Ile Lys Glu Leu Val Glu Leu Gly

35 40 45

Ile Gln Val Gly Val Val Ile Gly Gly Gly Asn Leu Phe Arg Gly Ala

50 55 60

Gly Leu Ala Lys Ala Gly Met Asn Arg Val Val Gly Asp His Met Gly

65 70 75 80

Met Leu Ala Thr Val Met Asn Gly Leu Ala Met Arg Asp Ala Leu His

85 90 95

Arg Ala Tyr Val Asn Ala Arg Leu Met Ser Ala Ile Pro Leu Asn Gly

100 105 110

Val Cys Asp Ser Tyr Ser Trp Ala Glu Ala Ile Ser Leu Leu Arg Asn

115 120 125

Asn Arg Val Val Ile Leu Ser Ala Gly Thr Gly Asn Pro Phe Phe Thr

130 135 140

Thr Asp Ser Ala Ala Cys Leu Arg Gly Ile Glu Ile Glu Ala Asp Val

145 150 155 160

Val Leu Lys Ala Thr Lys Val Asp Gly Val Phe Thr Ala Asp Pro Ala

165 170 175

Lys Asp Pro Thr Ala Thr Met Tyr Glu Gln Leu Thr Tyr Ser Glu Val

180 185 190

Leu Glu Lys Glu Leu Lys Val Met Asp Leu Ala Ala Phe Thr Leu Ala

195 200 205

Arg Asp His Lys Leu Pro Ile Arg Val Phe Asn Met Asn Lys Pro Gly

210 215 220

Ala Leu Arg Arg Val Val Met Gly Glu Lys Glu Gly Thr Leu Ile Thr

225 230 235 240

Glu

<210> 7

<211> 1650

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 7

atgaaaaaca tcaatccaac gcagaccgct gcctggcagg cactacagaa acacttcgat 60

gaaatgaaag acgttacgat cgccgatctt tttgctaaag acggcgatcg tttttctaag 120

ttctccgcaa ccttcgacga tcagatgctg gtggattact ccaaaaaccg catcactgaa 180

gagacgctgg cgaaattaca ggatctggcg aaagagtgcg atctggcggg cgcgattaag 240

tcgatgttct ctggcgagaa gatcaaccgc actgaaaacc gcgccgtgct gcacgtagcg 300

ctgcgtaacc gtagcaatac cccgattttg gttgatggca aagacgtaat gccggaagtc 360

aacgcggtgc tggagaagat gaaaaccttc tcagaagcga ttatttccgg tgagtggaaa 420

ggttataccg gcaaagcaat cactgacgta gtgaacatcg ggatcggcgg ttctgacctc 480

ggcccataca tggtgaccga agctctgcgt ccgtacaaaa accacctgaa catgcacttt 540

gtttctaacg tcgatgggac tcacatcgcg gaagtgctga aaaaagtaaa cccggaaacc 600

acgctgttcc tggtagcatc taaaaccttc accactcagg aaactatgac caacgcccat 660

agcgcgcgtg actggttcct gaaagcggca ggtgatgaaa aacacgttgc aaaacacttt 720

gcggcgcttt ccaccaatgc caaagccgtt ggcgagtttg gtattgatac tgccaacatg 780

ttcgagttct gggactgggt tggcggccgt tactctttgt ggtcagcgat tggcctgtcg 840

attgttctct ccatcggctt tgataacttc gttgaactgc tttccggcgc acacgcgatg 900

gacaagcatt tctccaccac gcctgccgag aaaaacctgc ctgtactgct ggcgctgatt 960

ggcatctggt acaacaattt ctttggtgcg gaaactgaag cgattctgcc gtatgaccag 1020

tatatgcacc gtttcgcggc gtacttccag cagggcaata tggagtccaa cggtaagtat 1080

gttgaccgta acggtaacgt tgtggattac cagactggcc cgattatctg gggtgaacca 1140

ggcactaacg gtcagcacgc gttctaccag ctgatccacc agggaaccaa aatggtaccg 1200

tgcgatttca tcgctccggc tatcacccat aacccgctct ctgatcatca ccagaaactg 1260

ctgtctaact tcttcgccca gaccgaagcg ctggcgtttg gtaaatcccg cgaagtggtt 1320

gagcaggaat atcgtgatca gggtaaagat ccggcaacgc ttgactacgt ggtgccgttc 1380

aaagtattcg aaggtaaccg cccgaccaac tccatcctgc tgcgtgaaat cactccgttc 1440

agcctgggtg cgttgattgc gctgtatgag cacaaaatct ttactcaggg cgtgatcctg 1500

aacatcttca ccttcgacca gtggggcgtg gaactgggta aacagctggc gaaccgtatt 1560

ctgccagagc tgaaagatga taaagaaatc agcagccacg atagctcgac caatggtctg 1620

attaaccgct ataaagcgtg gcgcggttaa 1650

<210> 8

<211> 1167

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 8

atgaaaatca ccatttccgg tactggctat gtcggcttgt caaacgggct tctaatcgca 60

caaaatcatg aggttgtggc attagatatt ttaccgtcac gcgttgctat gctgaatgat 120

cggatatctc ctattgttga taaggaaatt cagcagtttt tgcaatcaga taaaatacac 180

tttaatgcca cattagataa aaatgaagcc taccgggatg ctgattatgt catcatcgcc 240

actccaaccg actatgatcc taaaactaat tatttcaata catccagtgt agaatcagta 300

attaaagacg tagttgagat aaatccttat gcggttatgg tgatcaaatc aacggttccc 360

gttggtttta ccgcagcgat gcataagaaa tatcgcactg aaaatattat attctccccg 420

gaatttctcc gtgagggtaa agccctttac gataatctcc atccttcacg tattgtcatc 480

ggtgagcgtt cagaacgcgc agaacgtttt gctgctctgt tacaggaagg agcgattaag 540

caaaatatcc cgaccctgtt taccgactcc actgaagcag aagcgattaa actttttgca 600

aacacctacc tggcgatgcg cgtggcgtac tttaacgaac tggatagcta tgcagaaagt 660

ttaggtctga attcccgtca aataatcgaa ggcgtttgtc tcgacccacg tattggcaac 720

cattacaaca atccgtcgtt tggttatggt ggttattgtc tgccgaaaga taccaagcag 780

ttactggcga actaccagtc tgtgccgaat aacctgatct cggcaattgt cgatgctaac 840

cgcacgcgta aagattttat tgccgatgcc attttgtcac gcaagccgca agtggtgggt 900

atttatcgtc tgattatgaa gagcggttca gacaacttcc gcgcgtcttc cattcagggg 960

attatgaaac gtatcaaggc gaaaggcgtt gaagtgatca tttacgagcc ggtgatgaaa 1020

gaagactcat tcttcaactc tcgcctggaa cgtgatctcg ccactttcaa acaacaagcc 1080

gatgtcatta tttccaaccg tatggcagaa gagcttaaag atgtggcaga taaggtctac 1140

acccgcgatc tctttggcag cgactaa 1167

<210> 9

<211> 2427

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 9

atggccaatg cagagcgcat gatcacacgt gtgcacagtc aacgtgaacg tctgaacgag 60

accctggtta gcgagcgcaa cgaggttctg gcactgttaa gccgcgtgga agcaaagggc 120

aaaggcatcc tgcagcaaaa ccagatcatt gccgagtttg aagccctgcc ggaacagacc 180

cgtaagaagc tggagggtgg cccgttcttt gatctgctga aaagcaccca ggaagcaatt 240

gtgttacctc cgtgggtggc actggcagtt cgtccgcgtc cgggcgtttg ggaatacctg 300

cgtgtgaatc tgcatgcact ggtggttgag gagctgcagc ctgccgaatt cctgcatttc 360

aaggaagaac tggtggatgg cgttaaaaac ggtaatttta cattagagct ggactttgaa 420

ccgtttaatg ccagcattcc gcgcccgacc ctgcataaat atatcggtaa cggcgtggat 480

tttctgaatc gccatctgag cgccaagctg tttcatgaca aggagagctt actgcctctg 540

ctgaaatttc tgcgtctgca tagtcaccag ggcaagaacc tgatgctgag cgaaaagatc 600

caaaatctga acaccctgca gcacaccctg cgtaaagccg aggaatatct ggccgaactg 660

aagagcgaaa ccctgtatga ggagtttgag gccaagttcg aggagatcgg cctggagcgt 720

ggctggggtg acaacgcaga acgtgtgctg gacatgattc gtctgctgct ggacctgctg 780

gaggcaccgg atccgtgcac actggagaca ttcctgggcc gcgtgccgat ggttttcaat 840

gtggtgattc tgagcccgca cggctacttt gcacaggaca acgttctggg ttatccggat 900

acaggtggcc aagtggtgta cattctggat caggtgcgtg ccttagagat cgagatgctg 960

cagcgcatta aacagcaggg cctgaatatc aaaccgcgca tcctgatcct gacccgtctg 1020

ttacctgatg ccgtgggcac aacctgcggt gaacgcctgg aacgcgtgta tgatagcgaa 1080

tactgtgaca ttctgcgtgt gccgttccgt acagagaaag gcatcgtgcg taaatggatt 1140

agccgcttcg aggtttggcc ttacctggaa acctacaccg aggatgcagc agtggagtta 1200

agcaaagagc tgaacggcaa gccggacctg attattggca actacagcga cggcaacctg 1260

gtggccagcc tgttagccca caaattaggt gtgacccagt gtaccatcgc ccacgcactg 1320

gaaaagacaa aatacccgga cagcgatatc tactggaaaa agttagatga taaatatcac 1380

ttcagctgcc agtttaccgc cgacatcttt gccatgaacc acaccgattt tattatcaca 1440

agcacattcc aggaaatcgc aggcagtaaa gagaccgttg gccagtacga gagccataca 1500

gcctttacac tgcctggcct gtatcgtgtt gtgcacggca tcgatgtgtt tgatcctaaa 1560

tttaacattg ttagcccggg tgcagacatg agtatctact tcccgtacac cgaggagaag 1620

cgccgtctga ccaagtttca cagtgaaatc gaggaactgc tgtacagtga cgtggagaac 1680

aaggagcatc tgtgcgtgtt aaaggataag aaaaaaccga tcttatttac aatggcacgc 1740

ctggatcgcg tgaagaatct gagtggcctg gttgagtggt atggcaaaaa tacccgcctg 1800

cgcgaactgg ccaatctggt tgtggttggt ggcgaccgtc gtaaagaaag caaggacaac 1860

gaggagaagg ccgagatgaa gaaaatgtac gatctgatcg aagagtataa gctgaatggc 1920

cagtttcgct ggatcagcag tcagatggac cgtgtgcgca atggcgaact gtatcgctac 1980

atttgtgaca caaagggcgc attcgttcag ccggcactgt atgaggcctt cggcctgaca 2040

gtggtggaag ccatgacctg cggcctgccg acctttgcaa cctgcaaagg cggcccggca 2100

gaaatcatcg ttcatggcaa gagcggcttc catatcgatc cgtatcatgg tgaccaggcc 2160

gccgatacac tggcagactt ttttaccaaa tgtaaagagg atccgagcca ctgggatgag 2220

attagcaagg gtggtctgca gcgcatcgaa gaaaaataca cctggcagat ctacagccaa 2280

cgtctgctga ccctgaccgg tgtgtatggt ttctggaaac acgtgagtaa tctggaccgt 2340

ctggaagccc gccgttacct ggaaatgttc tatgcactga aatatcgccc gctggcacaa 2400

gccgttcctc tggcacaaga cgattaa 2427

<210> 10

<211> 808

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 10

Met Ala Asn Ala Glu Arg Met Ile Thr Arg Val His Ser Gln Arg Glu

1 5 10 15

Arg Leu Asn Glu Thr Leu Val Ser Glu Arg Asn Glu Val Leu Ala Leu

20 25 30

Leu Ser Arg Val Glu Ala Lys Gly Lys Gly Ile Leu Gln Gln Asn Gln

35 40 45

Ile Ile Ala Glu Phe Glu Ala Leu Pro Glu Gln Thr Arg Lys Lys Leu

50 55 60

Glu Gly Gly Pro Phe Phe Asp Leu Leu Lys Ser Thr Gln Glu Ala Ile

65 70 75 80

Val Leu Pro Pro Trp Val Ala Leu Ala Val Arg Pro Arg Pro Gly Val

85 90 95

Trp Glu Tyr Leu Arg Val Asn Leu His Ala Leu Val Val Glu Glu Leu

100 105 110

Gln Pro Ala Glu Phe Leu His Phe Lys Glu Glu Leu Val Asp Gly Val

115 120 125

Lys Asn Gly Asn Phe Thr Leu Glu Leu Asp Phe Glu Pro Phe Asn Ala

130 135 140

Ser Ile Pro Arg Pro Thr Leu His Lys Tyr Ile Gly Asn Gly Val Asp

145 150 155 160

Phe Leu Asn Arg His Leu Ser Ala Lys Leu Phe His Asp Lys Glu Ser

165 170 175

Leu Leu Pro Leu Leu Lys Phe Leu Arg Leu His Ser His Gln Gly Lys

180 185 190

Asn Leu Met Leu Ser Glu Lys Ile Gln Asn Leu Asn Thr Leu Gln His

195 200 205

Thr Leu Arg Lys Ala Glu Glu Tyr Leu Ala Glu Leu Lys Ser Glu Thr

210 215 220

Leu Tyr Glu Glu Phe Glu Ala Lys Phe Glu Glu Ile Gly Leu Glu Arg

225 230 235 240

Gly Trp Gly Asp Asn Ala Glu Arg Val Leu Asp Met Ile Arg Leu Leu

245 250 255

Leu Asp Leu Leu Glu Ala Pro Asp Pro Cys Thr Leu Glu Thr Phe Leu

260 265 270

Gly Arg Val Pro Met Val Phe Asn Val Val Ile Leu Ser Pro His Gly

275 280 285

Tyr Phe Ala Gln Asp Asn Val Leu Gly Tyr Pro Asp Thr Gly Gly Gln

290 295 300

Val Val Tyr Ile Leu Asp Gln Val Arg Ala Leu Glu Ile Glu Met Leu

305 310 315 320

Gln Arg Ile Lys Gln Gln Gly Leu Asn Ile Lys Pro Arg Ile Leu Ile

325 330 335

Leu Thr Arg Leu Leu Pro Asp Ala Val Gly Thr Thr Cys Gly Glu Arg

340 345 350

Leu Glu Arg Val Tyr Asp Ser Glu Tyr Cys Asp Ile Leu Arg Val Pro

355 360 365

Phe Arg Thr Glu Lys Gly Ile Val Arg Lys Trp Ile Ser Arg Phe Glu

370 375 380

Val Trp Pro Tyr Leu Glu Thr Tyr Thr Glu Asp Ala Ala Val Glu Leu

385 390 395 400

Ser Lys Glu Leu Asn Gly Lys Pro Asp Leu Ile Ile Gly Asn Tyr Ser

405 410 415

Asp Gly Asn Leu Val Ala Ser Leu Leu Ala His Lys Leu Gly Val Thr

420 425 430

Gln Cys Thr Ile Ala His Ala Leu Glu Lys Thr Lys Tyr Pro Asp Ser

435 440 445

Asp Ile Tyr Trp Lys Lys Leu Asp Asp Lys Tyr His Phe Ser Cys Gln

450 455 460

Phe Thr Ala Asp Ile Phe Ala Met Asn His Thr Asp Phe Ile Ile Thr

465 470 475 480

Ser Thr Phe Gln Glu Ile Ala Gly Ser Lys Glu Thr Val Gly Gln Tyr

485 490 495

Glu Ser His Thr Ala Phe Thr Leu Pro Gly Leu Tyr Arg Val Val His

500 505 510

Gly Ile Asp Val Phe Asp Pro Lys Phe Asn Ile Val Ser Pro Gly Ala

515 520 525

Asp Met Ser Ile Tyr Phe Pro Tyr Thr Glu Glu Lys Arg Arg Leu Thr

530 535 540

Lys Phe His Ser Glu Ile Glu Glu Leu Leu Tyr Ser Asp Val Glu Asn

545 550 555 560

Lys Glu His Leu Cys Val Leu Lys Asp Lys Lys Lys Pro Ile Leu Phe

565 570 575

Thr Met Ala Arg Leu Asp Arg Val Lys Asn Leu Ser Gly Leu Val Glu

580 585 590

Trp Tyr Gly Lys Asn Thr Arg Leu Arg Glu Leu Ala Asn Leu Val Val

595 600 605

Val Gly Gly Asp Arg Arg Lys Glu Ser Lys Asp Asn Glu Glu Lys Ala

610 615 620

Glu Met Lys Lys Met Tyr Asp Leu Ile Glu Glu Tyr Lys Leu Asn Gly

625 630 635 640

Gln Phe Arg Trp Ile Ser Ser Gln Met Asp Arg Val Arg Asn Gly Glu

645 650 655

Leu Tyr Arg Tyr Ile Cys Asp Thr Lys Gly Ala Phe Val Gln Pro Ala

660 665 670

Leu Tyr Glu Ala Phe Gly Leu Thr Val Val Glu Ala Met Thr Cys Gly

675 680 685

Leu Pro Thr Phe Ala Thr Cys Lys Gly Gly Pro Ala Glu Ile Ile Val

690 695 700

His Gly Lys Ser Gly Phe His Ile Asp Pro Tyr His Gly Asp Gln Ala

705 710 715 720

Ala Asp Thr Leu Ala Asp Phe Phe Thr Lys Cys Lys Glu Asp Pro Ser

725 730 735

His Trp Asp Glu Ile Ser Lys Gly Gly Leu Gln Arg Ile Glu Glu Lys

740 745 750

Tyr Thr Trp Gln Ile Tyr Ser Gln Arg Leu Leu Thr Leu Thr Gly Val

755 760 765

Tyr Gly Phe Trp Lys His Val Ser Asn Leu Asp Arg Leu Glu Ala Arg

770 775 780

Arg Tyr Leu Glu Met Phe Tyr Ala Leu Lys Tyr Arg Pro Leu Ala Gln

785 790 795 800

Ala Val Pro Leu Ala Gln Asp Asp

805

<210> 11

<211> 2445

<212> DNA

<213> 绿豆(Vigna radiata)

<400> 11

atgtctactc agccaaaacc aaaacttggt aggcttccca gtatcagaga tcgtgttgaa 60

gacactctct ctgctcatcg taacgaactc atttctcttc tctccaggta tgtggctcag 120

gggaaaggga ttttgcaacc tcataactta attgatgaac ttgacaacat ccctggggac 180

gatcaagcaa agttggatct taaaaatggc cccttcggtg aaattatcag ggcagcacag 240

gaagccatag ttttgcctcc ttttgtggca ataggagttc gtccaagacc tggtgtttgg 300

gaatatgtcc gtgttaatgt ctctgaactg agcgtggagc aattaagcgt tgctgaatat 360

ctgagcttta aggaggaact tgtggatgga aagaataatg acagttttgt actggaactt 420

gattttgagc cattcaatgc ctcattccct cgtccatccc gttcatcatc cattggcaat 480

ggtgtccaat ttctcaatcg ccacctttca tcaattatgt tccgcaacaa agattccttg 540

gaccccttgc ttgatttcct ccgagctcac aagtataagg gccatgctct gatgttaaat 600

gacagaatac agaacatttc caaactccag actgctctgg ccaagactga ggattatctt 660

aataagattc cacgtgatac accttattca gagtttgaat acgagttaca aggaatgggc 720

tttgagagag gatggggtga tactgctgaa agggtattgg aaacgatgca tctgctactg 780

gatattcttc aggctcctga tccttctacc ctagagactt ttcttggcag agtgccaatg 840

gtattcaatg ttgttatatt gtctcctcat ggcttcttcg gacaagccaa tgtcttgggt 900

ttgcctgaca ctggtgggca ggttgtttat atactagatc aagtgcgtgc ccttgagaat 960

gagatgctcc ttcggattaa gaaacaagga ttagatttca ctcctagaat tctgattgtt 1020

accaggctaa tacccgatgc aaaggggaca acttgcaacc aacgactaga aagagtcagt 1080

ggtaccgagc acactcatat tttgcgagtt ccattcagat cagagtcagg aactctccgt 1140

aaatggattt caaggtttga tgtgtggcct tatctagaga cttattcaga ggacgttgcc 1200

agtgaaattg ctgctgagtt acaaggctat cctgacttca tcattggaaa ctacagtgat 1260

gggaatcttg ttgcatcttt attggcttat aaaatgggag ttacacagtg caccatcgct 1320

catgcacttg agaagacaaa atatccagat tcagatatat actggaagaa atttgatgac 1380

aaatatcact tttcatgcca gttcactgct gatttaatag ccatgaataa cgctgatttt 1440

atcatcacca gtacctacca agagattgca ggaacgaaaa atacagttgg acagtatgag 1500

agccacactg gttttactct tcctgggctg tacagggttg tacatggcat tgatgttttt 1560

gatcccaagt tcaatattgt ttctcctgga gcagatatgt caatatattt cccctactct 1620

gaaaagcaga acaggcttac atccctgcac ggttccattg aacagctact gtatgatcca 1680

acacagactg atgactacat tggaacactg aaagacaagt caaagcccat aattttctca 1740

atggcaaggc tagacagagt gaagaacatg acaggattgg ttgaattatt tggtaagagc 1800

agcaaattga gggagctggt caaccttgtt gtagtagctg gttacattga tgtaaagaag 1860

tccagcgaca gagaagaaat tgcagaaatt gagaagatgc acgctctcat caaagagtac 1920

aacttaaacg gtgattttcg ttggattgct gctcaaacaa atagggcacg taacggggag 1980

ctgtatcgct acatagcaga cacacaaggt gctttcgttc agcctgcatt ctatgaggct 2040

tttgggctta cagttgtgga agccatgacc tgtggactcc ccacatttgc tactagcaat 2100

ggtggtccag ctgagatcat cgaacatggt atatcaggat ttcacattga tccttatcac 2160

cctgatcagg cttcagagct attggttgaa ttcttccaaa cctgcaagac tgacccaagc 2220

cattggaaga aaatatctga tggtggtctt aaaagaattt atgaaagcta cacttggaag 2280

atttattccg aaaggctctt gaccttggcg ggagtttaca gtttctggaa atacgtttcc 2340

aaattggaga ggcgtgaaac tcgacgatat cttgagatgt tctatatcct caagttccgt 2400

gatttggcaa aatctgtgcc cctagcaaaa gatgatgcaa gttaa 2445

<210> 12

<211> 814

<212> PRT

<213> 绿豆(Vigna radiata)

<400> 12

Met Ser Thr Gln Pro Lys Pro Lys Leu Gly Arg Leu Pro Ser Ile Arg

1 5 10 15

Asp Arg Val Glu Asp Thr Leu Ser Ala His Arg Asn Glu Leu Ile Ser

20 25 30

Leu Leu Ser Arg Tyr Val Ala Gln Gly Lys Gly Ile Leu Gln Pro His

35 40 45

Asn Leu Ile Asp Glu Leu Asp Asn Ile Pro Gly Asp Asp Gln Ala Lys

50 55 60

Leu Asp Leu Lys Asn Gly Pro Phe Gly Glu Ile Ile Arg Ala Ala Gln

65 70 75 80

Glu Ala Ile Val Leu Pro Pro Phe Val Ala Ile Gly Val Arg Pro Arg

85 90 95

Pro Gly Val Trp Glu Tyr Val Arg Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Val

100 105 110

Glu Gln Leu Ser Val Ala Glu Tyr Leu Ser Phe Lys Glu Glu Leu Val

115 120 125

Asp Gly Lys Asn Asn Asp Ser Phe Val Leu Glu Leu Asp Phe Glu Pro

130 135 140

Phe Asn Ala Ser Phe Pro Arg Pro Ser Arg Ser Ser Ser Ile Gly Asn

145 150 155 160

Gly Val Gln Phe Leu Asn Arg His Leu Ser Ser Ile Met Phe Arg Asn

165 170 175

Lys Asp Ser Leu Asp Pro Leu Leu Asp Phe Leu Arg Ala His Lys Tyr

180 185 190

Lys Gly His Ala Leu Met Leu Asn Asp Arg Ile Gln Asn Ile Ser Lys

195 200 205

Leu Gln Thr Ala Leu Ala Lys Thr Glu Asp Tyr Leu Asn Lys Ile Pro

210 215 220

Arg Asp Thr Pro Tyr Ser Glu Phe Glu Tyr Glu Leu Gln Gly Met Gly

225 230 235 240

Phe Glu Arg Gly Trp Gly Asp Thr Ala Glu Arg Val Leu Glu Thr Met

245 250 255

His Leu Leu Leu Asp Ile Leu Gln Ala Pro Asp Pro Ser Thr Leu Glu

260 265 270

Thr Phe Leu Gly Arg Val Pro Met Val Phe Asn Val Val Ile Leu Ser

275 280 285

Pro His Gly Phe Phe Gly Gln Ala Asn Val Leu Gly Leu Pro Asp Thr

290 295 300

Gly Gly Gln Val Val Tyr Ile Leu Asp Gln Val Arg Ala Leu Glu Asn

305 310 315 320

Glu Met Leu Leu Arg Ile Lys Lys Gln Gly Leu Asp Phe Thr Pro Arg

325 330 335

Ile Leu Ile Val Thr Arg Leu Ile Pro Asp Ala Lys Gly Thr Thr Cys

340 345 350

Asn Gln Arg Leu Glu Arg Val Ser Gly Thr Glu His Thr His Ile Leu

355 360 365

Arg Val Pro Phe Arg Ser Glu Ser Gly Thr Leu Arg Lys Trp Ile Ser

370 375 380

Arg Phe Asp Val Trp Pro Tyr Leu Glu Thr Tyr Ser Glu Asp Val Ala

385 390 395 400

Ser Glu Ile Ala Ala Glu Leu Gln Gly Tyr Pro Asp Phe Ile Ile Gly

405 410 415

Asn Tyr Ser Asp Gly Asn Leu Val Ala Ser Leu Leu Ala Tyr Lys Met

420 425 430

Gly Val Thr Gln Cys Thr Ile Ala His Ala Leu Glu Lys Thr Lys Tyr

435 440 445

Pro Asp Ser Asp Ile Tyr Trp Lys Lys Phe Asp Asp Lys Tyr His Phe

450 455 460

Ser Cys Gln Phe Thr Ala Asp Leu Ile Ala Met Asn Asn Ala Asp Phe

465 470 475 480

Ile Ile Thr Ser Thr Tyr Gln Glu Ile Ala Gly Thr Lys Asn Thr Val

485 490 495

Gly Gln Tyr Glu Ser His Thr Gly Phe Thr Leu Pro Gly Leu Tyr Arg

500 505 510

Val Val His Gly Ile Asp Val Phe Asp Pro Lys Phe Asn Ile Val Ser

515 520 525

Pro Gly Ala Asp Met Ser Ile Tyr Phe Pro Tyr Ser Glu Lys Gln Asn

530 535 540

Arg Leu Thr Ser Leu His Gly Ser Ile Glu Gln Leu Leu Tyr Asp Pro

545 550 555 560

Thr Gln Thr Asp Asp Tyr Ile Gly Thr Leu Lys Asp Lys Ser Lys Pro

565 570 575

Ile Ile Phe Ser Met Ala Arg Leu Asp Arg Val Lys Asn Met Thr Gly

580 585 590

Leu Val Glu Leu Phe Gly Lys Ser Ser Lys Leu Arg Glu Leu Val Asn

595 600 605

Leu Val Val Val Ala Gly Tyr Ile Asp Val Lys Lys Ser Ser Asp Arg

610 615 620

Glu Glu Ile Ala Glu Ile Glu Lys Met His Ala Leu Ile Lys Glu Tyr

625 630 635 640

Asn Leu Asn Gly Asp Phe Arg Trp Ile Ala Ala Gln Thr Asn Arg Ala

645 650 655

Arg Asn Gly Glu Leu Tyr Arg Tyr Ile Ala Asp Thr Gln Gly Ala Phe

660 665 670

Val Gln Pro Ala Phe Tyr Glu Ala Phe Gly Leu Thr Val Val Glu Ala

675 680 685

Met Thr Cys Gly Leu Pro Thr Phe Ala Thr Ser Asn Gly Gly Pro Ala

690 695 700

Glu Ile Ile Glu His Gly Ile Ser Gly Phe His Ile Asp Pro Tyr His

705 710 715 720

Pro Asp Gln Ala Ser Glu Leu Leu Val Glu Phe Phe Gln Thr Cys Lys

725 730 735

Thr Asp Pro Ser His Trp Lys Lys Ile Ser Asp Gly Gly Leu Lys Arg

740 745 750

Ile Tyr Glu Ser Tyr Thr Trp Lys Ile Tyr Ser Glu Arg Leu Leu Thr

755 760 765

Leu Ala Gly Val Tyr Ser Phe Trp Lys Tyr Val Ser Lys Leu Glu Arg

770 775 780

Arg Glu Thr Arg Arg Tyr Leu Glu Met Phe Tyr Ile Leu Lys Phe Arg

785 790 795 800

Asp Leu Ala Lys Ser Val Pro Leu Ala Lys Asp Asp Ala Ser

805 810

<210> 13

<211> 1248

<212> DNA

<213> 链霉菌(streptomyces )

<400> 13

atgaccaccc agaccactcc cgcccacatc gccatgttct ccatcgccgc ccacggccat 60

gtgaacccca gcctggaggt gatccgtgaa ctcgtcgccc gcggccaccg ggtcacgtac 120

gccattccgc ccgtcttcgc cgacaaggtg gccgccaccg gcgcccggcc cgtcctctac 180

cactccaccc tgcccggccc cgacgccgac ccggaggcat ggggaagcac cctgctggac 240

aacgtcgaac cgttcctgaa cgacgcgatc caggcgctcc cgcagctcgc cgatgcctac 300

gccgacgaca tccccgatct cgtcctgcac gacatcacct cctacccggc ccgcgtcctg 360

gcccgccgct ggggcgtccc ggcggtctcc ctctccccga acctcgtcgc ctggaagggt 420

tacgaggagg aggtcgccga gccgatgtgg cgcgaacccc ggcagaccga gcgcggacgg 480

gcctactacg cccggttcga ggcatggctg aaggagaacg ggatcaccga gcacccggac 540

acgttcgcca gtcatccgcc gcgctccctg gtgctcatcc cgaaggcgct ccagccgcac 600

gccgaccggg tggacgaaga cgtgtacacc ttcgtcggcg cctgccaggg agaccgcgcc 660

gaggaaggcg gctggcagcg gcccgccggc gcggagaagg tcgtcctggt gtcgctcggc 720

tcggcgttca ccaagcagcc cgccttctac cgggagtgcg tgcgcgcctt cgggaacctg 780

cccggctggc acctcgtcct ccagatcggc cggaaggtga cccccgccga actgggggag 840

ctgccggaca acgtggaggt gcacgactgg gtgccgcagc tcgcgatcct gcgccaggcc 900

gatctgttcg tcacccacgc gggcgccggc ggcagccagg aggggctggc caccgcgacg 960

cccatgatcg ccgtaccgca ggccgtcgac cagttcggca acgccgacat gctccaaggg 1020

ctcggcgtcg cccggaagct ggcgaccgag gaggccaccg ccgacctgct ccgcgagacc 1080

gccctcgctc tggtggacga cccggaggtc gcgcgccggc tccggcggat ccaggcggag 1140

atggcccagg agggcggcac ccggcgggcg gccgacctca tcgaggccga actgcccgcg 1200

cgccacgagc ggcaggagcc ggtgggcgac cgacccaacg gtgggtga 1248

<210> 14

<211> 415

<212> PRT

<213> 链霉菌(streptomyces )

<400> 14

Met Thr Thr Gln Thr Thr Pro Ala His Ile Ala Met Phe Ser Ile Ala

1 5 10 15

Ala His Gly His Val Asn Pro Ser Leu Glu Val Ile Arg Glu Leu Val

20 25 30

Ala Arg Gly His Arg Val Thr Tyr Ala Ile Pro Pro Val Phe Ala Asp

35 40 45

Lys Val Ala Ala Thr Gly Ala Arg Pro Val Leu Tyr His Ser Thr Leu

50 55 60

Pro Gly Pro Asp Ala Asp Pro Glu Ala Trp Gly Ser Thr Leu Leu Asp

65 70 75 80

Asn Val Glu Pro Phe Leu Asn Asp Ala Ile Gln Ala Leu Pro Gln Leu

85 90 95

Ala Asp Ala Tyr Ala Asp Asp Ile Pro Asp Leu Val Leu His Asp Ile

100 105 110

Thr Ser Tyr Pro Ala Arg Val Leu Ala Arg Arg Trp Gly Val Pro Ala

115 120 125

Val Ser Leu Ser Pro Asn Leu Val Ala Trp Lys Gly Tyr Glu Glu Glu

130 135 140

Val Ala Glu Pro Met Trp Arg Glu Pro Arg Gln Thr Glu Arg Gly Arg

145 150 155 160

Ala Tyr Tyr Ala Arg Phe Glu Ala Trp Leu Lys Glu Asn Gly Ile Thr

165 170 175

Glu His Pro Asp Thr Phe Ala Ser His Pro Pro Arg Ser Leu Val Leu

180 185 190

Ile Pro Lys Ala Leu Gln Pro His Ala Asp Arg Val Asp Glu Asp Val

195 200 205

Tyr Thr Phe Val Gly Ala Cys Gln Gly Asp Arg Ala Glu Glu Gly Gly

210 215 220

Trp Gln Arg Pro Ala Gly Ala Glu Lys Val Val Leu Val Ser Leu Gly

225 230 235 240

Ser Ala Phe Thr Lys Gln Pro Ala Phe Tyr Arg Glu Cys Val Arg Ala

245 250 255

Phe Gly Asn Leu Pro Gly Trp His Leu Val Leu Gln Ile Gly Arg Lys

260 265 270

Val Thr Pro Ala Glu Leu Gly Glu Leu Pro Asp Asn Val Glu Val His

275 280 285

Asp Trp Val Pro Gln Leu Ala Ile Leu Arg Gln Ala Asp Leu Phe Val

290 295 300

Thr His Ala Gly Ala Gly Gly Ser Gln Glu Gly Leu Ala Thr Ala Thr

305 310 315 320

Pro Met Ile Ala Val Pro Gln Ala Val Asp Gln Phe Gly Asn Ala Asp

325 330 335

Met Leu Gln Gly Leu Gly Val Ala Arg Lys Leu Ala Thr Glu Glu Ala

340 345 350

Thr Ala Asp Leu Leu Arg Glu Thr Ala Leu Ala Leu Val Asp Asp Pro

355 360 365

Glu Val Ala Arg Arg Leu Arg Arg Ile Gln Ala Glu Met Ala Gln Glu

370 375 380

Gly Gly Thr Arg Arg Ala Ala Asp Leu Ile Glu Ala Glu Leu Pro Ala

385 390 395 400

Arg His Glu Arg Gln Glu Pro Val Gly Asp Arg Pro Asn Gly Gly

405 410 415

<210> 15

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cgctacaatc ttccaaagtc acaattctca aaatcagaag agtattgcta gtgtaggctg 60

gagctgcttc 70

<210> 16

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gttgccggat gcggcgtgaa cgccttatcc ggcctacata tcgacgatga atgggaatta 60

gccatggtcc 70

<210> 17

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cgcaagtaac aaaagacaat cagggcgtaa atagccctga taacaggatg gtgtaggctg 60

gagctgcttc 70

<210> 18

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gatgctaaaa acatcatgat tcacagttaa gttaattctg agagcatgaa atgggaatta 60

gccatggtcc 70