阅读说明：本技术 一种南极磷虾小分子肽的制备方法 (Preparation method of euphausia superba small-molecule peptide ) 是由 欧阳小琨 卢雨清 杨立业 范丽红 于 2019-09-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物工程技术领域,公开了一种南极磷虾小分子肽的制备方法。包括以下步骤：1)将南极磷虾肉洗净后绞碎得肉糜,将肉糜浸入乙酸乙酯浸泡脱脂,静置,过滤分离得脱脂磷虾肉糜；2)将脱脂磷虾肉糜加入水中均匀分散,加入去氟复合颗粒,过滤分离得脱氟肉糜；3)将脱氟肉糜加入水中均匀分散,加入胰蛋白酶,加热酶解的南极磷虾酶解液；4)将南极磷虾酶解液依次经过超滤、凝胶柱层析纯化得南极磷虾小分子肽。本发明制备得到的小分子肽中氟元素含量较低,不会对人身体健康造成影响。(The invention relates to the technical field of bioengineering, and discloses a preparation method of euphausia superba small molecular peptide. The method comprises the following steps: 1) cleaning and mincing Antarctic krill meat to obtain meat paste, soaking the meat paste in ethyl acetate for degreasing, standing, filtering and separating to obtain degreased krill meat paste; 2) adding the degreased krill meat paste into water for uniform dispersion, adding defluorinated composite particles, and filtering and separating to obtain defluorinated meat paste; 3) adding the defluorinated minced meat into water for uniform dispersion, adding trypsin, and heating the enzymatic hydrolysate of the euphausia superba for enzymolysis; 4) and sequentially carrying out ultrafiltration and gel column chromatography purification on the euphausia superba enzymatic hydrolysate to obtain the euphausia superba small molecular peptide. The small molecular peptide prepared by the invention has low fluorine content, and does not affect human health.)

一种南极磷虾小分子肽的制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及一种南极磷虾小分子肽的制备方法。

背景技术

随着渔业装备与技术的不断进步已经形成以生态型高效捕捞技术支撑、高附加值产品驱动、集海上捕捞与船载加工为一体的全新型南极磷虾产业，但是，我国由于起步晚，有关捕捞、加工技术的不太成熟，我国南极磷虾产业目前尚处在发展的初级阶段。活性肽是一类具有特殊生理活性的肽类。活性肽分子结构复杂程度不一，可从简单的二肽到环形大分子多肽，而且这些多肽可通过磷酸化、糖基化或酰基化而被修饰。依据其功能，活性肽大致可分为生理活性肽(如降压肽、抗菌肽)、调味肽、抗氧化肽和营养肽等。南极磷虾肽中富含各种氨基酸、活性肽类、有机酸等，其中南极磷虾小分子肽的蛋白质含量达80％以上，具有分子量小，易水溶，易吸收的特点。但是南极磷虾的高含氟量限制了其应用，故应先利用生物脱氟剂制得低氟南极磷虾均液。南极磷虾小分子肽的分子量小，水溶性好，不通过消化道即可直接吸收利用，也可以透过细胞屏障，直接进入肌肉细胞，为增肌提供蛋白源。凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。故利用凝胶层析纯化可得南极磷虾小分子肽，进而为开发功能性的低氟南极磷虾小分子肽奠定基础。

中国专利公开号CN109880871公开了一种以南极虾磷虾粉为原料提取小分子肽的方法，经过热水提取、酶水解酶灭活后得酶剪切液，经钙盐沉淀、过滤、经过复合管式膜，去处小分子杂质、菌丝，经过纳滤膜后减压浓缩至一定浓度后再经过离心喷雾干燥得小分子肽。由于磷虾中氟元素较多，常规方法制备得到的小分钛中含有高含量的氟，不利于人体身体健康。

发明内容

本发明是为了克服以上技术问题，提供一种南极磷虾小分子肽的制备方法。本发明制备得到的小分子肽中氟元素含量较低，不会对人身体健康造成影响。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种南极磷虾小分子肽的制备方法，包括以下步骤：

1)将南极磷虾肉洗净后绞碎得肉糜，将肉糜浸入乙酸乙酯浸泡脱脂，静置，过滤分离得脱脂磷虾肉糜；

2)将脱脂磷虾肉糜加入水中均匀分散，加入去氟复合颗粒，过滤分离得脱氟肉糜；

3)将脱氟肉糜加入水中均匀分散，加入胰蛋白酶，加热酶解的南极磷虾酶解液；

4)将南极磷虾酶解液依次经过超滤、凝胶柱层析纯化得南极磷虾小分子肽。

本发明先使用乙酸乙酯对南极磷虾肉糜进行浸泡处理脱除磷虾肉糜中的脂质，然后加入去氟颗粒中对磷虾肉糜进行脱氟处理，通过物理吸附的方法除去磷虾肉糜中的氟离子和小分子杂质，吸附处理后得到纯净的磷虾肉糜，磷虾肉糜再经过胰蛋白酶的酶解处理，磷虾蛋白酶解为小分子的多钛，依次经过超滤和凝胶柱层析纯化得到较为纯净的南极磷虾小分子肽。本发明在对磷虾肉糜酶解前进行吸附的目的是防止去除颗粒吸附酶解得到的小分肽，提高磷虾小分子肽的产量。本发明先利用去氟颗粒除去磷虾中的氟元素，再利用胰蛋白酶酶解南极磷虾得到小分子肽，进一步利用超滤、凝胶层析纯化南极磷虾小分子肽。所得南极磷虾活性肽氟含量低，提高了产品的安全性和营养价值。

作为优选，所述步骤1)中肉糜与乙酸乙酯的质量体积比为2-5g/100mL。

作为优选，所述步骤3)中胰蛋白酶的添加量为脱氟肉糜质量的1-3％。

作为优选，所述步骤3)中酶解温度为40-45℃，酶解时间为5-8h。

作为优选，所述去氟复合颗粒的制备方法包括以下步骤：

将羧甲基壳聚糖加入水中配制成浓度为1-5wt％的羧甲基壳聚糖水溶液；将膨润土加入羧甲基壳聚糖水溶液中超声搅拌4-8h，过滤分离出膨润土，将膨润土加入三偏磷酸钠水溶液中浸泡1-3h，过滤分离，干燥得改性膨润土；将改性膨润土加入硝酸镧的乙醇溶液中，搅拌反应2-5h，过滤，洗涤，干燥，即得。

本发明利用膨润土的吸附作用先将氟离子进行吸附，然后利用膨润土层中的镧离子对氟进行固定，防止氟离子的脱吸附，得到的磷虾蛋白含氟率较低。本发明去氟复合颗粒的制备方法为先将膨润土浸入羧甲基壳聚糖的水溶液中，超声震荡使羧甲基壳聚糖分子分散在膨润土的层状结构中，添加交联剂，通过悬浮聚合的方法使膨润土夹层中的羧甲基壳聚糖分子发生交联形成三维网状聚合物，将三维网状聚合物加入硝酸镧的乙醇溶液中，三维网状聚合物上的活性位点与硝酸镧中的镧离子结合，从而将镧离子固定分散在三维网状聚合物中，三维网状聚合物能够增加镧离子在膨润土间分散的均匀性，从而提高镧对氟离子的固定作用。

作为优选，所述膨润土与羧甲基壳聚糖水溶液的质量体积比为1-3g/80mL。

作为优选，所述三偏磷酸钠水溶液的质量浓度为3-6％。

因此，本发明具有如下有益效果：(1)本发明先利用去氟颗粒除去磷虾中的氟元素，再利用胰蛋白酶酶解南极磷虾得到小分子肽，进一步利用超滤、凝胶层析纯化南极磷虾小分子肽，所得南极磷虾活性肽氟含量低，提高了产品的安全性和营养价值；(2)本发明利用膨润土的吸附作用先将氟离子进行吸附，然后利用膨润土层中的镧离子对氟进行固定，防止氟离子的脱吸附，得到的磷虾蛋白含氟率较低。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案做进一步说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的，实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1

去氟复合颗粒的制备方法包括以下步骤：

将羧甲基壳聚糖加入水中配制成浓度为3wt％的羧甲基壳聚糖水溶液；将膨润土加入羧甲基壳聚糖水溶液中在200W功率下超声搅拌6h，膨润土与羧甲基壳聚糖水溶液的质量体积比为2g/80mL，过滤分离出膨润土，将膨润土按质量体积比1g/45mL加入质量浓度为4％的三偏磷酸钠水溶液中浸泡2h，过滤分离，干燥得改性膨润土；将改性膨润土按质量体比1g/60mL加入质量浓度为3％的硝酸镧的乙醇溶液中，搅拌反应3h，过滤，洗涤，干燥，即得。

南极磷虾小分子肽的制备方法，包括以下步骤：

1)将南极磷虾肉洗净后绞碎得肉糜，将肉糜浸入乙酸乙酯浸泡脱脂，肉糜与乙酸乙酯的质量体积比为3g/100mL，静置，过滤分离得脱脂磷虾肉糜；

2)将脱脂磷虾肉糜按质量体积比2g/100mL加入水中均匀分散，加入去氟复合颗粒，肉糜与去氟复合颗粒的质量比为1:0.2，过滤分离得脱氟肉糜；

3)将脱氟肉糜按质量体积比5g/100mL加入水中均匀分散，加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的添加量为脱氟肉糜质量的2％，在42℃下酶解6h，得南极磷虾酶解液；

4)将南极磷虾酶解液依次经过超滤、凝胶柱层析纯化得南极磷虾小分子肽。

实施例2

去氟复合颗粒的制备方法包括以下步骤：

将羧甲基壳聚糖加入水中配制成浓度为4wt％的羧甲基壳聚糖水溶液；将膨润土加入羧甲基壳聚糖水溶液中在200W功率下超声搅拌7h，膨润土与羧甲基壳聚糖水溶液的质量体积比为3g/80mL，过滤分离出膨润土，将膨润土按质量体积比1g/45mL加入质量浓度为5％的三偏磷酸钠水溶液中浸泡3h，过滤分离，干燥得改性膨润土；将改性膨润土按质量体比1g/60mL加入质量浓度为3％的硝酸镧的乙醇溶液中，搅拌反应4h，过滤，洗涤，干燥，即得。

南极磷虾小分子肽的制备方法，包括以下步骤：

1)将南极磷虾肉洗净后绞碎得肉糜，将肉糜浸入乙酸乙酯浸泡脱脂，肉糜与乙酸乙酯的质量体积比为4g/100mL，静置，过滤分离得脱脂磷虾肉糜；

2)将脱脂磷虾肉糜按质量体积比2g/100mL加入水中均匀分散，加入去氟复合颗粒，肉糜与去氟复合颗粒的质量比为1:0.2，过滤分离得脱氟肉糜；

3)将脱氟肉糜按质量体积比5g/100mL加入水中均匀分散，加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的添加量为脱氟肉糜质量的3％，在45℃下酶解5h，得南极磷虾酶解液；

4)将南极磷虾酶解液依次经过超滤、凝胶柱层析纯化得南极磷虾小分子肽。

实施例3

去氟复合颗粒的制备方法包括以下步骤：

将羧甲基壳聚糖加入水中配制成浓度为2wt％的羧甲基壳聚糖水溶液；将膨润土加入羧甲基壳聚糖水溶液中在200W功率下超声搅拌5h，膨润土与羧甲基壳聚糖水溶液的质量体积比为1g/80mL，过滤分离出膨润土，将膨润土按质量体积比1g/45mL加入质量浓度为3％的三偏磷酸钠水溶液中浸泡2h，过滤分离，干燥得改性膨润土；将改性膨润土按质量体比1g/60mL加入质量浓度为3％的硝酸镧的乙醇溶液中，搅拌反应2h，过滤，洗涤，干燥，即得。

南极磷虾小分子肽的制备方法，包括以下步骤：

1)将南极磷虾肉洗净后绞碎得肉糜，将肉糜浸入乙酸乙酯浸泡脱脂，肉糜与乙酸乙酯的质量体积比为3g/100mL，静置，过滤分离得脱脂磷虾肉糜；

2)将脱脂磷虾肉糜按质量体积比2g/100mL加入水中均匀分散，加入去氟复合颗粒，肉糜与去氟复合颗粒的质量比为1:0.2，过滤分离得脱氟肉糜；

3)将脱氟肉糜按质量体积比5g/100mL加入水中均匀分散，加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的添加量为脱氟肉糜质量的1％，在40℃下酶解8h，得南极磷虾酶解液；

4)将南极磷虾酶解液依次经过超滤、凝胶柱层析纯化得南极磷虾小分子肽。

实施例4

去氟复合颗粒的制备方法包括以下步骤：

将羧甲基壳聚糖加入水中配制成浓度为5wt％的羧甲基壳聚糖水溶液；将膨润土加入羧甲基壳聚糖水溶液中在200W功率下超声搅拌8h，膨润土与羧甲基壳聚糖水溶液的质量体积比为3g/80mL，过滤分离出膨润土，将膨润土按质量体积比1g/45mL加入质量浓度为6％的三偏磷酸钠水溶液中浸泡3h，过滤分离，干燥得改性膨润土；将改性膨润土按质量体比1g/60mL加入质量浓度为3％的硝酸镧的乙醇溶液中，搅拌反应5h，过滤，洗涤，干燥，即得。

南极磷虾小分子肽的制备方法，包括以下步骤：

1)将南极磷虾肉洗净后绞碎得肉糜，将肉糜浸入乙酸乙酯浸泡脱脂，肉糜与乙酸乙酯的质量体积比为5g/100mL，静置，过滤分离得脱脂磷虾肉糜；

2)将脱脂磷虾肉糜按质量体积比2g/100mL加入水中均匀分散，加入去氟复合颗粒，肉糜与去氟复合颗粒的质量比为1:0.2，过滤分离得脱氟肉糜；

3)将脱氟肉糜按质量体积比5g/100mL加入水中均匀分散，加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的添加量为脱氟肉糜质量的3％，在45℃下酶解5h，得南极磷虾酶解液；

4)将南极磷虾酶解液依次经过超滤、凝胶柱层析纯化得南极磷虾小分子肽。

实施例5

去氟复合颗粒的制备方法包括以下步骤：

将羧甲基壳聚糖加入水中配制成浓度为1wt％的羧甲基壳聚糖水溶液；将膨润土加入羧甲基壳聚糖水溶液中在200W功率下超声搅拌4h，膨润土与羧甲基壳聚糖水溶液的质量体积比为1g/80mL，过滤分离出膨润土，将膨润土按质量体积比1g/45mL加入质量浓度为3％的三偏磷酸钠水溶液中浸泡1h，过滤分离，干燥得改性膨润土；将改性膨润土按质量体比1g/60mL加入质量浓度为3％的硝酸镧的乙醇溶液中，搅拌反应2h，过滤，洗涤，干燥，即得。

南极磷虾小分子肽的制备方法，包括以下步骤：

1)将南极磷虾肉洗净后绞碎得肉糜，将肉糜浸入乙酸乙酯浸泡脱脂，肉糜与乙酸乙酯的质量体积比为2g/100mL，静置，过滤分离得脱脂磷虾肉糜；

2)将脱脂磷虾肉糜按质量体积比2g/100mL加入水中均匀分散，加入去氟复合颗粒，肉糜与去氟复合颗粒的质量比为1:0.2，过滤分离得脱氟肉糜；

3)将脱氟肉糜按质量体积比5g/100mL加入水中均匀分散，加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的添加量为脱氟肉糜质量的1％，在40℃下酶解8h，得南极磷虾酶解液；

4)将南极磷虾酶解液依次经过超滤、凝胶柱层析纯化得南极磷虾小分子肽。

试样含氟率测定：

按照GB/T5009.18-2003食品中氟的测定中氟离子选择电极法进行。

脱氟率(％)＝(1-脱氟后肉糜中氟含量/脱氟前肉糜中氟含量)×100％

	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5
						脱氟率(％)	85.6	86.8	84.5	87.2	84.3

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。